khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN TRƯỜNG PHÁT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Pangasianodon hypophth

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THUỶ SẢN

NGUYỄN TRƯỜNG PHÁT

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG

VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN

MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN

2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THUỶ SẢN

NGUYỄN TRƯỜNG PHÁT

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG

VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN

MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts TỪ THANH DUNG

2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:

Cố vấn học tập cô Từ Thanh Dung người đã hướng dẫn tận tình để tôi có thể làm được đề tài này

Quí Thầy, Cô và cán bộ Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi chân thành cảm ơn sự chỉ dẫn hết sức nhiệt tình của chị Dương Thị Kim Loan lớp cao học K18

Cảm ơn anh Nguyễn bảo Trung, các bạn Trần Thanh Sang, Đặng Phạm Hòa Hiệp và tập thể lớp bệnh học thủy sản đã giúp đỡ tôi, luôn bên tôi khi tôi gặp khó khăn

Cần Thơ, ngày , tháng , năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trường Phát

TÓM TẮT

Đề tài khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra, nhằm tìm ra một số chủng vi khuẩn

lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn E ictaluri Nguồn vật liệu để phân lập

vi khuẩn lactic trong thí nghiệm này là dưa cải muối chua và ruột cá rô phi được thu mua ở các chợ địa bàn Thành phố Cần Thơ, vi khuẩn lactic được phân lập bằng môi trường MRS agar và MRS broth Các dòng vi khuẩn được chọn lọc dựa trên khả năng phân giải CaCO3 được thêm vào môi trường MRS agar và có các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản như: Gram (+), catalase, oxidase âm tính sẽ được chọn phân lập Kết quả là 34 chủng vi khuẩn lactic đã được phân

lập và được khảo sát tính kháng với vi khuẩn E ictaluri bằng phương pháp

giếng khuếch tán Bằng phương pháp này 9 dòng vi khuẩn lactic sinh ra vòng

kháng khuẩn và có khả năng đối kháng vơi vi khuẩn E ictaluri đã được tìm

thấy, trong đó hai chủng vi khuẩn RP11.1 và RP8.1 sinh vòng kháng khuẩn với đường kính lớn nhất lần lượt là 12 và 10,3 mm Hai chủng này đã được lựa chọn để định danh bằng phương pháp sinh học phân tử, giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal ARN Việc định danh được thưc hiện bởi công ty TNHH

TM và DV Nam Khoa, cho kết quả chủng RP11.1 đồng hình 100% và chủng

RP8.1 đồng hình 99% với vi khuẩn Lactobacillus plantarum

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

CHƯƠNG 2 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra 3

2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 3

2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý và phổ loài cảm nhiễm 3

2.2 Vi khuẩn lactic (LAB: Lactic acid bacteria) 4

2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic 4

2.2.2 Khái quát về phân loại 5

2.2.3 Vi khuẩn lactic trong quá trình lên men 6

2.2.4 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 7

2.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic trên động vật thuỷ sản 8

2.4 Định danh vi khuẩn lactic bằng phương pháp sinh học phân tử 9

CHƯƠNG 3 11

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 11

3.1 Thời gian, địa điểm 11

3.2 Vật liệu thí nghiệm 11

3.3 Phương pháp nghiên cứu 11

3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá rô phi và dưa cải muối chua 11

3.3.2 Th nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn E ictaluri của các dòng vi khuẩn lactic 12

3.3.3 Định danh vi khuẩn 13

Trang

CHƯƠNG 4 14

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

4.1 Kết quả quá trình phân lập vi khuẩn lactic 14

4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp giếng khuếch tán (Well diffusion agar) 16

4.3 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 21

CHƯƠNG 5 22

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

PHỤ LỤC A 26

PHỤ LỤC B 27

PHỤ LỤC C 28

PHỤ LỤC D 31

PHỤ LỤC E 32

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi

khuẩn lactic được phân lập 14

Bảng 4 2 Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn ở nghiệm thức 1 16 Bảng 4 3 Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn ở nghiệm thức 2 19 Bảng 7.1 Thành phần môi trường MRS 26 Bảng 7.2 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ ruột cá rô phi 28 Bảng 7.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ dưa cải muối chua 29

Bảng 7.4 Kết quả đo đường kính vòng tròn vô trùng của các mẫu đối

chứng 30

Trang

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Khả năng kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn lactic 9

