Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatis và Neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real-time PCR

Phản ứng multiplex real-time PCR được xây dựng có giới han phát hiện LODs là 4 bản sao/phan ứng, với độ đặc hiệu cao cho CT và NG.. Chính vì vậy các phương pháp nhân ban gene PCR, Real-t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

DO TRUNG HẬU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIEN DONG THỜIChlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BANG

PHUONG PHAP MULTIPLEX REAL-TIME PCR

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Hoc

Mã số: 60420201

TP HỖ CH MINH,TH NG 06 NĂM 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HOC BACH KHOA — ĐHQG Tp HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hồ Hu nh Th y Dương

Cán bộ cham nhận xét 1: TS Trần Trung Hiếu

Cán bộ cham nhận xét 2: TS Hoàng Anh Hoàng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCMngày 28 tháng 07 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Nguy n Đức Lượng2.Thưk hội đồng: TS Hu nh Ngọc Oanh

3 Ủy viên Phản biện 1: TS Trần Trung Hiếu4 Ủy viên Phản biện 2: TS Hoang Anh Hoang5 Ủy viên Hội đồng: PGS.TS Phan Ngọc H a

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quan! chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA kK THUATH A HỌC

NHIEM VỤ LUẬN VAN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Đỗ Trung Hậu MSHV: 1570255

Ngày, tháng, năm sinh: 01/10/1985 Nơi sinh: TP HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201I TÊN DE TÀI: Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatisvà Neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real-time PCR

Il NHIEM VU VA NOI DUNG:Xây dựng quy trình phát hiện đồng thoi Chlamydia trachomatis (CT) va Neisseriagonorrhoeae (NG) bang phương pháp multiplex real-time PCR với các nội dung

chính sau:

1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR.3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng.II NGÀY GIAO NHIEM VU: 06/02/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 18/06/2017V CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: PGS.TS Hồ Hu nh Th y Dương

Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƯỚNG DAN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TRUONG KHOA kK THUATH A HỌC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban Giám hiệu trường Đại học Bách Khoa, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ Thuật Hóa

Học, Bộ môn Công nghệ Sinh học c ng tất cả qu thầy cô đã giảng dạy, truyền đạtnhững kiến thức qu báu cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Ban Giám Đốc Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương đã tạo điềukiện cho tôi làm việc và thực hiện đề tài tại công ty

PGS.TS Hồ Hu nh Th y Dương, Bộ môn Di truyền — Đại học Khoa Học Tự

Nhiên TP HCM, người hướng dẫn khoa học cho tôi trong quá trình hoàn thành luận

văn này.

ThS Nguy n Thị Minh Tâm, các em ph ng nghiên cứu, ph ng Kiểm định Chấtlượng c ng toàn thé các đồng nghiệp làm việc tại công ty TNHH CNSH KhoaThương đã hỗ trợ và đồng hành c ng tôi trong suốt thời gian qua

Những người thân yêu của tôi: Ba m , Bà xã, con trai và các anh chi em tôi mếnthương nhất Cảm ơn Bà xã và con trai đã tạo động lực cho tôi hoàn thành luận văn

này.

Tp Hỗ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu

T MTATChlamydia trachomatis (CT) va Neisseria gonorrhoeae (NG) la hai tac nhan

vi khuẩn gây bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến trên thé giới và thườngđi kèm với nhau Nhằm tạo ra một công cụ hỗ trợ, phát hiện nhanh và chính xác CTvà NG trong bệnh phẩm, chúng tôi xây dựng quy trình multiplex real-time PCRphát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh này Phản ứng multiplex real-time PCR

được xây dựng có giới han phát hiện LODs là 4 bản sao/phan ứng, với độ đặc hiệu

cao cho CT và NG Quy trình có độ lặp lại tốt với hệ số biến thiên nội phản ứng nhỏhơn 1% và hệ số biến thiên liên phan ứng nhỏ hon 2%

Chúng tôi thực hiện trên 100 mẫu dịch phết tế bào, kết quả cho thấy có 20%trường hợp nhi m CT, 15% trường hợp nhi m NG và 8% trường hợp đồng nhi mCT/NG Đồng thời quy trình của chúng tôi có kết quả đúng với kết quả giải trình tự.Nghiên cứu này là tiền đề cho sự phát triển kit phát hiện đồng thời CT và NG

ABSTRACT

Chlamydia trachomatis (CT) and Neisseria gonorrhoeae (NG) are the mostcommon pathogens which cause sexually transmitted diseases in the world In orderto create a toolkit used for a rapid and accurate detection of CT and NG in clinicalsamples, we developed a multiplex real-time PCR test that can simultaneouslydetect both pathogens The limit of detection (LODs5) of the real-time PCR was 4copies per reaction The protocol had good repeatability, with intra-assay and inter-assay coefficients of variability inferior to 1% and 2%, respectively.

We tested 100 clinical samples for CT and NG The infection rates were 20 %for NG and 15% for CT, co-infection of CT/NG accounted for 8% in total Ourresults were confirmed by Sanger sequencing The study constituted the base forfurther development of diagnostic kit simultaneously detecting CT and NG inclinical samples.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các sô liệu và kêtquả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, nêu có gi sai sót tôi xin hoàn toàn chịutrách nhiệm.

Tp Hỗ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu

1.2.4 Phương pháp PCR và multiplex PCE 5-5 3< eessesessees 131.2.5 Phương pháp real-time PCR va multiplex real-time PCR 13

1.3 Một số nghiên cứu trên thé giới và tại Việt Nam c2 5 cccscececcee l61.3.1 Trên thế giới ¿6-5521 32 1 121511212111 2111111 1111111111111 1.1.1 l6

1.3.2 Tal 4/0 .ằ Še(( 17

CHUONG 2: VAT LIEU - PHƯƠNG PH P NGHIÊN CUU - 192.1 Dia điểm va thời gian nghiên €ỨU ¿-©- + + 2 2E +E£E+E+E£E+E£E+EeErerkrererree 19

2.2 Vat HEU ee ắa -Á 19

2.2.1 Mẫu thực nghiệm c.ccccccsescscscscscssscscscscsescsescscsescssesesssesssessseseseseseseseeeess 19

2.2.2 Môi, mẫu d và AMpLICON we eeeeccscesesssseeescsesseseseseseesesescscsssseseessesssseeeseees 192.2.3 HOa Chat nh 192.2.4 Thiết bị và dụng CỤ 5-5522 1 1 E1 121115111111 1111211 1111111111200 20

2.4.1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT va NG 222.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phan ứng multiplex real-time PCR 25

2.4.3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm

S0 Ả 262.5 Phương pháp nghiÊn CỨU - E990 re 27

2.5.1 Phương pháp kiểm tra mỗi và mẫu d_ 25s+c2=s+s+szs+¿ 27

2.5.2 Thu mẫu lâm sàng - - + E9E2E9E2E E21 E21 1 1 1E 11111111 27

2.5.3 Phương pháp tách chiết DNA - ¿5 252 223 E232 E8 E112 111k rke, 27

2.5.4 Phương pháp multiplex real-time PCR phát hiện CT va NG 31

Q5.5.XU1 0n cccececececesesescscscecescscsvscscecesssvevscscececevscecseeevavacecesessevacaceceees 33CHUONG 3 KET QUÁ — BIEN LUẬN - ¿G5 2 262 sESESESESEEEseseeeseseree 343.1 Kết quả thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG 343.1.1 Kết quả thiết lập phản ứng real-time PCR - ¿5 + 52 5s+s+cszszsee 343.1.2 Kết quả tối ưu hóa các phản ứng monoplex real-time PCR 363.1.3 Kết quả đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hóa phản ứng multilex real-time

3.3 Kết qua đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT va NG trên các mẫu lâm

Si — 55

CHUONG 4 KẾT LUẬN - DE NGHỊ, 5-6 + sEE9E+E+E£EEsE+EeESESEEeEseseseree 58AL KẾT luận G- s11 9191519111 51111151111 0101012110 1H11 TH ngu ren 584.2 DE nghị, ¿G1 S213 1 15131111 111151511 111111151101 11 0111110111010 11 0111111110701 1111 58TÀI LIEU THAM KHHẢO G-G + 66k E9E 93128 EEE E31 3191 gxgxgeseree 59

PHU LUC vecsccscccsessessecsessessucsuessessessessessessessussucsucsuesuessessessessssussuesusssssessessesuessesseeseesees a

BLAST:

CDC:CT/NGCT:Ct:CV:DNA:dNTP:IC:LOD:LPS:Md:MOMP:N/A:NCBI:NG:No Ct:PCR:STI:

Taq:TE:Tm:

Centers for Disease Control and PreventionCT c ng voi NG

Chlamydia trachomatisThreshold cycle (chuk ngưỡng)

