Thử nghiệm sử dụng bacteriocin trong điều trị bệnh gan, thận mủ trên cá tra giống do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra. Mục tiêu của thử nghiệm là nhằm tìm ra hoạt chất mới để điều trị hiệu quả bệnh trên cá tra và an toàn cho sức khỏe của con người.
Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2019 THÔNG BÁO KHOA HỌC ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA BACTERIOCIN ĐỐI VỚI VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN, THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) EVALUATION THE ANTIBACTERIAL OF BACTERIOCIN TO Edwardsiella ictaluri CAUSING WHITE SPOTS IN THE INTERNAL ORGANS OF STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyễn Thị Thúy Hằng¹ Ngày nhận bài: 30/6/2019; Ngày phản biện thơng qua: 17/9/2019; Ngày duyệt đăng: 28/9/2019 TĨM TẮT Thử nghiệm sử dụng bacteriocin điều trị bệnh gan, thận mủ cá tra giống vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây Mục tiêu thử nghiệm nhằm tìm hoạt chất để điều trị hiệu bệnh cá tra an toàn cho sức khỏe người Thí nghiệm thực cách gây cảm nhiễm cho cá khỏe với liều nhiễm 50% cho cá ăn thức ăn có trộn bacteriocin với nghiệm thức khác (NT1: 10 mL/ Kg thức ăn; NT2: 20 mL/ Kg thức ăn; NT3: 30 mL/ Kg thức ăn NT4:40 mL/ Kg thức ăn), nghiệm thức lặp lại lần Kết xác định liều nhiễm 50% vi khuẩn E ictaluri 6,8 x 107 CFU/mL Kết điều trị sau cảm nhiễm 48 14 ngày cho thấy tỉ lệ sống nghiệm thức NT4 đạt cao 92,22 %, giá trị RPS – hiệu điều trị (%) 91,86% khác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức lại Từ khóa: Bacteriocin, Cá tra, gan thận mủ ABSTRACT Experiment used bacteriocin in treat white spots in the internal organs disease of fingerling catfish (Pangasianodon hypophthalmus) caused by Edwarsiella ictaluri Tageted to find new ingredient that can replace antibiotivà cs for treatment white spots in the internal organs disease in catfish and safe for the health of humans Experimental treament was carried out by injection of E ictaluri bacteria into healthy striped catfish at infectious dose 50, and feed supplemented bacteriocin with four different experiment (NT1: 10 mL/ Kg; NT2: 20 mL/ Kg; NT3: 30 mL/ Kg NT4: 40 mL/ Kg of feed), each experiment was repeated times The result of injectious dose 50 of E ictaluri bacteria was 6.8 x 107 CFU/mL Results of treatment showed that survival rate highest in experimental treatment of NT4 was 92.22 % and ralative survival rate (RPS) was 91.86 % and significant difference statistically with the other treatments Keyword: Bacteriocin, Edwardsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus I.ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh cá tra ngày phổ biến khả kháng thuốc kháng sinh ngày cao Theo kết kháng sinh đồ 50 chủng vi khuẩn E ictaluri với số loại kháng sinh cho thấy vi khuẩn E.ictaluri giảm tính nhạy nhiều loại kháng sinh cefazoline (2%), cefalexin (2%), neomycin (6%), amoxicillin + clavulanic ¹ Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh acid (8%) ampiciline (14%) Trong đó, đa số vi khuẩn kháng flumenquin, trimethoprim + sulfamethoxazol kháng với streptomycin (80%) (Từ Thanh Dung cs, 2012) Ngày nay, việc sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược số kháng sinh tự nhiên nghiên cứu ứng dụng nhiều thực phẩm phòng trị bệnh cá tơm Trong đó, bacteriocin - sản phẩm sinh TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 25 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản từ vi khuẩn lactic xem kháng sinh sinh học để chống lại vi khuẩn gây bệnh quan tâm.Ngoài ra, bacteriocin không gây phản ứng dị ứng cho người vấn đề sức khỏe, bị phân hủy nhanh enzym protease, lipase (Parada cs, 2007) Do đó, việc đánh giá khả khả kháng khuẩn bacteriocin điều trị bệnh gan, thận mủ cá tra vi khuẩn E ictaluri gây ra, mở hướng tích cực việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn cá tra nói riêng động vật thủy sản nói chung (Bakkal cs, 2012) Kết đánh giá nhằm cung cấp thêm thông tin bacteriocin thay thuốc kháng sinh cơng tác phòng trị bệnh cho cá tra II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Cá tra giai đoạn giống có khối lượng khoảng 20 – 35 g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt mua từ Trung Tâm Giống Thủy sản An Giang Cá sử dụng bố trí thí nghiệm Mẫu cá tra bệnh thu từ hộ ni huyện Phú Tân Trại Bình Thạnh Trung tâm giống Thủy sản An Giang để phân lập định danh vi khuẩn E ictaluri Thời gian thu mẫu cá từ tháng đến tháng năm 2018 Bacteriocin: hoạt chất 3-HPA (3-Hydroxypropionaldehyde) chiết xuất từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri qua trình lên men yếm khí glycerol Nồng độ hoạt chất sử dụng 130 ppm Vật liệu nghiên cứu - Nguồn vi khuẩn E ictaluri Vi khuẩn phân lập định danh từ mẫu cá bệnh thu từ hộ nuôi Sau đó, vận chuyển sống phòng thí nghiệm Khu thí nghiệm Trường Đại học An Giang để phân lập định danh theo bước sau: - Ghi nhận dấu hiệu bất thường bên cá - Giải phẫu mẫu cá bệnh Phân lập vi khuẩn quan gan, thận tỳ tạng - Sau giải phẫu tiệt trùng bề mặt nội quan gan, thận tỳ tạng Dùng dao tiệt trùng rạch đường nhỏ quan cần phân lập 26 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 3/2019 Sau lấy que cấy tiệt trùng lấy mẫu vật cấy lên đĩa môi trường TSA chuẩn bị sẵn - Đem đĩa petri cấy vi khuẩn ủ nhiệt độ 28-30ºC 48 - Sau 48 vi khuẩn phát triển tiến hành tách ròng vi khuẩn Chọn khuẩn lạc đại diện từ đĩa petri ban đầu cấy sang đĩa môi trường TSA mới, lập lại 2-3 lần vi khuẩn - Vi khuẩn định danh kit API20E kết hợp với phương pháp giải mã trình tự gen Kiểm tra tính nhạy vi khuẩn Tính nhạy vi khuẩn bacteriocin phương pháp khuếch tán giếng thạch (Abo-Amer, 2007) Nguyên tắc phương pháp dựa vào khả ức chế bacteriocin Vi khuẩn E ictaluri nuôi tăng sinh môi trường BHI (Brain Heart Infusion) 48 giờ, pha loãng đến mật số khoảng 9x108 CFU/mL (dựa vào ống chuẩn McFarland số 3) Hút 0,2 mL dung dịch vi khuẩn trải đĩa petri có chứa mơi trường Trypticase Soy