khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN TRƯỜNG PHÁT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN TRƯỜNG PHÁT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. TỪ THANH DUNG 2013 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: Cố vấn học tập cô Từ Thanh Dung người hướng dẫn tận tình để làm đề tài này. Quí Thầy, Cô cán Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn dẫn nhiệt tình chị Dương Thị Kim Loan lớp cao học K18. Cảm ơn anh Nguyễn bảo Trung, bạn Trần Thanh Sang, Đặng Phạm Hòa Hiệp tập thể lớp bệnh học thủy sản giúp đỡ tôi, bên tôi gặp khó khăn. Cần Thơ, ngày ., tháng ., năm 2013 Sinh viên thực Nguyễn Trường Phát ii TÓM TẮT Đề tài khảo sát khả vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra, nhằm tìm số chủng vi khuẩn lactic có khả đối kháng vi khuẩn E. ictaluri. Nguồn vật liệu để phân lập vi khuẩn lactic thí nghiệm dưa cải muối chua ruột cá rô phi thu mua chợ địa bàn Thành phố Cần Thơ, vi khuẩn lactic phân lập môi trường MRS agar MRS broth. Các dòng vi khuẩn chọn lọc dựa khả phân giải CaCO3 thêm vào môi trường MRS agar có tiêu sinh hóa như: Gram (+), catalase, oxidase âm tính chọn phân lập. Kết 34 chủng vi khuẩn lactic phân lập khảo sát tính kháng với vi khuẩn E. ictaluri phương pháp giếng khuếch tán. Bằng phương pháp dòng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn có khả đối kháng vơi vi khuẩn E. ictaluri tìm thấy, hai chủng vi khuẩn RP11.1 RP8.1 sinh vòng kháng khuẩn với đường kính lớn 12 10,3 mm. Hai chủng lựa chọn để định danh phương pháp sinh học phân tử, giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal ARN. Việc định danh thưc công ty TNHH TM DV Nam Khoa, cho kết chủng RP11.1 đồng hình 100% chủng RP8.1 đồng hình 99% với vi khuẩn Lactobacillus plantarum. iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT . iii DANH SÁCH BẢNG . vi DANH SÁCH HÌNH . vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . viii CHƯƠNG . ĐẶT VẤN ĐỀ . 1.1 Giới thiệu . 1.2 Mục tiêu đề tài . 1.3 Nội dung đề tài . CHƯƠNG . TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra . 2.1.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Edwardsiella ictaluri . 2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý phổ loài cảm nhiễm . 2.2 Vi khuẩn lactic (LAB: Lactic acid bacteria) 2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 2.2.2 Khái quát phân loại . 2.2.3 Vi khuẩn lactic trình lên men . 2.2.4 Khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic . 2.3 Một số nghiên cứu vi khuẩn lactic động vật thuỷ sản . 2.4 Định danh vi khuẩn lactic phương pháp sinh học phân tử CHƯƠNG . 11 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 11 3.1 Thời gian, địa điểm 11 3.2 Vật liệu thí nghiệm 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu . 11 3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá rô phi dưa cải muối chua 11 3.3.2 Th nghiệm đánh giá khả kháng khuẩn E. ictaluri dòng vi khuẩn lactic 12 3.3.3 Định danh vi khuẩn 13 iv CHƯƠNG . 14 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 14 4.1 Kết trình phân lập vi khuẩn lactic 14 4.2 Kết khảo sát khả đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phương pháp giếng khuếch tán (Well diffusion agar) 16 4.3 Kết định danh phương pháp giải trình tự gen 21 CHƯƠNG . 22 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 23 PHỤ LỤC A . 26 PHỤ LỤC B . 27 PHỤ LỤC C . 28 PHỤ LỤC D . 31 PHỤ LỤC E . 32 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 4.1 Kết kiểm tra tiêu sinh hóa vi khuẩn lactic phân lập . 14 Bảng 4. Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn nghiệm thức . 16 Bảng 4. Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn nghiệm thức . 19 Bảng 7.1 Thành phần môi trường MRS. . 26 Bảng 7.2 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá rô phi 28 Bảng 7.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dưa cải muối chua 29 Bảng 7.4 Kết đo đường kính vòng tròn vô trùng mẫu đối chứng . 30 vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Khả kháng khuẩn số chủng vi khuẩn lactic . Hình 4.1 Quá trình phân lập tách ròng vi khuẩn lactic: A, B: Phân lập vi khuẩn lactic . C, D: Đĩa vi khuẩn thuần. . 14 Hình 4.2 Khả phân giải CaCO3 vi khuẩn lactic (A), mẫu nhuộm Gram tiêu biểu (B) 15 Hình 4.3 Kết phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức . 18 Hình 4.4 Kết phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức 20 Hình 4.5 Các mẫu đối chứng . 20 Hình 7.1 Một số ảnh kết phương pháp giếng khuếch tán . 32 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic Acid Bacteria RP Rô phi DC Dưa cải E. ictaluri Edwardsiella ictaluri AMC Amoxicillin-clavulanic acid BHI-B (A) Brain heart infusion borth (agar) CFU Colony forming unit CT Colistin sulphate CT Cần Thơ CTX Cefotaxime ĐBSCL Đồng sông Cửu Long DO Doxycycline FFC Florfenicol NV Novobiocin TSA Tryptone Soya Agar UB Flumequine viii CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthamus) mặt hàng thuỷ xuất chủ lực Việt Nam. Tổng giá trị xuất cá tra năm 2012 đạt 1,74 tỷ USD (www.vasep.com.vn). Để đảm bảo cung cấp nguồn nguyên liệu đủ ổn định đòi hỏi phải ngày thâm canh hóa để nâng cao sản lượng, vấn đề dịch bệnh xảy thường xuyên gây thiệt hại nhiều hơn, phổ biến bệnh như: gan thận mủ, trắng gan trắng mang, phù đầu, xuất huyết…(Dung et al., 2004). Trong số bệnh cá Tra nuôi Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) phổ biến gây thiệt hại nhiều bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bệnh xuất huyết vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây (Nguyễn Chính, 2005). Tỉ lệ xuất bệnh gan thận mủ cá tra khoảng (61%) không cao nhiều so với bệnh khác bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (68,3%), bệnh phù đầu (51,2%) (Trần Anh Dũng, 2005) .Nhưng tỷ lệ chết cao (60 - 80%) (Crumlish et al., 2002). Tỷ lệ hao hụt cao giai đoạn cá giống gây thiệt hại nặng giai đoạn cá lứa cở 300-500g (Từ Thanh Dung ctv., 2005). Do yêu cầu thực tiễn sản xuất người nuôi phải tăng cường thâm canh hoá đồng thời sử dụng nhiều thuốc kháng sinh. Tuy nhiên, việc chọn sử dụng kháng sinh không cách làm cho độ nhạy vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas sp. loại thuốc kháng sinh ngày giảm nguy không thuốc điều trị đến gần (Nguyễn Đức Hiền, 2008. Trích đẫn Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai, 2012). Theo nghiên cứu Nguyễn Thiện Nam ctv. (2010), nghiên cứu tìm thấy 97,5% chủng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri có tượng đa kháng thuốc (từ ba loại kháng sinh trở lên). Đặc biệt, số chủng kháng từ 6-10 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ cao 25% số chủng kháng với loại thuốc kháng sinh, 20% số chủng kháng loại thuốc kháng sinh 10% số chủng kháng 10 loại thuốc kháng sinh. Chính từ nguyên nhân mà việc tìm giải pháp hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh có để bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh dự phòng nhiệm vụ vô cấp bách cần thiết nhà khoa học thuỷ sản. Hiện việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học đặc biệt probiotics, bacteriocin để phòng trị bệnh cho động vật thuỷ sản nhiều nhà khoa học nghiên cứu (Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai, 2012). Từ lâu vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn hữu ch người áp dụng số đặc t nh khả lên men, chống hư hỏng cho thực Bảng 4. Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn nghiệm thức Stt Tên chủng Đường kính vòng tròn vô khuẩn (mm) Lần Lần Lần Trung bình (mm) Mức độ kháng khuẩn RP15 10 ++ RP14 5.3 ++ RP313 0. Không kháng RP8.1 10 11 10 10,3 +++ RP11.1 12 12 12 12 +++ DC64 3.3 + DC61 2. + *Mức độ xuất vòng vô khuẩn: (+): đường kính 10mm. Kết nghiệm thức cho thấy có chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn với vi khuẩn E. ictaluri có (4 chủng phân lập từ ruột cá rô phi, chủng phân lập từ dưa cải) chủng thể tính kháng với vi khuẩn (đường kính vòng kháng khuẩn lớn 1mm). Trong đó: chủng kháng mức độ yếu (+), chủng kháng mức độ trung bình (++) chủng kháng mức độ mạnh (+++ ) theo qui ước Dung et al. (2011). 17 A A b b a a C C c c Hình 4.3 Kết phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức 1:A: a: RP11.1(A); b: RP8.1; C: c: RP15. Nghiệm thức thứ hai Tiến hành ly tâm dung dịch nuôi vi khuẩn sau ngày nuôi 8000 vòng/phút 15 phút nhiệt độ 40C, thu 100µl phần dịch bên cho vào giếng thạch (được tạo đầu col tiệt trùng có đường k nh mm ) để thực phương pháp giếng khuếch tán. 18 Bảng 4.3 Các chủng vi khuẩn lactic sinh vòng kháng khuẩn nghiệm thức Stt Tên chủng Mức độ Đường kính vòng vô khuẩn kháng Trung bình (mm) khuẩn (mm) Lần Lần Lần RP15 2.7 + RP222 + RP312 0.3 Không kháng RP32 3.3 + DCC222 + DC61 + Ghi chú:Mức độ xuất vòng vô khuẩn: (+): đường kính 10mm. Theo qui ước Dung et al., 2011 có số chủng vi khuẩn lactic sinh vòng vô trùng nghiệm thức có t nh đối kháng với vi khuẩn E. ictaluri tất chủng thể t nh đối kháng mức độ yếu (+). Ngay chủng thể tính kháng (++) nghiệm thức có xu hướng thu hẹp đương k nh vòng kháng khuẩn sang nghiệm thức 2. Nghiệm thức cho kết tốt với số lượng chủng vi khuẩn lactic tạo vòng vô trùng nhiều tạo vòng vô trung lớn so với nghiệm thức 2. 19 A B Hình 4.4 Kết phương pháp giếng khuếch tán nghiệm thức A: chủng DC222; B: chủng RP32. Khi so sánh với mẫu đối chứng đĩa kháng sinh đồ với loại kháng sinh Flumequine, Amoxicillin-clavulanic acid, Novobiocin, Florfenicol chủng RP11.1, RP8.1, RP15 có đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhỏ đường kính vòng vô khuẩn đối chứng dương (ĐC (+)) AMC (xem Hình 4.7 Phụ luc C). ĐC(+) FFC ĐC(+) FFC ĐC (+) NV ĐC (-) ĐC (-) ĐC (+) CIP ĐC(+) AMC ĐC (-) ĐC (+) UB ĐC (+) AMC Hình 4.5 Kết phương pháp giếng khuếch tán mẫu đối chứng Chú thích: ĐC (-/+): viết tắt mẫu đối chứng (âm/ dương); FFC: Florfenicol; NV: Novobiocin; CIP: Ciprofloxacin; AMC: Amoxycillin clavulanic acid; UB: Flumequine. 20 4.3 K t định danh phương pháp giải trình tự gen 16S-ribosomal ARN Qua kết khảo sát khả kháng E. ictaluri chủng vi khuẩn lactic phân lập, hai chủng vi khuẩn có đường kính vòng vô trùng lớn RP11.1 RP8.1 chọn giải trình tự gen để định danh vi khuẩn Phòng xét nghiệm NK-BIOTEK công ty TNHH TM & DV Nam Khoa. Kết định danh: hai chủng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus plantarum với độ tương đồng chủng RP11.1 100%, RP8.1 99%. Hai chủng vi khuẩn RP11.1 RP8.1 hai chủng vi khuẩn phân lập định danh với đề tài luận văn cao học chị Dương Thị Kim Loan lớp cao học K18. 