Coeficient of variation (hé s6 bién thién)

Deoxyribonucleic acidDeox ynucleoside triphosphateInternal control (chứng nội)Limit of detection

Lipopol ysaccharideMegadalton

Major outer membrane proteinNot available

National Center for Biotechnology InformationNeisseria gonorrhoeae

Không có giá tri CtPolymerase Chain Reaction.Sexually transmitted infectionThermus aquaticus

Dung dịch gồm Tris va EDTA

Melting temperatureunit

World Health Organization

DANH MUC CAC BANG

Bang 1.1 Ty lệ nam nhi m NG tại 53 nước vào năm 2014/100.000 dân 7

Bang 1.2 Các chất phát và hấp thu hu nh quang thường sử dụng 16

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất sử dụng wie csssscsescscsssesescscsssscsesessssseseseseens 20Bảng 2.2 Danh sách thiết bị và dụng cụ ¿5-5252 2 SE2E+E2EEE£E£EzEeErkrkrkrrrvee 20Bang 2.3 Thanh phan phan ứng monoplex real-time PCR CT, NG và IC 22

Bang 2.4 Thanh phan hóa chất và phân bố trong đĩa/tube tách chiết TANBeadDNA Auto Kit oo Ả 30

Bảng 2.5 Di n giải phân tích kết qua multiplex real-time PCR - 33

Bang 3.1 Đặc tính của các cặp mỗi và mẫu d_ -5- c2 2 s+s+c+2 34Bang 3.2 Kết quả đánh giá hoạt động của mỗi và mẫu d_CT,NG và IC 35

Bang 3.3 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nhiệt độ lai khác nhau 37

Bảng 3.4 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG va IC ở các nồng độ MgCla 38

Bảng 3.5 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ môi 39

Bảng 3.6 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG va IC ở các nồng độ mẫu d_ 40

Bang 3.7 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ enzyme Tag DNAPOLYMELASE GGG G9990 0 0 kh 42Bảng 3.8 Hiệu quả nhân ban và ngưỡng phát hiện của phản ứng CT, NG, IC 43

Bang 3.9 Thành phan phản ứng multiplex real-time PCR -. 2-55 2-: 45Bang 3.10 Kết quả đánh giá tính hiệu quả phan ứng multiplex real-time PCR 46

Bảng 3.11 Bảng kết quả so sánh 3 phương pháp tách chiết DNA 48

Bảng 3.12 Bảng thống kê hệ số tương quan r giữa 3 phương pháp tách chiết0-11 49

Bang 3.13 Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện CT (HEX) 50

Bang 3.14 Độ nhạy phân tích cua phan ứng multiplex phat hiện NG (FAM) 50

Bang 3.15 Độ nhạy phân tích cua phan ứng multiplex phát hiện IC (CYS) 50

Bang 3.16 Kết quả độ đặc hiệu phân tích của phản ứng multiplex real-time PCR 52Bảng 3.17 Kết quả phát hiện CT và NG bằng phương pháp multiplex real-time

PCR trên 100 mẫu lâm sằng - ¿25252 S2 S2 2E 2E 9121111211111 xred 56

DANH MUC CAC HINH

Hình 1.1 Viêm cổ tử cung ở nữ và viêm niệu đạo ở nam do CT 5

Hình 1.2 Tế bào bị nhi m vi khuẩn CCT- -s- + xxx E392 EeEeESESksvservkrkes 5Hình 1.3 Cau trúc plasmid LGV440 của CT_ -¿ 55+ S2 ececcsrsrrerereee 6Hình 1.4 Chuk v ng đời của vi khuẩn CT_ -2- 55c 2 2 s+s+e+esrrerereee 6Hình 1.5 Viêm kết mạc ở mắt và trẻm_ mắt do NG - 2s + se £sEsesesxe 9Hình 1.6 Vi khuẩn NG se cv th HH re 10Hình 1.7 Cau trúc bé mặt của NG cccccccsccesescssecscecesesssvecscecceevevecsceceseevevacseeevevaeees 11Hình 1.8 Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phan ứng real-time PCR 14

Hình 1.9.NguyênL hoạt động của mẫu d TaqManŸ 555-5< 15Hình 2.1 May real-time PCR CFX96, Stratagene Mx3005P và AriaMx 20

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tong quat cccceccccsessssescscssssssesessssssesesessseseseseseees 21Hình 2.3 Máy tách chiết bán tự động Smart LabASSist << << s+2 30Hình 2.4 B6 trí đĩa tách chiết (trái) và khay tách chiết dang tube (phải) 31

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra hoạt động của mỗi và mẫu d_ CT, NG và ]C 35

Hình 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ mẫu d= của phản ứng CT, NG và IC 41

Hình 3.3 Hiệu quả nhân ban và ngưỡng phát hiện của phan ứng CT' 43

Hình 3.4 Hiệu quả nhân ban và ngưỡng phát hiện của phản ứng NG 44

Hình 3.5 Hiệu quả nhân ban và ngưỡng phát hiện cua phan ứng IC eee 44Hình 3.6 Kết quả đánh giá tính hiệu quả phan ứng multiplex real-time PCR 46

Hình 3.7 Biểu đồ đường cong chuẩn mau HEX (phải) và mau FAM (trái) 46

Hình 3.8 Biểu đồ kết quả so sánh 3 phương pháp tách chiết DNA 49

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu phân tích - 2 2 2 s+s+s+££z£szszc+ẻ 51Hình 3.10 Hệ số biến thiên nội phan Ứng -. cseescsessscssesesesssesseseseees 53Hình 3.11 Hệ số biến thiên liên phản ứng - - + 2 2525 2£ £2££+E+E+£z£z£szxceeẻ 54Hình 3.12 Kết quả phát hiện CT và NG một số mẫu lâm sảng - 55

MỞ ĐẦU

Chlamydia trachomatis (CT) va Neisseria gonorrhoeae (NG) là hai tac nhan vi

khuẩn gây bệnh lây truyền qua đường tình duc phố biến trên thé giới đặc biệt là ởcác nước dang phát triển [27], [31] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hang năm

có thêm khoảng 131 triệu người nhí m CT (36,7%) và 71 triệu người nhí m NG

(19.9%) trong tổng số 357 triệu người nhi m bệnh lây truyền qua đường tình dục[59] Một nghiên cứu tại 5 tỉnh biên giới của Việt Nam vào năm 2003 cho thấy tỷ lệnhĩ m CT là 11,9%; NG là 10.7%; đồng nhĩ m CT/NG là 19,9% [57] Một nghiêncứu khác công bố ty lệ nhi m CT ở phụ nữ đến khám vô sinh tại bệnh viện Phụ sản

Trung Ương năm 2012 là 25,2% [8] Tỷ lệ nhi m CT khoảng 16,7% và NG khoảng

14.7% trong tong số 314 nam bán dâm đồng giới tại Hà Nội năm 2014 — 2015 [9].Trong những năm gan đây, tỷ lệ người mắc bệnh do CT và NG gây ra ngay cảngtăng cao nhưng ít được thống kê đây đủ và chính xác [21]

Người mắc bệnh Chlamydia do CT và bệnh lậu do NG gây ra nếu không đượcphát hiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến những di chứng lâu dài ở cả nam và nữ như vôsinh, viêm hậu môn, trực tràng Đối với phụ nữ đang mang thai, việc mặc bệnh cónguy cơ dẫn đến viêm v ng chậu, thai chậm phát triển, chết thai, sinh non, sinh connh cân và đặc biệt có thể gâym 1 a ở trẻ sơ sinh do CT va NG lây truyền từ m

sang con [22].

Mặc d d điều trị nhưng bệnh lây lan rất nhanh trong cộng đồng và gây ra

những hậu quả khó lường do bệnh ít có triệu chứng hoặc được phát hiện ở giai đoạn

muộn Một số phương pháp truyền thống như nuôi cấy, nhuộm, soi tươi, mi n dichhu nh quang thường được sử dụng dé phát hiện CT va NG, tuy nhiên các phươngpháp này có độ nhạy thấp, tốn nhiều thời gian [54], [56] Chính vì vậy các phương

pháp nhân ban gene (PCR, Real-time PCR) đã được sử dụng rộng rãi trong thời

gian gan đây vì có độ nhạy cao so với các phương pháp nuôi cấy định danh [17],[19] và được Trung tâm Kiểm soát và Ph ng chống Dịch bệnh Hoa K (Centers forDisease Control and Prevention — CDC) khuyến cáo sử dụng trong các chương trình

giám sát CT va NG [20].