Hình 4.1 Quá trình phân lập và tách ròng vi khuẩn lactic: A, B: Phân lập vi khuẩn lactic

C, D: Đĩa vi khuẩn đã thuần 14

Hình 4.2 Khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn lactic (A), mẫu nhuộm Gram tiêu biểu (B) 15

Hình 4.3 Kết quả phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức 1 18

Hình 4.4 Kết quả phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức 2 20

Hình 4.5 Các mẫu đối chứng 20

Hình 7.1 Một số ảnh kết quả phương pháp giếng khuếch tán 32

Trang

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

RP Rô phi

DC Dưa cải

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Cá tra (Pangasianodon hypophthamus) là một trong những mặt hàng

thuỷ xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Tổng giá trị xuất khẩu cá tra năm 2012 đạt 1,74 tỷ USD (www.vasep.com.vn) Để đảm bảo cung cấp nguồn nguyên liệu đủ và ổn định thì đòi hỏi phải ngày càng thâm canh hóa để nâng cao sản lượng, do đó vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại nhiều hơn, phổ biến nhất là các bệnh như: gan thận mủ, trắng gan trắng mang, phù

đầu, xuất huyết…(Dung et al., 2004) Trong số các bệnh trên cá Tra nuôi ở

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) phổ biến và gây thiệt hại nhiều nhất là

bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra (Nguyễn Chính, 2005) Tỉ lệ xuất hiện

bệnh gan thận mủ trên cá tra khoảng (61%) không cao hơn nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (68,3%), bệnh phù đầu (51,2%) (Trần Anh

Dũng, 2005) Nhưng tỷ lệ chết là cao nhất (60 - 80%) (Crumlish et al., 2002)

Tỷ lệ hao hụt cao nhất ở giai đoạn cá giống nhưng gây thiệt hại nặng nhất ở

giai đoạn cá lứa cở 300-500g (Từ Thanh Dung và ctv., 2005)

Do yêu cầu thực tiễn sản xuất người nuôi phải tăng cường thâm canh hoá đồng thời sử dụng nhiều thuốc kháng sinh Tuy nhiên, do việc chọn và sử

dụng kháng sinh không đúng cách đã làm cho độ nhạy của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp đối với các loại thuốc kháng sinh ngày

càng giảm nguy cơ không còn thuốc điều trị đang đến gần (Nguyễn Đức Hiền,

2008 Trích đẫn bởi Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012) Theo

nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam và ctv (2010), nghiên cứu tìm thấy 97,5% chủng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri có hiện tượng đa kháng thuốc (từ ba loại

kháng sinh trở lên) Đặc biệt, trong đó số chủng kháng từ 6-10 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ khá cao 25% số chủng kháng với 8 loại thuốc kháng sinh, 20% số chủng kháng 9 loại thuốc kháng sinh và 10% số chủng kháng 10 loại thuốc kháng sinh

Chính từ những nguyên nhân trên mà việc tìm ra những giải pháp hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh hiện có để bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh

dự phòng là một nhiệm vụ vô cùng cấp bách và cần thiết của những nhà khoa học thuỷ sản Hiện nay việc nghiên cứu sử dụng các chế phẩm sinh học đặc biệt là probiotics, bacteriocin để phòng và trị bệnh cho động vật thuỷ sản đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu (Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012) Từ lâu vi khuẩn lactic một nhóm vi khuẩn hữu ch đã được con người áp dụng một số đặc t nh như khả năng lên men, chống hư hỏng cho thực

phẩm.…để chế biến nhiều loại thực phẩm như: dưa cải, dưa leo chua, yoghourt,…Thời gian gần đây có một số ứng dụng nhóm vi khuẩn hữu ích này vào trong lĩnh vực thuỷ sản để phòng trị bệnh điển hình là việc nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men đối kháng vi

khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên các tra nuôi của Ngô Thị Phương Dung và ctv (2011); Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai

(2012)

Do vậy đề tài “Khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn

Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus)” được thực hiện mong muốn sẽ đem lại một số đóng góp hữu

ích nữa cho việc phòng trị bệnh gan thận mủ

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài này nhằm khảo sát và tìm hiểu khả năng vi khuẩn lactic đối

kháng với vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

Đồng thời đóng góp t ch cực bổ sung cho những nghiên cứu trước đây về việc

sử dụng vi khuẩn lactic cho lĩnh vực phòng trị bệnh thủy sản

1.3 Nội dung đề tài

Phân lập vi khuẩn lactic từ một số sản phẩm lên men và từ ruột cá (dưa cải muối chua và ruột cá rô phi) được thu ở một số chợ địa bàn Thành phố Cần Thơ