Agar (TSA) để ráo, đục giếng thạch có đường kính mm (4 giếng/đĩa petri) Mỗi thể tích bacteriocin bơm từ 20, 30, 40, 50 60 μL vào lỗ (mỗi thể tích lặp lại lần) giếng lại bơm nước cất vô trùng vào để làm giếng đối chứng Ủ 28 ºC 48 Bacteriocin có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh tạo vòng vơ khuẩn xung quanh lỗ thạch Đo đường kính vòng vơ khuẩn để xác định tính nhạy bacteriocin vi khuẩn gây bệnh Nếu đường kính vòng vơ khuẩn nhỏ 12 mm, gọi có tính kháng (R) hay đường kính vòng vơ khuẩn lớn 12 mm, gọi mẫn cảm (S); mẫn cảm trung bình đường kính vòng vơ khuẩn từ 12-20 mm; mẫn cảm cao có đường kính vòng vơ khuẩn lớn 20 mm (Lê Xuân Thành cs, 2002) Thí nghiệm sử dụng bacteriocin điều trị bệnh gan, thận mủ cá tra vi khuẩn E ictaluri gây Thí nghiệm xác định ID50 (Inhibitory Dose 50%) thực theo phương pháp Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Phương (2012) Cụ thể, thí nghiệm xác định ID50 bố trí với nghiệm thức 15 thùng nhựa tích 160L Mỗi thùng bố trí 10 cá với lần lặp lại, cá gây cảm nhiễm cách tiêm vi khuẩn gốc vi ngực (0,1ml vi khuẩn/cá với nồng độ 103, 104, 105, 106 107 CFU/ml) Vi khuẩn E ictaluri nuôi tăng sinh môi trường BHI 48 Sau đó, dung dịch vi khuẩn chuyển sang ống eppendorf (2 mL) để li tâm 4000 vòng ºC 15 phút Bỏ phần dung dịch phía vi khuẩn rửa lần với nước muối sinh lý tiệt trùng hòa tan vi khuẩn sau li tâm với nước muối sinh lý tiệt trùng Xác định mật độ dung dịch vi khuẩn phương pháp so với độ đục ống chuẩn McFarland số (độ đục tương đương với 108 CFU/mL) Sau pha lỗng dung dịch vi khuẩn từ nồng độ 103 CFU/mL, 104 CFU/mL, 105 CFU/mL, 106 CFU/mL 107 CFU/mL Mật độ vi khuẩn xác định lại phương pháp đếm số khuẩn lạc Mật độ vi khuẩn gây nhiễm 50% cá thí nghiệm (ID50) xác định sử dụng để gây cảm nhiễm cho cá thí nghiệm điều trị Thí nghiệm cảm nhiễm điều trị: Thí nghiệm thực trại Thủy sản Trường Đại học An Giang Hệ thống thùng nhựa (160L) khử trùng chlorine xà phòng, rửa lại nước Sau cho nước vào bể lắp hệ thống sục khí liên tục ngày để loại hết chlorine, tiêu môi trường kiểm tra trước thí nghiệm gồm pH, oxy hòa tan, nhiệt độ, NH3 /NH4+ NO2Cá tra chọn làm thí nghiệm có trọng lượng 15-20g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt không nhiễm bệnh Cá bố trí ngẫu nhiên 30 con/bể chứa nước 2/3 thể tích bể hố ngày cho quen dần với mơi trường nước thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm nghiệm thức (NT), NT lặp lại lần: - NT1: Thí nghiệm điều trị với nồng độ bacteriocin 10 mL/kg thức ăn; - NT2: Thí nghiệm điều trị với nồng độ bacteriocin 20 mL/kg thức ăn; - NT3: Thí nghiệm điều trị với nồng độ Số 3/2019 bacteriocin 30 mL/kg thức ăn; - NT4: Thí nghiệm điều trị với nồng độ bacteriocin 40 mL/kg thức ăn; - NT 5: đối chứng (ĐC dương): Cá gây cảm nhiễm vào ngày cho ăn thức ăn không trộn bacteriocin; - NT6 đối chứng 2: Cá tiêm dung dịch 0.85% NaCl vào ngày cho ăn thức ăn không trộn bacteriocin; - NT7 đối chứng 3: Cá không gây cảm nhiễm vào ngày cho ăn thức ăn