Bài viết nghiên cứu sử dụng thuốc Đimetoat có nguyên tố đồng vị phóng xạ 32P để nghiên cứu khả năng phân giải thuốc Đimetoat của 2 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ vùng đất trồng rau tại Đà Lạt.
28(2): 68-76 T¹p chÝ Sinh häc 6-2006 Sư DơNG NGUY£N Tố ĐồNG Vị PHóNG Xạ Để NGHIÊN CứU KHả NĂNG PHÂN GIảI THUốC TRừ SÂU LÂN HữU CƠ (Đimetoat) CủA VI KHUẩN Phạm Thị Lệ Hà, Trần Thị Thủy, Nguyễn Duy Hạng Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt Để nghiên cứu phân giải loại thuốc bảo vệ thực vật nói chung thuốc trừ sâu nói riêng, loại nguyên tố đồng vị phóng xạ thờng đợc sử dụng [1-3] Các hợp chất bảo vệ thực vật, thờng đợc đánh dấu vị trí C P, trở thành 14C, 32P, nhờ nhận biết đợc phân giải vị trí phân giải chất có hoạt tính sinh học nh vi sinh vật, enzim Thuốc đimetoat (Đi) loại thuốc trừ sâu lân hữu đợc sử dụng nhiều vùng trồng rau màu công nghiệp [4-6] Bên cạnh hiệu bảo vệ thực vật, gây ô nhiễm môi trờng, làm giảm đa dạng sinh học Hơn nữa, làm giảm giá trị thơng phẩm sản phẩm nông nghiệp [7-10] Để xử lý thuốc Đi tồn d môi trờng, phơng pháp vật lý hóa học đợc sử dụng, song sử dụng phơng pháp sinh học hiệu bảo vệ môi trờng tốt [11-15] Việt Nam, nh giới, công trình nghiên cứu sử dụng nguyên tố đồng vị phóng xạ để nghiên cứu phân giải thuốc Đi [3] Mục đích công trình nghiên cứu bớc đầu sử dụng thuốc Đi có nguyên tố đồng vị phóng xạ 32P để nghiên cứu khả phân giải thuốc Đi chủng vi khuẩn đợc phân lập từ vùng đất trồng rau Đà Lạt (tỉnh Lâm Đồng) I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Chñng vi khuÈn Hai chñng vi khuÈn Aerococcus sp.T Neiseria sp.C có khả phân giải thuốc Đi đợc phân lập từ đất vùng trồng rau Đà Lạt, đợc sử dụng để nghiên cứu (các đặc trng sinh trởng, khả phân giải thuốc Đi chủng vi khuẩn đợc xác định) [16] 68 Thuốc Đi đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ Thuốc Đi có công thức hóa học: o,odimethyl-5-(N-methylcacbamido methyl) dithiophosphate Thuốc Đi đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị gốc phốt (32P-dimetoat) lò phản ứng Viện hạt nhân Đà Lạt, có độ hạt nhân > 99,5%, độ hóa phóng xạ > 98,8%, độ hóa học > 99,4% (theo kiểm nghiệm phòng Đồng vị phóng xạ, Viện hạt nhân Đà Lạt) Đánh giá phân giải thuốc Đi phơng pháp đồng vị phóng xạ Thuốc Đi đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị 32P (32P-Đi) đợc lọc khuẩn màng lọc khuẩn millipore trớc đợc đa vào bình có nuôi cấy chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T Neiseria sp.C với nồng độ 15 àg/ml Tại thời điểm h*, 24 h, 48 h, 72 h 120 h, đo tiêu sau: - Hoạt độ phóng xạ (HĐPX) tổng mẫu - Hoạt độ phóng xạ thuốc 32P-Đi Thuốc 32 P-Đi đợc tách chiết cách cho êtil axêtat vào dịch nuôi cấy theo tỷ lệ 1: 1; lắc 30 phút để tạo thành lớp; tách lớp hữu phía chứa thuốc 32P-Đi - Hoạt độ phóng xạ 32P dịch nuôi cấy sau loại bỏ sinh khối vi khuẩn màng läc khuÈn millipore (Millex GS), φ = 0,22 µm - Hoạt độ phóng xạ 32P sinh khối vi khuẩn Đối chứng bình có thuốc 32P-Đi môi trờng nuôi cấy, mà vi khuẩn Ghi chú: * HĐPX thuốc 32P-Đi đợc đo thuốc Đi, thêm vào ml êtil axêtat để chiết, ly tâm 30 phút, thu lấy ml êtil axêtat vào ống nghiệm, cho thêm Na2SO4 khan để