Tuyển chọn vi khuẩn lactic thông qua thí nghiệm đánh giá khả năng

kháng khuẩn Edwarsiella ictaluri của các dòng vi khuẩn lactic vừa được phân

lập bằng phương pháp giếng khuếch tán

Định danh 2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn

Edwarsiella ictaluri cao nhất

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên

cá tra

2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn

Gram âm, hình que và có k ch thước biến đổi (0,75-1,25µm), không di động hoặc di động yếu, lên men, cho phản ứng catalase dương t nh và oxidase âm tính, phản ứng indole và H2S âm tính Vi khuẩn E ictaluri phát triển tốt ở

280C sau 24-48 giờ tạo thành những khuẩn lạc có k ch thước nhỏ, tròn có màu

trắng, không nhân, rìa và có dạng không đồng nhất (Từ Thanh Dung và ctv.,

2004)

Edwardsiella ictaluri phát triển tốt trên môi trường chọn lọc

Edwardsiella ictaluri medium (EIM) (pH=7,0-7,2) sau 48 giờ ở nhiệt độ 30°C Khuẩn lạc có dạng nhỏ li ti, không trong suốt, có k ch thước 0,5-1,0 mm

28-(Shotts et al., 1990) Ngoài ra, khi phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

gây bệnh trên cá tra ở Việt Nam bằng môi trường TSA sau 48 giờ ở 28°C cho thấy khuẩn lạc có dạng pinpoint (nhỏ li ti) có rìa xung quanh, màu trắng nhạt,

k ch thước từ 0,11-0,17 mm (Crumlish et al., 2002)

Theo Plump (1999), vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước thời gian ngắn hay dài còn tuỳ thuộc vào nhiệt độ môi trường nước, nếu nhiệt độ của nước là 5oC thì vi khuẩn có thể tồn tại 15 ngày nhưng khi nhiệt độ tăng lên 25oC thì thời gian sống của vi khuẩn này khoảng 10 ngày Mặt khác, trong lớp bùn đáy ao ở nhiệt độ 5oC vi khuẩn tồn tại khoảng 15 ngày, 18oC vi khuẩn tồn tại khoảng 45 ngày và 95 ngày ở 25oC

2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý và phổ loài cảm nhiễm

Edwardsiella ictaluri lần đầu tiên được phân lập bởi Hawke (1976)

trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) Trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở

Thái Lan (Kasornchandra 1987) Ở Việt Nam bệnh xuất hiện chủ yếu trên cá tra, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa Xuất hiện trên tất cả các giai đoạn của

cá tra (Từ Thanh Dung và ctv., 2005)

Tuy nhiên, khả năng gây hại của Edwardsiella ictaluri trên cá nheo

Mỹ phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường nước, ở 18°C gây chết 10% nhưng ở

25°C tỷ lệ tử vong lên đến 77% Trên cá nheo Mỹ, Edwardsiella ictaluri gây

ra các dấu hiệu bệnh lý như bên ngoài có hiện tượng xuất huyết trên da ở

thân, mang, bụng và hàm dưới, những tổn thương màu đỏ xuất hiện trên da, lan rộng ra ở các giai đoạn sau của bệnh, phồng mang, lồi mắt, bệnh mãn tính vết loét mở rộng ra các cơ quan ở phần đầu giữa 2 mắt gây tỷ lệ tử vong cao

(Plumb et al., 1995) Ngoài ra vi khuẩn E ictaluri còn gây bệnh trên một số loài khác cùng giống như cá bông lao (I furcatus), cá sọc ngựa lam (Danio

devario), và cá trê trắng (Clarias batrachus) gây thiệt hại lớn về kinh tế trong

nghề nuôi cá công nghiệp ở Mỹ (Keskin et al., 2002) Ở Việt Nam từ năm

1998, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri gây ra lần đầu tiên phát hiện

trên cá tra nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long và gọi là bệnh BND (Bacillary

Necrosis of Pangasius) (Ferguson et al., 2001)

