Nghiên cứu Phân lập nhóm vi khuẩn Lactic Acid có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthanlmus

Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sản lượng cá tra tăng nhanh từ 52.248 năm 2000 đến 1.128.014 năm 2008, ước tính sản lượng tăng sấp xỉ 22 lần vòng 08 năm Sản lượng cá tra ngày gia tăng đôi với suy thoái môi trường nước thải bùn ao nuôi cá tra thâm canh thải trực tiếp sông, dẫn đến bùng phát dịch bệnh, gây thiệt hại cho người dân Phương pháp phòng trị bệnh truyền thống lạm dụng sử dụng kháng sinh hóa chất diệt khuẩn tạo chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc tăng độc lực Để thay phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng trị bệnh liệu pháp sinh học ngày ưa chuộng vaccine, chất tăng cường hệ miễn dịch (immunostimulants), probiotics Nghiên cứu vaccine ứng dụng cá tra nhiều nhà khoa học quan tâm Vaccine cho phương pháp hiệu phòng ngừa số bệnh gây vi khuẩn virus, chưa sử dụng phổ biến giá thành cao, thời gian nghiên cứu lâu thường gây sốc cho cá Những thành công đáng ý việc sử dụng chất tăng cường hệ miễm dịch thân thiện với môi trường có phổ phòng ngừa bệnh rộng Hơn nữa, phương pháp trị liệu sinh học vi sinh vật có lợi (probiotic) mong đợi trở thành công cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu nuôi trồng thủy sản thông qua khả cải thiện môi trường nước ức chế vi sinh gây bệnh Đặc biệt vi sinh vật có lợi có khả phân hủy phân tử tín hiệu (Quorum sensing) vi khuẩn gây bệnh nhằm làm giảm độc đồng thời ức chế phát triển chúng Trong khuôn khổ đề tài tiến hành nghiên cứu phân lập nhóm vi khuẩn lactic từ hệ tiêu hóa cá tra thịt giống, nước ao nuôi cá tra có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu đối kháng Edwardsiella ictaluri Và thực phẩm lên men truyền thống SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lâp dòng vi khuẩn có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, gây bệnh cho cá tra nuôi tỉnh đồng sông Cửu Long 1.3 Nội dung đề tài - Thu thập mẫu cá Tra tỉnh thuộc đồng sông Cửu Long: Tiền Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp - Sàng lọc mẫu có khả phân hủy phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) - Dùng số phương pháp để đánh giá khả đối kháng chủng vi khuẩn phân lập vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E ictaluri - Khảo sát khả phân hủy HHL đối kháng E ictaluri vi khuẩn nhận từ ngân hàng vi sinh vật - Bước đầu mô tả hình thái, nhộm gram chủng có khả phân hủy AHL đối kháng 1.4 Phạm vi nghiên cứu đề tài - Phân lập từ hệ vi sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra nuôi cá tra giống - Phân lập từ hệ vi sinh vật nước cá tra nuôi - Phân lập từ hệ vi sinh vật thực phẩm lên men truyền thống - Sàng lọc chủng vi khuẩn phân lập chủng từ ngân hàng vi sinh khả phân hủy phân tử tín hiệu AHLs đối kháng Edwardsiella ictaluri SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG TỔNG QUÁT TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm sinh học cá Tra 2.1.1 Phân loại Bộ cá nheo Siluriformes Họ cá tra Pangasiidae Giống cá tra dầu Pangasianodon Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) 2.1.2 Phân bố Cá tra phân bố lưu vực sông Mê Kông, có mặt nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan Ở Thái Lan gặp chúng lưu vực sông Mê Kông Chao phraya Ở nước ta cá bột cá giống vớt chủ yếu sông Tiền, cá trưởng thành thấy ao nuôi, tìm thấy tự nhiên 2.1.3 Đặc điểm hình thái sinh thái Cá thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám lưng, bụng bạc, miệng rộng, có hai đuôi râu dài Cá sống chủ yếu nước ngọt, sống vùng nước lợ (10 - 14 % độ muối), chịu đựng nước phèn với pH ≥ (pH cá bỏ ăn, bị sốc), chịu đựng nhiệt độ thấp 150C, chịu nóng tới 390C 2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng Cá hết noãn hoàn thích ăn mồi tươi sống, chúng ăn thịt lẫn bể ấp, chí cá vớt sông thấy chúng ăn đáy vớt cá bột Chúng ăn loại phù động vật có kích thước vừa cỡ miệng chúng Khi cá lớn, tính ăn tạp thiên động vật dễ chuyển đổi loại thức ăn Trong ao nuôi cá Tra có khả thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể thức ăn bắt buộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, động vật đáy,… SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng Cá tự nhiên, sống 20 năm Đã gặp cỡ cá tự nhiên 18 kg có mẫu dài