Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Đề xuất được quy trình ly trích phù hợp cho niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống.. Thêm vào đó sự ra đời của các thế hệ Taq polymerase khán

TỔNG QUAN

Xét nghiệm quan hệ huyết thống

Trong xã hội ngày nay, nhu cầu tìm hiểu, xác nhận mối quan hệ huyết thống giữa các cá thể người ngày càng tăng cao Không chỉ phục vụ cho giải đáp nghi vấn của cá nhân, xét nghiệm này còn phục vụ cho các mục tiêu pháp lý như làm giấy khai sinh, nhập quốc tịch, bảo lãnh, định cư Ngoài ra, trong điều tra hình sự, xét nghiệm này là công cụ hỗ trợ đắc lực giúp nhận diện cá thể truy lùng dấu vết Để giải quyết cho các nhu cầu trên, phương pháp xác định quan hệ huyết thống đã sớm ra đời từ đầu những năm 1920 dựa trên các hiểu biết về di truyền Một số chỉ thị sinh học được sử dụng trong nhận dạng và xác định mối quan hệ huyết thống bao gồm: Nhóm máu; Kháng nguyên bạch cầu- HLA; Các đoạn lặp đa hình

1.1.1 Xét nghiệm dựa trên nhóm máu Đầu những năm 1900 các nhà khoa học đã xác định được 4 nhóm máu cơ bản của con người là A, B, AB và O dựa trên một số chất cacbohydrat và protein đặc thù trên hồng cầu Đến những năm 1920, các nghiên cứu cho thấy nhóm máu được quyết định do gen Gen này quy định bởi 2 alen trội là I A , I B và 1 alen lặn i O , di truyền theo quy luật của Mendel [6] Do đó các nhà khoa học có thể dự đoán được nhóm máu của đứa trẻ dựa trên nhóm máu của cha mẹ Tuy nhiên việc sử dụng nhóm máu có những hạn chế nhất định do nó chỉ chính xác 30% và nó không phải là một công cụ hữu hiệu cho việc xác định mối quan hệ huyết thống Dựa trên nhóm máu này ta chỉ có thể khẳng định được một số trường hợp chắc chắn không phải là cha con

Ví dụ: Cha giả định có nhóm máu O (có cấu trúc gen i O i O ), mẹ ruột nhóm máu

O (có cấu trúc gen i O i O ) nếu con có nhóm máu A, B thì chắc chắn không phải là con của người cha giả định Tuy nhiên nếu con có nhóm máu O thì vẫn chưa đủ cơ sở để kết luận cha con vì vẫn có rất nhiều người đàn ông máu O

1.1.2 Xét nghiệm dựa trên hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA)

Năm 1970, các nhà khoa học khám phá ra các kháng nguyên bạch cầu (Human Leucocyte Antigen - HLA) của con người là các protein hiện diện trên tất cả các tế bào của cơ thể trừ hồng cầu, đặc biệt HLA tập trung trên tế bào bạch cầu Kháng

4 nguyên bạch cầu là các protein kháng nguyên hiện diện trên bề mặt tế bào, đóng vai trò quan trọng trong tổ chức miễn dịch của cơ thể cũng như những cơ chế giao tiếp giữa các tế bào HLA được xác định bằng cách sử dụng các test huyết thanh và kháng thể đơn dòng (anticorps monoclonaux) có mặt trên các tế bào bạch cầu lympho [7]

Có nhiều dạng HLA khác nhau và có sự hiện diện khác nhau ở từng người, tuy các gen quy định cho HLA cũng di truyền theo quy luật Menden Đứa trẻ khi được sinh ra sẽ có một nửa kháng nguyên bạch cầu di truyền từ bố và một nửa từ mẹ Do đó xét nghiệm HLA trở thành một công cụ cho phép xác định mối quan hệ huyết thống cha con Nếu chỉ sử dụng riêng xét nghiệm HLA có thể xác định được mối quan hệ cha con với độ chính xác là 80%, nếu kết hơp với xét nghiệm nhóm máu và xét nghiệm huyết thanh thì kết quả có độ chính xác lên tới 90% [8]

Tuy nhiên xét nghiệm HLA cũng không phải là một công cụ lý tưởng để xác định mối quan hệ huyết thống do xét nghiệm đòi hỏi lượng máu thu ban đầu khá lớn, quá trình lấy máu gây khó chịu và nguy hiểm cho các trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi Một số yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm như: mẫu máu bị vỡ hồng cầu, người làm xét nghiệm được truyền máu trước đó Do đó, hiện nay xét nghiệm HLA chủ yếu sử dụng để xác định tính tương hợp mô trước khi ghép tạng, tìm kiếm các HLA liên quan đến một số bệnh lý

1.1.3 Xét nghiệm dựa trên đoạn lặp đa hình

1.1.3.1 Khái niệm đoạn lặp đa hình

DNA được tạo thành từ 4 loại nucleotide, chính sự sắp xếp đa dạng của các nucleotide này làm cho DNA mỗi người trở nên độc nhất vô nhị Cơ thể mỗi người có tới 3.2 tỉ cặp base, việc xác định, tìm thấy sự khác biệt về trình tự base giữa các cá nhân là không hề đơn giản Năm 1984, Alec Jeffeya và các cộng sự trong khi nghiên cứu DNA mã hóa cho hemoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp lại 10-15 base, các đoạn lặp lại này được gọi là các Tandem Repeat Sequence – đoạn lặp lại đa hình [9] Các Tandem Repeat Sequence có tính đa hình về số lượng rất lớn, chúng khác nhau về

