Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát tiềm năng ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin của dịch thủy phân protein từ con hến

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Huỳnh Ngọc Oanh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 13 tháng 07 năm 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1 Chủ tịch hội đồng: TS Nguyễn Tiến Dũng

2 Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng3 Phản biện 2: TS Huỳnh Ngọc Oanh

4 Uỷ viên: PGS.TS Võ Đình Lệ Tâm5 Thư ký: TS Phan Thị Thanh Nga

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 25/03/1997 Nơi sinh: Khánh Hòa

I.TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát tiềm năng ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin của dịch thủy phân protein từ con hến

(Investigation of angiotensin converting enzyme inhibition potential of protein hydrolysate from babyclam)

II.NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

+ Xác định thành phần hóa học cơ bản của thịt hến

+ Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân để thu dịch thủy phân protein có hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin cao nhất

+ Phân đoạn dịch thủy phân, xác định phân đoạn peptide có hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin cao nhất

+ Xác định thành phần amino acid của dịch thủy phân + Đánh giá tính chất chức năng của dịch thủy phân + Khảo sát độ ổn định hoạt tính của bột dịch thủy phân III.NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022

IV.NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/06/2022 V.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS VÕ ĐÌNH LỆ TÂM

Tp HCM, ngày 13 tháng 06 năm 2022

PGS TS Võ Đình Lệ Tâm

Kỹ Thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tới các quý thầy, cô trong bộ môn đã truyền đạt, hướng dẫn, chia sẻ những kiến thức vô cùng quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường Đặc biệt, em muốn gửi lời cảm ơn đến cô PGS.TS.Võ Đình Lệ Tâm đã giao cho em đề tài và hướng dẫn em tận tình, chia sẻ những kinh nghiệm cũng như kiến thức vô cùng bổ ích về mặt học thuật

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy, cô quản lý phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được sử dụng các trang thiết bị, máy móc để có thể thực hiện luận văn này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình của em, đã luôn bên cạnh, hỗ trợ và động viên để em có thể hoàn thành luận văn này một cách tốt nhất

để thu được dịch thủy phân có hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin (ACEI) Đầu tiên, thành phần hóa học của con hến và ảnh hưởng của điều kiện thủy phân bao gồm tỷ lệ nguyên liệu:nước, tỷ lệ enzyme:cơ chất (E:S), thời gian thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân protein được đánh giá Sau đó, năm phân đoạn >30 kDa, 10-30 kDa, 3-10 kDa, 1-3 kDa và <1 kDa được thu nhận từ dịch thủy phân được đánh giá ACEI để tìm ra phân đoạn có hoạt tính ACEI cao nhất Tiếp theo, dịch thủy phân protein có ACEI cao nhất cũng được xác định thành phần, hàm lượng amino acid Kế đến, độ bền ACEI của bột dịch thủy phân dưới ảnh hưởng của pH và nhiệt độ và các tính chất chức năng gồm độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, khả năng giữ nước (WHC) và khả năng giữ dầu (OHC) của dịch thủy phân được đánh giá

Kết quả cho thấy thành phần hóa học của con hến có hàm ẩm là 77,5±0,5%, hàm lượng protein 64,4±1,3%, hàm lượng béo 11,8±0,1%, hàm lượng tro 4,2 ±0,2%, hàm lượng carbonhydrate 20,9 ±0,4% (theo hàm lượng chất khô) Dịch thủy phân protein của con hến có ACEI cao nhất đạt 85,9±2,8% với điều kiện thủy phân tốt nhất gồm tỷ lệ nguyên liệu: nước 1:10 (w/v), tỷ lệ E:S 50 U/g protein và thời gian thủy phân 5 giờ Phân đoạn peptide <1 kDa có ACEI cao nhất là 93,4±1,4% tại nồng độ protein là 1 mg/mL Giá trị IC50 của phân đoạn <1 kDa cao hơn 590 lần so với IC50 của lisinopril Acid amin cần thiết chiếm khoảng 42,2% tổng lượng acid amin Glu, Asp, Ala, Thr, Lys và Leu là các acid amin chủ yếu được tìm thấy trong thành phần dịch thủy phân Độ ổn định hoạt tính trong khoảng pH 1-11, ACEI của bột dịch thủy phân duy trì trên 59% so với mẫu không xử lý pH Sau khi xử lý nhiệt ở 100 oC, thời gian kéo dài đến 3 giờ ACEI của bột dịch thủy phân vẫn bảo toàn 72% so với mẫu không gia nhiệt Độ tan của dịch thủy phân protein con hến ở khoảng pH từ 3 đến 8, độ tan đạt trên 84%, độ bền nhiệt đạt trên 82% sau khi xử lý nhiệt ở 630C trong 30 phút và đạt trên 78% sau khi xử lý nhiệt ở 930C trong 30 giây Tại pH 3, khả năng tạo bọt (FC) và độ bền bọt (FS) của dịch thủy phân lần lượt

Trong khi, độ bền nhũ (ESI) lại cao hơn 1-6,1 lần so với natri caseinate WHC của dịch thủy phân con hến là 2,2±0,1 ml nước/g bột dịch thủy phân, cao hơn 1,4 lần so với WHC casein và OHC đạt 5,2±0,2 ml dầu/ g bột dịch thủy phân thấp hơn 1,3 lần so với OHC casein