tới 1,8m Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg cá 10 tuổi Nuôi ao năm cá đạt - 1,5 kg/con (năm đầu tiên), năm sau cá tăng trọng nhanh hơn, có đạt - kg/năm 2.1.6 Đặc điểm sinh sản Tuổi thành thục: Cá Tra đực thành thục tuổi thứ cá tuổi thứ trở lên Cá Tra quan sinh dục phụ (thứ cấp), nên nhìn hình dáng khó phân biệt đực - Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục cá đực phát triển lớn gọi buồng tinh, cá gọi buồng trứng Mùa vụ thành thục cá tự nhiên tháng - (dương lịch), cá đẻ tự nhiên sông khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp Cá không đẻ phần sông Việt Nam Ở Campuchia, bãi đẻ cá nằm từ khu vực ngã tư giao tiếp sông Mê Kông Tonlesap, từ Sombor, tỉnh Crache trở lên Trong sinh sản nhân tạo, ta nuôi thành thục sớm cho đẻ sớm tự nhiên (tháng 3) Trong tự nhiên không gặp tình trạng tái phát dục Chỉ có điều kiện nuôi nhân tạo, cá Tra tái phát dục - lần năm Số lượng trứng đếm buồng trứng cá ta gọi sức sinh sản tuyệt đối Sức sinh sản tuyệt đối cá Tra từ 200.000 đến vài triệu trứng 2.2 Các bệnh thường gặp Cá Tra Bệnh nguyên nhân gây thất thoát cá Tra nuôi Nếu không điều trị kịp thời, bệnh lây lan nhanh chóng dẫn đến kết không mong muốn Hiện nay, quy định sử dụng kháng sinh cá khắc khe nên người nuôi sử dụng phương pháp phòng bệnh chính, hạn chế tối đa việc sử dụng thuốc, hóa chất danh mục cấm Bộ Thủy Sản SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.2.1 Nhiễm khuẩn huyết vi khuẩn Aeromonas Tác nhân gây bệnh: Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromanas: A hyrophila, A caviae, A sobria Vi khuẩn có mặt nước có nhiều chất hữu Cá dễ mẫn cảm cá trưỡng thành, gây chết đến 80% Dấu hiệu bệnh lý: Cá bị bệnh sẫm màu vùng bụng, xuất mảng đỏ thể, hoại tử đuôi, vây, xuất vết thương lưng, khối u bề mặt thể, mắt lồi, mờ đục sưng phù, xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoại tử 2.2.2 Nhiễm khuẩn Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ) Tác nhân gây bệnh : Pseudomonas fluorescens, P.anguillise, P.chlororaphis Dấu hiệu bệnh lý: Xuất huyết đốm nhỏ da, xung quanh miệng nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt thể chảy máu, tuột nhớt không xuất huyết vây hậu môn Pseudomonas spp gây nhiễm khuẩn huyết thường xâm nhập vào thể cá qua thương tổn mang, da, vẩy 2.2.3 Nhiễm khuẩn huyết Edwardsiella (Edwarsiellosis) a Tác nhân gây bệnh: Bệnh vi khuẩn Edwardsiella tarda gây b Dấu hiệu bệnh lý Xuất vết thương nhỏ da (phía mặt lưng), đường kính khoảng 3-5m Những vết thương phát triển thành khối u rỗng bên da bị sắc tố Cá mắc bệnh chức vận động vây đuôi bị rách, gẫy Có thể xuất vết thương bên biểu bì, cơ, ấn vào phát khí có mùi hôi Các vết thương gây hoại tử vùng xung quanh Biết xuất chất lượng nước môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày Nhiệt độ thích hợp để phát triển khoảng 300C c Đặc điểm sinh hóa The Hawke et al (1981) Edwardsiella ictaluri loài thuộc Enterobacteria cea, gram âm, hình que ngắn kích thước 0.75x1.5-2.5μm di động yếu 25-300C, SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP không di động nhiệt độ cao hơn, Catalase dương tính, cytochrome oxidase âm tính lên men glucose (Shott,1989) Không sinh H2S Indole âm tính Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm môi trường BHI (36-48 28300C) Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh số loài cá điều kiện thí nghiệm như: Chinook salmon Oncarhynchus tshauytscha Rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Lương Trần Thục Đoan, 2006) Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu cá tra (ở tất giai đoạn phát triển) Tỷ lệ hao hụt lớn cá tra giống, gây thiệt hại kinh tế lớn giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung ctv, 2004) Theo Ferguson et al (2001), bệnh ghi nhận xuất ĐBSCL vào cuối năm 1998 có tên BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius) Từ Thanh Dung (2005) phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra nuôi bè Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng gan 2.2.4 Bệnh ký sinh trùng Bệnh trùng bánh xe (Trichodinosis) + Dấu hiệu bệnh lý: Thân cá có lớp nhớt màu trắng đục, mang cá đầy nhớt Cá thường đầu tập trung nơi có nước chảy, nhô đầu lên mặt nước lắc mạnh đầu Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vòng, chìm xuống đáy chết Trùng