tách H2O Tiêm àl vào máy sắc ký khối phổ (GC-MS), đềtectơ khối phổ tứ cực, nhiệt độ interface: 240C; nhiƯt ®é ngn ion: 210°C Sư dơng th− viƯn phỉ, kết hợp diện tích thu đợc đỉnh, xác định hợp chất hình thành hàm lợng chúng sau cho vào môi trờng Đo nguyên tố đồng vị đợc thực hệ máy đo IAEA cung cấp Quá trình phân tích đợc thực theo quy trình Phân tích chất hình thành sau phân giải Lấy ml dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T vµ Neiseria sp.C cã bỉ sung Vi sinh vËt 32 P-Đi 1-5 ngày Bay Đo 32P tổng (1) Êtil axêtat 32 P-Đi Đo 32P vi sinh vật (5) Vi sinh vật môi trờng Tách lọc Vi sinh vật Läc b»ng phin läc 32 P m«i tr−êng Bay Đo 32P-Đi môi trờng có vi sinh vật (3) Bay Đo 32P-Đi (2) Bay Đo 32P môi trờng (4) Hình Quy trình sử dụng thuốc trừ sâu đimetoat đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ 32 P (32P-Đi) để đánh giá khả phân giải thuốc trừ sâu Đi vi khuẩn 69 32 P-Đi giảm dần theo thời gian nuôi cấy Sau 24 giờ, HĐPX 36,9% 72 giờ, 32P-Đi mặt môi trờng nuôi cấy; nh chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T có khả phân giải thuốc Đi Sự phân giải đợc thể rõ nét qua HĐPX 32P cao môi trờng nuôi cấy (tăng từ 2% lên 75% sau 120 nuôi cấy) II KếT QUả NGHIÊN CứU Đánh giá khả phân giải thuốc Đi chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T kỹ thuật đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ Bảng hình cho thấy HĐPX thuốc Bảng Hoạt độ phóng xạ thuốc trừ sâu đimetoat ( 32P-Đi) đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ 32 P lại dung dÞch cã chđng vi khn Aerococcus sp.T £til 95,5 36,9 0,7 0 ∑ 100 96 93 89 80 0h 24 h 48 h 72 h 120 h MT 2,2 37,6 82,5 79,1 75,3 VK 2,0 20,5 8,7 9,1 4,7 % hoạt độ phóng xạ Ghi chú: đơn vị (%) hoạt độ phóng xạ (HĐPX); HĐPX toàn mẫu HĐPX thuốc trừ sâu có đánh dấu đồng vị phóng xạ 32 P; MT HĐPX 32 P môi trờng nuôi cấy; VK HĐPX 32 P vi khuÈn 100 80 60 40 20 0 24 48 72 120 Thêi gian (giê) H×nh Sự thay đổi hoạt độ phóng xạ m«i tr−êng nu«i cÊy cã chđng vi khn Aerococcus sp.T Hoạt độ phóng xạ 32P đo đợc sinh khèi cđa chđng vi khn Aerococcus sp.T, kh«ng cao Trong sinh khèi cđa vi khn, H§PX cđa 32P đo đợc hai dạng: dạng 32P thuốc 32P-Đi (thuốc Đi loại thuốc trừ sâu nội hấp nên đợc hấp thụ phần vào bên tế bào vi khuẩn) dạng 32P nhng 32P-Đi giai đoạn 24 giờ, HĐPX sinh khối cao giai đoạn khác, có lẽ 24 giai đoạn pha tiềm phát-pha lag chủng vi khn Aerococcus sp.T [14, 16], nªn kÝch th−íc cđa tÕ 70 bào tăng nhanh, hàm lợng ARN tăng nhanh; chúng có khả tiếp thu cao số chất, bên cạnh thuốc Đi loại thuốc trừ sâu nội hấp chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T vi khuẩn có khả sinh trởng phát triển mạnh, hấp thụ lớn 32P, chủ yếu 32P-Đi phần 32P tự có đợc trình phân giải enzym ngoại bào số vi khuẩn có ban đầu thời điểm 48 72 giờ, số lợng tế bào bắt đầu tăng lên, có lẽ 32P tự bên đợc đa trở lại, làm chất dinh dỡng cho tế bào, đồng thời thông qua trình dị hóa, thuốc 32P-Đi có tế bào đợc thải môi trờng ngoài, giai đoạn này, phần trăm HĐPX 32P tế bào giảm thấp đạt 8,7% 9,1% tơng ứng giai đoạn 120 giờ, pha cân bằng, lúc số lợng tế bào sinh quần thể trạng thái cố định động-số tế bào sinh số tế bào cũ chết đi, trình