5 số base trong một đơn vị, số lượng đơn vị lặp Chính sự đa hình này giúp cho sự phân biệt giữa các cá thể trong loài cũng như phân biệt giữa các loài với nhau [10]

Dựa vào số lượng base trong một đơn vị lặp, Tandem Repeat Sequence được chia làm 3 nhóm:

- DNA vệ tinh (DNA satellite): đơn vị lặp lại từ một đến vài trăm base Độ dài vùng lặp lại có thể lên tới vài Mb DNA satellite thường được tìm thấy ở xung quanh vùng tâm động nhiễm sắc thể Sự phân bố của chúng đóng vai trò nhất định trong sự phân chia tế bào, được biết chúng liên quan đến sự liên kết các protein điều khiển, kiểm soát quá trình di chuyển của nhiễm sắc thể về cực của tế bào DNA satellite ít khi được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhận dạng cá thể, mà thường dùng làm chỉ thị cho lập bản đồ gen vùng gần tâm động

- DNA tiểu vệ tinh (DNA minisatellite): còn gọi là DNA lặp lại ngẫu nhiên, đa hình (variable number tandem repeat-VNTR) Số lượng base trong một đơn vị dao động từ 10-100 base, lặp lại từ 1-30 lần, chiếm đoạn DNA từ 1- 5kb, thậm chí có thể lên tới 20 kb [11][12] VNTR phân bố tập trung hoặc rải rác trên nhiễm sắc thể Dựa vào sự phân bố đó người ta chia DNA minisatellite thành 2 loại:

 DNA tiểu vệ tinh đa vị trí (multi–locus mini satellite): Hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen Các tiểu vệ tinh đa vị trí được phát hiện vào năm 1985

 DNA tiểu vệ tinh đơn vị trí (single –locus mini satellite): chỉ có tại một vị trí trên bộ gen Nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí có giá trị dấu ấn DNA

- DNA vi vệ tinh (DNA microsatellite): còn gọi là single sequence repeat (SSRs) hay Short Tandem Repeat (STRs) có số lượng base rất ít, từ 1-6 base, được lặp lại nhiều lần thành đoạn khoản 200 base DNA microsatellite phân bố tập trung hay rải rác trên nhiễm sắc thể, genome, và chúng có tính đa hình về số lượng rất cao giữa các cá thể Chính vì thế chúng được dùng làm các chỉ thị phân tử rất thông dụng Một lý do khác là so với các DNA tiểu vệ tinh , ta có thể thiết kế được phản ứng PCR khuếch đại vùng gen chứa trình DNA vi vệ tinh [13]

6 Giống như các protein trên tế bào máu hay HLA, con cái có bộ nhiễm sắc thể một nửa nhận từ cha và một nửa nhận từ mẹ nghĩa là các đoạn lặp đa hình cũng được di truyền theo Các đoạn lặp đa hình này đa dạng hơn HLA hay protein trong máu, nó hiện diện trong tất cả các tế bào của cơ thể Với những đặc tính như vậy nên chúng trở thành chỉ thị phân tử lý tưởng cho xét nghiệm quan hệ huyết thống

1.1.3.2 Các kỹ thuật xét nghiệm quan hệ huyết thống bằng đoạn lặp đa hình

- Xét nghiệm quan hệ huyết thống sử dụng kỹ thuật RFLP

Kỹ thuật PCR-STR

PCR - STR là kỹ thuật cho phép phân tích tính đa hình của các DNA vi vệ tinh bằng việc thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các vị trí STR này và phân tích kết quả bằng điện di mao quản [16] [17]

Trong xét nghiệm quan hệ huyết thống hiện nay, phản ứng PCR STR được thiết kế là một phản ứng multiplex PCR khuếch đại cùng lúc 16- 24 vị trí STR 16-24 cặp primer tham gia phản ứng được gắn nhóm màu huỳnh quang khác nhau

 Sau quá trình PCR, ta có hỗn hợp đoạn DNA khuếch đại các vị trí STR có màu huỳnh quang của primer tương ứng

 Tiến hành điện di mao quản sản phẩm PCR cùng với allelic ladder Allelic ladder chứa tất cả các trường hợp lặp lại của các vị trí STR ở các màu huỳnh quang Các vị trí có primer khuếch đại gắn cùng một màu huỳnh quang sẽ

8 được phân tích cùng nhau cùng với ladder Số lần lặp lại của trình tự STR được xác định dựa trên allelic ladder được điện di cùng (hình 1.2)

 Cả mẫu và ladder trước khi điện di sẽ được trộn với một lane standard mang một màu huỳnh quang riêng biệt Phần mềm đọc kết quả dựa trên màu huỳnh quang này để loại ra các tín hiệu nhiễu, so sánh sản phẩm PCR với allelic ladder cho biết số lần lặp lại của vị trí STR (hình 1.1)[18]

 PowerPlex ® Fusion System là bộ mix PCR STR khuếch đại 24 vị trí STR bằng 4 nhóm primer có gắn màu huỳnh quang lần lượt là: Fluorescein, JOE, TMR-ET và CXR-ET và màu huỳnh quang thứ năm của WEN Internal Lane

 Ưu điểm: Là kỹ thuật PCR tiên tiến phát triển từ multiplex PCR kết với tín hiệu huỳnh quang trên trình tự primer khuếch đại và phân biệt được một lượng lớn các sản phẩm PCR đích khác nhau