bánh xe ký sinh chủ yếu da, mang, gốc Bệnh trùng dưa (Ichthyopthisiosis) + Dấu hiệu bệnh lý: Trùng dưa ký sinh da, mang vây Trùng bám thành hạt lấm nhỏ, đường kính lớn 0,5-1mm, thấy mắt thường Da mang cá có nhiều nhớt, màu sắc nhợt nhạt Cá đầu đàn mặt nước, bơi lờ đờ trùng bám nhiều mang, phá hoại biểu mô mang làm cá ngạt thở SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.3 Tình hình nuôi cá tra Đồng Bằng Sông Cửu Long 2.3.1 Tình hình nuôi cá tra Trong năm qua, nghề nuôi thủy sản nước có bước phát triển nhanh ngày có vị trí bật Sản lượng nuôi trồng thủy sản nước năm 2002 đạt 450.000 tấn, chiếm 46% sản lượng nuôi trồng khai thác thủy sản nội địa Trong loài cá nuôi nước ngọt, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) loài cá nuôi nước truyền thống nuôi chủ yếu bè, ao đăng quần với mức độ thâm canh, bán thâm canh qui mô nông hộ ao hồ nhỏ hầu hết tỉnh Nam bộ, tập trung chủ yếu tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ Sản lượng nuôi cá tra ước tính đạt khoảng 300.000 năm 2004, đạt 400.000 năm 2005, đạt 800.000 năm 2006, đạt 1.000.000 năm 2007 1.128.000 năm 2008 (Đồ thị 1) (Sáng et al., 2007) Đồ thị Sản lượng nuôi cá tra từ năm 2000-2008 (Vietnam association of Seafood Exporters and Producers-VASEP, 2008 SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tuy nhiên, tình hình sản xuất tiêu thụ cá tra năm qua thể thiếu bền vững Có nhiều nguyên nhân chủ quan, khách quan khác Chính phủ, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Bộ ngành, địa phương, tổ chức Hiệp hội nuôi cá chế biến xuất chung tay triển khai giải pháp đồng để khắc phục cách hữu hiệu (Sáng et al., 2007) Trong đó, vấn đề môi trường bị nhiễm dẫn đến dịch bệnh bùng phát tác động nghiệm trọng đến người nuôi đồng thời giảm chất lượng sản phẩm cá tra Các bệnh thường gặp cá tra giống thịt 2.3.2 Nghiên cứu bệnh gan thận mủ Bệnh vi khuẩn Bệnh xuất huyết: Aeromonas hydrophila, Clostridium botulinum, Pseudomonas spp., Edwardsiella tarda: mass mortality: 70-80% Edwardsiella ichtaluri gây bệnh gan thận mủ Tỉ lệ chết cao: 80-100% Bệnh ký sinh trùng: Cryptobia spp., Ichthyophthyrius multifiliis, Trichodina, Epistylis - tỉ lệ chết: 15-20% Hình Các bệnh thường xuyên xuất cá tra qua giai đoạn nuôi (Loan ctv., 2007) a Bệnh vi khuẩn gây cá tra nghiên cứu phòng bệnh gan thận mủ Hiện cá tra sản phẩm xuất chủ lực Việt Nam Năm 2008, khu vực Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) xuất SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 640.000 sản phẩm cá tra philê, đạt kim ngạch gần 1,5 tỷ USD, tăng 48% so với năm 2007 Chỉ vòng khoảng 10 năm, từ năm 1998 đến năm 2008, từ loài cá địa, cá tra trở thành sản phẩm chiến lược quốc gia, với sản lượng nuôi tăng gấp 65 lần, xuất sang 140 nước, chiếm 50% tổng sản lượng thủy sản xuất Việt Nam, đóng góp khoảng 2% GDP nước (Thủy sản Việt Nam, số 13/2009) Với phát triển ngày cao cá tra thị trường to lớn cho xuất khẩu, hàng ngàn nông dân chạy theo lợi nhuận từ cá tra cách vô điều kiện, với năm 2008 đỉnh điểm phong trào nuôi cá tra ĐBSCL Người nuôi ạt mở rộng diện tích nuôi, tăng mật độ nuôi cách tự phát, cung cấp lượng lớn thức ăn dẫn đến môi trường ao nuôi dễ dàng bị ô nhiễm, điều kiện để bệnh bộc phát, gây thiệt hại cho người nuôi Nghề nuôi cá tra năm gần có tỉ lệ hao hụt cao (khoảng 40-50%), cao gấp đôi so với năm trước (www.vasep.com.vn) Các bệnh thường gặp cá tra bao gồm bệnh vi khuẩn (bệnh gan thận mủ, bệnh đốm đỏ Pseudomonas, bệnh nhiễm trùng máu Edwardsiella tarda), nấm (nấm thủy mi, ) ký sinh trùng (trùng bánh xe, trùng dưa, sán đơn chủ, sán song chủ, ) Theo kết điều tra Nguyễn Thanh Phương (2007) bệnh tác nhân vi khuẩn xuất ao nuôi cá tra thâm canh tỉnh An Giang, 68,3% số hộ điều tra nhận thấy bệnh đỏ mỏ đỏ đuôi, 61% số hộ ghi nhận bệnh gan-thận-mủ, 51,2% số hộ ghi nhận bệnh phù đầu, 24,4% số hộ ghi nhận bệnh vàng da Theo thống kê Lý Thị Thanh Loan (2008), tần suất xuất bệnh năm 2007 tỉnh ĐBSCL bao gồm bệnh gan thận mủ: 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70%; vàng da: 21,60% Trong bệnh gan thận mủ (hay bệnh đốm trắng nội tạng) gây thiệt hại nhiều cho người nuôi Bệnh xuất lần cá tra nuôi ĐBSCL vào cuối năm 1998 Khi cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao (10-90%), lên đến 100% tùy thuộc vào cách quản lý kích cỡ cá