khảo sát tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) và cá rô phi đỏ (oreochromis sp)

13 3.3 Thí nghiệm: Xác định thời gian tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên nguyên liệu cá tra và cá rô phi đỏ .... 16 3.3.1 Xác định thời gian tồn lưu của kháng sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

CAO THỊ KIỀU TIÊN

KHẢO SÁT TỒN LƯU KHÁNG SINH SULFAMETHOXAZOLE VÀ TRIMETHOPRIM

TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.S TRẦN MINH PHÖ

2013

XÁC NHẬN Luận văn tốt nghiệp với tên đề tài “Khảo sát tồn lưu kháng sinh

Sulfamethoxazole và Trimethoprim trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus và cá rô phi đỏ (Oreochromis sp)” do sinh viên Cao Thị Kiều

Tiên thực hiện và báo cáo ngày 5 tháng 12 năm 2013 đã được hội đồng chấm

luận văn thông qua Luận văn đã được chỉnh sửa theo sự hướng dẫn của Hội

đồng và của giáo viên hướng dẫn đề tài này

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này ngoài nỗ lực riêng bản thân tôi còn nhận được không ít sự giúp đỡ và động viên từ phía rất nhiều người Nay tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Thầy Trần Minh Phú đã chỉ dẫn tận tình và truyền đạt những kiến thức quý báo cho tôi trong suốt thời gian qua

Quý thầy cô Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến, khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức chuyên môn trong suốt quá trình học tập Tạo các điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn

Chị Huỳnh Thị Ngọc Liên, phó phòng kiểm nghiệm Trung tâm kiểm nghiệm chất lượng nông lâm thủy sản Vùng 6 đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi

có cơ hội tìm hiểu học hỏi tại trung tâm

Anh Cô Hồng Sơn nhân viên phòng kiểm nghiệm đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại trung tâm

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã quan tâm giúp đỡ và động viên tôi trong suốt khoảng thời gian học tập vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Sinh viên thực hiện

Cao Thị Kiều Tiên

TÓM TẮT

Đề tài: “Khảo sát tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole và

trimethoprim trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá rô phi đỏ (Oreochromis sp)” được thực hiện nhằm tìm ra thời gian đào thải và mức tồn

lưu của kháng sinh sulfamethoxazole (SMX) và trimethoprim (TMP) trên đối tượng cá tra và cá rô phi đỏ

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trên ba bể cá tra (500L)

và 3 bể cá rô phi đỏ (1000L) Mật độ cá tra là 100 con/m3, cá rô phi đỏ là 200 con/m3 Cá tra và cá rô phi đỏ được cho ăn thức ăn có trộn sản phẩm Trimesul (20% sulfamethoxazole và 6% trimethoprim, Vemedim, Việt Nam) với liều lượng 5g/kg thức ăn, cho ăn 5 ngày liên tục Thu mẫu được tiến hành trước khi cho ăn thuốc, 1 ngày và 5 ngày sau khi cho ăn thuốc, 3, 7, và 15 ngày sau khi ngừng cho ăn thuốc Mẫu cá tra được thu mẫu cơ và da riêng, mẫu cá rô phi đỏ được thu mẫu cơ và da chung Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng sulfamethoxazole trong mẫu thức ăn là 674±10,1 mg/kg đạt 67,4% so với nồng độ lý thuyết Hàm lượng trimethoprim trong mẫu thức là 113±11,0 mg/kg đạt 37,8% so với nồng độ lý thuyết Kết quả phân tích mẫu cá tra sau 5 ngày cho ăn kháng sinh, tồn lưu của sulfamethoxazole và trimethoprim trong

cơ thịt cá và da cá tra đều tăng dần và đạt mức cao nhất trên da cá tra có hàm lượng SMX là 726±60,4 µg/kg; TMP là 203±93 µg/kg, trên cơ cá tra có tồn lưu SMX là 577±180 µg/kg; TMP là 92,5±83,7 µg/kg, và trên cơ cá rô phi có mức tồn lưu SMX là 604±255 µg/kg và TMP là 137±52,5 µg/kg ở ngày thứ 5

Kết quả khảo sát dư lượng SMX, TMP trên cá tra cho thấy tồn lưu trên

da lâu hơn trên cơ Tồn lưu SMX trên da sau 7 ngày ngừng cho ăn thuốc là 144±44,5 µg/kg, tồn lưu TMP là 30,1 ±15,7 µg/kg Kết quả phân tích trên cơ thịt cá tra sau 7 ngày ngừng cho ăn thuốc của SMX là 40,5±15,9 µg/kg, của TMP là 14±5,19 µg/kg Sau 15 ngày ngừng cho ăn thuốc tồn lưu cả hai kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên da cá tra đều thấp hơn giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn của châu Âu và FDA của Mỹ (100 µg/kg đối với sulfamethoxazole và 50 µg/kg đối với trimethoprim) Tồn lưu trên cơ và da cá

rô phi có thời gian đào thải nhanh hơn đối với cá tra Sau 3 ngày ngừng cho ăn thuốc tồn lưu của SMX và TMP thấp hơn giới hạn cho phép (SMX là 38,5±11,4µg/kg, TMP là 28,2±13,9µg/kg so với quy định của Châu Âu và FDA, Mỹ (SMX là 100 µg/kg, TMP là 50 µg/kg)

