Nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) và thử nghiệm môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri đột biến gen pura trong điều kiện thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ BÍCH THỦY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) VÀ THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN GEN PURA TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ Nha Trang, năm 2012 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ BÍCH THỦY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) VÀ THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN GEN purA TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM Chun ngành: Nuôi trồng thuỷ sản Mã số: 60 62 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS ĐỖ THỊ HÒA Nha Trang, năm 2012 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nêu luận văn cơng trình nghiên cứu với cho phép sử dụng chung số liệu nhóm tác giả thực đề tài thuộc chương trình Cơng nghệ sinh học cấp Nhà nước Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, số liệu trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả iii LỜI CẢM ƠN Luận văn thực với giúp đỡ nhóm nghiên cứu đề tài Cơng nghệ sinh học cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược độc dùng làm vắc xin phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) kỹ thuật gây đột biến gen” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc dẫn nhiệt tình, chu đáo giáo hướng dẫn PGS.TS Đỗ Thị Hồ giúp tơi suốt q trình xây dựng đề cương, triển khai thực nội dung hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cán thuộc Phòng nghiên cứu Bệnh Thủy sản dự báo, Trung tâm quốc gia quan trắc cảnh báo mơi trường phịng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản, Khoa sau Đại học, Trường Đại học Nha Trang, q thầy tận tình giảng dạy tơi suốt thời gian qua Cuối xin cảm ơn gia đình động viên giúp đỡ tơi hoàn thành luận văn Tác giả iv MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ………………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………… ii LỜI CẢM ƠN …………………………………………………………… iii MỤC LỤC …………………………………………………………… iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT….………………… vii DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ……………………………………… ix MỞ ĐẦU …………………………………………………………… Chương – TỔNG QUAN …………………………………………………… 1.1 Nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm Thế giới Việt Nam ………………………………………………………… 1.1.1 Thế giới ………………………………………………………… 1.1.2 Việt Nam …………………………………………………………… 1.2 Những nghiên cứu bệnh gan thận mủ cá tra nuôi Thế giới Việt Nam …………………………………………………………… 1.2.1 Thế giới …………………………………………………………… 1.2.2 Việt Nam …………………………………………………………… 1.3 Những nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả gây bệnh cá tra nuôi vi khuẩn E ictaluri …………………………………………… 1.3.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn E ictaluri ………………………………… 6 1.3.2 Những nghiên cứu khả gây bệnh cá tra nuôi vi khuẩn E ictaluri …………………………………………………………… 1.4 Những công nghệ đột biến gen ứng dụng để tạo chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh Thế giới Việt Nam ……………………………… 1.4.1 Thế giới …………………………………………………………… 1.4.2 Việt Nam …………………………………………………………… 13 1.5 Một số môi trường thường sử dụng nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn E ictaluri hoang dại chủng E ictaluri bị đột biến gen ………… 14 v Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………… 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………………… 16 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu ……………………………………… 16 2.2.1 Thời gian nghiên cứu …………………………………………………… 16 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu …………………………………………………… 16 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu đề tài …………………………… 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………… 17 2.4.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; đo kích thước vi khuẩn; nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri …………………………………………………… 17 2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá khả gây bệnh gan thân mủ cá tra vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA …………………… 19 2.4.3 Phương pháp tiêm khẳng định lại khả gây bệnh gan thận mủ cá tra chủng E ictaluri đột biến gen purA phân lập từ mẫu cá tra cảm nhiễm nhân tạo mơi trường EIM agar có bổ sung adenine ………………… 20 2.4.4 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.ictaluri đột biến gen purA điều kiện thí nghiệm ……………………………………… 2.4.5 Phương pháp cắt mô gan, thận, lách cá tra 21 22 2.4.6 Phương pháp xác định số tiêu môi trường nước bể thí nghiệm …………………………………………………………… 24 2.4.7 