Theo Ferguson (2001), dấu hiệu bệnh lý ở giai đoạn mới chớm bệnh cá giảm ăn, một số trường hợp cá biểu hiện đầy hơi, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết trên da và hậu môn Dấu hiệu bệnh lý đặc thù nhất là các nội quan gan thận tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng với đường kính từ 1-3mm, các cơ quan này sưng to và có biểu hiện nhũng ở thận Theo Từ Thanh

Dung và ctv.(2003) thì bệnh đốm trắng có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn phát

triển của cá tra nhưng nặng nhất là ở giai đoạn 300-500 g với những dấu hiệu tương tự Tuy nhiên, cần chú ý là ở giai đoạn đầu của bệnh những đốm trắng

chỉ xuất hiện trên thận hoặc tỳ tạng của cá (Từ Thanh Dung và ctv., 2005)

2.2 Vi khuẩn lactic ( LAB: Lactic acid bacteria)

2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram (+) (Fooks et al., 1999 Tr ch

dẫn bởi Shea Beasley, 2004) lên men hidrat cacbon khi có hoặc không có oxy

và tạo nên sản phẩm chính cuối cùng là axcid lactic (Jay, 2000) Hầu hết các loài đều hô hấp kỵ khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí (Endang, 2010) LAB là những

vi khuẩn hình cầu hoặc hình que thừơng được tìm thấy trong sự phân huỷ thực vật, các sản phẩm lactic, sản xuất lactic acid như là một phần của quá trình trao đổi chất của chúng và là sản phẩm của quá trình lên men Đặc tính này gắn bó với lịch sử của các thức ăn lên men, vì sự acid hoá còn là nhân tố kềm hảm sự phát triển của các nhân tố gây hư hỏng

Thảo, 1986) Chúng phát triển trên môi trường giàu dinh dưỡng, khuẩn lạc nhỏ, lên men kỵ kh và không hình thành bào tử, sản phẩm lên men chủ yếu là lactate (Marples, 1 6 ) Ngoài ra, LAB còn sản xuất các hợp chất hữu cơ cung cấp mùi thơm và hương vị cho các sản phẩm lên men (Caplice and Fitzgerald,

1999 Tr ch dẫn từ Shea Beasley, 2004)

2.2.2 Khái quát về phân loại

Vi khuẩn lactic được phân lập đầu tiên trong sữa (Carr et al., 2002; Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972) sản phẩm lên men như: thịt, các sản

phẩm sữa, rau quả, nước uống và bánh mì lên men (Aukrust and Blom, 1992;

Caplice and Fitzgerald, 1999; Harris et al., 1992; Gobbetti và Corsetti, 1997; Jay, 2000; Liu, 2003; Lonvaud-Funel, 2001; O’Sullivan et al., 2002) LAB

xuất hiện tự nhiên trong các thực phẩm lên men (Caplice and Fitzgerald, 1999)

và đã được xác định trong đất, nước, phân bón và chất thải (Holzapfel et al., 2001) Ngoài ra chúng còn tồn tại trong người (Boris et al., 1998; Carroll et

al., 1979; Eideman và Szilagyi, 1979; Elliott et al., 1991; Martín et al., 2003;

Ocaña et al., 1999; Reid, 2001; Schrezenmeir and de Vrese, 2001) và động vật (Fujisawa and Mitsuoka, 1996; Fuller and Brooker, 1974; Gilliland et al., 1975; Klijn et al., 1995; Sandine et al., 1972; Schrezenmeir and de Vrese,

2001) ( Tr ch dẫn từ Shea Beasley, 2004)

LAB chủ yếu thuộc các giống Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus, Lactococcus, và Streptococcus Ngoài ra còn có ở các giống Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weisella Chúng thuộc bộ Lactobacillales

Người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hình (sản phẩm lên men chỉ thuần axít lactic) và nhóm lên men lactic dị hình (sản phẩm lên men ngoài axít lactic còn có êtanol, CO2 hoặc axít axêtic)

LAB đồng hình bao gồm ba nhóm: cầu khuẩn (Streptococcus lactic, S.faecalis,

Pediococcus cerevisia), trực khuẩn ưa nhiệt (Lactobacillus lactic, L helvetcus,

L bulgaricus), trực khuẩn ưa ấm (Lactobacillus casei, L plantarum)

(Fugelsang and Edwards, 2007; Caplice and Fitzgerald, 1999; Jay, 2000;