trao đổi chất tế bào môi trờng giảm thấp Đối với chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T, giai đoạn ngắn [14, 16]; có lẽ mà % HĐPX 32P tế bào giảm hẳn, 4,7% Kết hợp với kết nghiên cứu trớc, chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T phân giải thuốc Đi không đờng hấp thụ mà tạo enzym ngoại bào phân giải thuốc Đi [14, 16], nh chứng tỏ chủng vi khuẩn phân giải thuốc Đi Bảng 32 Hoạt độ phóng xạ thuốc trừ sâu đimetoat ( P-Đi) đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ 32 P lại dung dÞch cã chđng vi khn Neiseria sp.C £til 95,5 28,4 1,3 0 ∑ 100 96 93 89 80 0h 24 h 48 h 72 h 120 h MT 2,2 60,6 89,1 80,2 60,6 VK 2,0 6,6 1,7 6,1 11,5 % hoạt độ phóng xạ Ghi chú: nh b¶ng 100 80 60 40 20 0 24 48 72 120 Thêi gian (giê) H×nh Sù thay đổi hoạt độ phóng xạ môi trờng nuôi cấy có chủng vi khuẩn Neiseria sp.C Đánh giá khả phân giải thuốc Đi chủng vi khuẩn Neiseria sp.C kỹ thuật đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ Bảng hình cho thấy HĐPX thuốc P-Đi giảm dần theo thời gian nuôi cấy thời điểm 24 giờ, HĐPX 28,4% 72 h sau nuôi cấy, thuốc 32P-Đi mặt m«i tr−êng Nh− vËy, chđng vi khn Neiseria sp.C có khả phân giải thuốc Đi khả phân giải cao so với chủng Aerococcus sp.T (37,6%) Điều phù hợp với kết sử dụng sắc ký khí để phân tích d lợng thuốc Đi 32 công trình nghiên cứu trớc [14, 16] Trong sinh khèi cña chñng vi khuÈn Neiseria sp.C cã 32P, nhiên tỷ lệ không đáng kể mà 32P chđ u tËp trung m«i tr−êng nu«i cÊy Trong sinh khối vi khuẩn, hoạt độ phóng xạ 32P giai đoạn 24 h 6,6%, sau giảm dần (ở thời điểm 48 h 1,7%); cã lÏ còng t−¬ng tù nh− chđng vi khn Aerococcus sp.T, 24 h giai đoạn pha tiềm phát-pha lag Tuy nhiên, trình sinh trởng chủng vi khuẩn Neiseria sp.C không mạnh nh chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T, cho nªn cã lÏ cã hÊp thơ thc 32P-Đi nhng không nhiều [14, 16] 71 giai đoạn 120 h, pha cân chủng vi khuẩn Neiseria sp.C, giai đoạn dài dài h¬n so víi chđng vi khn Aerococcus sp.T [14, 16] Do vậy, có lẽ giai đoạn này, môi tr−êng nu«i cÊy chđng vi khn Aerococcus sp.T, chÊt dinh dỡng cạn, độc tố môi trờng tích lũy cao th× ë chđng vi khn Neiseria sp.C, chÊt dinh d−ìng còn, độc tố cha cao, có trao đổi chất, chủng vi khuẩn Neiseria sp.C sử dụng 32 P trình đồng hóa, mà % HĐPX 32P tế bào tăng đạt 11,5% Nh vậy, chủng vi khuẩn Neiseria sp.C có khả phân giải thuốc Đi Các hợp chất hình thành trình phân giải thuốc Đi vi khuẩn Sự chuyển hóa phân giải hợp chất lân hữu tự nhiên nhanh nhng phức tạp, xuất nhiều hợp chất trung gian độc với côn trùng động vật máu nóng gấp nhiều lần dạng thuốc ban đầu Phần lớn hợp chất độc trung gian sản phẩm trình oxy hóa khử Thí dụ trình chuyển hóa phân giải parathion-mêtil, sản phẩm trung gian paraoxon-mêtil độc parathion-mêtil gấp lần; trình chuyển hóa phân giải thuốc Đi có sản phẩm trung gian PO-Đi độc gấp 10-11 lần thuốc Đi Nếu thuốc Đi đợc phân giải 90%, cần 10% dạng PO-Đi, độ độc cao so với ban đầu phân giải xem nh ý nghĩa Do vậy, việc phân tích hợp chất hình thành trình phân giải vi khuẩn cần thiết Bảng thể hợp chất có mặt dịch nuôi cấy có thuốc Đi hai chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T Neiseria