Trang 2 Mở đầu

Hiện nay, việc xây dựng phương pháp multiplex real-time PCR dé chan đoán CTvà NG vẫn chưa phố biến tại Việt Nam Chính vi vậy, việc xây dựng một phươngpháp phát hiện nhanh và chính xác CT va NG tại Việt Nam với chi phí thấp là vandé cap thiét nham ngăn ngừa, kiểm soát và hướng đến việc điều trị kịp thời các bệnhlây truyền qua đường tinh duc do hai vi khuẩn này gây ra Xuất phát từ thực ti n đó,chúng tôi thực hiện dé tài “Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydiatrachomatis va Neisseria gonorrhoeae bang phương pháp multiplex real-time

PCR” với các nội dung chính sau:

1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR

3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm

sàng.

Sự thành công của dé tài sẽ là tiền dé cho sự phát triển kit chân đoán multiplex

real-time PCR có kha năng phát hiện nhanh, chính xác CT và NG, tác nhân gây

bệnh lan truyền qua đường tình dục Đây là cơ sở thuận lợi cho công tác nghiên cứudich t học và chan đoán bệnh trong lĩnh vực y tế cộng động

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tong quan về Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG)1.1.1 Giới thiệu về CT

1.1.1.1 Dịch tế học bệnh Chlamydia

Theo ước tính của WHO, mỗi năm có khoảng 130.9 triệu người nhi m CT [58].Ty lệ nhi m CT cao nhất ở thanh thiếu niên trong độ tuổi từ 15-24 [22] Hầu hếtphụ nữ và nam giới nhỉ m CT đều không có triệu chứng Ty lệ nhi m CT không có

triệu chứng ở nữ (80%) thường cao hơn so với nam (50%) [49].Theo báo cáo của CDC, năm 2015, tại Mỹ, có khoảng 1.526.658 trường hợpnhi m CT, tăng 5,9% so với năm 2014 Trong đó, tỷ lệ nhi m CT ở nữ tăng 3,8% vàở nam tang 10,5% [21].

Ty lệ nhi m CT ngày càng gia tăng nhưng chưa được thống kê đầy đủ và chínhxác Các nghiên cứu gan đây tại An Độ cho thay tỷ lệ nhi m CT chiếm khoảng 23%tại các ph ng khám phụ khoa và chiếm 19,9% ở các bệnh nhân nhỉ m tr ng qua

đường tình dục Một nghiên cứu khác ở Anh, trong v ng 20 năm qua, ước tính tỷ lệ

nhĩ m CT ở các ph ng khám tiết niệu là 17,3%, ở các ph ng khám thai là 12,6%, tạicác cơ sở phá thai là 12,3%, tại các ph ng khám dành cho thanh thiếu niên chiếm10.7% và 10% ở các ph ng khám kế hoạch hóa gia đình [41]

Tại Việt Nam, theo số liệu các địa phương báo cáo về Viện Da li u Quốc gia, sốca nhỉ m CT có xu hướng tăng lên do bệnh này thường di n biến âm thầm và íttriệu chứng [10] Nghiên cứu của Lê Hồng Cam trên 415 phụ nữ viêm cỗ tử cungtrong độ tuôi từ 15 đến 45 trong thời gian từ 2/1998 đến 3/1999 tại huyện Hóc Môn,Thanh phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ nhi m CT trên đối tượng này là 18,07% [5].Nghiên cứu khác của Phạm Văn Đức và cộng sự về tỷ lệ nhi m CT ở phụ nữ hútthai 3 tháng dau và các yếu tố liên quan tại khoa Kế hoạch hóa gia đình — Bệnh việnTừ Dũ từ 01/08/2007 đến 30/01/2008 cho thấy trong 1003 trường hợp nghiên cứu,ty lệ nhi m CT ở phụ nữ hút thai là 9,2% với độ tuôi đưới 30 và có thu nhập trungbình [12] Theo một báo cáo đánh giá hoạt động ph ng chống bệnh lây truyền qua

đường tình dục năm 2014 của bệnh viện Phong — Da li u Trung ương Quy H aở 15

Trang 4 Tổng quan tài liệu

tỉnh khu vực miền Trung — Tây Nguyên từ Quảng Bình đến Bình Thuận và 5 tỉnhTây Nguyên (Kon Tum, Gia Lai, Dak Lak, Dak Nông, Lâm Đồng), tỷ lệ người mắcbệnh CT trong tổng số người đến khám chữa bệnh da li u ở các ph ng khám tuyếntỉnh là 288.950 người chiếm 0,07% [7] Việc tầm soát CT là một trong những biệnpháp ngăn ngừa và điều trị CT hiệu quả nhất

b Viêm kết mac thể vùi: do CT serovars D-K gây ra, thường gặp ở trẻ sơ sinh domat tiép xúc với dich đường sinh dục có vi khuẩn của m

c Nhiễm trùng ở đường sinh duc: do CT serovars D-K gây raỞ nam giới: chủ yếu gây viêm niệu đạo nhưng có 40% nam giới bị nhi m khôngcó triệu chứng Viêm mao tinh hoàn và viêm tuyến tiền liệt là biến chứng sau khinam giới bị nhi m CT, có tới 50% trường hợp viêm mao tinh hoàn dưới 35 tudi

Ở nữ giới: Thường gặp nhất là viêm niệu đạo, âm đạo, cô tử cung Khoảng 70%phụ nữ nhi m tr ng sinh dục không có triệu chứng, nếu không điều trị sẽ để lại dichứng nặng né và dẫn đến viêm v ng chậu (Pelvic Infection Disease - PID), tắc v i

trứng, thai ngoài tử cung, vô sinh [2], [49] Cac chương trình sàng loc CT đượcchứng minh là làm giảm tỷ lệ viêm v ng chậu ở phụ nữ [49].

d Viêm khớp do bệnh truyền qua đường tình dục (SARA — sexually bacquiredreactive arthritis): ảnh hưởng đến các khớp lớn, đặc biệt là khớp chân Nam giới bịảnh hưởng nhiều hon nữ giới với ty lệ 10:1.

e Nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ: tỷ lệ truyền từ m_ sang trẻ sơ sinh là55%, trong đó 45% là viêm kết mạc và 30% viêm phổi [2], [49]

f Lymphogranuloma Venereum (LGV - hoa liễu): là bệnh lây truyền qua đường

tinh dục do CT serovars LI - L3 gây ra [2].

1.1.1.3 Đặc điểm sinh hoc của CTQuan sát dưới kính hiển vi quang học, CT là vi khuẩn Gram âm có mảng làlipopolysaccharide, hình cầu hoặc bau dục, kích thước thay đổi Vi khuẩn thườngthay đổi hình dạng trong chuk_ sao chép Vỏ vi khuẩn gồm mảng trong và mang

ngoài, không có lớp peptidoglycan giữa các màng [3 |.

Trang 6 Tổng quan tài liệu

chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) mã hoá cho một số protein

kháng nguyên đặc trưng Mặc d chức năng của 8 gene trên cryptic plasmid c nchưa xác định hoàn toàn, nhưng trình tự nucleotide và sự có mặt của plasmid trong

tế bao cho thấy nó có vaitr quan trọng đối với vi khuẩn CT [53]

Tế bảo biéu mô

.

_ Nhân

Thé lưới

(RB) © Y Pannekoek

CT có kháng nguyên lipopolysaccharide chung và kháng nguyên protein vỏ riêng

dựa vào đó được chia ra 15 loại t p huyết thanh khác nhau bao gồm: Tp huyếtthanh A - C,D - K và LI - L3 Trong đó t p A, B, Ba và C gây bệnh ở mắt T p D-K gây bệnh ở đường sinh dục và ở mat T p LI gây bệnh hoa li u viêm hạch hat

[1], [2], [36]

Dị biệt kháng nguyên của CT là protein chủ yếu ở màng ngoài (major outermembrane protein - MOMP), chiếm đến 50% cau tao màng MOMP là một proteinxuyên mảng chứa các quyết định kháng nguyên đặc hiệu loài và đặc hiệu t p.Những hội chứng do CT gây ra có liên hệ đặc hiệu với các t p huyết thanh khác

nhau [3].