nuôi, đồng thời gan, thận tụy tạng xuất nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm bên chứa dịch màu trắng đục Khi cá bệnh người nuôi thường dùng hóa chất thuốc kháng sinh để chữa trị Tuy nhiên người ta phát tác nhân gây bệnh, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (theo kết định danh Crumlish et al., 2002), kháng với nhiều loại kháng sinh như: SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page of 133 MSSV:207111033 Header Page 10 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Florphenicol (42,5%), Amoxicillin (40,4%), Tetracyclin (31,9%), Doxycyclin (27,7%) (Nguyễn Hữu Thịnh Trương Thanh Loan, 2007) Nguyễn Thanh Phương (2007) xác định khả kháng thuốc kháng sinh chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra bệnh mủ gan, cho thấy chủng cho kết kháng với Colistin, Oxolinic acid, Streptomycin, Cefepime, Sulfa+trime, Ceftriaxone, Cefazolin, Gentamycin, Aztreonam, Cefixim, Cefotaxime, Oxytetracycline Amoxicillin Hơn sản phẩm cá tra sau thu hoạch thường không ưa chuộng tích lũy thuốc, hóa chất thịt, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc gây ô nhiễm môi trường nước Ngoài tồn dư chất kháng sinh thịt cá tra ảnh hưởng đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, làm giảm uy tín sản phẩm cá tra xuất thị trường nước Để giải vấn đề trên, phải tìm giải pháp thay cho việc chữa trị kháng sinh thuốc hóa học Hiện biện pháp sử dụng vaccine để phòng bệnh đánh giá có hiệu kinh tế Từ năm 2005, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II phối hợp với Công ty Thuốc thú y Trung ương II (Navetco) thực đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng Mỹ nuôi công nghiệp”, đối tượng quan tâm đặc biệt cá tra Sau ba năm thực hiện, việc nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra đạt số kết khả quan có triển vọng áp dụng vào thực tế Hiện loại vaccine nhận lời mời hợp tác từ công ty cổ phần Vĩnh Hoàn (Đồng Tháp), công ty nuôi xuất cá tra lớn thứ ba Việt Nam Ngoài ra, nghiên cứu hợp tác tập đoàn Bayer công ty sản xuất vaccine Pharmaq Nauy bệnh gan thận mủ cá tra bước đầu khẳng định tác nhân gây bệnh vi khuẩn E ictaluri, tiếp tục nghiên cứu để chế tạo vaccine Tuy nhiên, loại vaccine nói vaccine bất hoạt (sử dụng kháng nguyên tế bào vi khuẩn giết formalin 0,4%), có số nhược điểm tỉ lệ bảo hộ chưa cao, thời gian bảo hộ ngắn (hai tháng, vụ nuôi cá tra kéo dài tới 5-6 tháng), đòi hỏi phải bổ sung số chất bổ trợ để làm tăng hiệu SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 10 of 133 10 MSSV:207111033 Header Page 75 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 4.7.1.4 Độ nhạy phương pháp kiểm tra đối kháng Bảng 3.7.1.4.1 Kích thước vòng kháng khuẩn 14 chủng vi khuẩn phân lập phương pháp khác Đối kháng E ictaluri* Tên mẫu Mức độ phân hủy Đục lỗ C6-HHL Đĩa giấy Well-Difusion 24h 48h 24h 48h 24h 48h T.DT1.1 + 15,7 ± 1,2a 14,0 ± 1a - - - - T.DT1.2 ++ 16,3 ± 0,6a 16,3 ± 1,5a - - - - T.VL1.5 + 19,3 ± 1,5a 16,0 ± 1b - - - - G.VL1.9 ++ 19,7 ± 0,6a 14,3 ± 0,6b - - - - G.VL1.5 ++ 25,7 ± 1,2a 22,8 ± 2a - - 15,0 ± 0a 13,7 ± 1,2a T.TG1.4 ++ 17,3 ± 2,3a 15,7 ± 2,1a - - - - T.TG1.3 + 17,7 ± 1,5a 14,2 ± 0,8b - - - - SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 75 of 133 75 MSSV:207111033 Header Page 76 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP T.VL4 ++ 15,0 ± 1,7a 12,2 ± 0,8a - - - - T.TG1 ++ 17,7 ± 0,6a 12,5 ± 0,5b - - - - KC +++ 18,3 ± 1,5a 14,0 ± 1b - - - - DC ++ 0±0 0±0 - - - - DC +++ 19,0 ± 1a 16,3 ± 0,6b 16 ± 3a 16 ± 3a - - DC + 19,0 ± 1,7a 15,3 ± 0,6b - - - - DC ++ 20,0 ± 0a 13,8 ± 1,9b - - 18,7 ± 1,2a 17,3 ± 1,5a (*) Số liệu biểu thị cột lần lặp lại kích thước vòng kháng khuẩn Chữ thường (a, b) dòng biểu thị khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) hai thời gian ủ 24 48 SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 76 of 133 76 MSSV:207111033 Header Page 77 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Từ kết Bảng 3.7.1.4.1 kết luận phương pháp kiểm tra khả đối kháng, phương pháp đục lỗ thạch cho kết có vòng đối kháng cao có độ nhạy so với phương pháp đĩa giấy giếng khuếch tán Theo Hải ctv (2007) (Hai et al., 2007) khảo sát phương pháp (BLIS, BLIS cải tiến, giếng khuếch tán Well-diffusion, đĩa giấy Disc-diffusion, nuôi kết hợp coculture) khác để kiểm tra khả đối