không trộn bacteriocin Cá gây cảm nhiễm vào ngày cho ăn thức ăn trộn với bacteriocin từ ngày có biểu bệnh lý (từ 48 sau tiêm vi khuẩn) cho ăn liên tục ngày Trong q trình thí nghiệm pH, DO, NH3 / NH4+ NO2- nhiệt độ ghi nhận hàng ngày vào hai buổi sáng (lúc - giờ) chiều (lúc 14 – 16 giờ) Số lượng tỷ lệ cá chết chết ghi nhận ngày Cá bệnh mổ khám quan sát bệnh tích, phân lập, định danh vi khuẩn E ictaluri Kit API20E Tất cá sống sau thí nghiệm phân lập vi khuẩn xác nhận tình trạng nhiễm khuẩn Thời gian thí nghiệm 14 ngày Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm microsoft word excel để viết báo cáo tính hiệu điều trị bệnh Đồng thời, sử dụng kiểm định T- Test Ducan để so sánh khác biệt nghiệm thức Hiệu điều trị bệnh phòng thí nghiệm đánh giá tỉ lệ sinh tồn tương đối (relative survival rate – RPS) Giá trị RPS (%) theo công thức (Ellis, 1998): RPS (%) = [1 - (% cá chết nghiệm thức sử dụng bacteriocin /% cá chết nghiệm thức đối chứng dương)] x 100 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập đinh danh vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan, thận mủ cá tra giống Kết phân lập 25 mẫu cá bao gồm 20 mẫu cá bệnh mẫu cá khỏe Trong đó, mẫu cá khỏe có đặc điểm màu sắc TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 27 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2019 tươi sáng, đồng đều, vây da không bị tổn thương, nội quan gan, thận, tỳ tạng khơng có đốm trắng giống bệnh gan, thận mủ xoang bụng khơng có dịch vàng; ngược lại mẫu cá bệnh có dấu hiệu bất thường bên xuất huyết đốm li ti da đầu vùng bụng, cá gầy, bơi lội không linh hoạt Sau giải phẫu quan sát thấy xoang bụng có dịch vàng, dày đầy hơi, gan có màu sắc nhợt nhạt, thận sưng to có nhiều đốm trắng nhỏ, tỳ tạng có nhiều đốm trắng nhỏ (Hình 1) Hình Những đốm trắng li ti thận tỳ tạng cá tra bệnh Kết phân lập vi khuẩn 20 mẫu cá có dấu hiệu bệnh gan, thận mủ thu 10 chủng vi khuẩn có đặc điểm sau: vi khuẩn phát triển môi trường TSA sau 48 ni cấy, khuẩn lạc nhỏ có màu trắng Kết kiểm tra đặc điểm sinh lý thấy vi khuẩn: (i) di động; (ii) gram âm; (iii) hình que ngắn mãnh; (iv) catalse dương tính oxidase âm tính; (v) lên men mơi trường O/F glucose; (vi) phản ứng catalase dương tính; (vii) phản ứng cytochrome oxidase âm tính; (viii) đặc điểm sinh hoá vi khuẩn E ictaluri cho hầu hết phản ứng âm tính, có phản ứng dương tính LDC (Lysine) GLU (Glusose) Đồng thời, kết định danh kit API20E kết hợp với phương pháp giải mã trình tự gene cho thấy vi khuẩn gây bệnh cá tra có dấu hiệu bệnh lý (Hình 1) giống 100% với vi khuẩn E ictaluri Kết ghi nhận Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Trúc Phương (2010), Đồng Thanh Hà (2009) Từ Thanh Dung (2005) Theo Crumlish cs (2002) cho vi khuẩn E ictaluri tác nhân gây bệnh gan thận mủ gây bệnh chủ yếu cá da trơn nuôi thâm canh Kết kiểm tra khả kháng khuẩn bacteriocin vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan, thận mủ cá tra giống Qua kết thử nghiệm khả kháng khuẩn