LC – MS/ MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry

MỤC LỤC

Trang

XÁC NHẬN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

CHƯƠNG 1 1

GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

1.4 Thời gian thực hiện 1

CHƯƠNG II 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh 2

2.1.1 Định nghĩa 2

2.1.2 Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm 2

2.1.3 Tác hại của kháng sinh 2

2.2 Sơ lược về Sulfamid (SAs) 2

2.2.1 Sơ lược về nhóm Sulfamid (SAs) 2

2.2.2 Sulfamethoxazole (SMX) 3

2.3 Sơ lược về Trimethoprim (TMP) 4

2.3.1 Công thức cấu tạo: C14H18N4O3 4

2.3.2 Tính chất 5

2.3.3 Dược lý và cơ chế tác dụng 5

2.4 Thuốc thú y thủy sản Trimesul của Vemedim 5

2.5 Tổng quan về cá tra 6

2.5.1 Phân loại 6

2.5.2 Phân bố 6

2.5.3 Hình thái sinh lý 7

2.5.4 Đặc điểm dinh dưỡng 7

2.5.5 Đặc điểm sinh trưởng 7

2.5.7 Thành phần dinh dưỡng cá tra 8

2.6 Tổng quan về cá rô phi đỏ 8

2.6.1 Phân loại 8

2.6.2 Đặc điểm dinh dưỡng 9

2.6.4 Đặc điểm dinh dưỡng 9

2.7 Các phương pháp xác định dư lượng Sulfamid và Trimethoprim 9

2.7.1 Phương pháp xác định dư lượng sulfamid theo TCN196:2004: Sulfamid trong sản phẩm thuỷ sản – Phương pháp định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC 9

2.7.2 Phương pháp xác định đồng thời sulfadiazin và trimethoprim trên cá vền biển bằng HPLC (Papapanagiotou et al., 2013) 10

2.7.3 Xác định một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm bàng phương pháp sắc ký lỏng LC-MS/MS (Vũ Thị Trang, 2012) 11

CHƯƠNG 3 13

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Phương tiện nghiên cứu 13

3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm 13

3.1.2 Nguyên liệu 13

3.1.3 Thời gian 13

3.2 Vật liệu và phương pháp 13

3.2.1 Vật liệu 13

3.2.2 Hóa chất 13

3.2.3 Phương pháp phân tích 13

3.3 Thí nghiệm: Xác định thời gian tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên nguyên liệu cá tra và cá rô phi đỏ 16

3.3.1 Xác định thời gian tồn lưu của kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trong mẫu thức ăn thí nghiệm 16

3.3.2 Xác định thời gian tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trong nuôi cá tra 16

3.3 Xử lí số liệu 17

CHƯƠNG 4 18

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Thí nghiệm xác định tồn lưu của kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên cá tra 18

4.1.1 Yếu tố môi trường 18

4.1.1.1 Nhiệt độ 18

4.1.1.2 pH 18

4.1.1.3 Oxy hòa tan 19

4.1.2 Tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trong mẫu thức ăn 19

4.1.3 Tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trong da cá tra 19

21

4.1.4 Tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trên cơ cá tra 21

4.2 Thí nghiệm xác định tồn lưu của kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên rô phi đỏ 23

4.2.1 Yếu tố môi trường 23

4.2.1.1 Nhiệt độ 23

4.2.1.2 pH 24

4.2.1.3 Oxy hòa tan 24

4.2.2 Tồn lưu trên cá rô phi 25

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đề xuất 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC 1 31

PHỤ LỤC 2 36

PHỤ LỤC 3 43

PHỤ LỤC 4 45

PHỤ LỤC 5 51

PHỤ LỤC 5 52

PHỤ LỤC 6 53

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng cá tra trên 100g thành phẩm 8

Bảng 2.2 Chương trình pha động 10

Bảng 2.2 Mức độ tồn lưu của SDZ và TMP trong mẫu cá vền biển sau 7 ngày ngừng cho ăn thức ăn chứa kháng sinh (ng/g) 11

Bảng 2.2 Điều kiện phân mảnh 11

Bảng 4.1: Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm trên cá tra 18

Bảng 4.2 pH trung bình trong quá trình thí nghiệm trên cá tra 18

Bảng 4.3 Lượng oxy hòa tan trong nước trong quá trình thí nghiệm trên cá tra 19

Bảng 4.4a Tồn lưu SMX và TMP trên da cá tra trong 5 ngày cho ăn kháng sinh 19

Bảng 4.4b Tồn lưu SMX và TMP trên da cá tra sau 15 ngày ngừng cho ăn kháng sinh 20

Bảng 4.5 Tồn lưu SMX và TMP trên cơ cá tra trong 5 ngày liên tiếp cho ăn thức ăn chứa kháng sinh 21