kháng chủng probiotic Pseudomonas synxantha Vibrio spp., kết cho thấy phương pháp Cross-streak cho độ nhạy cao nhất, phương pháp giếng khuếch tán đĩa giấy Tuy nhiên theo tác giả (Chythanya et al., 2002) sử dụng phương pháp giếng khuếch tán (well-diffusion method) phương pháp đĩa giấy (disc-diffusion method) để thử khả đối kháng với Pseudomonas I-2, kết cho thấy phương pháp đĩa giấy có độ nhạy tốt phương pháp well-diffusion tất mẫu vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp 4.7.2 Nhóm vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh vật Bảng 4.7.2.1 Đường kính vòng kháng khuẩn sau ủ 24 48 phương pháp đục lỗ thạch Đường kính vòng kháng khuẩn Kí hiệu Loài vi khuẩn pH (Trung bình ± SD, n=3) Sau 24 Sau 48 VTCC-B-804 Bacillus thuringiensis 8,75 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 VTCC-B-614 Bacillus megaterium 8,75 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 VTCC-B-701 Lactobacillus plantarum 4,14 22,0 ± 2,0 24,7 ± 4,6 VTCC-B-871 Lactobacillus acidophilus 4,09 21,3 ± 2,3 22,0 ± 2,0 VTCC-B-800 Pediococcus acidilactici 4,15 26,0 ± 2,0 26,0 ± 2,0 VTCC-Y0011 6,32 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Saccharomyces cerevisiae SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 77 of 133 77 MSSV:207111033 Header Page 78 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Kết Bảng 4.7.2.1 cho thấy chủng thuộc vi khuẩn lactic có khả ức chế phát triển E ictaluri sau 24 48 ủ Kích thước vòng kháng khuẩn giao động từ 21-26mm sau 24 từ 22-26mm sau 48 Trong chủng thuộc giống Bacillus spp Sacchromyces cerevisiae khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh E ictaluri Vi khuẩn lactic acid sản sinh chất như: bacteriocins, nisin, H2O2, acid hữu chúng có khả ứng chế phát triển vi khuẩn gây bệnh (Ringo and Gatesoupe, 1998) (Schrøder et al., 1980) Schrøder et al (1980) chúng minh L plantarum phân lập từ hệ tiêu hóa cá Pollachius virens, có khả sản sinh chất ức chế kháng lại Vibrio sp Nhiều vi khuẩn lactic (L plantarum, Carnobacterium sp., C divergens, Lactococcus lactis) phân lập từ hệ tiêu hóa cá, chúng sản sinh hợp chất ức chế chuống lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh in vivo và/hay in vitro Aeromonas salmonicida, A hydrophila, Pasteurella piscida, Photobacterium Edwardsiella damselae subsp tarda, Flavobacterium piscicida, Streptococcus psychrophilum, milleri, Vibrio anguillarum, V ordali (Byun et al., 1997; Gildberg and Mikkelsen, 1998; Jöborn et al., 1997; Robertson et al., 2000; Schrøder et al., 1980; Villamil et al., 2002) Theo (Yermolenko et al., 2006) nghiên cứu Enterococcus faecium L3 tiết bacteriocins A B (enterocins) ức chế phát triển streptococci L platarum 7-40 (NTU102) có khả ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa (trong thực phẩm) in vitro (có vòng kháng khuẩn 7.7 mm) (Pan et al., 2002) Cũng thí nghiệm khả đối kháng L plantarum 7-40 (NTU102) với vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản Streptococcus spp., Aeromonas hydrophila, Lactococcus garvieae, V alginolyticus*, V alginolyticus**, Photobacterium damsela subsp damselae (Son et al., 2009) 4.8 Nhuộm gram đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập Hầu hết chủng phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra, nước sản phẩm lên men truyền thống gram dương, có hình dạng tế bào hình que cầu khuẩn Tế bào xếp dạng đơn bào, dạng tế bào hay dạng chuỗi, tế bào hay nhiều tế bào bó lại SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 78 of 133 78 MSSV:207111033 Header Page 79 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP (Bảng 4.8.1) Kết phù hợp với nghiên cứu (Ringo and Gatesoupe, 1998) Bảng 4.8.1 Đặc điểm hình thái chủng phân lập Cách xếp tế Ký hiệu mẫu Tên mẫu Nhuộm gram Kiểu tế bào 1.1 T.DT1.1 + Hình que Đơn, đôi 1.2 T.DT1.2 + Hình que Đôi, chuỗi 13 T.VL1.5 + 17 G.VL1.9 + Hình que Đơn, đôi 20 G.VL1.5 + Cầu khuẩn Đôi, chuỗi 23 T.TG1.4 + 24.1 T.TG1.3 + Hình que Đơn 35.1 T.VL4 + Cầu khuẩn Tetrad, cluster 38 T.TG1 + Cầu khuẩn Tetrad, cluster 44 KC + Hình que Đơn 50.3 DC + Hình que Đơn 50.4 DC + 50.1.1 DC + Hình que Đơn 50.1.2 DC + Hình que Đơn, đôi SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 79 of 133 79 bào MSSV:207111033 Header Page 80 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 4.8.1 Mẫu 1.1 Hình 4.8.3 Mẫu 17 Hình 4.8.5 Mẫu 24.1 SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 80 of 133 Hình 4.8.2 Mẫu 13 Hình 4.8.4 Mẫu 20 Hình 4.8.6 Mẫu 35.1 80 MSSV:207111033 Header Page 81 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 4.8.7 Mẫu 38 Hình 4.8.8 Mẫu 44 Hình 4.8.9 Mẫu 50.1.1 Hình 4.8.10 Mẫu 50.1.2 Hình 4.8.11 Mẫu 50.3 Hình 4.8.11 Mẫu Edwardsiella ictaluri SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 81 of 133 81 MSSV:207111033 Header Page 82 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Sáng, N.V., N.V Hảo, T.