1.1.2 Giới thiệu về NG

1.1.2.1 Dịch tế học bệnh lậu

Bệnh lậu do NG gây ra, đứng thứ hai sau bệnh Chlamydia trong các bệnh lây

truyền qua đường tình dục trên thé giới [30], [32] Theo bao cáo tại 28 quéc giathành viên thuộc Liên minh Châu Âu (EU) và khu vực kinh tế Châu Âu (EEU) vàonăm 2013, có 52.995 trường hợp nhi m NG được thống kê Trong đó, thanh thiếuniên trong độ tuổi từ 15 - 24 tuổi chiếm 39% các trường hợp nhi m NG va tỷ lệnhi m ở nam giới nhiều gấp 3 lần so với nữ giới [30]

Theo báo cáo khác của WHO ở 53 quốc gia vào năm 2014, tỷ lệ nhỉ m NG ở

nam là 25,5/100.000 nam giới trưởng thành Tây Thái Bình Dương là nơi được báo

cáo có tý lệ nam nhi m cao nhất và Đông Địa Trung Hải là nơi có tỷ lệ nam nhỉ mthấp nhất thé giới (3,2 trường hợp/100.000 nam) [58]

Bang 1.1 Tỷ lệ nam nhiễm NG tại 53 nước vào năm 2014/100.000 dân [58]

WHO region No countries reporting Median male gonorrhoea

case rate (range)African Region | 5 50.1 (7.2-238.0)Region of the Americas | 18 29.3 (1.9-153.3)

Eastern Mediterranean Region | 6 3.2 (0.9-385.5)European Region | 9 25.5 (2.9-61.2)South-East Asia Region | 4 7.0 (2.4-20.4)

Western Pacific Region 11 88.6 (0.5-317.1)

Overall | 53 25.5 (0.5-385.5)

Source: GARPR database (2015) (5)

Trang 8 Tổng quan tài liệu

Theo một báo cáo gần đây của CDC, tỷ lệ nhi m NG tại Mỹ tăng dần qua cácnăm Năm 2009, tỷ lệ nhi m NG là 98,1/100.000 người, đến giai đoạn 2009 - 2012tăng nh (106,7/100.000 người) và năm 2015 bat đầu tăng nhanh (129,9/100.000

người) so với năm 2014 Năm 2015, có khoảng 395,216 triệu người nhi m NG, tang12,8% so với năm 2014, trong đó, ty lệ nhí m ở nam tăng 18,3% và ở nữ là 6,8%.

Tỷ lệ nhi m tăng cao nhất ở miền Nam và miễn Tây nước Mỹ [21]

Tại khu vực Đông Nam nói chung và Việt Nam nói riêng, tỷ lệ bệnh lậu chưa

được thong kê day đủ nên việc kiểm soát bệnh gặp nhiều khó khăn đặc biệt là cácđối tượng có nguy cơ lây nhi m cao Một nghiên cứu của B i Thị Mậu và Lê ThiKim nh vẻ bệnh lây truyền qua đường tình dục ở gái mại dâm tại Trung tâm Chữabệnh — Giáo dục — Lao động Xã hội tỉnh H a Bình năm 2009 cho thay ty lé gai maidâm nhi m lậu chiếm 24,1% trong tong số 162 đối tượng được khảo sát với độ tuổidưới 29, trình độ học van thấp và thiếu hiểu biết về bệnh lây truyền qua đường tinhdục [6] Một nghiên cứu khảo sát về kiến thức, thái độ và niềm tin của học sinh từ 2trường dạy nghé tai Thành phố Hồ Chí Minh về các bệnh lây lan do quan hệ tinhdục cho thấy chỉ 55% hiểu biết về bệnh lậu [28] Tý lệ nhi m lậu ở nhóm mại dâmnam cũng là một điều đáng báo động Công trình nghiên cứu của Nguy n Văn H ngvà cộng sự về ty lệ nhi m HIV/STI và một số yếu tô liên quan ở nhóm nam bándâm đồng giới 16 - 29 tuổi tại Hà Nội năm 2014 - 2015 cho thấy bệnh lậu chiếmkhoảng 14,7% trong tong số 314 nam bán dâm đồng giới [9]

1.1.2.2 Triệu chứng lầm sàng [1], [2], [3]

a Ở nam giới: Các triệu chứng thường gặp là viêm niệu đạo nhưng cũng cókhoảng 3 - 10% nam nhi m lậu nhưng không có triệu chứng Nếu không được pháthiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến các bién chứng như viêm ống dẫn tinh, mào tinhhoàn, tuyến tiền liệt, túi tinh

b Ở nữ gidi: Triệu chứng thường gặp là viêm cổ tử cung, âm đạo, niệu đạo,tuyến Bartholine, nhưng đa số là không có triệu chứng hoặc triệu chứng không rõràng Nếu không được phát hiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến viêm tử cung, viêm v itrứng, đặc biệt ở phụ nữ mang thai sẽ dẫn đến vô sinh hoặc thai ngoài tử cung

c Ở trẻ sơ sinh: Lau mat ở trẻ sơ sinh do nhỉ m NG từ m Triệu chứng phố biếnnhất là kết mạc đỏ, xuất huyết và chảy mủ kết mạc Nếu không được điều trị kịpthời có thé dẫn đếnm_ 1 a.

Ngoài ra, bệnh lậu c_n gây ra một số hệ qua thứ cấp khác như:- _ Viêm họng do lậu cầu gặp ở người đồng tinh ở cả hai giới hoặc khác giới do

quan hệ tình dục bằng đường miệng.- _ Viêm trực tràng: gặp ở người đồng tính nam do quan hệ tình dục qua hậu môn

Triệu chứng này thường không điền hình.- Nhi m lậu cau lan tỏa (DGD): thường gặp ở những người bị lậu nhưng không

được điều trị dứt điểm, hầu hết xảy ra ở phụ nữ Bệnh thường có biểu hiện là

viêm khớp, viêm da, viêm gan, viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc, viêm màng

não.

Vi khuẩn NG là những song cầu khuẩn Gram âm hình hat cà phê, hai mặt d t vàonhau Kích thước tế bào khoảng 0,6 wm x 0,8 um, khoảng cách giữa 2 cầu khuẩnbăng 1/5 chiều rộng của tế bảo Vi khuẩn lậu không sinh nha bào, không có lông,một số chủng có pili [2] Màng ngoài bao gồm các protein, phospholipid valipopolysaccharide (LPS) Đặc tính d ng để phân biệt LPS lậu là cau trúc

oligosaccharide cơ bản phân nhánh và không có sự lặp lại của kháng nguyên O Dođó, LPS cua NG được gọi là lipooligosaccharide (LOS) [45].

Trong môi trường nuôi cay, NG có kích thước thay đổi và kiểu sắp xếp khôngđiển hình: có thể xếp thành đôi hoặc thành bốn Pili xếp thành từng sợi hoặc tập hợpsợi và hầu như che phủ toàn bộ bề mặt bên ngoài tế bào vi khuẩn [2]

Hình 1.6 Vi khuẩn NG [68]1.1.2.4 Đặc điểm bộ máy di truyền NG

Có 3 dang plasmid trong NG:- Loai 1: Plasmid 24,5 Md co kha năng hoạt hóa các plasmid khác.- Loai 2: Plasmid 2,6 Md chưa rõ chức năng.

- Loại 3: Plasmid quy định sinh B — lactamase, day la plasmid quy định tinh

kháng sinh của NG Có nhiều plasmid B — lactamase trong NG gây bệnh ở cácnước trên thế giới, chúng có trọng lượng phân tử thay đôi: 4,4 Md; 3,2 Md; 2,9

Md [2].

NG có cau trúc kháng nguyên không đồng nhất va có thé thay đổi cau trúc bề mặttrong điều kiện in vitro Đây là tính chất được xem như nhằm tránh sự dé kháng củak chủ trong điều kiện in vivo [3]:

- Pili: dai khoảng vai um, giúp vi khuẩn bam vào k_ chủ tốt hơn và chống lại

hiện tượng thực bao.

- Protein I (Por): tạo những lỗ nhỏ ở bề mặt, qua đó một số chất dinh dưỡng vaođược bên trong tế bào vi khuân Mỗi chủng Gonorrhoeae có một loại protein I

khác nhau.

- Protein II (Opa): gây kết dính các tế bao gonococci thành một khối và gắngonococci vào tế bào k_ chủ Một chủng có từ 0 đến 3 kiểu protein II ProteinII hiện diện ở khối đục, có thể có hay không có ở khối trong

- Protein III (Rmp): có ở tất cả gonococci, kết hợp với protein I tạo thành lễ nhỏ

trên bê mặt tê bào.

- Lipopolysaccharide (LPS): có ở màng ngoài của gonococci, trọng lượng phân

tử từ 3000 - 7000 Độc tính trong nhi m khuẩn gonococci phần lớn do LPS, cótác dụng như nội độc td

- Protein khác: có tính khang nguyên, nhưng vaitr gây bệnh chưa rõ [3].