Kết quả của nghiên cứu này đã đề xuất hướng tận dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu con hến Dịch thủy phân con hến có thể được sử dụng như một chất ức chế ACE có nguồn gốc tự nhiên hoặc phụ gia cải thiện cấu trúc thực phẩm dùng trong lĩnh vực công nghệ sinh học y dược hoặc thực phẩm

possessing angiotensin converting enzyme inhibitory activity (ACEI) Firstly, chemical composition of baby clam, and the influence of hydrolysis conditions including: baby clam:water, enzyme:substrate ratio (E:S ration), hydrolysis time on the ACEI were examined Followingly, five peptide fractions of >30 kDa, 10-30 kDa, 3-10 kDa, 1-3 kDa, and <1 kDa obtained from hydrolysate were evaluated theirs ACEI in order to find the fraction exhibiting the highest ACEI Afterwards, the amino acid composition of proteolysate with the highest ACEI were also investigated In the next stage, ACEI stability of the protein hydrolysate under the influence of pH and temperature and its functional properties comprising of solubility, heat stability, foaming property, emulsifying property, water holding capacity (WHC) and oil holding capacity (OHC) were evaluated

The results showed that chemical composition of baby clam included 77.5%±0.5% of moisture, 64.4±1.3% of protein, 11.8±0.4%, of lipid, 4.2 ±0.2% of ash, 20.9 ±0.4% of carbohydrate (on dry weight basic) The proteolysate exhibited the highest ACEI at 85.9±2.8% when being hydrolyzed of baby clam:water of 1:10 (w/v) , E:S ratio of 50 U/g protein, and for 5 hours Additionally, the <1kDa fraction displayed the highest ACEI of 93.4±1.4% % at protein content of 1mg/ml The IC50 value of the <1kDa fraction was 590 times higher than that of lisinopril The proteolysate had the indispensable amino acid content at nearly 42.2% and Glu, Asp, Ala, Thr, Lys and Leu were the prominent amino acid In the range pH 1-11, ACEI of hydrolysate powder still remained above 59% compared to the control sample After heating at 100oC for 3 hours, the ACEI of the protein hydrolysate remained 72% compared with the unheated sample In the pH range 3-8, The proteolysate exerted solubility over 84%, the heat stability achieved above 82% after heat treatment at 63oC for 30 min and 78% after heating at 93oC for 30s At pH 3, the foaming capacity (FC) and foaming stability (FS) of

lower than those of sodium caseinate, while its ESIs were 1-6.1 times higher than those of sodium caseinate WHC of protein hydrolysate was 2.2±0.1 water/g proteolysate powder, 1.4 times higher than that of casein and its OHC was 5.2±0.2 ml oil/g proteolysate powder, that was lower than 1.3 times of OHC casein

The result of this study suggested a new approach to use baby clam Baby clam hydrolysate can be used as a natural ACE inhibitor or food texture enhancer in medical biotechnology or food technology

đợt 2, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa thuộc Đại học Quốc Gia – Thành Phố Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập riêngcủa tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác Trong quá trình viết bài, các tài liệu tham khảo liên quan đã được trích dẫn nguồn cụ thể và rõ ràng theo đúng yêu cầu Nếu không đúng như đã nêu, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình

Học viên thực hiện luận văn

Phạm Việt Cường

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT v

LỜI CAM ĐOAN vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT xi

1.1.3 Đặc điểm sinh học của con hến 4

1.2 Dịch thủy phân protein 4

1.2.1 Phương pháp thu nhận 5

1.3 Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein 6

1.3.1 Hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) 7

1.3.2 Cơ chế ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) 8

1.3.3 Đặc tính của peptide có hoạt tính ức chế ACE 9

1.3.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein 10

1.4 Tính chất chức năng của dịch thủy phân protein 12

1.4.2.5 Khả năng giữ nước và giữ dầu 14

1.4.3 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng 14

2 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Chế phẩm enzyme và hóa chất 17

2.2 Sơ đồ nghiên cứu 18

2.3 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Xử lý nguyên liệu 19

2.4.2 Khảo sát thành phần hóa học của hến 19

2.4.3 Quá trình thủy phân 20

2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân 23

2.4.5 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan (Lowry và cộng sự, 1951) 24

2.4.6 Phương pháp xác định ACEI (Cushman, D.W và H.S Cheung, 1971) 24

2.4.7 Phương pháp thu nhận phân đoạn peptide từ dịch thủy phân 25

2.4.8 Phương pháp xác định mức độ thủy phân (Noman và cộng sự 2018) 26

2.4.9 Phương pháp xác định độ ổn định hoạt tính ức chế ACE dưới ảnh hưởng của pH và nhiệt độ (P.Sripokar và cộng sự, 2019) 27

2.4.11 Phân tích thống kê 28

3 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Kết quả thành phần hóa học của con hến 29

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân con hến 29

3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:nước 29

3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ E:S 31

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 32

3.3 Kết quả ACEI của phân đoạn dịch thủy phân con hến 34

3.4 Kết quả đánh giá thành phần amino acid, mức độ thủy phân, độ ổn định hoạt tính và tính chất chức năng của dịch thủy phân con hến 36

3.4.1 Kết quả đánh giá thành phần amino acid và mức độ thủy phân của dịch thủy phân con hến 36

3.4.2 Kết quả độ ổn định ACEI của dịch thủy phân với pH 40

3.4.3 Kết quả độ ổn định hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân với nhiệt độ………41

3.5 Kết quả tính chất chức năng của dịch thủy phân 42

4 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Đề xuất 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 64

ANOVA Analysis of variance (phân tích phương sai) AOAC Association of Official Analytical Chemists ACEI Hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin DH Degree of hydrolysis (mức độ thủy phân)

IC50 Nồng độ ức chế 50% enzyme chuyển hóa Angiotensin HHL Hippuryl-L-histidyl-L-leucine