sp.C Kết cho thấy hàm lợng thuốc Đi môi trờng nuôi cấy có vi khuẩn nhỏ so với vi khuẩn; đặc biƯt tr−êng hỵp cã chđng vi khn Neiseria sp.C, thuốc Đi bị phân giải hết Các hợp chất có mặt môi trờng có vi khuẩn không khác mà lại so với dung dịch môi trờng có thuốc Đi mà vi khuẩn; thêm vào đó, số lợng hợp chất hình thành trờng hợp, không thấy có dạng PO-Đi Bảng Các hợp chất có mặt môi trờng nuôi cấy có thuốc Đi hai chủng vi khuÈn Aerococcus sp.T vµ Neiseria sp.C STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 72 RT 18.79 20.46 20.79 21.82 24.11 25.38 27.19 27.42 27.58 29.29 30.04 30.99 32.29 Tên hợp chất Không có vi khuẩn Tetradecan Hexadecan Phocmatiông Điethyltoluamit Hexadecan Heptadecan Hexacizan Dimetoat Eicosan Polysiloxan Đibutylphthalat 3- Eicosan Polysiloxan Hydrocacbon Xyclo Eicosan Polysiloxan Octasican Xyclodecosan DiÖn tÝch (m2) 3975.93 71175.91 9529.46 12038.60 16428.41 16997.36 16003.82 12304.44 60863.59 13000.97 82617.30 8987.71 21 22 23 24 25 26 27 28 29 32.56 33.46 34.23 34.75 36.33 38.14 39.08 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 18.79 20.46 20.76 10 11 18.78 20.46 20.76 21.81 22.05 22.05 24.10 25.47 25.96 27.21 28.32 29.46 30.99 33.44 34.10 Hydrocacbon Polysiloxan Hydrocacbon §imetylphthalat Polysiloxan Hydrocacbon Polysiloxan Hydrocacbon Polysiloxan Vi khuÈn Aerococcus sp.T Tetradecan Hexadecan Phocmati«ng Heptadecan Hydrocacbon Dimetoat Axit tetradecanoic Hydrocacbon §ibutylphthalat Metil exte cña axÝt bÐo Hydrocacbon Hexadecanoic Hydrocacbon Hydrocacbon 1-Docosanol 112041.10 16003.82 154603.50 26637.91 229079.86 64017.42 220071.16 3975.93 1734.86 4388.07 4495.25 6430.91 10514.16 9309.32 38663.75 6885.35 9829.25 §iocthylphthlat 16285.83 12166.73 34.72 36.25 Vi khuÈn Neiseria sp.C Tetradecan Hexadecan Phocmati«ng Điethyltoluamit Hydrocacbon no mạch thẳng 5192.35 2577.69 540.98 4818.45 6262.78 3123.41 22.79 23.56 Hydrocacbon no mạch thẳng 23.66 24.99 Hydrocacbon mạch vòng Hydrocacbon no mạch thẳng 6453.54 4244.15 7140.88 73 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 25.97 §ibutylphthalat Metil exte cđa axit bÐo Axit hexadecanoic Hydrocacbon no m¹ch th¼ng 1-Eicosan 27.22 27.66 13706.29 11264.37 3602.15 30.22 31.00 Hydrocacbon 1714.55 2169.73 32.48 34.11 §iocthylphthlat 2757.57 15959.82 34.95 4686.39 38.36 5411.95 Ghi chó: RT (rectention time) thêi gian l−u gi÷ Neiseria sp.C thuốc 32P-Đi Sau 120 nuôi cấy, hoạt độ phóng xạ 32P đo đợc chđ u m«i tr−êng nu«i cÊy; sinh khèi vi khuẩn, 32P đo đợc thấp Các hợp chất hình thành trình phân giải thuốc §i bëi chđng vi khn Aerococcus sp.T vµ Neiseria sp.C so với vi khuẩn không hình thành hợp chất độc III KếT LUậN Sử dụng thuốc trừ sâu lân hữu dimetoat (Đi) đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ 32 P (32P-Đi), xác định đợc khả phân giải thuốc Đi chủng vi khuẩn Aerococcus sp.T Neiseria sp.C phân lập đợc từ vùng đất trồng rau Đà Lạt Sau 72 nuôi cấy, m«i tr−êng nu«i cÊy chđng vi khn Aerococcus sp.T vµ 25 27 22 29 18 15 13 10 28 89 67 11 12 14 21 24 20 1617 19 23 26 H×nh KÕt phân tích khối phổ mẫu có Đi mà vi khuẩn (các hợp chất đánh số 1, 2, có tên tơng ứng với tên hợp chất b¶ng 3) 74 14 10 