1.2.1 Phương pháp nuôi c y truyền thong

1.2.1.1 Nuôi c y CT

CT không nuôi cay được trong môi trường nhân tạo, ma phải được nuôi trongd ng tế bào McCoy, Hela 229 hoặc tế bào thận khi Thể v i có thé được thay sau48 - 72 giờ bằng phương pháp nhuộm Giemsa, Iodine hoặc nhuộm kháng thé gan

hu nh quang đặc hiệu cho kháng nguyên cua Chlamydia (LPS và MOMP) Khi sử

dụng các kháng thé đặc hiệu MOMP thì sự phát hiện CT có độ đặc hiệu cao.Phương pháp nuôi cay được xem là tiêu chuẩn vàng để phát hiện CT vì có độ đặchiệu cao (100%) nhưng có độ nhạy thấp (75 - 85%) ngay cả khi thực hiện trong

ph ng thí nghiệm chuyên nghiệp [24], [29].

Độ nhạy phụ thuộc vào điều kiện thu, vận chuyển và bảo quản mẫu do đó ít đượcsử dụng trong ph ng thí nghiệm Phương pháp này d ng để giám sát sự nhạy cảm

Trang 12 Tổng quan tài liệu

kháng sinh và sự thay đôi độc tính hoặc khi cần các xét nghiệm với độ đặc hiệu cao

[44]

1.2.1.2 Nuôi c y NG

Vi khuẩn NG khó nuôi cấy, rất d chết, chúng không thể phát triển trong môitrường thông thường mà đ ¡ hỏi môi trường phải giàu chất dinh dưỡng như máu vàcác yếu tố dinh dưỡng khác Các môi trường thường được sử dung là thạch

chocolate và các môi trường chọn lọc khác có chứa kháng sinh (Thayer-Martin,

Martin Lewis) dé ức chế các vi khuẩn khác và nam nhưng không ảnh hưởng đến sựphát triển của vi khuân NG Tế bao NG phát triển tốt khi ủ môi trường với 5 - 10%CO, ở nhiệt độ 35 — 37°C trong thời gian 18 - 24 giờ, độ âm > 70% và pH= 7.3 [2],

Có 2 loại kháng nguyên nhưng phần lớn phương pháp này sử dụng kháng nguyênMOMP vì kháng nguyên LPS có thể phản ứng chéo với LPS của các vi khuẩn khác

Với việc sử dụng kháng nguyên MOMP thì độ nhạy và độ đặc hiệu của phương

pháp kháng thé hu nh quang trực tiếp lần lượt là 80 - 90% và 98 - 99%.Phương pháp DFA không đ i hỏi điều kiện vận chuyển nghiêm ngặt, thời gianthực hiện nhanh nhưng việc đọc kết quả d i hỏi chuyên môn cao Do đó, phươngpháp này được khuyến cáo sử dụng trong ph ng thí nghiệm với số lượng mẫu thấp.Nó được đánh giá là nhạy hơn so với nuôi cay để phát hiện CT trong mẫu nội mạc

tử cung [41].

1.2.3 Phương pháp miễn dịch liên kết enzymeNguyên tac: Phương pháp min dịch liên kết enzyme (Enzyme-Linked

một kháng thé đặc hiệu Kết qua phản ứng mi n dich được phát hiện bằng cách sửdụng những kháng thé cộng hợp với enzyme Phức hợp kháng nguyên — kháng théhoạt hóa enzyme, chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm có mau, thông quacường độ màu có thể phát hiện và định lượng nông độ kháng nguyên hay kháng thểcó trong mẫu Hiện nay, phương pháp ELISA được quan tâm nhiều do tính đơn giản

và hiệu quả cao.Phương pháp ELISA có độ nhạy khoảng 62 - 96% và độ đặc hiệu từ 86 - 99% so

với phương pháp nuôi cấy tế bao Phương pháp này ph hợp với các ph ng thínghiệm không thể sử dụng phương pháp nuôi cấy [41]

1.2.4 Phương pháp PCR va multiplex PCR

PCR là phản ứng tong hợp phân tử DNA in vitro bang enzyme DNA polymerasechịu nhiệt (thường là Tag polymerase) Các DNA polymerase chi có thé tong hopđược mach DNA mới từ mạch khuôn băng cách kéo dai một môi (primer) là mộttrình tự nucleotide ngăn đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn Một phản ứng PCR baogôm nhiều chuk (30 - 40 chu k ); mỗi chu k gồm ba bước : (1) biến tinh dé táchrời hai mạch của phân tử DNA, (2) bắt cap các mỗi xuôi và ngược đặc trưng chotrình tự cần nhân bản, (3) tong hợp mạch mới băng cách kéo dài mỗi đã bắt cap

Multiplex PCR là phương pháp cải biên của PCR, nhiễu trình tự DNA được nhânbản c ng lúc, sử dụng nhiều hơn 1 cặp môi trong một phản ứng PCR Phương phápnày cho phép phát hiện c ng lúc nhiều tác nhân gây bệnh trong bệnh phẩm giúp rútngăn thời gian cho ra kết quả xét nghiệm Phương pháp multiplex PCR được ápdụng đã làm tăng độ chính xác của xét nghiệm chân đoán CT và NG Các công trìnhtrên thế giới đều cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR chân đoánCT và NG đều trên 90% [17], [26]

1.2.5 Phương pháp real-time PCR va multiplex real-time PCR

1.2.5.1 Nguyén tac [16], [18], [25]Real-time PCR duoc phat triển từ kỹ thuật PCR cổ điển dựa trên nguyên | cobản là sự nhân bản số lượng DNA mục tiêu được đưa vào phản ứng Nhưng real-time PCR khác PCR cổ điển là real-time PCR kiểm soát được tín hiệu hu nh quangphát ra tại mỗi chu k_ trong suốt quá trình xảy ra phản ứng Mỗi tín hiệu hu nh

Trang 14 Tổng quan tài liệu

quang phát ra tương ứng với một trình tự mục tiêu được nhân bản thành công.

Những hóa chất phát hu nh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA (Evagreen,

SYBR Green I, SYBR Green II) và một đoạn DNA mach đơn đặc hiệu cho v ng

gene mục tiêu được gan chat hu nh quang gọi là mẫu d (mẫu d TaqManŸ,

molecular beacon, mẫu d_ Eclipse )

Multiplex real-time PCR dựa trên nguyên tac của kỹ thuật real-time PCR nhưngtrong một ống phản ứng đơn có thé nhân bản đồng thời nhiều trình tự mục tiêu khisử dụng nhiều hơn một cặp mỗi và các mẫu d khác nhau

Hiện nay, mẫu d TaqManŸ và thuốc nhuộm liên kết Evagreen, SYBR Greenđược sử dụng pho biến nhất Mỗi loại đều có những ưu điểm và mặt hạn chế của

chúng nó.1.2.5.2 Các hóa ch t phát huỳnh quang thường được sử dung [16], [18]

a Thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng chủ yếu là SYBR Green I vàEvagreen cho phép liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi (Hình 1.8) Các chất

này chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu hu nh quang khi chúng ở dạng tự do

trong dung dịch, nhưng tín hiệu hu nh quang sẽ tăng lên đến 1000 lần khi chúngliên kết với DNA mạch đôi Như vậy, tín hiệu hu nh quang tổng từ phản ứng sẽ ty

lệ với lượng DNA mạch đôi hiện diện và gia tăng khi trình tự mục tiêu được nhânban.

g 3 g &g 9 Phan tr SYBR Green I chưaỤ —-=- ; 9 Q ©) Phan tử SYBR Green I được

6) “- @ Q sắn chèn

Hình 1.8 Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng real-time PCR [65]

Ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng đơngiản (chỉ cần 2 môi, không cần thiết kế mẫu d ), chỉ phí ban đầu thấp Tuy nhiên trởngại lớn nhất của thuốc nhuộm liên kết DNA là chúng không đặc hiệu, nghĩa làchúng liên kết với bất k DNA mạch đôi nào do đó phải thực hiện phân tíchmelting-curve (đường cong nóng chảy) dé kiểm tra độ đặc hiệu của phan ứng nhânbản Kết quả là sự hiện diện của các sản phẩm không đặc hiệu trong phản ứng real-time PCR có thể làm tăng lượng tín hiệu hu nh quang tổng và ảnh hưởng đến tínhchính xác của kết quả định lượng.

b Hóa ch t phát huỳnh quang dựa trên mẫu dò được sử dung phổ biến hiệnnay là mẫu d TaqManŸ Đó là một đoạn DNA mạch đơn đặc hiệu cho v ng genemục tiêu c ng với phân tử phat hu nh quang (reporter) va phân tử dập tắt hu nhquang (quencher) được gan cộng hóa trị ở hai đầu Khi mẫu d vane n nguyên v n,tín hiệu hu nh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher dập tắt Khi phản ứng PCRxảy ra, mẫu d bắt cặp với v ng gene mục tiêu nam giữa 2 môi và bi phân cắt bởi

hoạt tính 5’ — 3’ exonuclease của Tag DNA polymerase Lúc này, phân tu reporterva quencher được tách nhau ra va tín hiệu hu nh quang thu được từ reporter trở nên

mạnh hơn Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chuk và tương ứng với

lượng sản phẩm PCR được tạo ra

Trang l6 Tổng quan tài liệu

Ưu điểm chính của mẫu d TaqMan? là độ đặc hiệu cao và cho phép thực hiệncác phản ứng multiplex Tuy nhiên giá thành đất và việc thiết kế phản ứng phức tạp

hơn.