E:S Enzyme:Substrate (Tỉ lệ enzyme:cơ chất) WHC Water holding capacity (khả năng giữ nước) OHC Oil holding capacity (khả năng giữ dầu) v/v volume/volume (thể tích/thể tích)

w/v weight/volume (khối lượng/thể tích) w/w weight/weight (khối lượng/khối lượng)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại tên khoa học con hến 3Bảng 2.1 Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme Alcalase®2.5L 17Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân protein hến 24Bảng 3.1 Thành phần hóa học của con hến 29Bảng 3.2 Giá trị IC50 của phân đoạn peptide <1 kDa, lisinopril và dịch thủy phân điều kiện tốt nhất 35Bảng 3.3 Kết quả thành phần acid amin trong dịch thủy phân 36 Bảng 3.4 Khả năng giữ nước và khả năng giữ dầu của dịch thủy phân protein con hến và casein ………50

Hình 1.2 Mô tả hoạt động của enzyme chuyển hóa angiotensin trong cơ thể 7

Hình 1.3 Cấu trúc ACE và vị trí liên kết của ion kẽm tại đầu N và đầu C 8

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 18

Hình 2.2 Quy trình thu nhận dịch thủy phân từ con hến 22

Hình 2.3 Phản ứng thủy phân HHL bằng ACE 25

Hình 2.4 Cột lọc phân đoạn peptide 25

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: nước đến ACEI của dịch thủy phân con hến 30

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ E:S đến ACEI của dịch thủy phân con hến 31

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân con hến 32

Hình 3.4 ACEI phân đoạn dịch thủy phân con hến 34

Hình 3.5 ACEI của mẫu hến thủy phân điều kiện tốt nhất và mẫu không thủy phân 38

Hình 3.6 Mức độ thủy phân (DH) của dịch thủy phân con hến điều kiện tốt nhất 39

Hình 3.7 Độ ổn định hoạt tính ức chế ACE của bột dịch thủy phân con hến theo pH 40

Hình 3.8 Độ ổn định hoạt tính ức chế ACE bột dịch thủy phân con hến theo thời gian xử lý nhiệt ở 100oC 41

Hình 3.9 Độ tan của dịch thủy phân con hến 43

Hình 3.10 Độ hòa tan của dịch thủy phân protein con hến sau khi xử lý nhiệt ở 63oC trong 30 phút và ở 93oC trong 30 giây 44

Hình 3.11 Khả năng tạo bọt của dịch thủy phân protein con hến và albumin 45

Hình 3.12 Khả năng bền bọt của dịch thủy phân protein con hến và albumin 47

Hình 3.13 Khả năng tạo nhũ của dịch thủy phân protein con hến và natri 48

Hình 3.14 Độ bền nhũ của dịch thủy phân protein con hến và natri caseinate 49

Hến có thành phần dinh dưỡng cao có lợi cho sức khỏe chứa nhiều vitamin như vitamin A, vitamin B, vitamin B12; các nguyên tố vi chất như sắt, đồng, magie, canxi; giàu protein và ít chất béo Hến thường sống ở nhiều vùng nước khác nhau như các cửa sông nước lợ, nước ngọt, gần các vùng kênh, rạch và ven biển ở nước ta Hến là nguồn nguyên liệu dồi dào nhưng có giá trị kinh tế thấp và chủ yếu được sử dụng trong chế biến thực phẩm ở dạng tươi Phổ biến nhất là các món hến xào, hến sấy và món cơm hến nổi tiếng ở Huế [1] Vì vậy, nguồn nguyên liệu dồi dào, sản lượng nhiều từ hến vẫn chưa được khai thác sử dụng một cách hiệu quả

Cao huyết áp là một tình trạng bệnh lý mãn tính, trong đó huyết áp trong động mạch tăng cao Vì vậy các bệnh lý liên quan về tim mạch có liên quan tới cao huyết áp Angiotensin converting enzyme (ACE) là một loại enzyme thủy phân angiotensin-I bằng cách cắt dipetide từ đầu COOH thành angiotesin-II Angiotensin-II được tạo thành gây co mạch mạnh làm tăng huyết áp và các bệnh về rối loạn tim mạch [2] Các nhà khoa học nghiên cứu và tổng hợp nhiều loại thuốc như lisinopril, alacepril, captopril,… có tác dụng ức chế ACE Tuy nhiên, các loại thuốc trên lại có một số tác dụng phụ khiến người sử dụng bị ho, phát ban, rối loại vị giác và gây viêm [2] Vì vậy, việc tìm kiếm các chất ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên luôn được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi để thay thế các chất ức chế ACE tổng hợp

Một số nghiên cứu cho thấy dịch thủy phân từ các nguồn nguyên liệu thủy hải sản như hải sâm và cá ngựa cho hoạt tính ức chế ACE [3], [4] Chính vì vậy, dịch thủy phân từ con hến được xem là nguồn nguyên liệu tuyệt vời để thu nhận ức chế ACE nhằm giảm huyết áp Ngoài ra, các tính chất chức năng khác của dịch thủy phân như độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, khả năng giữ nước (WHC) và giữ dầu (OHC) cũng được quan tâm nhằm ứng dụng vào quy trình sản xuất thực phẩm [5]

thủy phân protein con hến” được tiến hành Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng ức chế ACE có nguồn gốc từ dịch thủy phân hến Bên cạnh đó, các tính chất chức năng, độ bền hoạt tính ức chế ACE của bột dịch thủy phân con hến cũng được khảo sát nhằm ứng dụng vào các lĩnh vực công nghệ sinh học y dược và thực phẩm

Hình 0.1 Con hến [7] 1.1.2 Phân loại

Con hến có tên tiếng anh là baby clam, tên khoa học là Corbiculidae sp., thuộc họ Corbiculidae trong bộ Veneroida

Phân loại con hến được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 0.1 Phân loại tên khoa học con hến [7]

