Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) trên môi trường nuôi cấy lỏng.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - - NGUYỄN THỊ THU HIỀN Nghiên cứu khả nhân nhanh lan điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) mơi trường ni cấy lỏng KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AIA : axit indol axetic BA : – benzyl adenine BAP : – benzyl aminopurine B5 : gamborg cs : cộng CT : công thức 2,4 – D : diclorophenoxyacetic acide ĐHQG – HCM : Đại học Quốc gia – Hồ Chí Minh GA : gibberellic acid IAA : indole – acetic acide IBA : indol – butyric acide KIN : kinetin MS : Murashinge & Skoog (1962) M6 : Chu et all (1975) NAA : α – napthalen acetic acide NOA : naphthoxyacetic acid N–6 : delta – isopentenyl TDZ : thidiazuron DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Tên bảng Ảnh hưởng lượng mẫu đưa vào đến khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng Ảnh hưởng nồng độ đường sucrose đến khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng môi trường lỏng So sánh khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng môi trường lỏng đặc Ảnh hưởng KIN, BAP, IBA đến khả nhân chồi in vitro lan điểm hồng Trang 19 22 24 26 28 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 3.2 3.3 3.4 Tên biểu đồ Ảnh hưởng lượng mẫu đưa vào đến khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng Ảnh hưởng nồng độ đường sucrose đến khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng So sánh khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng môi trường lỏng đặc Trang 20 22 25 26 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 3.1 3.2 3.3 Tên hình Lan điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) Protocorm phát sinh sau 15 ngày nuôi cấy với lượng mẫu nuôi cấy ban đầu khác Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy Trang 16 21 23 25 3.4 Protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy 27 3.2 Nhân chồi in vitro lan điểm hồng sau 60 ngày nuôi cấy 28 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, hoa lan trở thành mặt hàng có giá trị kinh doanh, xuất Thế giới Đặc biệt nước thuộc châu Á nhiệt đới Thái Lan, Singapore, Philippin, Indonesia…Thái Lan nước điển hình nuôi trồng xuất hoa lan [6] Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới ẩm Các loài lan rừng Việt Nam thành phần quan trọng cấu thành hệ sinh thái rừng Việt Nam tạo nên cho Việt Nam thành vùng phân bố loài lan quý Thế giới [6] Tuy nhiên thời gian gần hệ sinh thái rừng Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng dẫn đến việc thu hẹp nơi sinh sống loài lan rừng việc khai thác mức làm cho nhiều lồi có nguy tuyệt chủng cục Bằng kĩ thuật nuôi cấy phương pháp nuôi cấy ngập chìm điều kiện vơ trùng phận thể thực vật, phương pháp nuôi cấy in vitro ngập chìm cho số lượng lớn đồng mặt di truyền cách nhanh chóng, đồng thời bảo tồn phục hồi lồi q có hiệu Ứng dụng kĩ thuật vào sản xuất giải vấn đề bảo tồn đa dạng sinh học mà mở hướng cho sản xuất kinh doanh trồng loài dược liệu, hoa kiểng,… Trong số giống lan nước ta như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… Dendrobium chi lớn có giá trị kinh tế cao Nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) loài lan thuộc chi Dendrobium Đây loài lan đẹp, nằm sách đỏ Việt Nam có giá trị kinh tế cao Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh lan điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) môi trường nuôi cấy lỏng” Mục đích đề tài Xây dựng quy trình nhân nhanh lan điểm hồng kỹ thuật nuôi cấy in vitro môi trường lỏng Nội dung đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả nhân protocorm lan điểm hồng: lượng mẫu (protocorm) nuôi cấy ban đầu, tốc độ lắc, hàm lượng đường sucrose - So sánh khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng môi trường đặc - Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp chất KTST (BAP, KIN, IBA) lên khả nhân chồi từ protocorm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lan Dendrobium 1.1.2 Nguồn gốc phân bố Giống lan đặt tên vào năm 1799 Chữ Dendrobium có nguồn gốc chữ Hy Lạp Dendro có nghĩa gỗ, lớn; bio sống, tất lồi Dendrobium phụ sinh bám gỗ Dendrobium phong phú chủng loại, loài lớn thứ hai họ lan với khoảng 1600 loài phân bố vùng thuộc nhiệt đới châu Á, tập trung nhiều Đông Nam Á Úc châu Điều kiện sinh thái Dendrobium đa dạng có nhiều loài mọc hoa vùng lạnh, có lồi vùng nóng, có lồi trung gian có lồi thích nghi với điều kiện khí hậu [4] 1.1.3 Đặc điểm hình thái Dendrobium loại đa thân với nhiều giả hành, giả hành thường mang thân với nhiều mọc xen kẽ, thân có nhiều mắt ngủ Hoa mọc từ thân thành chùm hoa hay hoa đơn độc Hoa có màu trắng, vàng đến tím [4] Dendrobium chia làm hai nhóm theo dạng thân chúng: dạng thòng hay Nobile dạng thân mềm thường vùng lạnh Đà Lạt; dạng đứng hay Phalaenopsis dạng thân cứng thường sống vùng có khí hậu nóng [4] Hình dạng Dendrobium biến thiên: nhóm có giả hành dài mang dọc theo chiều dài giả hành ấy, thường rụng hết hoa Long Tu (Dendrobium primulinum), Ý Thảo (Dendrobium grastio sisimum)…; nhóm giả hành to, ngắn, tận thường có 2-3 dài, bền, không rụng Hoa tập trung phần tạo thành chùm đứng hay thòng Thủy Tiên trắng (Dendrobium farmeri), Thủy Tiên vàng (Dendrobium thyrisflorum)… Nhóm giả hành mảnh mai, dài hay ngắn, có mọc theo chiều dài chúng, dai, bền, không rụng Hoa thường cô độc nách Hương Duyên (Dendrobium revolutum)… 1.2 Vài nét lan điểm hồng 1.2.1 Nơi phân bố Nhất điểm hồng Dendrobium draconis mục sư C.P.S Parish tìm Miến Điện vào năm 1862 Cây lan mọc khắp Đông Nam Á Tại Việt Nam lan mọc Đà Nẵng, Nha Trang, Langbian, Đà Lạt, Sơng Bé, Lộc Ninh Theo sách Phạm Hồng Hộ Trần Hợp gọi điểm hồng [1] 1.2.2 Đặc điểm thực vật học Đây giống phong lan cao chừng 40 cm có 7-9 đốt với vỏ bọc đầy lông đen Hoa nở vào mùa Xuân, màu trắng, họng có màu đỏ hay đỏ cam, ngang to 6-7 phân, thơm mùi cam, quýt, lâu tàn mọc từ đốt gần thân năm trước [5] Cây mọc núi, thích hợp với thời tiết mát mẻ, sống chậu giá thể 1.2.3 Hiện trạng nghiên cứu lan điểm hồng 1.2.3.1 Hiện trạng Thuộc loài lan quý nằm sách đỏ Việt Nam 1.2.3.2 Những nghiên cứu lan điểm hồng Rangsayatorn cs nghiên cứu việc bảo tồn giống Dendrobium draconis từ hạt sau tạo protocorm chuyển thành chồi Kết cho thấy môi trường Vacin Went bổ sung 200 ml/l nước dừa phát triển tốt nhất, số lượng chồi phát triển tốt [21] Rangsayatorn nghiên cứu khả nhân nhanh chồi lan điểm hồng chồi với môi trường MS bổ sung mg/l BA 1mg/l NAA [20] Phan Hùng Vĩnh cs nghiên cứu nhân giống in vitro lan điểm hồng (Dendrobium draconis) loài lan rừng quý [18] Lê Thị Nhung nghiên cứu khả nhân nhanh chồi in vitro lan Nhất Diểm Hồng (Dendrobium dranconis Rchb.f) mơi trường lỏng [6] Nhìn chung nghiên cứu lan điểm hồng Thế