Bảng 4.6 Tồn lưu SMX và TMP trên cơ cá tra sau 15 ngày ngừng cho ăn thuốc 22

Bảng 4.7 Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 23

Bảng 4.8 Giá trị pH trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 24

Bảng 4.9 Hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình thí nghiệm cá rô phi đỏ 24

Bảng 4.10 Tồn lưu SMX và TMP trên cá rô phi trong thời gian cho ăn thức ăn chứa kháng sinh 25

Bảng 4.11 Tồn lưu SMX và TMP trên cá rô phi sau 15 ngày ngừng cho ăn chứa kháng sinh 25

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Công thức cấu tạo SMX 3

Hình 2.2 Công thức cấu tạo TMP 5

Hình 2.3 Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 6

Hình 2.4 Cá rô phi đỏ Oreochromis sp 8

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thời gian thu mẫu 17

Hình 4.1 Đồ thị thể hiện dƣ lƣợng kháng sinh SMX và TMP trên da cá tra theo thời gian 21

Hình 4.2 Đồ thị thể hiện dƣ lƣợng kháng sinh SMX và TMP trên cơ cá tra theo thời gian 22

Hình 4.3 Đồ thị thể hiện dƣ lƣợng kháng sinh SMX và TMP trên cơ cá rô phi đỏ theo thời gian 26

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Năm 2012, tổng sản lượng thủy sản của cả nước đạt 5.876 nghìn tấn, tăng 8,8% so với kế hoạch (Bộ Nông Nghiệp, 2013) Sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt gần 1.759 nghìn tấn, tăng 3,1 % so với cùng kỳ năm trước Sản lượng cá tra năm 2012 đạt 1,2 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 1,8 tỷ đô

la Mỹ (VASEP, 2013) Sự tồn lưu kháng sinh trên sản phẩm thủy sản, đặc biệt

là cá tra đang ngày càng được kiểm soát nghiêm ngặt

Trong nuôi cá tra, một số loại kháng sinh được sử dụng nuôi phổ biến như: Florfenicol, doxycycline, sulphonamide kết hợp với trimethoprim, (Phú

et al., 2012) Sulfamide là một nhóm kháng sinh có phổ tác dụng mạnh đối với các vi khuẩn gây bệnh gram âm và dương Khi kết hợp với trimethoprim thì khả năng kháng khuẩn này tăng cao và hạn chế độc tính của sulfamide đơn thuần Việc sử dụng hổn hợp kháng sinh này sẽ dẫn đến tồn lưu trên cá tra Tuy nhiên chưa có nghiên cứu về thời gian đào thải của hai loại kháng sinh này trên cá tra và cá rô phi đỏ nuôi Chính vì vậy việc thực hiện đề tài “Khảo sát tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên cá tra và cá rô phi đỏ” là cần thiết

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định thời gian tồn lưu và dư lượng của kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trong cá tra và cá rô phi đỏ

1.3 Nội dung nghiên cứu

Xác định thời gian tồn lưu của kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trong mẫu thức ăn, trong mẫu cơ cá tra, da cá tra và cơ cá rô phi

đỏ

1.4 Thời gian thực hiện

Từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh

2.1.1 Định nghĩa

Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hoá học

2.1.2 Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm, nhưng chủ yếu là do các nguyên nhân sau:

 Có thể nhiễm vào thức ăn do thức ăn tiếp xúc môi trường có chứa kháng sinh

 Do sử dụng thường xuyên kháng sinh: mục đích kích thích tăng trọng, phòng bệnh mùa dịch bệnh, chữa bệnh

 Nhằm kéo dài thời gian bảo quản, tránh hư hỏng cho thực phẩm

2.1.3 Tác hại của kháng sinh

Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho người và động vật, nếu còn tồn dư một lượng dù nhỏ nhất cũng có thể gây ra sự kháng thuốc

của E Coli (Escherichia coli) Khi E Coli đã kháng thuốc thì có thể truyền

plasmid kháng thuốc của nó cho các loại vi khuẩn gây bệnh khác sống trong đường ruột Một số tác hại chính của kháng sinh:

 Phản ứng mẫn cảm đối với người nhạy cảm với kháng sinh

 Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thực phẩm tồn lưu kháng sinh

 Tạo ra thể vi sinh vật kháng thuốc

 Gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn

2.2 Sơ lược về Sulfamid (SAs)

2.2.1 Sơ lược về nhóm Sulfamid (SAs)

Ðây là nhóm kháng khuẩn có từ thập niên 1940 Bắt nguồn từ phân tử Protonsil – một loại thuốc nhuộm azo, các sulfamid được tổng hợp là những chuyển hóa chất của sulfanilamid do thay thế nhóm –NH2 hoặc –SO2NH2 Là

dạng bột trắng rất ít tan trong nước, tan nhanh hơn trong huyết thanh (Võ Văn

Ninh, 2007).