Phân ngành (subphylum) Lophazoa

Phân lớp (subclass) Heterodonta

1.1.3 Đặc điểm sinh học của con hến

Con hến (Corbicula sp.) có kích thước chỉ to hơn đầu ngón tay út, có vỏ hình bầu dục

hoặc tam giác giác Vùng đỉnh vỏ của hến nhô cao trong khi phần đầu và đuôi thì gần bằng nhau Phần cạnh bụng của hến cong nhiều hơn trong khi phần cạnh trước và cạnh sau đều tròn Kích thước hến trưởng thành gặp từ 20,5mm đến 28,5mm Trên lớp vỏ có đường vân sinh trưởng thể hiện số tuổi của hến Màu sắc của mặt ngoài vỏ hến thường có màu vàng xanh hay vàng đen Mặt trong thì màu trắng hoặc xám Màu sắc của hến cũng thay đổi phụ thuộc vào nơi chúng sinh sống, vỏ của hến thường có màu từ vàng lục đến nâu nhạt hoặc từ màu trắng đến xanh nhạt Một số hến ở tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc có vỏ màu vàng và nâu trong khi hến được thu hoạch ở phía Tây Nam Hoa Kỳ lại có màu sắc tối [8]

Hến sinh sản khá nhanh, một con hến có thể sinh sản 400 con non trong một ngày Hến sống ở môi trường nước có nhiệt độ từ 2-30oC Ở Việt Nam, hến sống ở kênh rạch và lớn hơn một tí là ra sông, khi trưởng thành thì thường sống ở vùng cồn cát Lúc hến sống được bên cồn cát là rất mập, trắng lại tròn Ở Việt Nam, từ tháng 3 đến tháng 8 âm lịch là mùa hến sinh sản và phát triển nhiều nhất

Hến sinh sản bằng cách thả các ấu trùng đã nở bên trong vỏ vào các vùng nước xung quanh nó sinh sống, sự thụ tinh diễn ra bên trong vỏ Tuổi thọ của hến khoảng từ 1-7 năm [9]

1.2 Dịch thủy phân protein

Dịch thủy phân protein là sản phẩm tạo ra từ quá trình thủy phân protein sử dụng các tác nhân khác nhau như tác nhân hóa học gồm acid và base hoặc tác nhân sinh học (chế phẩm enzyme protease) Bên cạnh đó, dịch thủy phân protein còn được định nghĩa là

hỗn hợp của các polypeptide phân tử lượng cao, hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng trung bình, peptone, hỗn hợp các peptide mạch ngắn, hỗn hợp các peptide phân tử lượng thấp và hỗn hợp các acid amin tự do [10]

Dịch thủy phân protein là một hỗn hợp chứa nhiều các peptide có độ dài và trình tự acid amin khác nhau Thông thường, những peptide được tạo ra từ quá trình thủy phân chứa từ 2-20 acid amin cùng với các acid amin tự do [10]

1.2.1 Phương pháp thu nhận 1.2.1.1 Thủy phân

Quá trình thuỷ phân được định nghĩa là quá trình phá vỡ các liên kết peptide trong protein có sự tham gia của nước khi sự có mặt của chất xúc tác như tác nhân hoá học (acid hoặc base) hoặc tác nhân hóa sinh (chế phẩm enzyme)

1.2.1.2 Thủy phân bằng tác nhân hóa học

Trong sản xuất công nghiệp thực phẩm, thủy phân bằng tác nhân hóa học thường được sử dụng do những ưu điểm như giá thành thấp và đơn giản dễ thực hiện Trong sản xuất thực phẩm, phương pháp này thường được áp dụng trong sản xuất nước tương, các sản phẩm lên men Các acid mạnh như HCl hoặc H2SO4 hoặc base mạnh (NaOH) thường được sử dụng để xúc tác ở nhiệt độ cao để cắt đứt liên kết peptide Ngoài các ưu điểm nêu trên, phương pháp này cũng tồn tại các hạn chế Khi thủy phân bằng tác nhân hóa học sử dụng acid mạnh dẫn đến mất các acid amin quan trọng như glutamine, asparagine và tryptophan cũng như các vitamin sẽ bị mất đi Nguyên nhân là do nồng độ acid quá cao (6-10N) và nhiệt độ cao (118oC) Dẫn đến tính chất chức năng và giá trị dinh dưỡng của dịch thủy phân thu được kém Thêm vào đó, quá trình trung hòa lượng acid và kiềm dư sau khi thủy phân cũng dẫn đến dịch thủy phân chứa một hàm lượng muối cao ảnh hưởng đến cảm quan của sản phẩm [3]

1.2.1.3 Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh

Phương pháp thủy phân protein bằng tác nhân hóa sinh phổ biến nhất là sử dụng chế phẩm enzyme protease (còn được gọi là peptidase hay proteinase)

Protease là một tên gọi dùng chung cho một nhóm các enzyme có chức năng phân giải protein bằng việc phân cắt liên kết peptide của protein Protease được tìm thấy ở động vật, thực vật nấm và vi sinh vật Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật là nguồn enzyme lớn nhất, được ứng dụng trong các lĩnh vực công nghiệp, công nghệ sinh học, y dược và phục vụ nghiên cứu các lĩnh vực khoa học cơ bản [3]

Protease được phân loại thành 5 nhóm chính dựa vào nhóm chức chức năng ở trung tâm hoạt động bao gồm serine, thiol, cystein, carboxyl và metallo Bên cạnh đó, protease còn được phân loại thành 2 nhóm là endoprotease và exoprotease dựa theo vị trí phản ứng Nhóm endoprotease, nhóm này thủy phân liên kết peptide trong protein, sinh ra những peptide lớn Và nhóm còn lại là exoprotease (aminopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N và carboxypeptidase thủy phân liên kết peptide đầu C của protein) [3] Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với phương pháp hóa học Ưu điểm lớn nhất là bảo vệ được giá trị dinh dưỡng của các acid amin được tạo ra trong quá trình thủy phân do hạn chế sử dụng hóa chất Ngoài ra dựa vào sự đặc hiệu của vị trí cắt của các enzyme protease khác nhau, từ đó có thể lựa chọn enzyme protease phù hợp để kiểm soát được thành phần peptide và acid amin của dịch thủy phân [11]