 Nhược điểm: Kết quả đọc dựa trên cường độ màu huỳnh quang RFU (relative fluorescence units) và kích thước sản phẩm đòi hỏi cao ở chất lượng phản ứng PCR Trang thiết bị cho phản ứng PCR đắt tiền, khó sử dụng rộng rãi

Hình 1.1: Kết quả hiển thị Liz scan -WEN Internal Lane Standard 500 [4]

Bảng 1.1: Các locus STR được phân tích trong bộ kit PowerPlex ® Fusion System [4]

STT STR locus Màu huỳnh quang Khoảng kích thước trên allelic ladder

25 WEN Internal Lane Standard 500 được gắn màu huỳnh quang thứ 5, chứa 21 đoạn DNA có kích thước:

Hình 1.2: Kết quả hiển thị cho Allelic ladder với 4 màu huỳnh quang [4]

Hình 1.3: Kết quả điện di STR bằng bộ kit PowerPlex ® Fusion System [4]

Các cải tiến trong DNA polymerase

Ngoài các bước tiến trong quy trình chạy PCR, kỹ thuật PCR còn được cải tiến không ngừng ở DNA polymerase tham gia phản ứng Từ năm 1976, việc cô lập thành công Taq polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một enzyme chịu nhiệt cho phép tham gia vào chu kỳ luân nghiệt đã giúp cải thiện đáng kể hiệu quả của PCR 1988 Kary Mullis và Tổng công ty Cetus đã thương mại hoá Taq Polymerase để sử dụng rộng rãi và sau đó là sự đời của hệ thống máy PCR

Taq polymearse thế hệ đầu không hoàn hảo, nó cho thấy những khuyết điểm như hiệu suất không cao, dễ ức chế, xảy ra lỗi trong quá trình tổng hợp DNA đặc biệt là đối với các trình tự giàu GC, cấu trúc thứ cấp PCR ngày càng phát triển và tham gia vào hầu hết nghiên cứu sinh học và đặc biệt lĩnh vực xét nghiệm y học, do đó đòi hỏi sự ra đời DNA polymerase thế hệ sau ưu tú hơn

Năm 1994, kỹ thuật sử dụng kháng thể khóa enzyme polymerase cho phép tránh tình trạng taq tổng hợp trình tự DNA không đặc hiệu ở nhiệt độ thấp Năm 2005, sản phẩm thương mại High-Fidelity DNA Polymerases tạo thành trên công nghệ protein tái tổ hợp, giúp polymerase có hoạt tính polymerase 5´→ 3´, exonuclease 3´→ 5´ cho hiệu suất tổng hợp cao gấp 50 lần taq thông thường và độ chính xác cao nhờ hoạt tính sửa sai

Theo sau đó là sự ra đời của hàng loạt các DNA polymerase cho phép chạy phản ứng PCR trên mẫu DNA nhiều tạp chất Năm 2009, nghiên cứu thành công việc tạo đột biến trên Taq DNA polymerase cho phép kháng lại các chất ức chế hiện diện trong máu [19] Năm 2013 Miura và cộng sự đã tiến hành khảo sát hiệu quả khuếch đại DNA của 6 loại direct DNA polymerase đã được thương mại hóa Kết quả cho thấy cả 6 loại taq trên đều cho phép chạy phản ứng PCR trên đối tượng mẫu DNA thô mang nhiều chất ức chế [3]

Một số direct DNA polymerase trên thị thường hiện nay:

- KOD FX - Hãng Toyobo Life Science Deparment - Mighty Amp - Hãng Takara Bio

- Hemo KlenTaq - Hãng New England Biolabs (NEB) - Phusion Blood direct PCR kit – Hãng Thermo Fisher Scientific

13 - KAPA Blood PCR kit - Hãng Kapa Biosystems - BIOTAQ -Hãng Bioline

Các phương pháp ly trích DNA

Nhiều phương pháp ly trích DNA được xây dựng, tuy nhiên các phương pháp đều gồm ba bước cơ bản:

- BƯỚC 1: Ly giải -Quá trình này giúp phá hủy các cấu trúc protein, giải phóng các acid nucleic từ hạt nhân Thành phần đệm ly giải gồm đệm pH, muối, chất phá màng

- BƯỚC 2: Loại bỏ thành phần không phải DNA, chủ yếu là protein

Do DNA là nguồn nguyên liệu đầu vào cho phản ứng sinh học phân tử, tiêu chí hướng đến của quy trình ly trích là dễ thao tác, tránh ngoại nhiễm, ly trích được nhiều DNA, độ tinh sạch cao, giá thành rẻ, an toàn Tuy nhiên có được quy trình ly trích đạt được tất cả các yêu cầu đó là rất khó Vì vậy tùy vào nguồn mẫu, yêu cầu về độ tinh sạch, lượng DNA cần cho phản ứng, ta lựa chọn phương pháp ly trích phù hợp

Năm 1953, Grassmann và Deffner phát hiện rằng phenol là chất thích hợp để chiết xuất protein từ dung dịch nước [21] Kirby (1956), báo cáo phenol ở các điều kiện pH khác nhau cho phép phân tách DNA và RNA ra khỏi protein Ngay sau đó,

1957, Kirby tìm thấy rằng sự có mặt của muối anion (ví dụ p-aminosalicylate và natri benzoate) giúp tăng lượng DNA và RNA trong quá trình ly trích [20][22]

Ngày nay, phương pháp Kirby tiếp tục được sử dụng với sự bổ sung một số chất hỗ trợ khác như chất tẩy rửa anion SDS, chloroform và isoamyl alcohol