Nhóm kháng sinh Sulfamid gồm các loại chính sau: sulfadimidin, sulfadimethoxin, sulfamerazin, sulfadiazine, sulfamethoxypyrimidin, sulfapyridin Giới hạn tồn lưu cho phép trong thủy sản của SAs (các loại) là 100µg/kg theo quy định của Cộng đồng Châu Âu

Sulfamid là kháng sinh kìm khuẩn, chúng ức chế dihydrofolat synthetase – một enzyme tham gia tổng hợp acid folid Sulfamid có cấu tạo khá giống PABA (Para Amino Benzoic Acid), là một nguyên liệu rất cần thiết cho vi khuẩn để tổng hợp acid folid phục vụ cho quá trình phát triển Chính vì vậy mà sulfamid đã tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid

folic của vi khuẩn (Võ Văn Ninh, 2007)

Phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, hầu hết các cầu khuẩn và các trực khuẩn gram âm và dương:

- Cầu khuẩn gram (+): liên cầu, phế cầu, tụ cầu (tụ cầu vàng)

- Cầu khuẩn gram (-): màng não cầu, lậu cầu

- Trực khuẩn gram (+): ưa khí và kỵ khí

- Trực khuẩn gram (-): đặc biệt là trực khuẩn đường ruột

- Một số sulfamid tác dụng với clamydia, ký sinh trùng sốt rét, toxoplasma

- Hiện nay do tỷ lệ kháng thuốc và kháng chéo giữa các sulfamid cao nên ít dùng Vi khuẩn kháng thuốc bằng cách tăng tổng hợp PABA hoặc giảm tính thấm với thuốc Dựa vào dược động học, các sulfamid được chia làm 4 loại:

- Loại hấp thu nhanh, trừ nhanh: thời gian bán thải

2

t

= 6 – 8 giờ, sulfadiazin, sulfadimidin, sulfamethoxazol

- thải Loại hấp thu rất ít: điều trị viêm ruột, loét đại tràng: sulfaguanidin (ganidan), phtalylsulfathiazol

- Loại thải trừ chậm: duy trì nồng độ điều trị trong máu lâu,

2

t

= 7 – 9 ngày, nên chỉ uống 1 lần/ngày: sulfadoxin (fanasil) có trong thành phần viên fansidar thuốc điều trị sốt rét

- Loại dùng tại chỗ: ít hoặc không tan trong nước, dùng điều trị các vết thương tại chỗ (mắt, vết bỏng ) Dạng dùng: dung dịch hoặc kem (sulfacetamid, bạc sulfadiazin, mafenid)

2.2.2 Sulfamethoxazole (SMX)

Công thức cấu tạo:

C 10 H 11 N 3 O 3 S

Sulfamethoxazole là 4 – amino – N – (5 – methylisoxazol – 3 – yl) – benzenesulfonamide

Tính chất

Sulfamethoxazole bột trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, vị đắng, không tan trong nước, ít tan trong ethanol

Màu sắc của dung dịch

Hòa tan 0,5 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch natri hydroxyd 1 M (TT) Dung dịch thu được có màu không được đậm hơn dung dịch màu mẫu

Giới hạn acid

Lấy 1,25 g chế phẩm đã được nghiền mịn, thêm 25 ml nước không có carbon dioxyd, lắc đều Đun nóng khoảng 700C trong 5 phút Làm nguội trong nước đá khoãng 15 phút và lọc Hút 20 ml dịch lọc, thêm 0,1 ml dung dịch

xanh Bromothymol (TT), không được dùng quá 0,2 ml dung dịch natri

hydroxyd 0,1 M (CĐ) để làm chuyển màu của chỉ thị

Tác dụng

Sulfamid ngày càng ít dùng đơn thuần vì nhiều độc tính và đã có kháng sinh thay thế Các chế phẩm hay dùng dưới dạng phối hợp với trimethoprim Các chỉ định hiện nay còn dùng: điều trị phong, nhiễm khuẩn tiêu hoá, tiết niệu, mắt hột, viêm kết mạc, sốt rét, dịch hạch, dự phòng dịch tả và điều trị tại chỗ

Trong nuôi trồng thủy sản sulfamethoxazole thường được sử dụng kết hợp với trimethoprim để trị các bệnh nhiễm khuẩn

Phương pháp định lượng

Hòa tan 0,250 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 20 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M và 50 ml nước Thêm 3 g kali bromid, làm lạnh dung dịch trong nước đá và chuẩn độ chậm bằng dung dịch natri nitrit 0,1 M, xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo ampe 1 ml dung dịch natri nitrit 0,1 M tương đương với 27,83 mg C12H14N4O2S

2.3 Sơ lược về Trimethoprim (TMP) – đại diện chính của

diaminopyrimidine

2.3.1 Công thức cấu tạo: C14H18N4O3

Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin, phải chứa từ 98,5đến 101,% C14H18N4O3, tính theo chế phẩm đã làm khô

Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus faecalis và chống lại nhiều vi

khuẩn dạng E Coli

Trimethoprim được hấp thu nhanh và hầu như hoàn toàn qua đường tiêu hóa, nồng độ đỉnh trong máu đạt được sau 1 – 4 giờ là 1 microgam/mL sau khi uống liều 100mg Gắn với protein huyết tương khoảng 45% Trimethoprim phân bố trong nhiều mô và các dịch gồm thận, gan, phổi, dịch phế quản, nước bọt, thủy dịch ở mắt, tuyến tiền liệt và dịch âm đạo Thuốc đi qua hàng rào nhau thai và có trong sữa mẹ Thời gian bán hủy của thuốc là 8 -

11 giờ ở người lớn và ít hơn ở trẻ em, kéo dài hơn ở người suy thận và ở trẻ sơ sinh Trimethoprim đào thải chủ yếu qua thận thông qua lọc cầu thận

và bài tiết ở ống thận, chủ yếu dưới dạng không đổi Khoảng 40 - 60% liều được đào thải qua thận trong 24 giờ Trimethoprim có thể bị loại khỏi máu qua lọc máu

Trong thủy sản trimethoprim là loại kháng phòng, trị các bệnh do nhiểm khuẩn

2.4 Thuốc thú y thủy sản Trimesul của Vemedim

Trimesul là sản phẩm của công ty cổ phần xuất khẩu kinh doanh vật tư

và thuốc thú y Vemedim Thành phần chính của Trimesul là sulfamethoxazole

20 % và trimethoprim 6% Thuốc có tác dụng đặc trị các bệnh đường tiêu hóa – chướng hơi, phình ruột Hiệu quả cao trong việc trị các bệnh nhiễm của cá

do vi khuẩn gây ra, đặc hiệu trên các giống vi khuẩn Vibrio, Pseudomonas,

Hình 2.2 Công thức cấu tạo TMP

Enterobacteria, Aeromonas, Filamentous bacteria gây bệnh viêm dạ dày –

ruột, sình bụng, lòi mắt, chướng hơi, bệnh lở loét, tuột nhớt, tuột vảy, mòn đuôi, đốm trắng, đốm đỏ, xuất huyết

Trimesul được sử dụng bằng cách trộn chung với thức ăn cho thủy sản Trộn vào thức ăn cho cá liên tục 5 – 7 ngày theo liều sau: 5g/kg thức ăn, dùng cho 20kg cá

Giống cá tra dầu Pangasianodon

Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878, Fish base)

2.5.2 Phân bố

Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mekong, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan Ở Thái Lan còn gặp chúng ở lưu vực sông Mekong và Chao phraya

Ở nước ta những năm trước đây, khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu Cá trưởng thành chỉ thấy trên ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên Việt Nam đã thành công trong sinh sản nhân tạo và đã đáp ứng được nhu cầu về giống cho nghề nuôi thương phẩm

Cá tra là một trong những loài cá có giá trị kinh tế phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long Đây là loài cá có kích thước lớn, dễ nuôi, tăng trọng nhanh Hiện nay cá tra có nguồn gốc sinh sản nhân tạo đã được thả nuôi ổn

định và là một trong những đối tượng nuôi trồng thủy sản đang được phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Năng suất nuôi cá Tra rất cao, trong ao đạt tới 60 – 70 tấn/ ha, trong bè có thể đạt tới 100 – 300kg/m3 nước bè nuôi Tập trung nhiều tại An Giang và Đồng Tháp, và là một trong những loài cá có giá trị xuất khẩu cao

Cá tra ngoài tự nhiên phân bố ở những sông, hồ, kinh, rạch, mương vùng nước ngọt, sống ở các thủy vực nước tĩnh và nước chảy Cá cũng được nuôi với hình thức nuôi bè, ao, hầm

2.5.3 Hình thái sinh lý

Cá tra là cá da trơn (không vảy) thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, có 2 đôi râu dài Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống

ở vùng nước hơi lợ (nồng độ muối từ 7 – 10% ) có thể chịu đựng được nước

phèn với pH từ 6,0 – 8,0 (Dương Nhật Long, 2003) Cá dễ chết ở nhiệt độ thấp

≤ 150C nhưng chịu nóng đến 390C (Hội nghề cá Việt Nam VINAFISH, 2004) Oxy thích hợp cho sự phát triển của cá là ≥ 3,0 (Thông tư số 45/2010/TT-

BNNPTNT)

Cá tra có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường thiếu oxy hòa tan, cá có ngưỡng oxy thấp nên sống được ở ao tù nước bẩn

2.5.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp, thậm chí cá vớt trên sông vẫn thấy chúng ăn nhau trong đáy vớt cá bột Chúng ăn các loại phù du động vật có kích thước vừa cở miệng chúng

Khi cá lớn tính ăn tạp thiên về động vật và dễ chuyển đổi loại thức ăn Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức

ăn bắt buộc như mùn, bã hữu cơ, động vật đáy

2.5.5 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra có tốc độ sinh trưởng tương đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10 – 12cm (14 – 15g/con) Từ khoảng 2,5 kg trở đi mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18kg/con hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m