1.3 Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein

Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân có được có liên quan tới sự cộng hưởng hoạt tính của các thành phần có trong dịch thủy phân như peptide, protein tan trong nước và các acid amin [12] Trong đó, peptide đóng vai trò quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của dịch thủy phân do peptide chiếm phần lớn trong thành phần dịch Tuy nhiên, các peptide chỉ thể hiện được các hoạt tính sinh học như liên kết kim loại, kháng khuẩn, ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE), kháng oxy hóa và các hoạt tính khác khi

chúng được giải phóng khỏi trình tự protein thông qua các quá trình như tiêu hóa, thủy phân bằng enzyme [13]

1.3.1 Hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE)

Cao huyết áp là một tình trạng bệnh lý mãn tính, trong đó huyết áp trong động mạch tăng cao Do đó, nó là nguy cơ phổ biến nhất của nhiều bệnh lý liên quan về tim mạch [14] ACE là một enzyme có vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa huyết áp ACE xúc tác quá trình chuyển đổi angiotensin-I (một hormone peptide) thành angiotensin-II bằng cách loại bỏ hai amino acid ở đầu cuối carboxyl của angiotensin-I Angiotensin-II làm co mạch máu dẫn đến huyết áp cao [15]

Ngoài ra, theo hình 1.2 ACE còn làm phân hủy cả bradykinin- một chất làm giãn mạch máu khi mạch máu bị co quá mức Vì vậy, ức chế ACE là mục tiêu chính cho hoạt động hạ huyết áp, ngăn ngừa các bệnh tim mạch Dựa trên cơ chế điều hòa huyết áp trong cơ thể, rất nhiều thuốc ức chế ACE tổng hợp được điều chế như captopril, lisinopril, enalapril và alacepril Tuy nhiên, những chất này lại có tác dụng phụ khiến người sử dụng bị ho, phát ban da, rối loạn vị giác hay bị viêm Vì thế, các chất ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên được nghiên cứu rộng rãi nhằm thay thế chất ức chế ACE tổng hợp [15]

1.3.2 Cơ chế ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE)

ACE là một glycoprotein có chứa gốc carbohydrate bao gồm mannose, galactose, fructose, N-acetylneuraminic acid và N-acetyl-glucosamine Cấu trúc của ACE bao gồm hai vùng, đó là vùng N và vùng C Mỗi vùng chứa các vị trí mà tại đó liên kết với Zn2+ Do đó Zn2+ đóng vai trò là cofactor xúc tác cho các phản ứng của ACE Vì vậy, Zn2+

đóng vai trò quan trọng và cần thiết cho hoạt động của ACE

Hình 1.3 minh họa cấu trúc của ACE Do đó, ACE có thể bị ức chế bởi các tác nhân tạo phức với kim loại [16]

Hình 0.3 Cấu trúc ACE và vị trí liên kết của ion kẽm tại đầu N và đầu C [17] Các cơ chế ức chế ACE được phát hiện là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh Trong cơ chế ức chế cạnh tranh, chất ức chế cạnh tranh với cơ chất bằng cách liên kết với vị trí hoạt động của ACE Tương tác nhiều liên kết hydro giữa ACE và peptide có thể thúc đẩy sự ức chế hoạt động của ACE [18] Ngoài ra, các peptide ức chế cạnh tranh

với cơ chất thường có độ dài mạch ngắn khoảng từ 2 - 12 amino acid Các peptide lớn không thể liên kết với các vị trí hoạt động của ACE [16] Một yếu tố khác là thành phần acid amin của các peptide,các peptide có các amino acid có tính acid như Glu và Asp tạo điện tích âm cho peptide Vì vậy, peptide hình thành liên kết phối trí với Zn2+ ở vị trí hoạt động của ACE [16]

Trong cơ chế ức chế không cạnh tranh, chất ức chế liên kết với một vị trí khác với vị trí hoạt động của ACE Sự gắn kết của chất ức chế với ACE làm thay đổi cấu trúc của ACE, điều này ngăn cản cơ chất liên kết với vị trí hoạt động của ACE [16] Thông thường, chất ức chế liên kết với phức hợp cơ chất-enzyme tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất-peptide ức chế, ngăn cản tạo thành sản phẩm và dẫn đến làm giảm Vmax của ACE [19]

1.3.3 Đặc tính của peptide có hoạt tính ức chế ACE

Theo nghiên cứu của Gu và cộng sự (2013), hai mô hình mỗi quan hệ định lượng giữa hoạt tính và cấu trúc đã được xây dựng cho các dipeptide và tripeptide tương ứng dựa trên 168 dipeptide và 140 tripeptide có hoạt tính ức chế ACE mạnh được báo cáo trong các công trình đã xuất bản trước đây Kết quả chỉ ra rằng đối với các dipeptide, ưu tiên các gốc axit amin có chuỗi kích thước lớn cũng như các chuỗi bên kỵ nước như phenylalanin, tyrosine và tryptophan Cấu trúc của đầu cacboxyl của dipeptide có liên quan trực tiếp đến hoạt tính ức chế ACE của dipeptide hơn là đầu N [20]

Đối với tripeptide, cấu trúc ức chế ACE phù hợp nhất là bao gồm phần dư acid amin thơm ở đầu C, phần dư acid amin tích điện dương ở giữa và phần dư acid amin kỵ nước ở đầu N Nhiều tripeptide được xác định trong nghiên cứu của Gu và cộng sự (2013) chứa phenylalanin, tryptophan hoặc tyrosine ở đầu C và axit amin kỵ nước như leucine, tryptophan ở đầu N, góp phần vào hoạt tính ức chế ACE cao [21]