Một khía cạnh quan trọng trong việc thiết kế mẫu d là việc lựa chọn chất phátvà hấp thu hu nh quang

Bang 1.2 Các ch t phátvàh p thu huỳnh quang thường sử dụng

Tên reporter othe Gam) ch ‘phat ae my Quencher

FAM 495 520 TAMRA, DABCYL, BHỌIHEX 535 556 BHQI1

ROX 586 610 BHQ2, BHO3, DABCYLCY5 647 667 BHQ2, BHQ3VIC 538 554 BHQI1TEXAS RED 590 610 BHQ2, BHO3, DABCYL

1.3 Một số nghiên cứu trên thé giới và tại Việt Nam1.3.1 Trên thế giới

Hiện nay, các phương pháp nhân bản gene được lựa chọn trong các ph ng thí

nghiệm lâm sàng trên toàn thé giới dé chân đoán thường quy CT va NG [27].Năm 2014, Dhawan và cộng sự đã sử dụng phương pháp real-time PCR để pháthiện việc nhi m CT ở những phụ nữ vô sinh tại khu vực Bac An Độ Kết quả độ

nhạy và độ đặc hiệu ph hợp với kit COBAS TaqMan C trachomatis Test (Roche,

Mỹ) và có thé phát hiện CT ở nông độ 10 bản sao/phan ứng [24].Đến năm 2015, nghiên cứu của Tayoun và cộng sự sử dụng phương phápmultiplex PCR va Melt Curve Analysis để phát hiện đồng thời CT, NG,Trichomonas vaginalis (TV) va chung noi (Internal Control) duoc bé sung vaotrong quá trình tách chiết DNA dé kiểm soát quá trình tách chiết DNA va PCR Kếtquả phương pháp chân đoán này tiết kiệm được chỉ phí, có độ nhạy, độ đặc hiệucao, d dàng phát hiện sự đồng nhi m của CT, NG, TV và có thé sử dụng nhiều loạimẫu khác nhau: nước tiéu, dich phết âm đạo [56]

Tiếp theo đó cũng vào năm 2015, công trình nghiên cứu của Rumyantseva va

cộng sự đánh giá phương pháp multiplex real-time PCR (AmpliSens) phát hiện

đồng thời 4 mục tiêu CT, NG, TV và Mycoplasma geneitalium (MG) Phương phápc n phát hiện thêm trình tự DNA chứng nội Kết quả cho thấy phương pháp có độnhạy và độ đặc hiệu cao với ty lệ nhi m CT, NG, TV, MG lần lượt là 6,3%; 0.3%;

0,08% và 5,7% [51].

Gan đây là nghiên cứu của Meyer và cộng sự năm 2016 Các tác giả thực hiệnđánh giá kit PelvoCheck CT/NG bằng phương pháp PCR để phát hiện CT và NG,kit sử dụng gene ADA77 được bồ sung vào master mix lam chứng nội kiểm soát quá

trình nhân bản c ng với DNA CT/NG [43] Cũng trong năm 2016, nghiên cứu của

Jaureguy và cộng sự sử dụng phương pháp real-time PCR dé xác định tỷ lệ nhi mCT và NG ở những cá nhân bị tấn công tình dục ở Paris, Pháp Kết quả phát hiện

15% nhi m CT, 5% nhi m NG và 3% đồng nhi m cả hai loại vi khuẩn trên [38]

1.3.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu đã công bố về xây dựng các phương pháp phát hiệnCT và NG có phần hạn chế hơn so với thế giới

Năm 2007, Võ Hồ Hồng Hải đã xây dựng và chuẩn hóa quy trình phát hiện đồngthời CT và NG sử dụng kỹ thuật PCR-ELISA và chứng nội Kết quả phát hiện 6%nhi m CT, 2% nhỉ m NG trong 100 mẫu dich phét cô tử cung [14]

Vào năm 2011, Trần Đăng Thăng và cộng sự đã xây dựng thành công quy trìnhmultiplex PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh HPV và NG Kết quả chothay 2 trường hợp dương tính với NG chiếm 6% trong 30 mau thu thập từ bệnhnhân và | trường hợp đồng nhi m với HPV [13]

Như vậy, các công trình nghiên cứu về phương pháp phát hiện CT và NG đãđược thực hiện rộng rãi trên thế giới dưới nhiều hình thức khác nhau Tuy nhiên, ởViệt Nam các công trình nghiên cứu đã được công bố sử dụng phương phápmultiplex real-time PCR phát hiện CT va NG chưa phổ biến Phương pháp real-timePCR có nhiều ưu điểm hơn so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định sốlượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao, kết quảreal-time được đánh giá không can phải điện di trên gel agarose, giúp tiết kiệm thời

Trang 18 Tổng quan tài liệu

gian Dong thời, việc tiễn hành phản ứng và đánh giá kết quả trong một hệ thốngống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhi m và loại bỏ những thao tác sau

phản ứng nhân bản.

Trong dé tai này, chúng tôi sử dụng mẫu d TaqManŸ và mỗi nhân bản v nggene đặc trưng của CT và NG Ngoài ra, trong hỗn hợp phản ứng real-time PCR c nchứa một cặp mỗi nhân bản một đoạn gene ALAS/ của người làm chứng nội nộisinh Khác với một số công trình công bố gần đây đã sử dụng chứng nội ngoại sinh,đoạn gene này được ly trích c ng với DNA CT va NG trong quá trình tách chiếtgiúp phát hiện các chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả của quá trìnhtách chiết DNA cũng như phản ứng PCR [38], [51] [56]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứuĐề tài được thực hiện tại Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương.Thời gian thực hiện đề tài: 16/01/2017 — 18/06/2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Mẫu thực nghiệm

Mau DNA và mẫu lâm sang được thu tại một bệnh viện có chuyên khoa da li u ở

Hà Nội được chỉ định xét nghiệm CT va NG từ thang 01/2017 đến 04/2017.Mẫu DNA các vi sinh vật khác được lưu trữ tại ph ng Kiểm định Chất lượng -

công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương.

2.2.2 Môi, mẫu dò va ampliconCặp môi, mau d CT và NG sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo từ cáccông trình nghiên cứu đã công bố [54], [37] Trình tự mỗi và mẫu d_ bắt cặp trên

đoạn gene ALAS/ của người d ng làm chứng nội (IC) từ một công trình nghiên cứukhác trong nhóm nghiên cứu cua chúng fôi tại công ty TNHH Công nghệ Sinh hocKhoa Thương.

Các trình tự amplicon được xác định bằng phan mềm Annhyb dựa trên các cặpmôi [54], [37] và các trình tự được công bố trên ngân hàng gene (NCBI), trong đó:

- Amplicon CT: mang v ng trình tự dài 71 bp năm trên cryptic plasmid của CT.- Amplicon NG: mang v ng trình tự dài 90 bp năm trên v ng gene opa của NG.- Amplicon IC: mang v ng trình tự dai 144 bp năm trên v ng gene ALAS/ ở

người.

Các cặp mỗi, mẫu d va amplicon được tổng hợp bởi công ty Integrated DNA

Technologies - [DT (Mỹ).2.2.3 Hóa ch t

Trang 20 Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu

Bảng 2.1 Danh sách hóa ch t sử dụngTên hóa ch t Hãng sản xu t Xu txt

Hóa ch t dùng tách chiết DNAKit tách chiết DNA tủa: AccuRive

pDNA Prep kit Khoa Thuong Biotech Việt Nam

Silica: AccuRive sDNA Prep kit | Khoa Thương Biotech | Việt NamKit tach chiét DNA ban tu dong: Taiwan Advanced Đài Loan

TANBead DNA Auto Kit Nanotech Inc.

Hóa ch t dùng trong phan ứng real-time PCR

h-Taq DNA polymerase va Buffer SolGent Han QuécHỗn hop dNTP 10 mM SolGent Hàn QuốcMgCl, 25 mM SolGent Hàn Quốc

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ

Bang 2.2 Danh sách thiết bị và dung cuTên thiết bị và dung cu Hãng sản xu t Xu txtHệ thống real-time PCR CFX96 Bio-Rad My

Stratagene Mx3000P vài Mxã 005P Agilent My

Hệ thống real-time PCR AriaMx Agilent MyMay tách chiết DNA tự động| Taiwan Advanced Đức

Smart LabAssist Nanotech Inc.