21 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 K t luận Vi khuẩn lactic tồn nhiều dưa cải muối chua ống tiêu hóa cá rô phi. Hơn nữa, có nhiều chủng có khả thể tính kháng với vi khuẩn E. ictaluri, khả khác tùy chủng. Qua kết định danh vi khuẩn kết luận loài Lactobacillus plantarum có khả kháng cao với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Thời gian nuôi vi khuẩn tối ưu để thực phương pháp giếng khuyếch tán tốt khác tùy theo chủng vi khuẩn lactic, theo kết mà nghiệm thức đưa sau thời gian nuôi ngày hầu hết chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dưa cải ruột cá rô phi cho vòng tròn vô trùng với đường kính lớn so với thời gian nuôi vi khuẩn ngày. 5.2 Đề xuất Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn RP11.1 RP8.1 thuộc loài Lactobacillus plantarum lớn có tiềm cao để sản xuất sản phẩm probiotics. Do vậy, cần có nghiên cứu thêm đặc tính kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri chủng vi khuẩn nói riêng vi khuẩn lactic nói chung vào việc phòng trị bệnh gan thận mủ cá tra. 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Crumlish, M., T.T. Dung, J. F. Turnbull, N.T.N. Ngoc and H.W. Ferguson, 2002. Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases. 25: 733–736. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Nguyễn Bá Tú Lại Thúy Hiền, 2007. Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio nước nuôi tôm sú Bacillus subtilis HY1 Lactococcus lactis CC4K. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 5: 383-390. De Man, J.C., M. Rogosa and M.E. Sharpe, 1960. A medium for the cultivation of Lactobacilli. Journal Applied Bacteriol. 23: 130-135. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản, Đại học thủy sản Nha Trang, 345 trang. Endang S. Rahayu, 2010. Biotechnology of Lactic Acid Bacteria and Their Role in Food Industry. International Seminar Biotechnology for Enhancement the Tropical Biodiversity. October 18-20, 2010. Bandung Indonesia. Ferguson, H.K., J.F. Turbull, A. Shinn, K. Thompson, T.T. Dung and M. Crumlish, 2001. Bacillary necrosis in farmed the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases. 24: 509-513. Fugelsang, K.C. and C.G. Edwards, 2007. Wine Microbiology. Practical Applications and Procedures. Second editor. 393p. ISBN: 978-0-38733341-0. G.Nicolasfrerichs and Stuart D. Millar, 1993. Manual for the isolation and identification of fish bacterial pathogens. Institute of Aquaculture. University of Stirling, Scotland. Pages 46-50. http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_bacteria (truy cập ngày 9/08/2013). http://nguyenanhvn.com/san-pham/moi-truong-vi-sinh-mrs-agar-de-man,rogosa,-sharpe--1953.html. Truy cập ngày 17/8/2013. http://old.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-va-cong-nghe/nhuom-gram-phuongphap-hucker-cai-tien.html. Truy cập ngày 17/8/2013 http://www.lactospore.com/about/background-info/ (truy cập ngày 9/08/2013). Majamaa, H., E. Isolauri. 1997. Probiotics: A novel approach in the management of food allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 179-185. Marples, M.J, 1969. Life on the human skin. Scientific American. 220: 108115. Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly Huỳnh Xuân Phong, 2011. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn. Tạp chí Khoa học, số 19a: 176-184. Nguyễn Lân Dũng Đinh Thúy Hằng, 2006. Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên loài vi khuẩn. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghi em-dinhtenvk.htm. Truy cập ngày 21/07/2013. 23 Nguyễn Ngọc Trai, 2011. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sp. có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Công nghệ Sinh học. Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. Nguyễn Thành Đạt Nguyễn Duy Thảo, 1986. Vi sinh học. NXB Giáo dục. TP.HCM. Nguyễn Thành Đạt, 2001. Cơ sở sinh học vi sinh sinh vật- tập II. NXB Giáo dục. Hà Nội. Nguyen Thanh Tam1, Dang Thi Thu Thao1,Sunee Nitisinprasert2,Kenji Sonomoto3 and Nguyen Van Ba1 (2011). Inhibition of Edwardsiella ictaluri by Lactic acid bacteria. In The 4th International Conference on Fermentation Technology for Value Added Agricutural Products. Faculty of Applied Biology, Tay Do University, Can Tho City, Viet Nam. Nguyễn Thiện Nam, Phạm Thanh Hương, Trần Duy Phương Từ Thanh Dung, 2010. Nghiên cứu đa kháng thuốc ci khuẩn Edwardsilla ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Tạp chí khoa học 2010. Đại học Cần Thơ. 2000-2010. Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai, 2012. Phân lập tuyển chon vi khuẩn Lactobacillus sp. có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra. Tạp chí khoa học 2012 :23a: 224-234. Trường Đại học Cần thơ. Plumb, J.A. and C. Shoemaker, 1995. Effects of temperature and salt concentration on latent Edwardsiella ictaluri infections in channel catfish. Disease Of Aquatic Organisms. 21: 171-175. Ringø E., Gatesoupe F. J, 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture. 160: 177–203. Shea Beasley, 2004. Isolation, identification and exploitation of lactic acid bacteria from human and animal microbiota. Academic Dissertation in Microbiology. University of Helsinki. Helsinki Finland. Shotts, E.B. and W.D. Waltman, 1990. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. Journal of Wildlife Diseases. 26: 214-218. Tài liệu thực tập giáo trình bệnh học thuỷ sản, 2012. Trường Đại học Cần Thơ. Khoa Thuỷ sản. Bộ môn Bệnh học thuỷ sản. Talpur A. D., A. J. Memon, M. I .Khan, M. Ikhwanuddin, M. M. Danish, Daniel and A.B Abol-Munafi, 2012. Inhibition of pathogens by lactic acid bacteria and application as water additive multi isolates in early stages larviculture of P. pelagicus (Linnaeus, 1758). The Journal of Animal & Plant Sciences. 22: 54-64. Trịnh Hùng Cường, 2011. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sp. tôm sú công nghiệp có khả kháng vi khuẩn gây bệnh Vibrio sp Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Công nghệ sinh học. Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2003. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142 trang. 24 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thi Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình Bệnh học Thủy sản. Tủ sách Đại học Cần Thơ, hoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Trang 161. Vijayabaskar, P. and S.T. Somasundaran, 2008. Isolation of bacteriocin producing lactic acid bacteria from fish gut and probiotic activity against common fresh water fich pathogen Aeromonas hydrophila. Biotechnology. 7: 124-128. 25 PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MRS AGAR (theo DeMan, Rogosa & Sharpe, 1960) Bảng 7.1 Thành phần môi trương MRS agar Stt Thành phần Tỷ lệ khối lượng thể tích) Peptone 1,0 % Meat extract 0,8 % Yeast extract 0,4 % Glucose 2,0 % Sodium acetate trihydrate 0,5 % Polysorbate 80 (Tween 80) 0,1 % Dipotassium hydrogen phosphate 0,2 % Triammonium citrate 0,2 % Magnesium sulfate heptahydrate 0,02 % 10 Manganese sulfate tetrahydrate 0,005 % 11 Agar 1,0 % Điều chỉnh pH 6,2 25°C 26 PHỤ LỤC B CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU HÌNH THÁI, SINH LÝ, SINH HÓA CỦA VI KHUẨN Phụ lục B1: Phương pháp nhưộm gram Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy t vi khuẩn từ thạch (sau cấy 24 giờ) hoà vào giọt nước cất phiến k nh, làm khô không kh . Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn 2-3 lần. Nhuộm dung dịch T m kết tinh (Crystal violet) phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại dung dịch Iod phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến vừa thấy màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung dung dịch Safranin 2-3 phút, rửa nước, để khô không kh . Soi k nh: dùng vật k nh dầu 100X. Vi khuẩn Gram (+) xác định mẫu nhuộm có màu xanh t m, Gram (-) mẫu nhộm bắt màu hồng đỏ (http://old.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-va-congnghe/nhuom-gram-phuong-phap-hucker-cai-tien.html). Phụ lục B1: Phương pháp thử catalase (catalase test): Dùng que thuỷ tinh lấy mẫu vi khuẩn cần kiểm tra chuyển tới lame nhỏ sẵn giọt 3% hydrogen peroxide. Phản ứng dương t nh tượng sủi bọt xuất vòng phút (G.Nicolasfrerichs and Stuart D. Millar 1993). Phụ lục B3: Phương pháp thử oxidase (oxidase test): Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn phết lên giấy tẩm cytochrom oxidase. Quan sát mẫu 30 giây. Vi khuẩn cho phản ứng oxidase (+) làm giấy tẩm cytochrom oxidase chuyển màu t m đậm (so màu theo hướng dẫn nhà sản xuất). Ngược lại. Phụ lục B4: Phương pháp kiểm tra tính di động: Cho vaseline lên góc lamelle đặt ngửa lamelle bàn, dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn cho lên lamelle có giọt nước muối sinh l . Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lí chứa vi khuẩn. Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle. Đặt lame lên kính hiển vi quan sát vật kính 40x kiểm tra t nh di động vi khuẩn. 27 PHỤ LỤC C KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng 7.2 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá rô phi Ký hiệu Khả di động Kích thước, Dạng, màu khuẩn lạc Hình dạng t bào RP11 + 0.2 mm , tròn lồi, trắng đục Hình cầu, chuỗi ngắn RP112 + 0,2 mm, tròn lồi, trắng đục Hình cầu RP113 + 0,2 mm, tròn lồi, trắng đục Hình cầu RP121 - 0,8 mm, tròn lồi, trắng đục sữa Hình cầu RP124 + 0,5mm, tròn, trắng đục Hình cầu RP14 + mm, tròn phẳng, trắng đục sữa Hình cầu RP15 - 0.2 mm, tròn, trắng đục Hình cầu RP161 - 1mm, tròn phẳng, trắng đục sữa Hình cầu, chuỗi ngắn RP211 + Li ti, tròn, trắng đục Cầu kết đôi, chuỗi ngắn 10 RP213 - 0,5 mm, tròn phẳng, trắng đục Cầu kết đôi, chuỗi ngắn 11 RP222 - mm, tròn, trắng đục Cầu 12 RP311 + mm, tròn lồi, trắng đục Cầu kết đôi, chuỗi ngắn 13 RP313 - mm, tròn lồi, trắng đục Que ngắn 14 RP314 + mm, tròn lồi trắng đục sữa Cầu kết đôi, chuỗi ngắn 15 RP32 - mm, tròn lồi, trắng đục sữa Hình cầu, chuỗi ngắn 16 RP321 - 1,5 mm tròn lồi, trắng đục sữa Que ngắn 17 RP44 + 0,5 mm, tròn lồi, trắng đục sữa Que ngắn 19 RP8.1* mm, tròn lồi, vàng nhạt Que ngắn 20 RP11.1* 2,5 mm, tròn lồi, vàng nhạt Que ngắn STT Chú thích: (*) chủng vi khuẩn phân lập với đề tài luận văn cao học K18 Nguyễn Thị Kim Loan, định danh phương pháp giải trình tự gen 16S-rARN; RP: ký hiệu chủng vi khuẩn 28 lactic phâ lập từ ruột cá rô phi.; DC: ký hiệu chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mẫu dưa cải muối chua. Bảng 7.