15 17 26 27 18 H×nh KÕt phân tích khối phổ mẫu có thuốc Đi chñng vi khuÈn Aerococcus sp.T 11 10 13 14 18 26 H×nh Kết phân tích khối phổ mẫu có thuốc Đi chủng vi khuẩn Neiseria sp.C TàI LIệU THAM KHảO Braschi I et al., 2000: J Agric Food Chem., 48: 2565-2571 Hussain M., 1989: Energy Agency Bull., 31: 2-36 Hussain M., 1993: FAO/IAEA, Interregional training course on radiotrace and conventional techniques for studies of pesticides in food and the environment, Vienna Miller G T Jr., 1988: Environmental 75 Science, An Introduction, 2nd ed by Wadsworth Publishing Company, Belmont, California 94002 Lê Văn Khoa, 1995: Môi trờng ô nhiễm Nxb Giáo dục, Hà Nội Trần Quang Hùng, 1995: Thuốc bảo vệ thực vật Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Tuyên, 1997: Sinh thái Môi trờng Nxb Giáo dục, Hà Nội Lê Huy Bá, 1997: Môi trờng t.1 Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phạm Văn Lầm, 1997: Hãa chÊt n«ng nghiƯp víi m«i tr−êng Nxb N«ng nghiƯp, Hà Nội 10 Lê Huy Bá, 1998: Sinh thái môi trờng đất Nxb Nông nghiệp, Hồ Chí Minh 11 Bollag J M., Liu S Y., 1990: Biological transformation processes of pesticides, in Pesticides in the soil environment, SSSA Book series, no 2, 677 S Segoe Rd., Madison, WI 53711 12 Madsen E L., 1991: Sci Technol., 25(10): 1663 13 Bollag J M., Myers C J and Minard R D., 1992: The science of the total environment, 123/124: 205-217 14 Trần Thị Thủy, Phạm Thị Lệ Hà, 2001: Khả sinh trởng vi khuẩn (T) môi trờng có thuốc trừ sâu lân hữu cơ, Hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội 15 Doãn Thái Hòa cs., 2001: Tạp chí Khoa học Công nghệ, XXXIX(1): 46-51 16 Phạm Thị Lệ Hà cs., 2003: T¹p chÝ Sinh häc, 25(2): 35-38 USING RADIOISOTOPE TO STUDY THE DIMETHOATE DEGRADATION CAPACITY OF BACTERIA Pham Thi Le Ha, Tran Thi Thuy, Nguyen Duy Hang SUMMARY The dimethoate (Di) biodegradation capacity of bacterium strains Aerococcus sp.T and Neiseria sp.C isolated from agricultural soil of Dalat city was determined by using 32P labeled dimethoate (32P-Di) Adding 32 P-Di into the culture medium of these bacterium strains, 32P-Di was quickly biodegraded and at 72 hours of cultivation, 32P-Di was not detected After 120 hours of incubation, the radioactivity of 32P was mostly accumulated in the medium, partly in the biomass of bacteria Intermediates found in the biotransformation processes by the strains Aerococcus sp.T and Neiseria sp.C were less than compared to the non biotransformation process and the poisonous intermediates were not found Ngµy nhËn bµi: 9-5-2005 76 ... 32P môi trờng (4) Hình Quy trình sử dụng thuốc trừ sâu đimetoat đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ 32 P (32P-Đi) để đánh giá khả phân giải thuốc trừ sâu Đi vi khuẩn 69 32 P-Đi giảm dần theo... so với vi khuẩn không hình thành hợp chất độc III KếT LUậN Sử dụng thuốc trừ sâu lân hữu dimetoat (Đi) đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ 32 P (32P-Đi), xác định đợc khả phân giải thuốc Đi... ngoại bào phân giải thuốc Đi [14, 16], nh− vËy chøng tá chđng vi khn nµy phân giải thuốc Đi Bảng 32 Hoạt độ phóng xạ thuốc trừ sâu đimetoat ( P-Đi) đợc đánh dấu nguyên tố đồng vị phóng xạ 32 P