Trong báo cáo của Cushman và cộng sự (1973), sự hiện diện của tyrosine, phenylalanine, tryptophan, proline, lysine, isoleucine, valine, leucine và arginine trong peptide có ảnh hưởng mạnh đến liên kết của ACE Vị trí hoạt động của ACE gồm ba vị phụ : vị trí trước

áp chót (S1), vị trí áp chót (S1’) và vị trí cuối cùng (S2’) Trong cơ chất, các acid amin Pro, Ala, Val, Leu sẽ liên kết cho S1; Ile liên kết cho S1’; và Pro và Leu liên kết cho S2’ Vị trí phụ S1 bao gồm các gốc Ala354, Glu384 và Tyr523; Túi S1’ chứa Glu162; và túi S2 bao gồm Gln281, His353, His513, Lys511 và Tyr520 [22] Có thể thấy các peptide ức chế ACE có độ dài mạch ngắn, thường là tripeptide Các peptide này có các amino acid thường thấy là Tyr, Phe, Trp, Pro hoặc Lys ở đầu C Trong đó, Pro, Trp và Lys cho hiệu quả nhất trong tăng hoạt tính ức chế ACE của peptide Ngoài ra, các amino acid kỵ nước và các amino acid có vòng thơm xuất hiện ở đầu C của peptide cho thấy peptide có hoạt tính ức chế ACE [22]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein

1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein trên thế giới

Trên thế giới, có nhiều nghiên cứu về hoạt tính ức chế ACE sử dụng dịch thuỷ phân protein bằng các chế phẩm enzyme protease khác nhau Các chế phẩm enzyme protease phổ biến được sử dụng nhiều nhất là Alcalase, Neutrase, Protamex và Flavourzyme N.H.Ishak và cộng sự (2021) sử dụng enzyme alcalase để thuỷ phân protein cá nục chuối và đạt mức độ thuỷ phân là từ 67,7% đến 99,52% và hoạt tính ức chế ACE còn 10,16% đến 94,21% Trình tự amino acid của peptide từ cá nục chuối là Arg-Gly-Val-Gly-Pro-Val-Pro-Ala-Ala [23]

J.Shi và cộng sự (2020) sử dụng alcalase để thuỷ phân protein cá ngựa và thu được peptide ức chế ACE mới có trình tự là Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala Dịch thuỷ phân thu được cho thấy khả năng ức chế ACE là 51,85% ở nồng độ protein là 1 mg/mL [9]

Adamson và Reynolds (1996) đã quan sát thấy sự phân cắt của liên kết peptide khi các amino acid Glu, Met, Leu, Tyr, Lys và Gln ở P1, ưu tiên nếu là Glu [14] Alcalase có

thể được sử dụng để thu được các peptide có đặc điểm chung là kỵ nước [10], phân cắt các liên kết peptide tại Gln-His, Ser-His, Leu-Tyr và Tyr-Thr[14]

Trong nghiên cứu của Mongkonkamthorn và cộng sự (2020) đã sử dụng ba loại enzyme là Alcalase, Neutrase và Flavourzyme để thuỷ phân máu cá ngừ Kết quả cho thấy dịch thủy phân có chứa các acid amin kỵ nước như Lys, Ile, Val, Leu, Phe cho hoạt tính ức chế ACE cao nhất [24] Bên cạnh đó, nghiên cứu của Yang Su và cộng sự (2016) thủy phân phụ phẩm súp lơ bằng enzyme protease xác định được một dipetide ức chế ACE có trình tự là Val-Trp có giá trị IC50 là 31,30 μM [25]

Một nghiên cứu khác của Ghanbari và cộng sự (2015) đã thủy hải sâm bằng nhiều enzyme protease khác nhau bao gồm Alcalase, Bromalin, Papain, Flavorzyme, Pepsin và Trypsin Kết quả cho thấy hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân từ 6 loại enzyme khác nhau có hoạt tính ức chế ACE giá trị IC50 trong khoảng từ 1,50-2,54 mg/mL [4] 1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Ngo và cộng sự (2016) sử dụng các loại enzyme protease khác nhau để thủy phân da cá tuyết Thái Bình Dương nhằm thu nhận và xác định phân đoạn, trình tự peptide có hoạt tính ức chế ACE cao nhất Kết quả cho thấy peptide có phân đoạn <1 kDa có trình tự GASSGMPG có khối lượng phân tử 662 Da cho hoạt tính ức chế ACE cao nhất Giá trị IC50 của phân đoạn này là 6,9 μM [26]

Một nghiên cứu khác của Ngo và cộng sự (2014) sử dụng 4 loại enzyme khác nhau gồm Alcalase, Neutrase, Protamex thủy phân da cá đuối để thu nhận peptide có hoạt tính ức chế ACE cao nhất bằng siêu lọc và giải trình tự phân đoạn peptide Kết quả thu nhận được hai phân đoạn peptide có hoạt tính ức chế ACE cao nhất là MVGSAPGVL và LGPLGHQ có giá trị ức chế ACE IC50 lần lượt là 3,09 μM và 4,22 μM [27]

1.4 Tính chất chức năng của dịch thủy phân protein

1.4.1 Giới thiệu về các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein

Các tính chất chức năng quan trọng của dịch thủy phân gồm: độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ và khả năng giữ nước và giữ dầu Những thay đổi về điều kiện thủy phân ảnh hưởng trực tiếp đến các tính chất chức năng của dịch thủy phân Nghiên cứu của Cho và cộng sự (2014), cũng chỉ ra rằng dịch thủy phân từ các nguồn protein khác nhau như lòng đỏ trứng gà, xương cá ngừ vây vàng có các tính chất chức năng khác nhau Vì vậy, cần thiết để xác định tính chất chức năng của dịch thủy phân bên cạnh hoạt tính sinh học của dịch [28]