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu …………………………………… 24 Chương - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………… 26 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA (E ictaluri PAM) vi khuẩn E ictaluri chưa bị đột biến (E ictaluri WT) …………………………………………………………… 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái ……………………………………………………… 26 3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ……………………………………………… 28 3.1.3 Đặc điểm sinh trưởng …………………………………………………… 31 3.2 Kết nghiên cứu khả gây bệnh gan thận mủ cá tra chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA ………………… 32 3.2.1 Kết theo dõi số tiêu môi trường nước bể thí nghiệm 32 vi 3.2.2 Kết nghiên cứu khả gây bệnh gan thận mủ cá tra chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau đột biến gen purA ………………… 32 3.2.3 Kết tiêm khẳng định lại khả gây bệnh gan thận mủ cá tra chủng E ictaluri sau đột biến gen purA phân lập từ mẫu cá tra cảm nhiễm nhân tạo môi trường EIM agar có bổ sung Adenine+Kanamycine … 37 3.2.3.1 Kết nuôi cấy, phân lập định danh lại chủng E ictaluri PAM cá tra cảm nhiễm nhân tạo dùng để làm thí nghiệm ……………………… 37 3.2.3.2 Kết tiêm khẳng định lại khả gây bệnh gan thận mủ cá tra chủng E ictaluri PAM phân lập từ cá tra nhiễm bệnh gan thận mủ nhân tạo …………………………………………………………… 38 3.3 Kết nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA môi trường khác ……………………………………… 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………… 44 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………… 46 PHỤ LỤC …………………………………………………………… vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT API 20E: Hệ thống định danh vi khuẩn họ Enterobacteriaceae vi khuẩn Gram âm hình que BHIA: Brain Heart Infusion Agar (Môi trường thạch Brain Heart Infusion) BHIB: Brain Heart Infusion Broth (Môi trường dịch canh Brain Heart Infusion) CFU: Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) Cs: Cộng DMM: Defined Minimal Medium (Môi trường tối thiểu cho vi khuẩn E ictaluri) EIM: Edwardsiella Ictaluri Medium (Môi trường chọn lọc vi khuẩn E ictaluri) ESC: Enteric Septicemia of Catfish (Bệnh xuất huyết nội tạng cá nheo Mỹ) KIA: Klegler Iron Agar LB: Luria Bertami (Môi trường Luria Bertami) LDC: Lysine decarboxylase MAC: Mac Conkey Agar (Môi trường thạch Mac-Conkey) NN&PTNT: Nông nghiệp phát triển nông thôn OD: Optical Density (mật độ quang) ODC: Ornithine decarboxylase O/F: Oxydation/Fermentation ONPG: β- Galactosidase TSA: Tryptone Soya Agar (Môi trường thạch Tryptone Soya) viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả gây bệnh gan thân mủ cá tra vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA………………… 19 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng kích thước chủng vi khuẩn E ictaluri bị đột biến gen purA………………………………………… 26 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn E ictaluri PAM, E ictaluri WT…………………………………………………………………… 28 Bảng 3.3 Một số yếu tố mơi trường nước bể ni thí nghiệm……… 32 Bảng 3.4 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) cá tra sau 14 ngày thí nghiệm 33 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) cá tra sau 14 ngày thí nghiệm tiêm chủng E ictaluri PAM “hoàn độc” lần cá tra khỏe 39 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Diện tích (ha) ni cá tra tỉnh Đồng sơng Cửu Long 20082010………………………………………………………………… Hình 1.2 Sản lượng ni (nghìn tấn) cá tra tỉnh Đồng sông Cửu Long 2008-2010 Hình 1.3 Con đường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA 10 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu đề tài 17 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tiêm khẳng định lại khả gây bệnh gan thận mủ cá tra chủng E ictaluri đột biến gen purA Hình 2.3 21 Thí nghiệm chọn mơi trường phù hợp nuôi cấy chủng E ictaluri PAM 22 Hình 2.4 Sơ đồ tiến hành làm tiêu mô học mẫu cá tra Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri (A, B) mơi trường BHIA 27 Hình 3.2 Vi khuẩn E ictaluri hoang dại chưa đột biến gen purA vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA Hình 3.3 23 27 Sinh trưởng quần thể vi khuẩn E ictaluri đột biến gen purA mơi trường DMM có bổ sung adenine (E ictaluri PAM+Ad.0,05) không bổ sung adenine (E ictaluri PAM) 30 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng (theo mật độ) vi khuẩn E ictaluri PAM E ictaluri WT mơi trường ni cấy BHIB Hình 3.5 31 Đường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn E ictaluri PAM E ictaluri WT môi trường nuôi cấy BHIB 31 Hình 3.6 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) cá tra theo thời gian thí nghiệm 33 Hình 3.7 Một số dấu hiệu bệnh lý cá tra cảm nhiễm nhân tạo 35 Hình 3.8 