Ly trích bằng phenol là phương pháp ly trích ra đời sớm nhất, vẫn được sử dụng trong các phòng thí nghiệm và được xem là phương pháp ly trích cơ bản thích hợp cho nhiều đối tượng mẫu

Nguyên tắc: Phenol là chất biến tính protein mạnh đóng vai trò phá hủy các protein màng, enzyme phân hủy DNA, RNA Phenol không hòa tan acid nucleic, khi xử lý với hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội

14 bào: DNA, RNA, protein… Sau khi ly tâm, mẫu xử lý sẽ phân tách thành hai lớp:

Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa DNA, phần protein bị biến tính sẽ nằm ở bề mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ DNA trong phần dịch nổi ở trên sẽ được thu nhận bằng cách tủa với isopropanol có bổ sung chất trợ tủa (sodium acetat)

Muối dư thừa được rửa sạch với ethanol 70% Ly tâm, hong khô bằng nhiệt để loại bỏ ethanol Sau đó DNA được hòa tan với đệm TE hoặc nước cất vô trùng

- Ưu điểm: Ly trích được DNA có kích thước lớn trên nhiều loại mẫu

- Nhược điểm: Mất nhiều thời gian, dễ gây ức chế phản ứng PCR do đó đòi hỏi cao ở tay nghề kỹ thuật viên, hóa chất sử dụng độc hại [22]

Năm 1990, Boom và cộng sự công bố phương pháp ly trích DNA bằng silica trong môi trường muối chaotropic [23]

Nguyên tắc: Hạt silica tích điện dương hấp thụ DNA tích điện âm Trong điều kiện khác nhau về pH và thành phần muối của môi trường đệm, các yếu tố không cần thiết được loại bỏ dần trong quá trình rửa với các đệm chaotropic khác nhau

Bốn bước chính trong ly trích là ly giải tế bào, hấp thu các acid nucleic, rửa và rửa giải [24]

Silica tồn tại ở dạng tinh thể SiO 2 và một số dạng hóa học khác như oxit silic vô định hình và bột thủy tinh, alkylsilica, silicat nhôm (zeolit) hoặc silica gắn nhóm -

NH 2 Quy trình hydrat hóa silica tạo hạt silica ngậm nước tích điện dương sử dụng cho ly trích DNA được đăng ký patent vào năm 1994 bởi Woodard và cộng sự [25]

Hình 1.4: Ly trích bằng silica [26]

15 - Ưu điểm: Là phương pháp được sử dụng phổ biến Nhiều phương pháp ly trích ra đời trên cơ sở cải tiến từ phương pháp Boom Khắc phục được một số hạn chế của ly trích pha lỏng, hạn chế ức chế

- Nhược điểm: 4 giai đoạn thao tác ly giải, hấp thu, rửa và rửa giải dẫn đến quy trình ly trích nhiều bước, kỹ thuật viên thao tác dễ có nhầm lẫn, sai sót

1.4.3 Ly trích bằng cột lọc

Cột ly tâm chứa chất bám silica (silica resin) cho phép gắn chọn lọc DNA/

ARN/ plasmid Trong các đều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica giữ lại DNA/RNA, các thành phần không mong muống được loại bỏ bằng lực quay ly tâm

- Ưu điểm: Phần lớn các bộ kit ly trích tay thương mại hiện nay đều dùng phương pháp ly trích cột lọc Hạn chế tối đa trường hợp ức chế so với phương pháp phenol hay Boom Bộ ly trích cột không đòi hỏi đầu tư cao ở trang thiết bị, phù hợp cho số lượng mẫu ly trích nhỏ, do đó được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xét nghiệm

Ly trích thô DNA bằng các chất biến tính protein

Các quy trình ly trích DNA truyền thống cho thấy nhiều hạn chế về mặt ứng dụng như: Quy trình phức tạp dẫn đến dễ sai sót, nhầm lẫn trong quá trình ly trích của người kỹ thuật viên; Ly trích pha lỏng đòi hỏi yêu cầu cao ở tay nghề để tránh ngoại nhiễm và ức chế mẫu; Hóa chất độc hại; Hệ thống ly trích tự động khó thiết kế, giá thành cao Để nâng cao chất lượng quy trình xét nghiệm, yêu cầu xây dựng một quy trình ly trích nhanh với các ưu thế:

- Thực hiện đơn giản, từ một đến hai bước thao tác giúp tránh sai sót, nhầm lẫn trong ly trích

- Giảm vật tư tiêu hao, giảm giá thành ly trích

- Mở ra tiềm năng thiết kế hệ thống ly trích tự động chi phí thấp

1.5.2 Một số chất biến tính protein

Nhu cầu xây dựng quy trình ly trích nhanh DNA luôn tồn tại, tuy nhiên tại thời điểm trước, trình độ phát triển công nghệ sinh học chưa tạo ra tiền đề cho phép áp dụng quy trình ly trích nhanh DNA trong thực tế [2] Hiện nay dựa trên cơ sở là sự phát triển của công nghệ polymerase tái tổ hợp, ta có thể cân nhắc đến một số quy trình ly trích nhanh DNA bằng một số chất biến tính protein Có nhiều chất biến tính protein theo nhiều cơ chế khác nhau: Chất chaotropic (Phenol, chloroform), chất tẩy rửa (SDS, Triton, NaOH)