giới chưa nhiều bắt đầu Việt Nam Những nghiên cứu nghiên cứu bước đầu số tổ hợp môi trường chưa nghiên cứu tồn diện để tìm mơi trường tối ưu cho việc nhân giống loài lan kĩ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật 1.3 Tình hình ni trồng, sản xuất hoa lan Thế giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình ni trồng sản xuất hoa lan Thế giới Ở châu Á, hoa lan biết đến đưa vào nuôi trồng từ sớm Đến kỉ 20, người Anh đến Singapore mở đầu cho giai đoạn lập trại nuôi trồng hoa lan kỹ thuật nuôi trồng lan Các giống lan nuôi trồng là: Arachnis, Vanda, Oncidium…đồng thời lai tạo loài Đầu kỷ 20, kỹ thuật gieo trồng hoa lan từ nhiều nấm cộng sinh có từ lan mẹ bắt đầu mở giai đoạn Với kĩ thuật nhân giống hạt mở khả phát triển ngành lan Châu Âu Thế giới Từ năm 1957, Thái Lan, Indonexia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy mô ngày lớn phục vụ cho việc xuất Các loài lan rừng, lan lai, lan cắt cành Thái Lan xuất qua nhiều nước Thế giới Có thể nói Thái Lan nước điển hình cho ngành ni trồng xuất hoa lan nước Châu Á Công nghiệp sản xuất, xuất hoa lan Thái Lan Thong Lor Rakhpa Busobat Bangkok Sau thành cơng Thong Lor việc sản xuất kinh doanh hoa lan rộng sang Ấn Độ, Sri Lanka, Philippin đến Thái Lan học hỏi kinh nghiệm sản xuất kinh doanh hoa lan Mọi kỹ thuật nhân giống nuôi trồng hoa lan trở thành phận chủ yếu ngành trồng hoa cảnh xuất nhiều nước Việc nuôi trồng để xuất hoa lan nhiều nước đạt đến số lượng hàng trăm ngàn giò lan cành lan năm Nhu cầu trồng hoa lan quy mô công nghiệp ngày phát triển Ở nhiều nước nhà nuôi trồng hoa lan nghiệp dư chuyên nghiệp lập hội hoa lan ngày nhiều Đã có 400 hội hoa lan Thế giới có nhiều chuyên sang hoa lan xuất Nhiều hội thảo hoa lan quốc tế tổ chức [4] 10 2.2.3 Xử lý số liệu Kết phân tích xử lý thống kê phần mềm Microsoft excel 2007 phương pháp thống kê sinh học 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng số điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả nhân protocorm lan điểm hồng Hạt lan nảy mầm sản xuất khối tế bào chưa phân hóa rõ ràng gọi protocorm Tất protocorm tiếp tục phát triển nhiều tuần, nhiều tháng hay chí nhiều năm phụ thuộc lồi đủ lớn để tạo rễ (McKendrick, 2000) [16] Vì việc tìm mơi trường, điều kiện ni cấy thích hợp ni cấy lỏng để nhân nhanh protocorm, làm sở cho việc sản xuất nhanh giống lan điểm hồng có ý nghĩa thực tiễn lớn 3.1.1 Ảnh hưởng lượng sinh khối protocorm nuôi cấy ban đầu Protocorm (2 tháng tuổi) nuôi cấy bình tam giác 250 ml chứa 50 ml mơi trường MS + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + mg/l BAP + mg/l NAA với lượng mẫu nuôi cấy ban đầu 1, 3, 5, gam Kết thu sau 15 ngày trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng lượng mẫu đưa vào đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy Lượng mẫu nuôi cấy ban đầu (g) Lượng mẫu (protocorm) sau 15 ngày (g) Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 1.59 4.76 7.82 8.8 59.00% 58.56% 56.33% 25.71% 24 70% 60% 59.00% 58.56% 56.33% 50% 40% 30% 25.71% 20% Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 10% 0% gam gam gam gam Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng lượng mẫu đưa vào đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy Kết bảng 3.1 biểu đồ 3.1 cho thấy, lượng mẫu đưa vào có tác động đến hình thành protocorm Với 50ml mơi trường lỏng ni cấy điều kiện sau 15 ngày