Đ Trọng, N.C Dân, Q.Đ Thi, N.T.D Thúy, Đ Hùng, B.T.L Hà, N Điền, N.Q Tâm, N.H Ngân, and T.Q Sơn 2007 Chọn giống cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhằm tăng tỉ lệ phi lê chọn lọc gia đình Báo cáo khoa học Hiền, N.T., N.D Thư, N.T.M Hoàng, H.T.N Nga, N.T.H Vân, L.T Tín, N.M Thắng, L Dupuis, N.V Hảo (2009) Bước đầu sử dụng chất bổ trợ khác việc tạo vaccine bất hoạt phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra Loan, L.T.T., Đ.Q.T Vương, N.T Trúc, T.N Bảo, Đ.N Thùy, L.D Điền 2007 Quan trắc, cảnh báo môi trường phòng ngừa dịch bệnh số vùng nuôi thủy sản tỉnh phía nam - năm 2005 Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007 Thu, N.D., N.T.M Hoang, L.T.B Thuy, N.T Hien, N.T.H Van, N.M Thang, and N.V Hao 2007 Producing test of vaccine for preventing white spot disease on tra-catfish (Pangasius hypophthalmus) Asian-Pacific Aquaculture 2007 Meeting Abstract Bùi Quang Tề (2006), Bệnh học thủy sản.Nxb Nông Nghiệp Nguyễn Hữu Phúc, 2003 Khả phát triển việc sử dụng chế phẩm vi sinh NTTS Việt Nam Trong Tuyển tập nghề cá sông Cửu Long Nxb Nông Nghiệp Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Vũ Hồng Như Yến (2007) , Hổn hợp vi khuẩn phân hủy NACYL Hormoserine Lactone giúp nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá Turbot (Scophthalmus maximus L.)Tuyển tập nghề nuôi cá sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007 Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2008 Chuyên đề 3: Các phương pháp xác định chế tác động vi khuẩn Probiotic Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 82 of 133 82 MSSV:207111033 Header Page 83 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hữu Thịnh, 2007 Bài giảng môn Vi Sinh Ứng Dụng Trong NTTS Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Văn Sáng (2009) Báo cáo trạng sản xuất giống cá tra giải pháp nâng cao chất lượng giống Cục Nuôi Trồng Thủy Sản Lý Thị Thanh Loan, Đỗ Quang Tiền Vương, Nguyễn Thanh Trúc, Thới Ngọc Bảo, Đặng Ngọc Thùy, Lưu Đức Điền(2007) Quan trắc, cảnh báo môi trường phòng ngừa dịch bệnh số vùng nuôi thủy sản tỉnh phía nam – năm 2005 Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007 Lương Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thuỷ sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành Công nghệ sinh học tập năm công nghệ vi sinh môi trường NXB Giáo dục, 2007 Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Trần Thạnh Phong, 2004 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm VEM dùng nuôi trồng thủy sản Tuyển tập Hội thảo toàn quốc NC&ƯD KHCN nuôi trồng thủy sản.) Vũ Thị Thứ cộng sự, 2004 Lên men chế phẩm sinh hoc BioF ứng dụng nuôi trồng thủy sản Tuyển tập Hội thảo tòan quốc NC&ƯD KHCN nuôii trồng thủy sản Nguyễn Hữu Phúc, 2003 Khả phát triển việc sử dụng chế phẩm vi sinh NTTS Việt Nam Trong Tuyển tập nghề cá sông Cửu Long NXB Nông Nghiệp Tài liệu Tiếng Anh Aditya Kesarcodi-Watson, Heinrich Kaspar, M.Josie Lategan, Lewis Gibson, 2008.Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes, Aquaculture 274 ( 1–14) SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 83 of 133 83 MSSV:207111033 Header Page 84 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dong, Y.H., Gusti, A.R., Zhang, Q., Xu, J.L., Zhang, L.H., 2002.Identification of quorum-quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species Appl Environ Microbiol 68,1754– 1759 Fuqua, C., Parsek, M.R., Greenberg, E.P., 2001 Regulation of gene expression by cell-to-cell communication Annu Rev Genet.35, 439– 468 Gram, L., Løvold, T., Nielsen, J., Melchiorsen, J., Spanggaard, B.,2001 In vitro antagonism of the probiont Pseudomonas fluorescens strain AH2 against Aeromonas salmonicida does not confer