Nuôi trong ao một năm cá đạt 1 – 1,5kg/con Những năm sau cá tăng trọng nhanh hơn có khi đạt tới 5 – 6kg/con/năm Tùy môi trường sống và sự cung cấp thức ăn cũng như loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hoặc ít Độ

béo của cá tăng dần theo trọng lượng và nhanh nhất ở những năm đầu Cá đực thường có độ béo cao hơn cá cái và độ béo thường giảm đi khi vào mùa sinh sản

2.6 Tổng quan về cá rô phi đỏ

Hình 2.4 Cá rô phi đỏ (Oreochromis sp)

2.6.2 Đặc điểm dinh dưỡng

Tất cả các loài rô phi đều có tính ăn tạp, tuy nhiên thức ăn ưa thích của

rô phi là những sinh vật thuỷ sinh lơ lửng trong nước Ngoài ra rô phi còn có khả năng sử dụng trực tiếp những loại thức ăn do con người cung cấp như cám, tấm, các loại rong bèo (bèo tấm, bèo hoa dâu) Đây là đặc điểm rất thuận lợi cho nghề nuôi cá

Cá rô phi đỏ có thể sống được cả môi trường nước ngọt và nước lợ, pH

từ 5 – 9, thích hợp nhất là 6,8 – 8,3 nhiệt độ dao động từ 7 – 450C, tốt nhất là

từ 25 – 320C Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của cá rô phi là 20 –

350C, tối ưu ở 28 – 300C Trên 320C tốc độ tăng trưởng và tiêu thụ thức ăn tỷ

lệ nghịch với quá trình tăng nhiệt độ Khi nhiệt độ dưới 200C cá tăng trưởng chậm và ngừng ăn khi dưới 150C Dưới 100C tỷ lệ cá chết rất nhiều Giới hạn nhiệt độ gây chết là 110C và 420

C (Nguyễn Việt Dũng, 2008)

2.6.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Sau một tháng tuổi cá con có thể đạt trọng lượng 2 – 3g/con và sau khoảng 2 tháng tuổi có thể đạt 10 – 12g/con Cá cái sẽ lớn chậm hơn sau khi tham gia sinh sản trong khi đó cáđực vẫn lớn bình thường vì vậy trong đàn cá

rô phi thì cá đực bao giờ cũng có kích thước lớn hơn cá cái Sau khoảng 5 – 6 tháng nuôi cá rô phi vằn đực có thể đạt 200 – 250g/con và cá cái có thể đạt

150 – 200g/con

2.7 Các phương pháp xác định dư lượng Sulfamid và Trimethoprim

2.7.1 Phương pháp xác định dư lượng sulfamid theo TCN196:2004: Sulfamid trong sản phẩm thuỷ sản – Phương pháp định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004, qui định phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxypiridazine, sulfacloropyridazin, sulfadoxin, sulfamethoxazone, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin) trong sản phẩm thủy sản bằng HPLC đầu dò huỳnh quang Các chất nhóm sulfonamide có trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng hỗn hợp acetonitril và dichlorometan Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamine để tạo dẫn xuất huỳnh quang Hàm lượng các dẫn xuất được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn

Kháng sinh Sulfamid trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng acetonitril và dichlorometan Cột sắc ký: Cột Nucleosil 250 x 3 mm 100-5 C18

AB

Pha động bao gồm dung dịch H3PO4 0,02 M (hòa tan 2,3 g H3PO4 85% với nước cất rồi định mức thành 1000 ml) và hỗn hợp dung dịch methanol và acetonitril (tỷ lệ 1:1) (hòa tan 500 mL methanol trong 500 mL acetonitril) Pha động được chạy theo chương trình cụ thể như sau:

Bảng 2.2 Chương trình pha động

H3PO4 0,02 M

Hỗn hợp dung dịch methanol và acetonitril (tỷ lệ1:1)

2.7.2 Phương pháp xác định đồng thời sulfadiazin và trimethoprim trên

cá vền biển bằng HPLC (Papapanagiotou et al., 2013)

Phương pháp này dựa trên chất chuẩn Sigma (StLouis, MO, Hoa Kỳ) nhằm xác định đồng thời cả hai kháng sinh sulfadiazin (SDZ) và trimethoprim (TMP)trong cùng một điều kiện Mẫu được chiết tách bằng dichlorometan với

pH khoảng 3 Cột sắc ký Nucleosil 100 RP C18 (250 x 4,6 mm x 5µm) Pha động bao gồm acetonitrile: axit photphoric với tỉ lệ 16:84, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, phát hiện nhạy nhất ở bước sóng 271 nm

Độ tồn lưu của SDZ và TMP trong mẫu cá vền biển sau thời gian 7 ngày kể từ khi ngừng cho ăn thức ăn chứa kháng sinh được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Mức độ tồn lưu của SDZ và TMP trong mẫu cá vền biển sau 7 ngày ngừng cho ăn thức ăn chứa kháng sinh (ng/g)