May ly tam Hermle DucVortexer Stuart AnhBồn ủ nhiệt khô Nam Khoa Biotech Viet Nam

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quátMục tiêu của dé tài là xây dựng quy trình multiplex real-time PCR phát hiệnđồng thoi CT và NG Trước tiên, chúng tôi thiết lập phản ứng real-time PCR và sửdung amplicon nhân tạo dé tối ưu hóa các phan ứng monoplex, từ các thành phanđược tối ưu tiến hành thiết lập, đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hóa phản ứngmultiplex Sau khi tối ưu thành công phản ứng multiplex, tiếp tục so sánh cácphương pháp tách chiết DNA từ mẫu dịch phết tế bào để chọn phương pháp táchchiết đạt hiệu quả cao Nhằm hướng tới việc phát triển kit trong tương lai, chúng tôixác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR và áp dụngquy trình đã xây dựng phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng Công trình

nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau:

- Thiết lập phản ứng real-time PCR.- Tối ưu hóa phản ứng monoplex

real-time PCR.

4 - Thiết lập, đánh giá tính hiệu quả va

Thiết lập quy trình multiplex real-time

PCR phát hiện CT và NG tối ưu hóa phản ứng multiplex.

trình tự một số mẫu kiểm tra độ đúng

của quy trình.

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Trang 22 Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu

2.4 Bồ trí thí nghiệm2.4.1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG

2.4.1.1 Thiết lập phản ứng real-time PCRĐề thiết lập phản ứng real-time PCR chúng tôi thực hiện các nội dung sau:- Lua chọn các cặp môi (primer) và mẫu d (probe) phát hiện CT, NG từ các

công trình nghiên cứu đã công bồ [54] [37].- _ Kiểm tra in silico và bang thực nghiệm hiệu quả hoạt động cua các cặp mỗi và

mẫud đã chọn.Sử dụng các mẫu DNA gồm mẫu âm tính với CT và NG, mẫu dương tính vớiCT, mẫu dương tính với NG để kiểm tra hoạt động của các cặp mỗi và mẫu d mục

tiêu.

Thành phân ban đầu của một phản ứng monoplex real-time PCR được trình bày

trong Bảng 2.3.

Bang 2.3 Thành phan phản ứng monoplex real-time PCR CT, NG va IC

Thanh Phan tng CT va phan tng NG Phan ứng ICphan | Nàng độ đầu | Nong độ cuối | Nồng độ đầu | Nồng độ cuốiBuffer [0X 10X 1X 10X 1XMgCl, 25 mM 3,0 mM 25 mM 3,0 mMdNTP 10 mM 0,2 mM 10 mM 0,2 mMh-Taq 2,5 U/ul 10U 25U 10U

Moi 25 uM 0,2 uM 10 uM 0,2 uMMau d 10 uM 0,1 uM 10 uM 0,1 uMNước cất Đủ 20 wl Đủ 20 wl

DNA 5 wl 5 ul

Chương trình real-time PCR: Cai đặt chương trình định dang vi tri các mẫu trongblock nhiệt của máy Đối với phản ứng CT chọn màu hu nh quang HEX, phản ứngNG chọn màu FAM và phản ứng IC chọn màu CY5 cho tất cả các giếng chạy mẫu

với chương trình như sau:

1 chu kì 95°C — 15 phút40 chu kì 95°C — 20 giây

60°C — 60 giây, đọc tín hiệu (FAM/HEX/CY5)Phân tích kết quả real-time và điện di kiểm tra kích thước sản phẩm mục tiêu.Sau đó chúng tôi gửi giải trình tự sản phẩm phản ứng PCR của CT và của NG tạicông ty Axil Scientific (Singapore) Chúng tôi sử dụng phần mềm ClustalX2 dé tiếnhành so sánh sự tương đồng với các trình tự đã được công bố trên NCBI

2.4.1.2 Tối ưu hóa các phan ứng monoplex real-time PCRa Chuẩn bị chứng dương (amplicon)

Chứng dương được tổng hợp ở dạng đông khô, b6 sung TE 1X dé được chuẩngốc có nồng độ 2 x 10” bản sao/ul Pha loãng chuẩn gốc về các nồng độ thích hợpbăng TE 1X d ng trong các thí nghiệm tiếp theo

Đối với phản ứng monoplex pha loãng từng amplicon CT, NG và IC theo bậc 10giảm dần xuống nồng độ 2 x 10°, 2 x 10’ và tiếp tục đến 2 x 10” bản sao/ul (mỗinông độ được pha 1000 ul)

Chúng tôi sử dụng 3 mẫu chứng dương với các nông độ sau khi đặt phản ứngPCR là 10°, 10* và 10° bản sao/phan ứng Tất cả các phan ứng PCR tai mọi điềukiện thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần Tiêu chí đánh giá là chọn giá trị Ct trungbình thấp nhất hoặc giá trị Ctph hợp với thí nghiệm nếu các giá trị Ct không quákhác biệt khi tối ưu Đồng thời phản ứng sau tối ưu phải đạt giá trị hệ số tương quanR” 0,980 và hiệu quả nhân ban từ 90% - 105% [18][25]

b Khảo sát nhiệt độ lai toi wu: Dựa vào Tm của các cặp mỗi và mẫu d_, chúngtôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bat cặp trên dãy các nhiệt độ bắt cặp từ 56°C đến66°C, khoảng cách nhiệt độ do máy tự thiết lập, từ đó chọn ra nhiệt độ lai tối ưu

chung cho các phan ứng monoplex CT, NG và IC.

c Khảo sát nông độ MgCl: Nong độ MgCl, cũng là một nhân t6 ảnh hưởngmạnh đến quá trình PCR [4] Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ MgCl, từ 2,0 —5,0 mM, mỗi bậc khảo sát tăng 0,5 mM [50] Các thành phần của các phản ứng

monoplex real-time PCR được giữ nguyên.

Trang 24 Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu

d Khao sat nong do môi: Môi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sựnhân bản đặc trưng và có hiệu quả cao [4] Trong thí nghiệm này, mỗi được khảosát ở 5 nông độ từ 200 - 400 - 600 - 800 - 1000 nM [23]

e Khảo sát nông độ mẫu dò: Như mọi thí nghiệm PCR khác, thí nghiệm bằngTaqManŸ yêu cầu sự nhân bản hiệu quả và đặc hiệu sản phẩm Mẫu d TaqMan” làthành phần tốn kém nhất của một thí nghiệm TaqManŸ Trong thí nghiệm này,chúng tôi khảo sát nồng độ maud ở 3 nồng độ 100 nM, 200 nM, 300 nM [18]

Khảo sát nông độ enzyme Taq DNA polymerase: Tag DNA polymerase từnhững nha cung cấp khác nhau có thé đạt hiệu quả khác nhau bởi công thức, điềukiện thí nghiệm và/hoặc đơn vi đo lường khác nhau [35] Do đó, chúng tôi tiễn hànhkhảo sát 4 nông độ Tag DNA polymerase: 1,0 U; 1,5 U; 2,0 U; 2,5 U [35], [42]

g Kiểm tra hiệu quả nhân bản và giới hạn phát hiện của phan ứng monoplexHiệu quả nhân bản và giới hạn phát hiện sau khi tối ưu các phản ứng monoplexđược kiểm tra để đánh giá hiệu quả nhân bản của phản ứng có tốt không Hiệu quảnhân bản (E) được tính toán từ độ dốc của đường chuẩn theo công thức sau:

E= i0 1⁄4 dốcHiệu quả nhân bản thường được biểu thị ở dạng số phân trăm:

% Hiệu quả = (E - 1) x 100%

Đối với phản tng! tưởng: % Hiệu quả = (2 - 1) x 100% = 100% [18].Trong thí nghiệm nay, sử dung 9 nồng độ chứng dương pha loãng bậc 10 tir 10°giảm dan đến 10° ban sao/phan ứng dé đánh giá hiệu quả nhân bản va giới hạn phat

hiện của phản ứng.