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dưa cải muối chua. Khả di động Kích thước ,Dạng, Màu STT Ký hiệu DC12 + 0.2mm, tròn lồi, trắng đục sữa Cầu, cầu đôi DC222 - 0.5mm, tròn phẳng, trắng đục Cầu ,tứ cầu DC23 - 2mm, bìa chia thùy, trắng đục, nhầy Que ngắn DC24 + 1,5mm , tròn lồi, trắng đục sữa Que ngắn DC25 + 0,5mm, tròn phẳng, trắng đục sữa Que ngắn DC313 + 0,8mm, tròn lồi, trắng đục sữa Que ngắn DC41 - 3,5mm, tròn phẳng, trắng đục sữa Que ngắn DC42 - 2mm, tròn lồi, trắng đục sữa Que ngắn DC53 + 0,5mm, tròn phẳng, trắng đục sữa, nhầy Que dài 10 DC54 + 1,5mm, tròn phẳng, trắng đục Que dài 11 DC61 - 1,5mm, tròn lồi, trắng đục sữa Que ngắn 12 DC621 - 1mm, tròn phẳng, trắng đục Cầu 13 DC622 - 0,3mm, tròn, trắng đục Cầu, tứ cầu 14 DC64 - 2mm, tròn lồi, trắng đục sữa Que ngắn khuẩn lạc 29 Hình dạng t bào Bảng 7.4 Kết đo đường kính vòng tròn vô trùng mẫu đối chứng. Đối chứng Lần lặp lại Trung bình Mức độ kháng Lần Lần Lần ĐC(+) AMC 40 40 40 40 +++ ĐC(+) FFC + ĐC (+) NV - ĐC (+) UB - ĐC(+) CIP - ĐC (-) - 30 PHỤ LỤC D ĐỊNH DANH VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S-rARN Qua kết xác định khả ức chế từ dòng phân lập vi khuẩn E ictaluri. Sau chọn lọc dòng đặc trưng hình thái, đặc điểm tế bào. Việc định danh thực công ty TNHH TM DV Nam Khoa. Theo Phạm Hùng Vân (2009); trích dẫn Nguyễn Ngọc Trai (2011) qui trình giải trình tự công ty Nam Khoa thực tóm tắt sau: - Vi khuẩn mọc hộp thạch lấy cho vào nước muối sinh lý vô trùng để đạt độ đục 0,5 – McF. Sau đun cách thủy sôi 10 phút. Để nguội ly tâm 13000rpm phút. Lấy 5ul dịch cho vào PCR mix 45ul chứa sẵn thành phần kể cặp mồi NK16s-F NK 16s-R. - Chạy chương trình PCR gồm : + chu kỳ 94oC – phút để kích hoạt Taq polymerase + 40 chu kì ới chu kì gồ giai đoạn : 96o C – 15 giây, 600C – 30 giây, 720C – phút. + Sản phẩm PCR sau tinh Wizard SV Gel and PCR clean – up System Promega. + Sản phẩm tinh điện di thạch định lượng quang phổ GenQuant Pharmacia, sau đưa vào phản ứng giải trình tự chiều sử dụng mồi xuôi mồi ngược PCR thực thuốc thử DTCS cycle sequencing kit Backman Coulter. Chương trình luân nhiệt phản ứng giải trình tự với thuốc thử 30 chu kì, chu kì gồm giai đoạn: 960C – 20 giây, 500C – 20 giây, 600C – phút. + Sản phẩm phản ứng giải trình tự tủa ethanol, sau chạy điện di giải trình tự bặng máy giải trình tự CEQ8000 ABI3130XL 16 capillary. Kết giải trình tự so chuỗi chương trình blast search ngân hàng liệu gen BCBI. Từ kết so với chuỗi, có kết định danh vi khuẩn. 31 PHỤ LỤC E: NHỮNG HÌNH ẢNH CÓ LIÊN QUAN TỚI ĐỀ TÀI A B C D Hình 7.1 Một số ảnh kết phương pháp giếng khuếch tán số chủng vi khuẩn lactic có sinh vòng kháng khuẩn. A, B: chủng vi khuẩn RP15 nghiệm thức 1; C: Chủng vi khuẩn RP222 nghiệm thức 2; D: chủng vi khuẩn RP15 nghiệm thức 2. 32 [...]... ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus)” được thực hiện mong muốn sẽ đem lại một số đóng góp hữu ích nữa cho vi c phòng trị bệnh gan thận mủ 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài này nhằm khảo sát và tìm hiểu khả năng vi khuẩn lactic đối kháng với vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Đồng thời đóng góp t ch cực bổ sung cho những nghiên cứu trước đây về vi c... nhóm vi khuẩn hữu ích này vào trong lĩnh vực thuỷ sản để phòng trị bệnh điển hình là vi c nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men đối kháng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên các tra nuôi của Ngô Thị Phương Dung và ctv (2011); Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai (2012) Do vậy đề tài Khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri. .. bằng phương pháp giếng khuếch tán Định danh 2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri cao nhất 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra 2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Edwardsiella ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn Gram âm, hình que và có k ch thước biến đổi... khuẩn lactic đã làm tăng sức đề kháng của ấu trùng cá bơn chống lại mầm bệnh vibrio Một số chủng vi khuẩn Lactobacillus sp cũng được phân lập từ ruột và dạ dày của cá tra và cá rô phi có khả năng ức chế cả vi khuẩn E ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra Tuy nhiên chỉ có một chủng Lb12 tạo ra bacteriocin có khả năng ức chế cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh trên Kết quả giải trình tự đoạn... bệnh xuất hiện chủ yếu trên cá tra, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa Xuất hiện trên tất cả các giai đoạn của cá tra (Từ Thanh Dung và ctv., 2005) Tuy nhiên, khả năng gây hại của Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường nước, ở 18°C gây chết 10% nhưng ở 25°C tỷ lệ tử vong lên đến 77% Trên cá nheo Mỹ, Edwardsiella ictaluri gây ra các dấu hiệu bệnh lý như bên ngoài có... kháng khuẩn E ictaluri của các dòng vi khuẩn lactic Tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar) Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn chỉ thị : Vi khuẩn E ictaluri đã được định danh và trữ trong tủ âm (-80oC) được phục hồi trên môi trường TSA ở 28oC Sau 48 giờ, quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra độ thuần vi khuẩn Sau... 1996) Ngày nay, sự xuất hiện bệnh trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng trên diện rộng có thể do các vi khuẩn khác nhau thuộc các giống của vi khuẩn lactic như: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus và Carnobacterium 2.2.4 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic Trong quá trình trao đổi chất vi khuẩn lactic sinh các sản phẩm có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật có hại như: bacteriocin,... được có thể bao gồm những dòng vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus sp và còn có thêm những dòng vi khuẩn khác giống Lactobacillus sp 4.2 K t quả khảo sát khả năng đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp gi ng khu ch tán (Well diffusion agar) Qua phương pháp này, kết quả có 9 chủng vi khuẩn lactic tạo vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị Edwardsiella ictaluri (xem Bảng 4.1 và 4.2)... XUẤT 5.1 K t luận Vi khuẩn lactic tồn tại rất nhiều trong dưa cải muối chua và cả trong ống tiêu hóa của cá rô phi Hơn thế nữa, có nhiều chủng có khả năng thể hiện tính kháng với vi khuẩn E ictaluri, và khả năng này khác nhau tùy chủng Qua kết quả định danh vi khuẩn có thể kết luận loài Lactobacillus plantarum có khả năng kháng cao với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Thời gian nuôi vi khuẩn tối ưu để... tiềm năng rất cao để sản xuất các sản phẩm probiotics Do vậy, cần có nghiên cứu thêm đặc tính kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của 2 chủng vi khuẩn này nói riêng và của vi khuẩn lactic nói chung vào vi c phòng trị bệnh gan thận mủ trên cá tra 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Crumlish, M., T.T Dung, J F Turnbull, N.T.N Ngoc and H.W Ferguson, 2002 Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater . tài kho sát kh n lactic kháng vi khun Edwardsiella ictaluri gây bnh gan thn m trên cá tra, nhm tìm ra mt s chng vi khun lactic có kh i kháng vi khun E. ictaluri. . NGUYN NG PHÁT KHO SÁT KH  VI KHUN LACTIC KHÁNG VI KHUN Edwardsiella ictaluri GÂY BNH GAN THN M TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUT. NGUYN NG PHÁT KHO SÁT KH N LACTIC KHÁNG VI KHUN Edwardsiella ictaluri GÂY BNH GAN THN M TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUT NGHII