protection of salmon against furunculosis Aquaculture199, 1–11 Gibson, L.F., Woodworth, J., George, A.M., 1998 Probiotic activity of Aeromonasmedia on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii Aquaculture 169, 111–120 Hansen, G.H., Sorheim, R., 1991 Improved method for phenotypical characterization of marine bacteria J Microbiol Methods 13, 231–241 Irianto, A., Austin, B., 2002 Use of probiotics to control furunculosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) J Fish Dis 25, 333–342 Maeda M (1994) Biocontrol of the larval rearing biotope in aquaculture Bull Natl Res Inst Aquaculture 1: 71–74 Parker, R.B., 1974 Probiotics The other half of the antibiotics story Anim Nutr Health 29, 4–8 Ruiz-Ponte C, Samain JF, Sanchez JL & Nicolas JL (1999) The benefit of aRoseabacter species on the survival of scallop larvae Mar Biotechnol 52 –59 Ruiz-Ponte, C., Samain, J.F., Nicolas, J.L., 1998 Antibacterial activity exhibited by the marine strain Roseobacter sp In: Le Gal, Y., Muller-Feuga, A Eds., Marine Microorganisms for Industry Proceedings of a Meeting, 17–19 SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 84 of 133 84 MSSV:207111033 Header Page 85 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP September 1997, Brest, France Actes Colloq IFREMER No 21, IFREMER, Plouzane, France, pp 166–168 Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W., 2000.Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture.Microbiol Mol Biol Rev 64, 655– 671 Venkat HK, Sahu NP & Jain KK (2004) Effect of feeding Lactobacillus-based probiotics on the gut microflora, growth and survival of postlarvae of Macrobrachium rosenbergii (de Man) Aquaculture Res 35: 501–507 Villamil L, Figueras A, Planas M & Novoa B (2003) Control of Vibrio alginolyticus in Artemia culture by treatment with bacterial probiotics Aquaculture 219: 43– 56 Nguyen Thi Ngoc Tinh, Kristof Dierckens, Patric Sorgeloos, Petr Bossier, 2007 A Review of the Funtionality of Probiotics in the Larviculture Food Chain Marine Biotechnology Nguyen Thi Ngoc Tinh, R.A.Y.S Asanka Gunasekara, Nico Boon, Kristof Diercken, Patrick Sorgeloos and Peter Boosier, 2007 N – acyl homoserime lactone – degrading microbial enrichment cultures isolated from Penaeus vannaemei shrimp gut and their Probiotic in Brachionus plicatilis culture FEMS Microbiol Ecol 62 Balcázar, J.L., I de Blas, I Ruiz-Zarzuela, D Vendrell, O Girones, and J.L Muzquiz 2007 Sequencing of variable regions of the 16S rRNA gene for identification of lactic acid bacteria isolated from the intestinal microbiota of healthy salmonids Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 30:111-118 Byun, J.-W., S.-C Park, Y Benno, and T.-K Oh 1997 Probiotic effect of Lactobacillus sp DS-12 in flounder (Paralichthys olivaceus) The Journal of General and Applied Microbiology 43:305-308 SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 85 of 133 85 MSSV:207111033 Header Page 86 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chythanya, R., I Karunasagar, and I Karunasagar 2002 Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain Aquaculture 208:1-10 FAO 2008 Food and Agriculture Organization of the Unitied Nations Fisheries Department, Fisherieds Information, Data and Statistisc Units FISHSTATS Plus Version 2.30 Retrieved October 31, 2007 from the Word Wide Web: http://www.fao.org/fi/website/FIRetrieveAction.do?dom=topic&fid=16073 [Online] Gatesoupe, F.-J 2008 Updating the Importance of Lactic Acid Bacteria in Fish Farming: Natural Occurrence and Probiotic Treatments Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 14:107-114 Gildberg, A., and H Mikkelsen 1998 Effects of supplementing the feed to Atlantic cod (Gadus morhua) fry with lactic acid bacteria and immuno-stimulating peptides during a challenge trial with Vibrio anguillarum Aquaculture 167:103-113 Gildberg, A., A Johansen, and J Bogwald 1995 Growth and survival of Atlantic salmon (Salmo salar) fry given diets supplemented with fish protein hydrolysate and lactic acid bacteria during a challenge trial with Aeromonas salmonicida Aquaculture 138:23-34 Hagi, T., D Tanaka, Y Iwamura, and T Hoshino 2004 Diversity and seasonal changes in lactic acid bacteria in the intestinal tract of cultured freshwater fish