bacteriocin thể tích khác từ 20 µL, 30 µL, 40 µL, 50 µL 60 µL vi khuẩn E ictaluri phòng thí nghiệm (Bảng 1) cho thấy bacteriocin có khả Bảng Kết kiểm tra khả kháng khuẩn bacteriocin Lặp lại Thể tích (µL) Lần Lần Lần Đường kính TB (mm) Độ lệch 20 9,2 8,2 8,3 8,57 0,55 30 17,3 19 17,3 17,87 0,98 40 17,6 19,3 17,6 18,17 0,98 50 20 20,6 20 20,20 0,35 60 22,3 24,3 22,3 22,97 1,15 Đối chứng 0 0 28 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản tạo vòng kháng khuẩn thể tích thử nghiệm với đường kính trung bình vòng vơ trùng tương ứng 8,57 mm ± 0,55; 17,87 mm ± 0,95; 18,17 mm ± 0,98; 20,20 mm ± 0,35 22,97 mm ± 1,15 Trong đó, giếng đối chứng bơm nước muối sinh lý khơng tạo vòng vơ khuẩn xung quanh giếng Từ đó, kết luận bacteriocin chất có khả ức chế diệt vi khuẩn E ictaluri Kết điều trị Kết thí nghiệm thăm dò xác định nồng độ ID50 6,8 x 107 CFU/mL để tiêm cảm nhiễm cho nghiệm thức điều trị nghiệm thức đối chứng dương Ngồi ra, tiêu mơi trường nhiệt độ từ 28 – 28,5 ºC, pH dao đông từ – 7,5, NO2- từ 0,5- Số 3/2019 ppm, NH3/NH3+ khoảng 0,5 – ppm oxy hòa tan từ – mg/L theo dõi ghi nhận q trình thực thí nghiệm nằm khoảng cho phép phù hợp cho cá sống bình thường Kết điều trị ghi nhận Hình cho thấy tỉ lệ sống cá thí nghiệm giảm dần từ NT7, NT4, NT6, NT3, NT2, NT1 cuối NT5 – đối chứng dương Kết cho thấy sử dụng nồng độ điều trị tăng dần từ 10 đến 40 mL/Kg thức ăn tỉ lệ sống tăng theo Tuy nhiên, có NT6 khơng tiêm vi khuẩn có cá chết giải thích trường hợp cá bị sốc bắt lên tiêm nước muối sinh lý tỉ lệ sống cá cao đạt 86,67 % thấp NT4 NT7 Hình Tỉ lệ sống nghiệm thức sau kết thúc thí nghiệm (14 ngày) Kết cho thấy tỉ lệ sống nghiệm thức điều trị sau kết thúc thí nghiệm đạt cao NT4 đạt 92,22%, sử dụng liều 40 mL/kg thức ăn thấp NT1 48,89% So sánh với hiệu sử dụng thuốc kháng sinh Erythromycin thiocyanate để điều trị bệnh cho cá tra gây nhiễm vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan thận mủ Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương nghiên cứu (2012), tỉ lệ sống nghiệm thức điều trị với liều 60 mg/kg trọng lượng cá đạt 62,9% Song song đó, nhận định nghiên cứu ứng dụng bacteriocin Bakkal cs (2012) thay thuốc kháng sinh để phòng điều trị số bệnh vi khuẩn thường gặp nuôi trồng thủy sản Aeromonas, Vibrio, Streptococcus Edwardsiella Ngoài việc dựa vào tỉ lệ sống để đánh khả kháng khuẩn bacteriocin việc xác định giá trị RPS (%) – hiệu điều trị chất kháng khuẩn đóng vai trò quan trọng việc lựa chọn sản phẩm nồng độ sử dụng bacteriocin phù hợp, điều mang lại hiệu cao điều trị bệnh gan, thận mủ nói riêng bệnh nhiễm khuẩn động vật thủy sản nói chung Kết ghi nhận hiệu điều bacteriocin thí nghiệm thể Bảng Bảng Hiệu điều trị bacteriocin cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri Nghiệm thức Giá trị RPS (%) NT1 46,51a ± 18,83 NT2 65,12ab ± 13,27 NT3 84,88bc ± 2,60 NT4 91,86c ± 2,07 Chú thích: Các giá trị mangchữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với NT lại với mức ý nghĩa P