nuôi cấy, lượng mẫu nuôi cấy ban đầu gam có tỷ lệ tăng cao (59%), tiếp đến gam (58,56%) gam (56,33%) với tỷ lệ tăng xấp xỉ nhau, thấp mẫu gam với tỷ lệ tăng đạt 25,71% đồng thời protocorm bị hóa nâu Như vậy, qua kết khảo sát nhận thấy lượng mẫu nuôi cấy ban đầu gam thích hợp cho nhân nhanh protocorm 25 Hình 3.1 Protocorm phát sinh sau 15 ngày nuôi cấy với lượng mẫu nuôi cấy ban đầu khác (a): lượng mẫu nuôi cấy ban đầu 1g; (b): lượng mẫu nuôi cấy ban đầu 3g; (c): lượng mẫu nuôi cấy ban đầu 5g; (d): lượng mẫu nuôi cấy ban đầu 7g 3.1.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc Nuôi cấy lỏng lắc giúp tăng tối đa việc phát triển mô qua việc loại trừ tượng phân cực nó; ngăn chặn ức chế mơ tiết cách hòa tan chất này; giúp mơi trường thống khí, qua hơ hấp, tổng hợp protein hấp thụ muối khống tế bào; mơi trường lỏng gia tăng bề mặt tiếp xúc mô chất dinh dưỡng Tốc độ lắc nuôi cấy lỏng liên quan nhiều đến khả tăng sinh tế bào Đó tốc độ lắc ảnh hưởng đến lưu thơng bình ni cấy nồng độ oxy hồ tan (DO) bình Trong thí nghiệm chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng tốc độ lắc khác lên khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng Protocorm (2 tháng tuổi) nuôi cấy bình tam giác 250 ml chứa 50ml mơi trường MS + 2mg/l BAP + 1mg/l NAA + 30g/l đường sucrose + 5g lượng 26 mẫu nuôi cấy ban đầu, đặt máy lắc với tốc độ 80, 100, 120 vòng/phút Kết sau 15 ngày ni cấy trình bày bảng 3.2 biểu đồ 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày ni cấy Tốc độ lắc 80 vòng/phút 100 vòng/phút 120 vòng/phút Lượng mẫu (protocorm) sau 15 ngày (g) 7.72 9.07 8.52 90% Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 54.33% 81.40% 70.33% 81.40% 80% 70.33% 70% 60% 54.33% Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 50% 40% 30% 20% 10% 0% 80 vòng/phút 100 vòng/phút 120 vòng/phút Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy Khi ni cấy mơi trường lỏng lắc vòng, khối protocorm bị vỡ nhiều mảnh nhỏ, mảnh hình thành khối protocorm Căn vào bảng 3.2, nhận thấy với tốc độ lắc 100 vòng/phút tỷ lệ tăng khối lượng protocorm (81,40%) cao Khi tăng tốc độ lắc lên 120 vòng/ phút khối protocorm bị vỡ va đập mạnh vào nhau, vào thành bình khó hình thành khối protocorm dẫn đến tỷ lệ tăng khối lượng giảm 70,33% Và giảm tốc độ lắc xuống 80 vòng/ phút xảy tượng yếm khí tốc độ lắc chậm, protocorm bị hóa nâu (chết), tỷ lệ tăng khối lượng đạt 54,33% 27 Hình 3.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy (a): Tốc độ lắc 80 vòng/phút; (b): tốc độ lắc 100 vòng/phút; (c): tốc độ lắc 120 vòng/phút 3.1.3 Ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng, nhiều trường hợp chúng sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo lục lạp có khả quang hợp Vì việc đưa vào mơi trường ni cấy nguồn carbon hữu điều bắt buộc Nguồn carbon thông dụng kiểm chứng sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến 2-3%, song phụ thuộc vào mục đích ni cấy mà thay đổi có giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước) Trong thí nghiệm tiến hành khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose khác lên khả nhân protocorm lan điểm hồng Sử dụng 5g protocorm (2 tháng tuổi) ni cấy bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường MS + 15% nước dừa + 2mg/l BAP + 1mg/l NAA với nồng 28 độ đường sucrose 10, 20, 30, 40 g/l, đặt máy lắc 100 vòng/phút Kết sau 15 ngày