1.5.2.1 Chất chaotropic Chaotropic – muối hoạt động bề mặt – làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước Do đặc tính này, các chất chaotropic có khả năng làm thay đổi cấu trúc của protein dẫn đến: 1) ly giải màng tế bào, 2) biến tính protein, DNA và các đại phân tử khác, 3) bất hoạt enzyme nuclease, 4) thúc đẩy quá trình gắn acid nucleic vào silic [30] Một số chất chaotropic như:

17 Butanol, Ethanol, Guanidinium chloride, Magnesium chloride, Phenol, Propanol,

Sodiumperchlorat (NaClO 4), Sodium iodide(NaI)…

Công thức hóa học: C 6 H 5 OH Tính chất hóa học: Chất biến tính protein mạnh, phenol tan vô hạn ở 66 0 C, là chất không phân cực Trong khi acid nucleic là chất phân cực, do đó không bị hòa tan trong sự hiện diện của phenol Phenol tách pha trong nước Pha hữu cơ dưới cùng có chứa các protein biến tính và các thành phần khác của tế bào Pha nước ở trên chứa acid nucleic [11]

Phenol thường được sử dụng kết hợp với chloroform Mục đích của việc thêm cloroform cùng với phenol là để đảm bảo sự tách biệt rõ ràng giữa pha nước và pha hữu cơ

Chất tẩy rửa là phân tử hóa học có cấu trúc gồm đuôi không phân cực kị nước (hydrophob) và đầu phân cực ưa nước (hydrophyl) Phân loại chất tẩy rửa dựa trên tính chất của đầu ưa nước:

 Chất hoạt hóa ion: Đầu phân cực bị ion hóa, tích điện dương, âm, hoặc cả hai

 Chất hoạt hóa phi ion: đầu phân cực không bị ion hóa

Hình 1.5: Cấu tạo hóa học chất tẩy rửa [31]

18 Chất tẩy rửa tác động làm gián đoạn các liên kết ưa nước, kỵ nước trên màng sinh học do đó được sử dụng trong ly giải tế bào, bước đầu của quá trình ly trích DNA Một số chất tẩy rửa thường được sử dụng: SDS, Triton X 100 [31]

- Sodium dodecyl sulfate- SDS Thuộc nhóm chất hoạt hóa ion có đầu phân cực tích điện âm SDS xen đuôi kỵ nước vào cấu trúc protein = > thay đổi cấu trúc không gian của protein => bất hoạt protein

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học SDS [32]

- Triton X100 Chất tẩy rửa phi ion có đuôi kỵ nước cứng nhắc và cồng kềnh do đó không thâm nhập và làm biến tính các protein hòa tan trong nước Triton được sử dụng trong ly trích protein và trong phạm vi đề tài chúng tôi khảo sát quy trình ly trích thô bằng triton bởi lượng triton còn thừa trong dịch ly trích không tác động đến cấu trúc enzyme DNA polymerase [33]

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học triton X100 [33]

19 - NaOH: Chất hóa học có tính kiềm mạnh thường được sử dụng phá màng tế bào, biến tính sợi DNA Trong phương pháp alkaline, NaOH sử dụng kết hợp với SDS trong ly trích plasmid [34].

Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu thế trong xét nghiệm huyết thống

1.6.1 Đặc điểm tế bào niêm mạc miệng

Khoang miệng được giới hạn bởi môi (phía trước), má (hai bên), lưỡi (phía dưới) và vòm hầu (phía sau) Niêm mạc miệng là lớp tế bào bao phủ khoang miệng và lưỡi, là một tế bào hoàn thiện nghĩa là tế bào niêm mạc miệng mang DNA đại diện cho cá thể Ưu điểm của tế bào niêm mạc miệng:

- Dễ bong tróc do đó dễ dàng thu nhận để làm xét nghiệm DNA - Thao tác thu mẫu đơn giản, không xâm lấn

- Các tế bào niêm mạc miệng là những tế bào bong tróc rời rạc => dễ ly trích DNA [24]

Hình 1.8: Tế bào niêm mạc miệng dưới kính hiển vi [24]

1.6.2 Tế bào niêm mạc miệng - nguồn mẫu DNA ƣu thế cho xét nghiệm huyết thống

Nhiều nghiên cứu khảo sát tiềm năng cung cấp DNA của niêm mạc miệng đã được thực hiện Lee Moore và cộng sự (2001) đã khảo sát các phương thức thu nhận tế bào niêm mạc miệng và các yếu tố ảnh hưởng đến lượng DNA thu được Kết quả cho thấy mẫu niêm mạc miệng cung cấp lượng DNA dồi dào, phù hợp cho các phản

20 ứng PCR, mẫu có thể được bảo quản tốt trong điều kiện nhiệt độ thấp [5] Sau thời gian bảo quản lên tới 6 tháng, lượng DNA mẫu niêm mạc miệng vẫn được bảo toàn [35] Heath và cộng sự (1992) cũng có kết luận tương tự là niêm mạc miệng cung cấp DNA phù hợp cho các xét nghiệm lâm sàng và nghiên cứu [36]

Với các ưu điểm nêu trên, niêm mạc miệng trở thành nguồn mẫu đầu vào cho không chỉ cho xét nghiệm nhận dạng cá thể STR mà nó còn được sử dụng cho nhiều xét nghiệm khác Trên thị trường hiện nay đã có một số bộ kit cho phép ly trích nhanh DNA từ mẫu niêm mạc miệng như: BodeElute™ DNA Elution Reagent kit, QuickExtract™ DNA Extraction Solution, BuccalAmp™ DNA Extraction Kits Điểm chung của các sản phẩm này là thời gian ly trích ngắn, thao tác đơn giản, hiệu quả Giá thành của các bột kit ly trích nhanh khá cao nhưng vẫn được sử dụng vì yêu cầu quan trọng nhất trong các xét nghiệm, đặc biệt trong xét nghiệm STR, là độ chính xác Thao tác càng đơn giản thì các rủi ro nhầm lẫn, sai sót trong ly trích càng thấp