Kuipers et al., 2000) Vi khuẩn lactic lên men dị hình (heterofermentaires): sử

dụng đường bằng con đường pentose phosphate tạo sản phẩm cuối cùng không chỉ acid lactic mà còn các sản phẩm khác như: CO2, ethanol, axit acetic,… Các

chi đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Leuconostoc,

Oenococcus, Weissella, và lactobacilli nhóm III (L brevis, L buchneri, L fermentum, L reuteri) (http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_bacteria)

2.2.3 Vi khuẩn lactic trong quá trình lên men

Theo Nguyễn Thành Đạt (2001), việc sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, quả, ủ chua thức ăn gia súc là hình thức bảo quản thực phẩm bằng công nghệ lên men vi sinh vật Các vi khuẩn lên men lactic chủ yếu thuộc các

giống: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus Khi muối rau

quả lên men lactic, sẽ tạo ra sản phẩm đạt yêu cầu sau: (1) Tạo được lượng sinh khối vi khuẩn có ích, át chế các vi sinh vật gây thối (2) Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm (3) Chuyển rau quả về dạng chín sinh học

do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng Quá trình chuyển hóa sinh học trong muối chua rau quả gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Muối ăn (NaCl) với nồng độ 2.5-3% sẽ làm cho môi trường ưu trương, đường và các chất từ tế bào rau quả một phần sẽ khuếch tán

ra môi trường, do đó vi khuẩn lactic và các loại vi sinh vật khác cũng phát triển

Giai đoạn 2: Do vi khuẩn lactic phát triển mạnh, nên pH môi trường giảm còn 3-3.5, làm ức chế các vi khuẩn khác, rau quả trở nên chua, ngon Tuy nhiên, nếu không đậy kín tạo môi trường kị khí cho vi khuẩn lactic phát triển hoặc cho muối quá 5 - 6% sẽ ức chế cả vi khuẩn lactic, nếu dưới 3% thì nhiều tạp khuẩn lấn át gây hư rau quả

Giai đoạn 3: Khi rau quả đã chua, pH giảm xuống 3, thì ngay cả vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, nấm mốc sẽ bắt đầu phát triển, phân giải axit lactic thành CO2 và H2O, sản phẩm bắt đầu có váng và môi trường giảm chua,

có mùi mốc, có nhiều bọt khí

Trong nước dưa chua ngon có khoảng 5 - 10mg acid lactic/ml và có khoảng 109 tế bào vi khuẩn, không có vi khuẩn gây bệnh, có kháng sinh Nisine, Diplococcine nên rất có ch cho tiêu hóa và điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong việc sản xuất sữa chua, nem chua Đặc biệt, sản phẩm axit lactic của quá trình lên men ngô, khoai, sắn, khoai tây được dùng rộng rãi trong công nghiệp nhuộm, thuộc da, trong y học, chế tạo chất dẻo, sơn,…là nhờ sự hiện diện của vi khuẩn

Lactobacillus delbruskii

Tuy nhiên, vi khuẩn lactic cũng có thể gây ra những tác dụng có hại cho sản xuất công nghiệp và đời sống, khi sự phát triển của chúng không theo

ý muốn của con người Như bia, rượu vang, nước ngọt bị nhiễm khuẩn lactic

sẽ gây hiện tượng vẩn đục, bị chua Trong quá trình lên men rượu đôi khi xảy

ra điều kiện bất lợi cho sự phát triển của nấm men, nhưng lại thuận lợi cho vi khuẩn lactic, do đó làm hỏng cả quá trình lên men rượu, cho rượu kém chất

lượng, vi khuẩn thường thấy ở đây là Lactobacillus manitopocrum

Theo Ringø et al (1998), vi khuẩn lactic thuộc các giống như:

Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, và Carnobacterium thuộc hệ vi

sinh vật bình thường trong ruột cá khỏe Và mật độ của vi khuẩn lactic liên quan đến đường tiêu hóa bị ảnh hưởng bởi yếu tố dinh dưỡng và môi trường như: chế độ ăn, axit béo không bão hòa, oxit chromic, stress và độ mặn Tuy nhiên, một số chủng của LAB cũng gây bệnh trên động vật thủy sản như: dịch bệnh Streptococcosis đã xảy ra trong hơn ba thập kỷ qua ở các trang trại Nhật Bản nuôi cá hồi vân (rainbow trout) (Hoshina, 1 56) và cá đuôi vàng