Nội quan cá tra khỏe mạnh bệnh gây cảm nhiễm nhân tạo 35 Hình 3.9 Mơ học gan, thận lách cá tra bệnh gan thận mủ cá tra khỏe 36 Hình 3.10 Sự phát triển chủng E ictaluri PAM môi trường nồng độ adenine khác nhau………………………………………………… 40 Hình 3.11 Sự phát triển chủng E ictaluri PAM môi trường ni cấy có nồng độ adenine khác nhau…………………………………… 40 Hình 3.12 Sự phát triển chủng E ictaluri PAM môi trường khác nhau………………………………………………………………… 41 50 38 Plumb J A (1993), “Edwardsiella septicaemia”, Bacterial Dieases of Fish, Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp 61-79 39 Reed L J and Muench H (1938), “A simple method of estimating fifty percent endpoints”, American Journal of Hygiene, 27, pp 493-497 40 Shotts, E B., and W D Waltman (1990), “A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri”, Journal of Wildlife Diseases, 26(2), pp 214-218 41 Nguyen Manh Thang (2007), Report on Fish Vaccine production, RIA2 and NAVETCO: workshop on development vaccine used in Aquaculture, Ha Noi 6/20007 42 Nguyen Huu Thinh, Kuo T Y., Hung L T., Loc T H., Chen S C., Evensen O., Schuurman H J (2009), “Combined immersion and oral vaccination of Vietnamese catfish (Pangasianodon hypophthalmus) confers protection against mortality caused by Edwardsiella ictaluri”, Fish & Shellfish Immunology, 27(6), pp 773-776 43 Thune R.L., Hawke J.P., Fernandez D.H., Lawrence M.L., and Moore M.M (1997), “Immunization with bacterial antigens: edwardsiellosis”, In: Fish Vaccinology, Gudding R., Lillehaug A., Midtlyng P.J and Brown P.J., eds Dev Biol Stand., Karger, Basel, Switzerland, 90, pp 125-134 44 Thune R L., D H Fernandez, and J R Battista (1999), “An aroA mutant of Edwardsiella ictaluri is safe and efficacious as a live, attenuated vaccine”, Journal of Aquatic Animal Health, 11(4), pp 358-372 45 Thune R L., D H Fernandez, J Benoit, M Kelly-Smith, M Rogge, N J Booth and R Bologna (2007), “Identification of virulence factors involved in the pathogenesis of Edwardsiella ictaluri using signature tagged mutagenesis including a putative type three secretion system”, Applied and Environmental Microbiology, 73, pp 7934-7946 46 Vinitnantharat S., and Plumb J A (1993), “Protection of channel catfish Ictalurus punctatus following natural exposure to Edwardsiella ictaluri and effects of feeding antigen on antibody titer”, Dis Aquat Org., 15, pp 31-34 47 Waltman W D., Shotts E B and Hsu T C (1986), “Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri”, Applied and Environmental Microbiology, 51, pp 101-104 51 48 Wise, D J., P H Klesius, C A Shoemaker, and W R Wolters (2000), “Vaccination of Mixed and Full-Sib Families of Channel Catfish Ictalurus punctatus Against Enteric Septicemia of Catfish With a Live Attenuated Edwardsiella ictaluri Isolate (RE-33)”, Journal of the World Aquaculture Society, 31(2), pp 206-212 49 Yamamoto S., Izumiya H., Morita M., Arakawa E., Watanabe H (2009), “Application of lambda Red recombination system to Vibrio cholerae genetics: simple methods for inactivation and modification of chromosomal genes”, Gene, 438(1-2), pp 57-64 50 Yuasa, K., E B Kholidin, N Panigoro and K Hatai (2003), “First isolation of Edwardsiella ictaluri from cultured striped catfish (Pangasius hypophthalmus) in Indonesia”, Fish Pathology, 38(4), pp 181-183  TÀI LIỆU INTERNET 51 http://www.afa.vn Truy cập ngày 24 tháng 11 năm 2011 52 http://www.agriviet.com Truy cập ngày tháng năm 2011 53 http://www.vemedim.vn Truy cập ngày 12 tháng năm 2011 54 http://www.freepatentsonline.com/6010705.html Truy cập ngày tháng 10 năm 2010 PHỤ LỤC 1: Thành phần môi trường nuôi cấy đặc thù vi khuẩn E ictaluri EIM agar (Edwardsiella ictaluri Medium) theo Shotts Waltman, (1990) Tryptone: 10g Yeast extract: 10g Phenylalanine: 1,25g Ferric ammonium citrate: 1,2g Bromothymol blue: 0,003g Bile salts: 1,0g Agar: 15g Nước cất vô trùng: 980ml PHỤ LỤC 2: Thành phần môi trường BHI (Brain Heart Infusion) - Biorad (Mỹ) Peptone: 10g Veal Brain heart extract: 12,5g Beef Brain heart extract: 5g NaCl: 5g Disodium phosphate: 2,5g Glucose: 2g Nước cất cho đủ: 1000ml PHỤ LỤC 3: Thành phần môi trường LB (Luria Bertami) Tryptone: 10g Yeast extract: 5g NaCl: 10g Nước cất cho đủ: 1000ml PHỤ LỤC 4: Thành phần môi trường DMM (Defined Minimal Medium) nuôi cấy vi khuẩn E ictaluri theo Collins Thune (1996) Na2HPO4.7H2O: KH2PO4: NH4Cl: NaCl: MgSO4.7H2O: FeSO4.7H2O: Glucose: Pantothenic acid: Niacinamide: Peptone from casein: Nước cất cho đủ: 15g 7,5g 2,5g 1,25g 0,24g 0,005g 4g 0,0005g 0,001g 0,3g 1000ml PHỤ LỤC 5: Xử lý thống kê t-Test * So sánh kích thước khuẩn lạc PAM WT (p< 0,05) * So sánh kích thước vi khuẩn PAM WT (p