1.6.3 Các nghiên cứu ly trích thô DNA

Xét nghiệm nhận diện cá thể có tính chất nhạy cảm do đó yêu cầu cao ở độ chính xác Xây dựng quy trình xét nghiệm STR đòi hỏi giảm thấp nhất các rủi ro trong quá trình ly trích Ngoài ra bộ kit xét nghiệm STR trên thị trường hiện nay đều có khuyến cáo là enzyme DNA polymerase sử dụng trong bộ kit có tính kháng ức chế, cho phép chạy PCR trên đối tượng DNA nhiều tạp chất Qua đó thấy được đã có đủ các tiền đề cho phép áp dụng quy trình ly trích thô DNA trên mẫu niêm mạc miệng cho xét nghiệm STR [4]

Nhiều quy trình ly trích nhanh niêm mạc miệng đã được đề xuất, tuy nhiên chúng tôi quan tâm đến quy trình ly trích nhanh có thành phần chất ly giải là NaOH và Triton X 100 do tính chất phù hợp với yêu cầu ly trích nhanh Phenol không phù hợp cho ly trích nhanh bởi ở nhiệt độ 66 o C, phenol tan trong nước vì vậy dịch ly trích DNA sẽ mang một lượng phenol gây ức chế phản ứng [11] NaOH và Triton X100 (triton có đuôi kỵ nước cồng kềnh không xen vào được cấu trúc protein) có ưu điểm đó là lượng chất ly giải nếu còn sót lại trong dịch ly trích cũng không làm ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme polymerase [33]

21 - Quy trình ly trích nhanh bằng NaOH

Brenda Richards đã tiến hành ly trích niêm mạc miệng bằng NaOH [36] Quy trình thực hiện như sau:

 Cho tăm bông lấy mẫu niêm mạc miệng

 Vortex mạnh mẫu tăm bông trong 600μL dung dịch NaOH 50mM

 Hút cạn dịch lỏng trong tube sang tube mới, trung hòa bằng 60 μl 1M Tris-

 Sản phẩm DNA ly trích được tiến hành chạy PCR multiplex khuếch đại 5 vị trí exon trên vùng gen CFTR Kết quả cho thấy, chất lượng DNA thu được tham gia được phản ứng PCR multiplex

Ngoài ra tác giả Amy H Walker và công sự (1999) cũng đã chứng minh DNA từ mẫu niêm mạc miệng ly trích theo quy trình trên có thể tham gia vào phản ứng PCR với tỉ lệ thành công trên 92% [38]

- Quy trình ly trích nhanh bằng Triton X100

Trong nghiên cứu Daniel và cộng sự (1995), tác giả tiến hành ly trích nhanh bằng quy trình sử dụng Triton X 100 [37] Quy trình thực hiện như sau:

 Cho mẫu vào dung dịch biến tính protein (1% triton X100, 10mM Tris-HC1 pH8, EDTA 0.1mM)

 Ly tâm 12000g/10 phút, hút dịch nổi Kết quả cho thấy sản phẩm DNA ly trích bằng Triton không gây ức chế phản ứng

- Quy trình ly trích nhanh bằng NaOH và SDS

Trong báo cáo của cKlintschar M và cộng sự (2000), tác giả sử dụng quy trình alkalin (NaOH và SDS) ứng dụng trong ly trích DNA sử dụng trong phản ứng PCR STR [39] Quy trình thực hiện như sau:

 Cho mẫu vào dung dịch biến tính protein (50mM NaOH, SDS 0.025%)

 Trung hòa bằng 60 μl 1M Tris HCl pH8

 Ly tâm mạnh, hút dịch nổi chạy PCR Các nghiên cứu trên cho thấy, ly trích thô DNA từ niêm mạc miệng có thể thực hiện, chất lượng DNA thu được phù hợp cho một số các phản ứng PCR

Cải tiến vượt bậc của taq polymerase với hoạt tính kháng ức chế đã mở ra hướng ứng dụng của các quy trình ly trích thô DNA trong thực tiễn Trong xét nghiệm DNA, một quy trình ly trích niêm mạc miệng đơn giản trong một đến hai bước thao tác sẽ giúp giảm thiểu tối đa các sai sót, đồng thời giúp tiết kiệm chi phí , thời gian Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm khảo sát lại một số quy trình ly trích thô DNA trên đối tượng niêm mạc miệng đã công bố, lựa chọn và tiến hành cải tiến quy trình để có thể ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ nội dung nghiên cứu

- Trên cơ sở hiểu biết cơ bản về chất ly giải, lựa chọn nguồn hóa chất phổ biến (SDS, NaOH, triton X100,…), chúng tôi lựa chọn 3 quy trình ly trích thô DNA đã được báo cáo [36][37][39] Tiến hành ly trích song song 3 quy trình này, so sánh với quy trình ly trích đối chứng là bộ ly trích cột OMEGA trên đối tượng mẫu là niêm mạc miệng Từ đó lựa chọn quy trình phù hợp cho xét nghiệm

DNA trên cơ sở thỏa mãn yêu cầu sau:

 Rút ngắn được thời gian ly trích, thao tác đơn giản so với bộ ly trích đối chứng

 Sản phẩm DNA thu được phù hợp cho phản ứng PCR multiplex trên bộ kit PowerPlex ® Fusion System

- Cải tiến quy trình được chọn

- Đánh giá hiệu quả của quy trình đã cải tiến:

 So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình ly trích thương mại trên 10 mẫu

 Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu

Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Ly trích so sánh với bộ ly trích thương mại- 10 mẫu Đánh giá hiệu quả của quy trình đã cải tiến

Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu

Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp Ly trích khảo sát

Quy trình A: Triton X100 Quy trình đối chứng: Bộ ly trích E.Z.N.A ® Forensic DNA

Vật liệu

- Máy ủ nhiệt Benchmark: Xuất xứ Mỹ

- Máy PCR ASTEC: Xuất xứ Nhật Bản

- Hệ thống điện di mao quản ABI 3130 Genetic Analyzer: Xuất xứ Mỹ

- Tăm bông y tế 5mm - Bạch Tuyết: Xuất xứ Việt Nam

- Bộ kit ly trích cột E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit: Hãng sản xuất – OMEGA, xuất xứ -Mỹ

- Bộ kit PowerPlex ® Fusion System: Hãng sản xuất Promega, xuất xứ -Mỹ

- Hi-Di™ Formamide: Hãng sản xuất ABI, xuất xứ - Mỹ

- Các hóa chất ly trích:

 Tris-HCl (pH8, 1M) – hãng Sigma Aldrich

Thu nhận mẫu

- Phương pháp thu mẫu: Theo hướng dẫn của Michael S Adamowicz và cộng sự

 Yêu cầu: Người cung cấp mẫu không ăn uống bất kỳ thứ gì trong vòng 30 phút trước khi lấy mẫu

 Dùng tăm bông y tế quệt vào thành bên trong miệng 30 lần, xoay tròn tăm bông trong quá trình quệt

 Cho đầu tăm bông vào tube vô trùng , bổ sung 500μl dung dịch TE1X (Tris-HCl 10mM pH8, EDTA 0.1mM)

 Vortex mạnh, đặt vào máy lắc, lắc 10 phút ở tốc độ 900 vòng / phút để phóng thích các tế bào biểu mô

 Hút cạn dịch lỏng sang tube mới

 Mẫu lấy nhiều tăm bông thực hiện tương tự cho mỗi tăm bông Hút toàn bộ dịch lỏng dồn vào 1 tube lớn

 Bảo quản ở -20 o C - Số lượng mẫu thu nhận: 211 mẫu Lựa chọn đối tượng thu mẫu theo bảng 2.1

- Thời gian thu mẫu: 1 tháng

Bảng 2.1: Danh sách đối tượng thu mẫu

Nhóm Đối tƣợng thu mẫu Số lƣợng mẫu cần Số tăm bông thu/ 1 mẫu

4 10 cặp không cha con 20 mẫu 1

Ly trích khảo sát - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp

Dựa trên 3 quy trình ly trích bằng Triton, NaOH, và NaOH kết hợp SDS của các nhóm tác giả, chúng tôi tiến hành ly trích khảo sát so sánh với bộ ly trích thương mại E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit (bộ ly trích cột) Từ đó xác định quy trình ly trích phù hợp cho xét nghiệm quan hệ huyết thống

Dùng mẫu niêm mạc miệng thuộc nhóm 1(bảng 2.1), ly trích theo 4 phương pháp, mỗi phương pháp lặp lại 5 lần

- Ly trích bằng Triton X100 (bảng 2.2) - Ly trích bằng NaOH (bảng 2.3) - Ly trích bằng NaOH + SDS (bảng 2.4) - Ly trích đối chứng bằng bộ E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit (bảng 2.5)

Bảng 2.2: Quy trình ly trích bằng Triton X100 Quy trình A: Ly trích bằng Triton X100 theo Daniel (1995) [37]

Công thức pha đệm ly giải:

- Ủ 100 μl mẫu với 500μl dịch ly giải ở

95 o C/ 30 phút => Tạo hỗn hợp có nồng độ Triton X100 là 1%

- Hút dịch nổi, pha loãng 5 lần trong TE1X

Bảng 2.3: Quy trình ly trích bằng NaOH Quy trình B: Ly trích bằng NaOH theo Brenda (1992) [36]

Tạo hỗn hợp có nồng độ NaOH là 50mM

- Trung hòa bằng 60 μl 1M Tris HCl pH8

- Pha loãng 5 lần trong TE1X

Bảng 2.4: Quy trình ly trích bằng NaOH - SDS Quy trình C: Ly trích bằng NaOH + SDS [39]

- Cho 500μl dịch ly giải vào 100 μl mẫu =>

Tạo hỗn hợp có nồng độ : NaOH 50mM SDS 0.025%

- Trung hòa bằng 60 μl 1M TrisCl H pH8

- Pha loãng 5 lần trong TE1X

Bảng 2.5: Quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng bằng bộ ly trích cột E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit

Quy trình đối chứng: Ly trích bằng bộ E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit

Tài liệu tham khảo: Hướng dẫn sử dụng cung cấp bởi nhà sản xuất

 Cho 225 μl BL buffer vào mẫu => ủ 60 o C/10 phút

 Hút toàn bộ dịch vào cột

 Rửa lần 1 bằng 500 μl HBC buffer => Ly tâm 13000

 Rửa 2 lần bằng 700 μl DNA wash buffer

 Chuyển cột vào tube sạch

 Cho 200 μl elution buffer vào tube

 Ly tâm 13000 RPM/1phút => thu dịch

 Pha loãng 5 lần trong TE1X => Chạy PCR STR

2.4.2 Chạy PCR – phân tích kết quả

- Mix PCR STR được pha theo hướng dẫn của tài liệu Technical manual- Powerplex Fusion của Promera Bộ hóa chất sử dụng PowerPlex ® Fusion System (bảng 2.6)