Phương pháp nghiên cứu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách

và xác định các SAs, tối ưu quá trình xử lý mẫu, ứng dụng phân tích trên một

số mẫu thực tế Mẫu được chiết tách theo phương pháp QuEChERS với nguyên tắc: chiết các SAs ra khỏi nền mẫu bằng ACN, loại nước bằng MgSO4 khan, làm sạch dịch chiết bằng phân tán pha rắn với bột PSA (primary secondary amine) và bơm vào hệ LC-MS/MS Cột sắc ký loại C18 (150mm x 2,1mm x 3,5μm) của Agilent (USA) Pha động bao gồm nước chứa 0,1% acid formic và acetonitril, tốc độ pha động 0,4 ml/phút, nhiệt độ cột tách 300C Bảng 2.2 Điều kiện phân mảnh

STT Ion mẹ Ion con DP (eV) CE (eV) CXP (eV)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Bộ môn dinh dưỡng và chế biến – Khoa Thủy sản – Trường Đại Học Cần Thơ

 Hóa chất cho phân tích

- Chuẩn sulfamethoxazole dạng rắn  98% (Dr Ehrenstorfer, Germany)

- Chuẩn trimethoprim dạng rắn  98% (Dr Ehrenstorfer, Germany)

- Nước dùng cho UPLC (Merck, Germany)

- Acetonitril (Merck, Germany)

- Acid acetic 100% (JT Baker, USA)

- Acid formic 99% (Merck, Germany)

- MgSO4 (JT Backer, USA)

- NaCl (Merck, Germany)

- Bột C18 Bondesil C18 40 µm, 100 mg (Agilent, USA)

- PSA (Agilent, USA)

 Thiết bị

- Máy ly tâm 50 RS (Hettich zentrifugen, Germany)

- Máy lắc (Multi – Shaker, Japan)

- Bể đánh siêu âm Elma (Elamasonic, Germany)

- UPLC (Acquity of Water, USA)

- Đầu dò: Xevo TQ MS (Water, USA), sử dụng phần mềm MassLynx 4.1, phần mềm định lƣợng TargetLynx

- Bộ đựng mẫu cho vào máy UPLC (Water N/P, USA)

- Cột sắc ký Acquity UPLC BEH C18 (1,7, 3µm x100mm) có gắn cột bảo vệ cùng loại (Waters, USA)

 Điều kiện phân mảnh

(m/z)

Ion con (m/z)

Dwell(s) Cone(v) Collision(v)

Sulfamethoxazole 254.1

92.1 156.1*

0.025 0.025

0.02 0.02

- Cân 2 g mẫu phân tích

- Chiết bằng 10 mL dung dịch: 1% CH3COOH trong ACN

- Thổi khô dưới dòng khí nitrogen 500C

- Hút 1 mL pha động vào hoàn nguyên Pha động bao gồm ACN và 0,1 acid formic với tỷ lệ 20:80

- Đánh siêu âm vài phút, vortex

- Lọc và cho vào vial

- Bơm mẫu vào LC-MS/MS

3.3 Thí nghiệm: Xác định thời gian tồn lưu kháng sinh sulfamethoxazole

và trimethoprim trên nguyên liệu cá tra và cá rô phi đỏ

3.3.1 Xác định thời gian tồn lưu của kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trong mẫu thức ăn thí nghiệm

100g có 20g sulfamethoxazole và 6g trimethoprim

=>5g thuốc chứa 1g sulfamethoxazole và 0,3g trimethoprim

Liều lượng: 5g thuốc dùng cho 1kg thức ăn

Thuốc kháng sinh được bổ sung bằng cách cân 5g thuốc pha với 100mL nước cất rồi sau đó phun đều lên 1kg thức ăn và trộn đều với 5mL dầu mực Thức ăn được phối trộn sử dụng trong ngày

 Mục đích

Xác định hàm lượng kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim có trong thức ăn

 Phương pháp tiến hành

 Thu mẫu phân tích

Mẫu thức ăn được thu lại sau khi phối trộn kháng sinh sẽ được bảo quản ở nhiệt độ -200C trước khi tiến hành phân tích

Cá thí nghiệm được mua về và được nuôi trong bể 2 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm

Tại vị trí 0 * ngày là ngày thu mẫu trước khi cho ăn thức ăn chứa kháng sinh

Chuẩn bị mẫu cá phân tích

Cá tra sau khi thu mẫu sẽ tiến hành fillet tách riêng cơ và da, cắt nhỏ, xay nhuyễn cơ và cắt nhỏ da cho vào ống ly tâm 15 mL Đối với cá rô phi đỏ thu mẫu tương tự nhưng không tách da và cơ riêng Mẫu xử lý xong được bảo quản ở nhiệt độ -200C trước khi phân tích

3.3 Xử lí số liệu

Tất cả các số liệu được xử lí bằng Microsoft Excel

Giá trị trung bình được tính bằng hàm AVERAGE

Giá trị độ lệch chuẩn được tình bằng hàm STDEV

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm xác định tồn lưu của kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim trên cá tra