ni cấy trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy Hàm lượng đường sucrose 10 g/l 20 g/l 30 g/l 40 g/l Lượng mẫu (protocorm) sau 15 ngày (g) 6.31 8.97 7.88 7.97 Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 26.13% 79.33% 57.53% 59.33% Kết bảng 3.3 cho thấy nồng độ đường sucrose có vai trò quan trọng đến phát sinh protocorm Với hàm lượng đường sucrose 10 g/l sau 15 ngày nuôi cấy tỷ lệ tăng protocorm thấp (26,13%), tăng hàm lượng lên 20 g/l tỷ lệ tăng protocorm đạt cao (79,33%) Nhưng tăng hàm lượng đường sucrose lên 30, 40 g/l tỷ lệ tăng lại giảm xuống 57,53% 59,33% Như vậy, qua khảo sát nhận thấy hàm lượng đường sucrose thích hợp cho nhân nhanh protocorm lan điểm hồng môi trường lỏng 20 g/l 29 90% 79.33% 80% 70% 57.53% 60% 59.33% 50% Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 40% 30% 26.13% 20% 10% 0% 10 g/l 20 g/l 30 g/l 40 g/l Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày ni cấy Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy (a): Hàm lượng đường sucrose 10 g/l; (b): hàm lượng đường sucrose 20 g/l; (c): hàm lượng đường sucrose 30 g/l; (c): hàm lượng đường sucrose 40 g/l 30 3.2 So sánh khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng môi trường đặc Sử dụng 5g protocorm (2 tháng tuổi) ni cấy bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường MS + 15% nước dừa + 20g/l đường sucrose + 2mg/l BAP + 1mg/l NAA, đặt máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút Sử dụng 5g protocorm (2 tháng tuổi) ni cấy môi trường MS + 15% nước dừa + 20g/l đường sucrose + 0,8% agar + 2mg/l BAP + 1mg/l NAA Sau 15 ngày ni cấy, kết trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 So sánh khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng môi trường lỏng đặc sau 15 ngày nuôi cấy Môi trường khảo sát Lỏng Đặc 90% 80% Lượng mẫu (protocorm) sau 15 ngày (g) 7,05 Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 80.00% 41.00% 80% 70% 60% 50% 41% 40% 30% Phần trăm lượng mẫu tăng sau 15 ngày nuôi cấy 20% 10% 0% MT lỏng MT đặc Biểu đồ 3.4 So sánh khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng môi trường lỏng đặc sau 15 ngày nuôi cấy Bảng 3.4 biểu đồ 3.4 cho thấy, với lượng mẫu gam ni cấy ban đầu sau 15 ngày, tỷ lệ tăng lượng protocorm môi trường lỏng (80%) cao 31 gần gấp hai lần so với môi trường đặc (41%) Như vậy, kết luận khả nhân nhanh protocorm lan Nhất Điểm hồng môi trường lỏng hiệu Theo D Puchooa so sánh phát triển tế bào lan Dendrobium môi trường nuôi cấy in vitro khác Trong tất môi trường nghiên cứu để tăng sinh protocorm, số lượng tạo nhiều môi trường lỏng MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, mg/l NAA, 15% nước dừa với tốc độ lắc 80 vòng/ phút [20] Kết nghiên cứu cho thấy môi trường lỏng MS bổ sung mg/l BAP, mg/l NAA, 20g/l đường sucrose, 15% nước dừa với tốc độ lắc 100 vòng/phút khả phát sinh protocorm cao Hình 3.4 Protocorm lan điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy; (a): protocorm môi trường đặc sau 15 ngày nuôi cấy; (b): protocorm môi trường lỏng sau 15 ngày nuôi cấy 3.3 Ảnh hưởng tổ hợp chất KTST (BAP, KIN, IBA) lên khả nhân chồi từ protocorm Chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt auxin cytokinin có vai trò đặc biệt quan trọng q trình tăng trưởng phát triển thực vật Sẽ tăng trưởng khơng có mặt chất điều hòa sinh trưởng Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng phối hợp chất KTST khác (BAP, KIN, IBA) lên khả nhân chồi lan điểm hồng sau 60 ngày nuôi cấy với kết thu bảng 3.5 32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng KIN, BAP, IBA đến khả nhân chồi in vitro lan điểm hồng sau 60 ngày nuôi cấy Chất KTST (mg/l) KIN 1,5 Khả nhân chồi từ protocom BAP IBA Số chồi/ protocorm Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi 0,5 - 4,56 ± 1,88 0,29 ± 0,28 2,71 ± 1,04 1,0 - 4,22 ± 2.86 0,15 ± 0,1 2,47 ± 0,86 1,5 - 5,44 ± 3,68 0,16 ± 0,11 2,41 ± 0,73 2,0 - ± 3,46 0,17 ± 0,1 2,31 ± 0,62 2,5 - 5,78 ± 4,02 0,14 ± 0,07 2,46 ± 0,75 - 0,25 4,07 ± 4,1 0,21 ± 0,23 2,71 ± 1,25 - 0,5 3,63 ± 3,5 0,58 ± 0,38 3,44 ± 1,1 - 0,75 6,63 ± 5,04 0,16 ± 0,16 2,44 ± 1,01 - 1,0 6,15 ± 4,03 0,5 ± 0,33 3,53 ± 1,33 Hình 3.5 Nhân chồi in vitro lan điểm hồng sau 60 ngày nuôi cấy (a): Chồi phát sinh môi trường MS + 1,5 mg/l KIN + 0,5 mg/l BAP; (b): Chồi phát sinh môi trường MS + 1,5 mg/l KIN + mg/l IBA Kết bảng 3.5 cho thấy mơi trường có bổ sung 1,5 mg/l KIN phối hợp với (0,5 – 2,5) mg/l BAP phối hợp với (0,25 – 1)mg/ l IBA có khả phát sinh chồi từ protocorm Ở môi trường bổ sung 1,5 mg/l KIN 1,0 mg/l 33 IBA khả phát sinh chồi cao (6,63 chồi/ protocorm) chiều cao chồi đạt 0,5 cm (hình 3.5b) Điều cho thấy nồng độ cytokinin cao kết hợp với auxin nồng độ thấp quan trọng việc tạo chồi Sự phối hợp BAP KIN nồng độ khác có ảnh hưởng đến phát triển chồi từ protocorm nhiên mức độ ảnh hưởng không cao so với tổ hợp KIN BAP (hình 3.5a); tổ hợp nồng độ 1,5 mg/l KIN + 0,5 mg/l BAP tốt cho phát triển chồi, số chồi/protocorm đạt 4,56; chiều cao chồi 0,29 cm; số lá/chồi 2,71 3.4 Quy trình nhân nhanh in vitro lan điểm hồng môi trường nuôi cấy lỏng Từ kết nghiên cứu chúng tơi rút quy trình nhân nhanh lan điểm hồng môi trường nuôi cấy lỏng sau: Hạt lan nảy mầm môi trường MS + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + 1% than hoạt tính + 0,2 mg/l NAA Protocorm nuôi cấy môi trường MS + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + 2mg/l BAP + 1mg/l NAA Protocorm ni cấy bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường MS + 15% nước dừa + 20g/l đường sucrose + 2mg/l BAP + 1mg/l NAA, đặt máy lắc 100 vòng/phút, với lượng mẫu đưa vào ni cấy ban đầu 5g để nhân nhanh protocorm Nuôi cấy protocorm môi trường MS + 15% nước dừa + 30g/l đường sucrose + 1% than hoạt tính + 0,8% agar + 1,5 mg/l KIN + mg/l IBA để nhân chồi 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút kết luận sau: [1] Môi trường MS + 15% nước dừa + 20 g/l đường sucrose + mg/l BAP + mg/l NAA chứa gam lượng mẫu (protocorm) nuôi cấy ban đầu, đặt máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút đạt tỷ lệ tăng 80% sau 15 ngày nuôi cấy [2] Hiệu nhân protocorm môi trường lỏng cao gấp lần so với môi trường đặc [3] Môi trường MS + 15% nước dừa + 30 g/l đường sucrose + 1% than hoạt tính + 0,8% agar + 1,5 mg/l KIN + mg/l IBA thích hợp cho việc nhân chồi từ protocorm Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu, khảo sát thêm số điều kiện nuôi cấy khác ảnh hưởng đến khả nhân nhanh lan điểm hồng mơi trường ni cấy lỏng để hồn thiện quy trình nhân nhanh lồi lan quy mơ lớn 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt Bùi Bá Bổng (1995), Nhân giống nuôi cấy mô, Sở khoa học công nghệ môi trường An Giang Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến q trình ni