Bảng 2.6: Công phức pha mix PCR-STR [4]

Hóa chất Thể tích/ 1 mix

PowerPlex ® Fusion 5X Primer Pair Mix 5μl

- Điện di trên hệ thống điện di mao quản ABI 3130 Genetic Analyzer:

 Cho vào plate chạy mẫu điện di hỗn hợp: 0.5μl WEN ILS 500 + 9.5 μl Hidi + 1 μl sản phẩm PCR

 Điện di kèm với một ladder: 0.5μl WEN ILS 500 + 9.5 μl Hidi + 1 μl

PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix

 Biến tính mẫu ở 95 o C/ 3 phút, chuyển ngay vào đá lạnh trong 3 phút

 Đặt vào máy ABI 3130 Genetic Analyzer, tiến hành điện di [4]

2.4.3 Phân tích kết quả lựa chọn quy trình ly trích phù hợp

Kết quả được phân tích trên phần mềm GeneMapper ID V3.2, so sánh với bộ đối chứng (OMEGA) ghi nhận số mẫu bị ức chế ( không có sản phẩm PCR), phần

29 trăm vị trí locus STR lên đủ peak, chiều cao peak (RFU) trung bình trên tổng số peak lên

Phương pháp ly trích ưu thế là phương pháp có:

- Số mẫu ức chế thấp nhất - Chiều cao trung bình peak cao nhất - Phần trăm số vị trí STR lên đủ peak cao nhất

2.5 Cải tiến trình ly trích phù hợp

- Dùng 1 mẫu niêm mạc miệng thuộc nhóm 1 (bảng 2.1) - Ly trích mẫu theo quy trình NaOH-SDS có nồng độ NaOH giữ nguyên 50mM, nồng độ SDS lần lượt là: 0.045%, 0.035%, 0.025%, 0.015%, 0.01% và 0.005%

(bảng 2.7) Ở mỗi nồng độ SDS, ly trích lặp lại 5 lần

- Chạy PCR STR, điện di phân tích kết quả theo hướng dẫn mục 2.4.2

- Phân tích kết quả bằng phần mềm Gene Mapper ID v3.2 - Từ bảng kết quả phân tích STR của mỗi quy trình ghi nhận số mẫu bị ức chế

(không có sản phẩm PCR), số vị trí STR lên đủ peak, chiều cao peak (RFU) trung bình trên tổng số peak lên

- Nồng độ SDS phù hợp là nồng độ tại đó, kết quả phân tích cho thấy:

 Không có mẫu ức chế

 Cường độ huỳnh quang trung bình của peak cao nhất

 Lên đủ peak ở 100% các vị trí STR

2.6 Đánh giá hiệu quả của quy trình cải tiến 2.6.1 So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình ly trích thương mại

- Số mẫu thực hiện: 10 mẫu thuộc nhóm 2 (bảng 2.1) - Từ quy trình ly trích xây dựng được ở mục 2.5, tiến hành ly trích song song với quy trình ly trích thương mại E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit

- Phân tích kết quả bằng phần mềm Gene Mapper ID v3.2

- Từ bảng kết quả phân tích STR của mỗi mẫu trên hai phương pháp ly trích ghi nhận:

 Số mẫu bị ức chế (không có sản phẩm PCR)

 Phần trăm số peak lên

 Số mẫu có tín hiệu peak thấp dưới 50 RFU

- Quy trình ly trích đã cải tiến đạt yêu cầu khi kết quả phân tích tương đồng với bộ đối chứng ở số lần lặp lại của trình tự STR, không có tín hiệu peak dưới 50 RFU

Bảng 2.7: Công thức pha đệm ly giải ở các nồng độ SDS khác nhau

Công thức pha đệm ly giải

Nồng độ SDS khảo sát Nồng độ SDS tương ứng trong dịch ly giải

2.6.2 Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu

- Số mẫu thực hiện: 160 mẫu thuộc nhóm 2, 10 cặp mẫu có quan hệ huyết thống cha con - nhóm 3, 10 cặp mẫu không có quan hệ huyết thống cha con - nhóm 4 (bảng 2.1)

- Ly trích theo quy trình ly trích xây dựng được ở mục 2.5

- Phân tích kết quả bằng phần mềm Gene Mapper ID v3.2 - Từ bảng kết quả phân tích STR của mỗi mẫu ghi nhận số mẫu bị ức chế (không có sản phẩm PCR), số mẫu lên đủ peak ở 24 vị trí STR, chiều cao peak

Quy trình ly trích đạt yêu cầu, có thể áp dụng trong thực tế khi:

 100% mẫu lên đủ peak ở 24 vị trí STR

 Trên 90% peak có cường độ huỳnh quang > 100RFU

 100% peak có cường độ huỳnh quang > 50RFU

 Trên 10 cặp mẫu đã biết có quan hệ huyết thống cha con, kết quả phân tích cũng phải có quan hệ huyết thống

 Trên 10 cặp mẫu đã biết không có quan hệ huyết thống cha con, kết quả phân tích cũng phải không có quan hệ huyết thống.

Đánh giá hiệu quả của quy trình ly trích đã cải tiến