(yellowtail) (Kusuda et al., 1976) Các tác nhân gây bệnh, ban đầu được xác định là Streptococcus sp., sau đó đã được phân loại lại là Enterococcus (Kusuda, 1992), tiếp theo là Lactococcus garvieae (Domenech et al., 1993; Eldar et al., 1996) Ngày nay, sự xuất hiện bệnh trong nuôi trồng thủy sản

ngày càng tăng trên diện rộng có thể do các vi khuẩn khác nhau thuộc các

giống của vi khuẩn lactic như: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus và

Carnobacterium

2.2.4 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic

Trong quá trình trao đổi chất vi khuẩn lactic sinh các sản phẩm có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật có hại như: bacteriocin, hyđro peroxit, cacbon điôxit, diacetyl và axit lactic

(theo:http://www.lactospore.com/about/background-info/)

Theo Ngô Thị Phương Dung và ctv (2011), kết quả nghiên cứu những

năm gần đây cho thấy vi khuẩn lactic không chỉ có thể lên men rau quả mà còn có thể sinh các chất kháng khuẩn bacteriocin chống lại vi khuẩn gây bệnh được sử dụng trong bảo quản thực phẩm

Hầu hết vi khuẩn lactic đều có thể tổng hợp bacteriocin nên thành phần kháng khuẩn rất đa dạng như Lactacin, Niocin, Acidolin,….từ rất lâu các bacteriocin này đã được sử dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm điển hình là Nisin Năm 1 3 thương phẩm Nisaplin xuất hiện trên thị trường như một chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1 6 WHO đã công nhận sản phẩm này như là một chất bảo quản thực phẩm an toàn sinh học

(Ngô Thị Phương Dung và ctv., 2011) Cũng theo Ngô Thị Phương Dung và

ctv (2011) trong 46 dòng vi khuẩn phân lập từ sữa chua, dưa cải muối chua,

kim chi,…thì có tới 23 dòng có khả năng kháng khuẩn trong đó có tới 7 dòng

có khả năng kháng khuẩn mạnh với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 11mm, 11 chủng kháng khuẩn trung bình với dường kính vòng kháng khuân 5-10mm, 5 chủng kháng khuẩn yếu với đường k nh vòng tròn vô trùng bé hơn

5mm (với dòng vi khuẩn chỉ thị la B suptilis)

Theo Ouwehand et al (2004), trong vi khuẩn lactic có sẵn các hợp chất

có tính kháng khuẩn như reuterin, reutericylin, acid carboxylic và khi chúng sinh trưởng cũng tạo ra những thành phần có tính kháng khuẩn như acid lactic, bacteriocin, CO2, H2O2 và cả diacetyl

2-pyrrolydone-5-2.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic trên động vật thuỷ sản

Năm 1 60, De Man, Rogosa, và Sharpe đã nghiên cứu ra một loại môi trường nhân tạo để nghiên cứu LAB mang tên MRS theo tên của 3 tác giả này

Năm 1 4, Gatesoupe đã phân lập được vi khuẩn lactic từ luân trùng

Brachionus plicutilis, có đặc điểm gần giống với loài Lactobacillus plantarum

hoặc Carnobacteriurn sp hi giàu hoá chủng vi khuẩn này vào luân trùng làm thức ăn cho ấu trùng cá bơn (Scophthalmus maximus) ở nồng độ cao có thể hạn chế đáng kể tỷ lệ chết của cá khi tiếp xúc với mầm bệnh Vibrio ở ngày

thứ 9 Và nồng độ tối ưu của vi khuẩn lactic khi giàu hóa là 107 - 2 x 107CFU/ml/ngày, tỷ lệ sống của ấu trùng là 53% sau 72 giờ tiếp xúc với mầm bệnh so với đối chứng tỷ lệ sống chỉ 8% Điều này cho thấy vi khuẩn lactic đã làm tăng sức đề kháng của ấu trùng cá bơn chống lại mầm bệnh vibrio

Một số chủng vi khuẩn Lactobacillus sp cũng được phân lập từ ruột và

dạ dày của cá tra và cá rô phi có khả năng ức chế cả vi khuẩn E ictaluri và

Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra Tuy nhiên chỉ có một chủng Lb12

tạo ra bacteriocin có khả năng ức chế cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh trên Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy Lb12 đồng hình 100% với