Aquaculture 234:335-346 Hai, N.V., R Fotedar, and N Buller 2007 Selection of probiotics by various inhibition test methods for use in the culture of western king prawns, Penaeus latisulcatus (Kishinouye) Aquaculture 272:231-239 Jöborn, A., J.C Olsson, A Westerdahl, P.L Conway, and S Kjelleberg 1997 Colonization in the fish intestinal tract and production of inhibitory substances in intestinal mucus and faecal extracts by Carnobacterium sp strain K1 Journal of Fish Diseases 20:383-392 SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 86 of 133 86 MSSV:207111033 Header Page 87 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Molina, L., F Constantinescu, L Michel, C Reimmann, B Duffy, and G Defago 2003 Degradation of pathogen quorum-sensing molecules by soil bacteria: a preventive and curative biological control mechanism FEMS Microbiol Ecol 45:71-81 Pan, T.-M., C.-H Chiu, and Y.-K Cuu 2002 Characterization of Lactobacillus isolates from pickled vegetables for use as dietary or pickle adjuncts Foods Food Ingredients Journal of Japan 206:15-21 Ringo, E., and F.-J Gatesoupe 1998 Lactic acid bacteria in fish: a review Aquaculture 160:177-203 Ringø, E., and F.-J Gatesoupe 1998 Lactic acid bacteria in fish: a review Aquaculture 160:177-203 Ringø, E., H.R Bendiksen, S.J Gausen, A Sundsfjord, and R.E Olsen 1998 The effect of dietary fatty acids on lactic acid bacteria associated with the epithelial mucosa and from faecalia of Arctic charr, Salvelinus alpinus (L.) Journal of Applied Microbiology 85:855-864 Robertson, P.A.W., C O'Dowd, C Burrells, P Williams, and B Austin 2000 Use of Carnobacterium sp as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) Aquaculture 185:235-243 Sáng, N.V., N.V Hảo, T.Đ Trọng, N.C Dân, Q.Đ Thi, N.T.D Thúy, Đ Hùng, B.T.L Hà, N Điền, N.Q Tâm, N.H Ngân, and T.Q Sơn 2007 Chọn giống cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhằm tăng tỉ lệ phi lê chọn lọc gia đình Báo cáo khoa học Schrøder, K., E Clausen, A.M Sandberg, and J Raa 1980 Psychrotrophic Lactobacillus plantarum from fish and its ability to produce antibiotic substances In: Connell, J.J (ed), Advances in Fish Science and Technology Fishing News Books, Farnham, Surrey, England, pp 480–483 Son, V.M., C.C Chang, M.C Wu, Y.K Guu, C.H Chiu, and W Cheng 2009 Dietary administration of the probiotic, Lactobacillus plantarum, enhanced the SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 87 of 133 87 MSSV:207111033 Header Page 88 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides Fish Shellfish Immunol 26:691-698 Vaughan, E.E., E Caplice, R Looney, N O’Rourke, H Coveney, C Daly, and G.F Fitzgerald 1994 Isolation from food sources, of lactic acid bacteria that produced antimicrobials Journal of Applied Bacteriology 1994, 76, 11 13-1 23 76:118-123 Villamil, L., C Tafalla, A Figueras, and B Novoa 2002 Evaluation of Immunomodulatory Effects of Lactic Acid Bacteria in Turbot (Scophthalmus maximus) Clinical and Diagnostic laboratory immunology 9:1318-1323 Xu, F., T Byun, H.-J Dussen, and K.R Duke 2003 Degradation of N-acyl homoserine lactones, the bacterial quorum-sensing molecules, by acylase Journal of Biotechnology 101:89-96 Yermolenko, E., A Chernish, G Aleshina, E Cvetkova, I Martsinkovskaya, V Kolodjieva, and A Suvorov 2006 Antagonistic activity of Enterococcus faecium L3 against different groups of pathogenic streptococci International Congress Series 1289:363-366 SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 88 of 133 88 MSSV:207111033 Header Page 89 of 133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: Trần Trọng Nguyễn Footer Page 89 of 133 89 MSSV:207111033 ... tiêu đề tài Phân lâp dòng vi khuẩn có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, gây bệnh cho cá tra nuôi tỉnh đồng sông Cửu Long 1.3 Nội dung đề tài - Thu thập mẫu cá Tra tỉnh thuộc... Nhiễm khuẩn huyết vi khuẩn Aeromonas Tác nhân gây bệnh: Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromanas: A hyrophila, A caviae, A sobria Vi khuẩn có mặt nước có nhiều chất hữu Cá dễ mẫn cảm cá. .. hệ vi sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra nuôi cá tra giống - Phân lập từ hệ vi sinh vật nước cá tra nuôi - Phân lập từ hệ vi sinh vật thực phẩm lên men truyền thống - Sàng lọc chủng vi khuẩn phân lập