1.4.2 Các tính chất chức năng của dịch thủy phân 1.4.2.1 Độ tan

Độ hòa tan là một trong những tính chất quan trọng của dịch thủy phân protein Độ hòa tan của dịch thủy phân là một yếu tố thiết yếu cần xem xét và đánh giá đầu tiên nếu sử dụng dịch thủy phân trong sản xuất công nghệ thực phẩm như thức uống giải khát và thức uống cho trẻ em Các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến độ hòa tan của dịch thủy phân là cường độ ion, pH, nhiệt độ và sự hiện diện của các chất phụ gia khác nhau trong dung môi Thay đổi các yếu tố trên dẫn làm tăng độ hòa tan của dịch thủy phân Tuy nhiên việc thay đổi các điều kiện dung dịch không phải luôn luôn phù hợp để tăng độ hòa tan của dịch thủy phân protein đến mức cần thiết [29]

1.4.2.2 Độ bền nhiệt

Bên cạnh độ hòa tan, độ bền nhiệt cũng là một tính chất quan trọng của dịch thủy phân cần được quan tâm Xử lý nhiệt là một quy trình quan trọng, thiết yếu trong công nghệ chế biến và sản xuất thực phẩm Vì vậy, dựa vào độ bền nhiệt có thể xác định được mức độ ứng dụng của dịch thủy phân vào công nghệ chế biến thực phẩm Sự thay đổi độ tan của protein trong quá trình xử lý nhiệt là bằng chứng của sự thay đổi cấu hình trong cấu trúc của protein Protein bị thay đổi cấu hình dẫn đến hình thành phản ứng kết tủa phức

tạp và bất thuận nghịch Vì vậy dựa vào độ tan có thể xác định được độ bền nhiệt của dịch thủy phân [3]

1.4.2.3 Khả năng tạo bọt

Khả năng tạo bọt của dịch thủy phân protein rất quan trọng vì trực tiếp ảnh hưởng đến cấu trúc của sản phẩm Khả năng tạo bọt của dịch thủy phân bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như nguồn protein, phương pháp tạo bọt và các thông số quá trình như nhiệt độ, pH, nồng độ protein, thời gian khuấy Bên cạnh đó, khả năng tạo bọt của protein còn phụ thuộc vào khả năng hình thành màng bao mềm dẻo, đàn hồi và cố kết để bao bọc và giúp bọt chống lại tác động cơ học [29]

1.4.2.5 Khả năng giữ nước và giữ dầu

Khả năng giữ nước (WHC) cũng là một tính chất quan trọng của dịch thủy phân WHC của bột dịch thủy phân có được là nhờ vào khả năng cố định, giữ nước trong mạng protein chống lại lực hút vật lý và hóa lý của protein WHC có ảnh hưởng đến cấu trúc và độ cứng của sản phẩm [31] WHC của dịch thủy phân phụ thuộc thành phần acid amin và kích thước peptide của dịch thủy phân Nước tương tác với protein thông qua nhiều con đường, chủ yếu là liên kết hydro với các nhóm ưa nước như sulfhydryl, amino, imino, carboxyl và carbonyl Bên cạnh đó, peptide có khối lượng phân tử lớn hơn thường giữ nước kém hơn peptide có khối lượng phân tử nhỏ hơn Nguyên nhân là do peptide có khối lượng phân tử nhỏ có tính ưa nước cao hơn Vì vậy protein/peptide có WHC cao có thể sử dụng như một chất giữ ẩm trong quá trình sản xuất thực phẩm [32]

Khả năng giữ dầu OHC cũng là một yếu tố thiết yếu và là cơ sở quan trọng ảnh hưởng đến hương vị thực phẩm Cơ chế giữ dầu của protein có được là nhờ vào bẫy vật lý Protein có khối lượng riêng càng cao thì OHC càng cao [33] Ngoài ra OHC dịch thủy phân còn bị ảnh hưởng bởi điều kiện xử lý, nguồn protein, kích thước protein và các thành phần phụ gia Thêm vào đó, các yếu tố khác như mức độ thủy phân, bề mặt kỵ nước của peptide và tính đặc hiệu enzyme-cơ chất cũng ảnh hưởng tới OHC của bột dịch thủy phân [34]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng

1.4.3.1 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng trên thế giới

Trên thế giới, nghiên cứu của Putra và cộng sự (2018) về độ tan, khả năng tạo nhũ (EAI), khả năng tạo bọt (FC) , khả năng giữ nước (OHC) của dịch thủy phân ốc bươu vàng Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch thủy phân ốc bươu vàng có độ tan cao nhất là 77,78% EAI và FC cao nhất lần lượt là 19,90 m2/g và 34,67% OHC của dịch thủy phân ốc bươu vàng cũng đạt cao nhất với giá trị là 4,24 ml nước/g bột dịch thủy phân [31]

Một nghiên cứu khác của Taheri và cộng sự (2011) sử dụng enzyme Alcalase thủy phân phụ phẩm gia cầm và cá hồi vân Nghiên cứu đánh giá các tính chất chức năng của hai dịch thủy phân với các tính chất gồm độ hòa tan, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC và OHC Kết quả cho các tính chất như khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, độ hòa tan của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi vân cao hơn so với dịch thủy phân phụ phẩm gia cầm Tuy nhiên, OHC và WHC của hai dịch thủy phân lại không có sự chênh lệch nhiều [35]