2.4.1.3 Đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hóa phản ứng multiplex

real-time PCR

a Chuẩn bị chứng dươngĐối với phản ứng multiplex, chúng tôi trộn chung 3 amplicon 2 x 10° bản sao/pl(CT, NG và IC) c ng với TE 1X để làm thành 1 ống chứng dương 2 x 10’ bansao/ul phát hiện cả 3 trình tự CT, NG và IC Tiếp tục pha loãng theo bậc 10 giảmdần đến nồng độ 2 x 10” bản sao/pl (mỗi nồng độ được pha 1000 ul) d ng để tối ưu

b Đánh giá tính hiệu quả và toi wu ha phản ứng multiplex real-time PCRChúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng multiplex bằng cách kết hợp các thànhphân đã được tối ưu ở phản ứng monoplex lại với nhau Sau đó các phản ứng

monoplex và phản ứng multiplex được chạy c ng với nhau trên c ng một bản mẫu

và chúng tôi so sánh giá trị Ct giữa phản ứng multiplex và các phản ứng monoplex

đã được tối ưu hóa Giá trị thu nhận từ phản ứng multiplex không được quá khácbiệt với các phản ứng monoplex Nếu giá trị Ct từ các phản ứng multiplex quá khácbiệt, chúng tôi tiễn hành tối ưu hóa phản ứng multiplex [18]

2.4.1.4 So sánh các phương pháp tách chiết DNAChúng tôi sử dụng mẫu dịch phét tế bào đồng nhi m với CT/NG nông độ cao phaloãng với các mẫu dịch phết tế bào âm tính với CT/NG theo bậc 10 để được 7 mẫudịch phét tế bao có các nồng độ từ thấp đến cao Tiến hành tách chiết DNA, sử dụng

3 phương pháp (phương pháp tủa, phương pháp sử dụng cột silica và phương pháp

bán tự động), mỗi mẫu lặp lại 3 lần trong mỗi phương pháp tách chiết Phát hiệnCT và NG bằng phản ứng multiplex đã xây dựng và chọn phương pháp tách chiếtDNA cho hiệu quả tốt nhất

2.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR

2.4.2.1 Độ nhạy phân tích

Định nghĩa: Độ nhạy phân tích được đánh giá qua chỉ số LOD (limit ofdetection), là giới hạn lượng mau phân tích ít nhất có trong chất nền đặc trưng cóthé cho kết quả dương tinh Tại giới han nay, khả năng phát hiện chính xác đốitượng mục tiêu ít nhất là 50% (LODs9) [46]

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dung 5 nông độ chứng dương (1, 5, 10, 20,100 bản sao/phan ứng) chứa đồng thời 3 trình tự CT, NG và IC, mỗi nông độ đượclặp lại 10 lần Lặp lại 4 lần thí nghiệm để xác định độ nhạy phân tích của phản ứng

multiplex real-time PCR.2.4.2.2 Do dac hiéu phan tichDinh nghĩa: Độ đặc hiệu phan tích là kha năng phan biệt giữa trình tự mục tiêu

và các trình tự khác có thể xuất hiện trong mẫu [46]

Trang 26 Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu

Chúng tôi sử dụng 2 nhóm mẫu: Mẫu DNA có trình tự của vi sinh vật mục tiêu

(CT va NG) và 21 mẫu DNA của các chủng vi sinh vật khác gồm mẫu có nền mẫuban đầu thu từ người và mẫu tách chiết từ dịch tăng sinh bằng phương pháp nuôicấy Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần

2.4.2.3 Độ lặp lại

Định nghĩa: Độ lặp lại là mức độ tương đồng giữa các kết quả trong nhiều lần lặplại của 1 mẫu, trong c ng 1 lần chạy và giữa các lần chạy khác nhau vào những

ngày khác nhau Những thí nghiệm này chạy trong các ph ng thí nghiệm khác nhau

hoặc sử dung lô thuốc thử khác nhau hoặc các thiết bị khác nhau [34], [46].Đề kiểm tra độ lặp lại, chúng tôi sử dụng 3 nồng độ chứng dương 10°, 10, 107bản sao/phản ứng, mỗi nồng độ được lặp lại 4 lần trong | lan chạy Thực hiện 6 lần

2.4.3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu

lâm sàng

Tiến hành thực hiện quy trình multiplex real-time PCR trên 100 mau bénh phamdịch phết tế bao thu từ bệnh viện dé phat hiện CT va NG Các mau dich phết tế baođược tach chiết DNA bang phương pháp sử dung cột silica, sau đó đặt phan ứng cácmẫu DNA và chạy trên máy real-time PCR Stratagene Mx3005P Phân tích kết quả,

xác định tỷ lệ nhi m CT va NG.

Một số mẫu dương tính với CT và NG được gửi giải trình tự tại công ty AxilScientific (Singapore) để kiểm tra lại độ đúng của quy trình thực hiện

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp kiểm tra mỗi và mẫu dòThông số của các cặp môi và mẫu d được kiểm tra bằng phần mềmOligoAnalyzer Tool (IDT) và kiểm tra sự đặc hiệu in silico bang Basic LocalAlignment Search Tool (BLAST) Đồng thời sử dụng phần mém Annhyb kiểm travị trí bat cặp của các môi, mẫu d_ tham khảo trên v ng cryptic plasmid của CT,trình tự gene opa của NG và trình tự gene ALAS/ của người được công bố trênNCBI Từ đó, chúng tôi kiểm tra lại kích thước của sản phẩm PCR

2.5.2 Thu mẫu lâm sàngMau dịch phét tế bào được trữ trong 700 pl dung dịch bảo quan mẫu PBS 1X docác kỹ thuật viên của bệnh viện thu mẫu và gửi đến công ty TNHH Công nghệ sinh

học Khoa Thương.

2.5.3 Phương pháp tách chiết DNA2.5.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tủaNguyên tắc: DNA bộ gene của các phần tử vi khuẩn CT và NG có trong mẫudịch phết được thu nhận bằng phương pháp phenol-chloroform Các thành phần như

phenol, guanidine isothiocyanate, B-mercaptopethanol có trong dung dịch KTS1-D

có vai tr chính trong việc phá vỡ cấu trúc protein của mang tế bào người và vỏcapsid của CT và NG Ngoài ra, hoạt động biến tính protein của các chất này cũnglàm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA có trong hỗn hợp DNA sau khi được giảiphóng sẽ di chuyển vào pha nước Chloroform được b6 sung vào hỗn hợp nhằm thu

hút hoàn toàn phenol ra khỏi pha nước và giúp sự phân tách giữa pha nước và phahữu cơ (phenol-chloroform) trở nên rõ ràng hơn DNA trong pha nước sau đó được

chuyển sang trạng thái không tan băng isopropanol Các gốc isopropanol được loạibỏ ra khỏi tủa DNA băng ethanol 70% Dung dịch này đảm bảo việc làm sạch DNAvà giữ DNA ở trạng thái không tan Cuối e ng, tủa DNA được h a tan trong dungdịch nước đã qua xử | để bất hoạt RNAse, DNase (KTS5) trước khi sử dụng cho

phản ứng PCR.

Quy trình tách chiết DNA tủa

Trang 28 Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu

- Bude 1: Chuan bị một số lượng eppendorf 1,5 ml mới có đánh số tương ứngvới số lượng mẫu Bồ sung 900 ul dung dịch KTS1-D

- _ Bước 2: Chuyển 100 ul dịch phết sang các eppendorf 1,5 ml đã chuẩn bị.- _ Bước 3: Vortex dé tan hết protein biến tính và dé yên 10 phút

- _ Bước 4: Bồ sung 200 pl dung dịch KTS2 Vortex kỹ

- - Bước 5: Ly tâm 13.000 v ng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ ph ng.

- Bước 6: Chuyển 600 ul dịch nổi sang các eppendorf 1,5 ml mới chứa sẵn

600 ul dung dịch KTS3.

- _ Bước 7: Vortex trộn đều Dé yên 10 phút

- - Bước 8: Ly tâm 13.000 v ng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ ph ng.

- _ Bước 9: Đồ bỏ dịch nỗi, giữ cặn Thêm 900 pl dung dịch KTS4

- - Bước 10: Ly tâm 13.000 v ng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ ph ng.

- _ Bước 11: Đồ bỏ dịch nỗi, giữ cặn Làm khô cặn trong 10 phút ở 60°C.- Bude 12:H a cặn trong 50 pl KTS5 dé thu nhận DNA

2.5.3.2 Phương pháp tách chiết DNA sử dụng cột silicaNguyên tắc: Các mẫu dịch phết trong dung dịch bảo quản mẫu sẽ được ly giảibang các dung dịch đệm ly giải có chứa các muối, hóa chất biến tinh và chat tay đểgiải phóng DNA ra khỏi chất nền Các dịch ly giải sẽ được làm sạch bằng cách lytâm, cho phép loại bỏ các chat ban, cặn tế bào, các đại phân tử khỏi dịch noi Sau đódịch nỗi sạch được trộn với dung dịch đệm gan cột va isopropanol dé tạo các điềukiện tối ưu cho sự liên kết của DNA và mang silica Tiép đó cột được rửa với haidung dịch đệm khác nhau để loại bỏ hết các chất ức chế PCR DNA có thể đượcdung giải trong các dung dịch có nồng độ muối thấp và sẵn sàng được sử dụng ngay