Lactobacillus suntoryeus LH5 (Nguyễn Ngọc Trai, 2011) Nghiên cứu sâu hơn

về khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của chủng vi khuẩn lactic CC4K và

chủng vi khuẩn Bacillus sp HY1 được phân lập từ nước nuôi tôm và nước

dưa cải bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và phổ hồng ngoại cho thấy chất kháng khuẩn do chủng CC4K tiết ra là axit lactic, còn chủng HY1 có khả năng kháng vi sinh vật là do chất kháng sinh ngoại bào không có bản chất polypeptide Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy chủng CC4 tương

đồng 99,1% với Lactococcus lactis CC4K, chủng HY1 tương đồng 99% với

Bacillus subtilis HY1 (Đặng Phương Nga và ctv., 2007)

Ngoài ra, Talpur et al (2012) nghiên cứu và đã tìm ra một hỗn hợp vi khuẩn lactic bao gồm: Lactobacillus plantarum, L salivarius và L rhamnosus được phân lập từ ruột của Ghẹ xanh (Portunus pelagicus) đã được thêm vào môi trường nước ương ấu trùng Ghẹ xanh (Portunus pelagicus) hàng ngày với

số lượng 106, 5 x 106 và 107 cfu/ml Kết quả cho thấy tỷ lệ sống là 10,3%, 11,2% và 11,0% tương ứng theo số lượng vi khuẩn bổ sung vào môi trường nước, so với 2.2%, 3.3% và 2.8% ở đối chứng Hoạt động của các enzyme tiêu

hóa đặc biệt là protease và amylase được tăng cường và pH ổn định hơn so với đối chứng

Đặc biệt với vi khuẩn E ictaluri có một số nghiên cứu điển hình và

mang tính khả thi bằng việc ứng dụng khả năng kháng khuẩn của LAB để đưa

ra hướng ứng dụng đối kháng với vi khuẩn này Theo nghiên cứu của Nguyen

Thanh Tam et al (2011) từ 80 chủng LAB thu thập từ 100 mẫu cá lên men ở

bốn thành phố ở vùng Đồng bằng Sông Cửu Long thì hiệu quả kháng khuẩn

thể hiên ở tất cả các dòng LAB phân lập được với E ictaluri và 2 dòng vi khuẩn chỉ thị: B coagulans, P pentosaceus bằng phương pháp giếng khuếch tán Trong đó 3 dòng kháng với E ictaluri, 30 dòng kháng vơi B coagulans

và 20 dòng kháng P pentosaceus, Trong 39 dòng thể hiện khả năng kháng khuẩn E ictaluri thì 15 dòng kháng khuẩn với đường kính vòng vô trùng lớn

2,5-4mm, 15 dòng có đường kính vòng vô trùng trung bình 1,5-2,5mm, 9 dòng còn lại có đường kính vòng vô trùng thấp hơn 1,5mm (theo phương pháp giếng khuếch tán)

Hình 2.1 Khả năng kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn lactic

(Ghi chú:2 vòng tròn vô trùng với vi khuẩn chỉ thị P pentosaceus (A, 1A, 2A, dịch vi khuẩn chưa qua lọc; 4A, 5A, 6A-dịch vi khuẩn qua lọc), B coagulans (B) and E ictaluri (C); 1C vòng kháng khuẩn lớn; 2C-trung bình và 3C-nhỏ) của những dòng vi khuẩn lactic theo phương pháp giếng khuếch tán (Nguyen Thanh Tam et al, 2012).)

3A-2.4 Định danh vi khuẩn lactic bằng phương pháp sinh học phân tử

Vi khuẩn lactic có thể định danh bằng phương pháp truyền thống bằng việc kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa, tuy nhiên ở thời điểm hiện tại việc định

dang vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ cho kết quả chính xác,

và nhanh chóng hơn nhiều Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S-ARN) Xác định trình tự rARN 16S của các chủng vi

khuẩn theo phương pháp của Sakiyama et al (2009) Đoạn gen 16S rRNA

gồm khoảng 1542 nucleotid, 16S ribosomal RNA (16S rRNA) là bộ phận cấu thành bán đơn vị 30S của ribosomes ở prokaryote Đoạn gen 16S rRNA được

sử dụng cho nghiên cứu về nguồn gốc phát sinh loài bởi vì nó có tính bảo toàn cao giữa các loài khác nhau của vi khuẩn và archaea Việc phân tích trình tự của đoạn gen 16S rRNA được thực hiện bằng việc giải trình tự đoạn gen này