cấy phát sinh tế bào soma phơi vơ tính hoa lan (Dendrobium, Phalaenopsis, Cymbidium), Hộ nghị Khoa học Công nghệ 2007 Dương Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô tế bào thực vật II, NXB Đại học Quốc gia TP HCM Đào Thanh Vân (2008), Giáo trình hoa lan, NXB Nơng nghiệp Hồ Thiên Hoàng cs (2009), Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến trình nhân giống in vitro lan Ngọc Điểm Đỏ (Rhynchostylis gigantea rild Var Rubra (red), Báo cáo hội nghị Khoa học lần III, Đại học Công nghiệp TP HCM Lê Thị Nhung (2010), Nghiên cứu khả nhân nhanh chồi in vitro lan điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) mơi trường lỏng Lê Văn Hồng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia TP HCM Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Nguyễn Văn Vinh, Nguyễn Hữu Lễ (2009), Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh chồi rễ phong lan giã hạt Dendrobium anosmum, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 47 (số 5), trang 99 – 107 11 Phan Hùng Vĩnh (2009), Nghiên cứu nhân giống in vitro số loài lan rừng quý 12 Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, TP HCM 36 13 Trịnh Cẩm Tú Bùi Trang Việt (2006), Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro để nghiên cứu phát triển phát hoa Dendrobium Sonia, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, Tập (số 9), trang 83-88 B Tài liệu tiếng Anh 14 Guek Eng Sim et al (2007), Induction of in vitro flowering in Dendrobium Madame Thong-In (Orchidaceae) seedlings is associated with increase in endogenous N6- (D2 isopentenyl) – adenine (iP) and N6 – (D2 – isopentenyl) – adenosine (iPA) levels, Plant Cell Rep, 27 (8): 1281 -1289 15 Khin Lay Nge et al (2006), Chitosan as a growth stimulation in orchid tissue culture, Plant Science, 170: 1185 – 1190 16 McKendrick et al (2000), Symbiotic germination and development of mycoheterotrophic plants in nature: ontogeny of Corallorhiza trifida and characterization of its mycorrhizal fungi, New Phytol., 145, pp 523-537 17 Murashige and Skoog (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15: 473 – 497 18 Narayanswamy (1997), Plant cell and Tissue culture, Tata McGraw – Hill publishing Co Ltd., New Dehli, India, pp 116 – 118 19 Puchooa (2004), Comparison of Different Culture Media for the In vitro Culture of Dendrobium (Orchidaceae), International journal of agriculture & biology, 6(5): 884-888 20 Rangsayatorn (2009), Micropropagation of Dendrobium draconis Rchb.f from thin cross – section culture, Scientia Horticulture, 122(4): 662 – 665 21 Rangsayatorn et al (2009), Slow growth in vitro conservation of Dendrobium Draconis Rchb.f effect of black kwao krua (Mucuna collettii lace), ISHS Acta Horticulturae, 1(69): 829 37 ... quy trình nhân nhanh lan điểm hồng kỹ thuật nuôi cấy in vitro môi trường lỏng Nội dung đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả nhân protocorm lan điểm hồng: lượng... cs nghiên cứu nhân giống in vitro lan điểm hồng (Dendrobium draconis) loài lan rừng quý [18] Lê Thị Nhung nghiên cứu khả nhân nhanh chồi in vitro lan Nhất Diểm Hồng (Dendrobium dranconis Rchb.f). .. đến khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng Ảnh hưởng nồng độ đường sucrose đến khả nhân nhanh protocorm môi trường lỏng Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả nhân nhanh protocorm lan điểm hồng môi trường