4.1.1 Yếu tố môi trường

4.1.1.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.1

Bảng 4.1: Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm trên cá tra

Thí nghiệm Nhiệt độ trung bình các ngày thu mẫu (

C – 300C

4.1.1.2 pH

Giá trị pH trong quá trình thí nghiệm được ghi nhận và trình bày trong bảng 4.2

Bảng 4.2 pH trung bình trong quá trình thí nghi ệm trên cá tra

Nhìn chung giá trị pH trong quá trình thí nghiệm nằm trong khoảng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cá tra, dao động trong khoảng

từ 6,6 đến 6,9 pH giữa các buổi chênh lệch không nhiều

Thí nghiệm pH trung bình các ngày thu mẫu (

4.1.1.3 Oxy hòa tan

Hàm lượng oxy hòa tan trong nước trong quá trình thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.3

Bảng 4.3 Lượng oxy hòa tan trong nư ớc trong quá trình thí nghiệm trên cá tra

4.1.2 Tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trong mẫu thức ăn

Kết quả phân tích làm lượng SMX trong mẫu thức ăn 674±10,13 mg/kg

và TMP là 113±11,0 mg/kg Theo lý thuyết, SMX và TMP lần lượt được gây nhiễm với nồng độ là 1000 mg/kg và 300 mg/kg Vậy kết quả phân tích của SMX, đạt 67,4% so với yêu cầu, còn TMP đạt 37,8% so với yêu cầu Kết quả trên do nguyên nhân chính là quá trình phối trộn thao tác chưa đều và do chất lượng hóa chất sử dụng

4.1.3 Tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trong da cá tra

Kết quả phân tích tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trên da cá tra được trình bày trong bảng sau:

Bảng 4.4a Tồn lưu SMX và TMP trên da cá tra trong 5 ngày cho ăn kháng sinh

Ngày 0* 1 ngày (µg/kg) 5 ngày (µg/kg)

LOD của SMX và TMP là 1µg/kg

Sau 5 ngày liên tiếp cho cá tra ăn thức ăn có chứa kháng sinh với nồng

độ SMX là 675 mg/kg và TMP là 113 mg/kg, dư lượng kháng sinh SMX và TMP trên da đạt cao nhất lần lượt là 726±60,4 µg/kg và 203±93,0 µg/kg Như vậy, khi cho cá ăn kháng sinh SMX và TMP có sự tích lũy hai loại kháng sinh này

Bảng 4.4b Tồn lưu SMX và TMP trên da cá tra sau 15 ngày ngừng cho ăn kháng sinh

3 ngày (µg/kg) 7 ngày (µg/kg) 15 ngày (µg/kg)

dư lượng kháng sinh của SMX trên da cá tra là 2,4±0,5 µg/kg thấp hơn so với nồng độ quy định cho phép của cộng đồng châu Âu và FDA của Mỹ (MRL của SMX ≤ 100 µg/kg) Riêng kháng sinh TMP sau 7 ngày ngừng gây nhiễm,

dư lượng tồn lưu đã thấp hơn nồng độ cho phép (MRL của TMP ≤ 50 µg/kg)

Dư lượng SMX giảm nhanh hơn so với TMP trên cùng một mẫu và cùng điều kiện thí nghiệm Sau khi ngừng cho cá ăn thức ăn chứa kháng sinh

15 ngày, dư lượng tồn lưu đều dưới mức cho phép Riêng TMP do gây nhiễm

ở nồng độ thấp hơn nhiều so với SMX nên thời gian đào thải ngắn loại bỏ hoàn toàn dư lượng ngắn hơn chỉ 7 ngày thì tồn lưu dưới giới hạn phát hiện (Hình 4.1) Tồn lưu SMX và TMP trên da sau khi ngừng cho cá ăn thuốc 7

ngày cao hơn so với trên cơ Theo Stoffegren et al (1997) cho rằng

enrofloxacin tồn lưu trên da lâu hơn trên cơ

Hình 4.1 Đồ thị thể hiện dư lượng kháng sinh SMX và TMP trên da cá tra theo thời gian

4.1.4 Tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trên cơ cá tra

Kết quả phân tích tồn lưu sulfamethoxazole và trimethoprim trên da cá tra được trình bày trong bảng sau:

Bảng 4.5a Tồn lưu SMX và TMP trên cơ cá tra trong 5 ngày liên tiếp cho ăn thức ăn chứa kháng sinh

LOD: của SMX và TMP là 1µg/kg

Dựa vào bảng 4.5a tồn lưu 2 kháng sinh SMX và TMP nhìn chung đều đạt cao nhất ở ngày thứ 5 sau 5 ngày liên tiếp cho ăn thức ăn chứa kháng sinh

do lượng kháng sinh cá ăn vào được tích lũy lại So với kết quả phân tích trên

da thì tồn lưu trên cơ thấp hơn Sau 5 ngày dư lượng SMX trên cơ là 577±180µg/kg, dư lượng TMP là sau 5 ngày ngừng cho ăn thuốc trên cơ là 92,5±83,7µg/kg

Ngày 0* (µg/kg) 1 Ngày (µg/kg) 5 Ngày (µg/kg)