và dùng một số cặp mồi được gọi là “universal primers” để thực hiện phản ứng PCR Mục tiêu cùa các primer này là những vùng bảo toàn trong đoạn gen 16S rRNA và khuếch đại chúng thành nhiều phần khác nhau Cuối cùng những phần được khuếch đại này có thế được nối với nhau để có toàn bộ trình tự amino acid của đoạn gen 16S rRNA “universal primers” phổ biến nhất được thiết kế bởi Weisburg et al và được sử dụng hiện nay đó là cặp primer 27F và 1492R Tuy nhiên, việc phát triển một số primer để tạo sản phầm PCR với chiều dài gen ngắn hơn phục vụ cho những mục đ ch khác nhau đã được nghiên cứu (http://cn.wikipcdia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA)

Dubernet et al (2002) đã phân t ch sự tương đồng của các trình tự

nucleotid thuộc vùng giữa hai đoạn gen 16S rRNA và 23S rRNA của nhiều

dòng Lactobacillus và thiết kế nên primer LbLMAl-rev (5 -CTC AAA ACT

AAA CAA AGT TTC-3) Nhờ vào primer chuyên biệt này cùng với

“universal primer” RI6-] (5-CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA-3 ) thông

qua phản ứng PCR giúp định danh Lactobacillus ở mức độ giống Cặp primer

này được nhiều tác giả sử dụng thành công đế định danh nhiều loài thuộc

giống Lactobacillus như: Wiss et al., (2005), Klayraung et al., (2008); trích

dẫn bởi: Nguyễn Ngọc Trai và Nguyễn Văn Thành (2011)

Phòng thí nghiệm NK-Biotck và đơn vị R&D của công ty Nam hoa đã phát hiện được cặp mồi và sau đó đặt tên là 16s-F và NK16s-R, cặp mồi này khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự phân biệt giống và loài các vi khuẩn, công ty đã xây dựng thành công qui trình PCR cho gen 16S rDNA và qui trình giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR này để định danh vi khuẩn

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Thời gian, địa điểm

Thời gian thực hiện từ tháng 9/12/2013 đến 12/12/2013 Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Bộ môn Bệnh học Thuỷ sản, Khoa Thuỷ sản, Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu thí nghiệm

Dụng cụ: Ống nghiệm 10ml, 15ml, đĩa petri, chai nút xanh chịu nhiệt,

que cấy, đèn cồn, đầu col, pipet 10-100µl, pipet 100-1000µl,

Thi t bị: Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, máy ly tâm, nồi hấp tiệt trùng,

Hóa chất, môi trường: Môi trường sử dụng trong thí nghiệm gồm có:

môi trường chọn lọc vi khuẩn MRS Agar (De Man, Rogosa, Sharpe) và môi trường nuôi tăng sinh vi khuẩn MRS Broth Môi trường nuôi tăng sinh vi khuẩn Nutrient Broth (NB) hoặc BHIB (Brain-Heart Infusion Broth) Môi trường BHIA (Brain-Heart Infusion Agar) Hóa chất nhuộm Gram, test oxidase, catalase, CaCO3. Cồn tuyệt đối, cồn đốt, NaCl, parafin lỏng, parafin giấy

Vật liệu: Cá rô phi, dưa cải muối chua được thu mua theo phương

pháp thu mẫu Nguồn vi khuẩn E ictaluri được cung cấp từ Bệnh học Thủy

sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá rô phi và dưa cải muối chua

Phương pháp thu mẫu: Sản phẩm lên men (dưa cải muối chua) và cá

rô phi được thu ở các địa bàn Thành phố Cần Thơ Thu 2 mẫu cho mỗi loại sản phẩm tại mỗi địa điểm (3 địa điểm) Thu tất cả 12 mẫu

Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic từ dưa cải chua và ruột cá

rô phi (được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu của Ngô thị Phương Dung

và ctv., 2011; Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2011)

Cá sau khi đem về phòng thí nghiệm được tiệt trùng bên ngoài bằng cồn 700, sau đó phẩu thuật lấy phần vật chất bên trong dạ dày và một đoạn ruột sau của cá Nghiền mẫu ruột trong nước cất tiệt trùng Để lắng dung dịch vừa nghiền, thu phần dịch trong ở bên trên Lấy phần dịch trong cho vào môi