1.4.3.2 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Võ Đình Lệ Tâm và cộng sự (2020) khảo sát các tính chất chức năng của dịch thủy phân con ruốc khô Các tính chất được khảo sát gồm: độ hòa tan, độ bền nhiệt, tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC và OHC Kết quả cho thấy trong khoảng pH khảo sát từ 3 đến 8, hầu hết dịch thủy phân đạt độ tan trên 74% và đạt cực đại tại giá trị 94,63±2,47% tại pH 8 Độ tan của dịch thủy phân con ruốc khô đạt trên 73% sau quá trình xử lý nhiệt ở 93 oC trong 30 giây và 63 oC trong 30 phút FC của dịch thủy phân con ruốc đạt giá trị cực đại là 97,98±9,08% tại giá trị pH 7 EAI của dịch thủy phân cũng đạt giá trị cực đại tại giá trị pH 7 là 24,15±1,66 m2/g ,trong khi ESI đạt cực đại tại giá trị pH 8 là 51,64±2,71 phút WHC và OHC của dịch thủy phân lần lượt là 2,52±0,16 mL nước/g bột dịch thủy phân và 5,47±0,41 ml dầu/g bột dịch thủy phân [36] Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của Võ Đình Lệ Tâm và cộng sự (2020) khảo sát các tính chất chức năng gồm độ hòa tan, độ bền nhiệt, tạo bọt, khả năng tạo nhũ, OHC và WHC của dịch thủy phân từ phụ phẩm cá hồi Kết quả cho thấy dịch thủy phân trong khoảng pH từ 3 đến 8 đạt độ tan trên 85% Độ tan của dịch thủy phân cũng đạt trên trên 65% khi xử lý nhiệt 93 oC trong 30 giây và trên 85% sau khi xử lý nhiệt ở 63 oC trong 30 phút Giá trị FC và FS của dịch thủy phân cũng cao hơn thấp hơn lần lượt từ 1,4-4,7 lần và 1,8-12,8 lần so với albumin EAI và ESI của dịch cũng thấp hơn lần lượt là 1,1-2,7 và

4,1-11,1 lần so với natri caseinate WHC và OHC của bột dịch thủy phân lần lượt là 2.00 ± 0.09 mL nước/g bột dịch thủy phân và 6.47 ± 0.25 mL dầu/g bột dịch thủy phân [37]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1.1 Nguyên liệu và hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu hến sông được thu mua từ chợ đầu mối và vận chuyển lạnh đến nơi xử lý 2.1.2 Chế phẩm enzyme và hóa chất

Chế phẩm enzyme Alcalase®2.5L được mua từ Novozymes (Đan Mạch) Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 0.1 Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme Alcalase®2.5L

Loại enzyme pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu Phân loại enzyme

Các loại hóa chất được sử dụng: Angiotensin converting enzyme từ phổi thỏ có hoạt độ 0.1U/mg được mua từ Sigma-Aldrich (Mỹ) (Trong đó 1U được định nghĩa là số đơn vị enzyme tại điều kiện 37oC, pH 8,3 trong 50mM Natri borat chứa 500 mM NaCl giải phóng 1µmol hippuric acid từ Hippuryl-L-histidyl-L-leucine trong 1 phút) Hippuryl-L-histidyl-L-leucine được mua từ Sigma-Aldrich (Mỹ) Các hóa chất đồng sulphate (CuSO4), NaOH, HCl được mua tại công ty Hóa Nam (Việt Nam), Folin Ciocalteu, Albumin, Tyrosin, Ethyl acetate và các hóa chất khác được mua từ công ty Merck, Schuchardt (Đức) Tất cả chất trên đều đạt chuẩn phân tích Nước cất được dùng trong nghiên cứu này

1.2 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 0.1 Sơ đồ nghiên cứu

1.3 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu được thể hiện trên hình 2.1 Đầu tiên, thành phần hóa học của con hến sẽ được khảo sát nhằm sát định thành phần protein, lipid, carbonhydrate, ẩm và tro Tiếp đó, dịch thủy phân con hến sẽ được khảo sát ba yếu tố là tỷ lệ nguyên liệu:nước, tỷ lệ E:S và thời gian thủy phân Mục tiêu là thu được điều kiện tốt nhất của dịch thủy phân có hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein con hến Sau đó, dịch thủy phân sẽ được tách phân đoạn nhằm xác định phân đoạn có hoạt tính ức chế ACE cao nhất Dịch thủy phân cũng được khảo sát các thành phần amino acid, tính chất chức năng cũng như độ bền hoạt tính của dịch theo nhiệt độ và pH và mức độ thủy phân

1.4 Phương pháp nghiên cứu 1.4.1 Xử lý nguyên liệu

Hến được rửa qua nước sạch nhằm loại bỏ bùn đất, tạp chất còn dính lại trên vỏ hến Tiếp theo đó, nguyên liệu sẽ được chần qua nước nóng (90 – 95oC) trong 5 phút, khuấy đảo mạnh trong suốt quá trình để phần thịt được tách ra khỏi vỏ và nổi lên mặt nước Tiến hành thu nhận phần thịt tươi và rửa lại với nước sạch để loại bỏ hoàn toàn phần cát, vỏ hến còn dính vào nguyên liệu, để ráo trong 10 phút để tránh việc hấp thụ nước Phần thịt sau khi làm ráo được tiến hành xay nhuyễn 2 lần (để đảm bảo đồng nhất về kích thước) thành dạng paste sử dụng thiết bị nghiền trục vis với đường kính lỗ là 5mm Việc xay nhuyễn nhằm mục đích tăng bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu với enzyme, do đó tăng độ hiệu quả của trình thủy phân Nguyên liệu được bảo quản trong túi polyethylene (200-500g/ túi) và được bảo quản lạnh ở -20oC trong tủ đông đến khi thí nghiệm

2.4.2 Khảo sát thành phần hóa học của hến

2.4.2.1 Xác định protein tổng bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000)

Nguyên tắc: khi đốt nóng mẫu đem phân tích với dung dịch H2SO4 đậm đặc, carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với dung dịch H SO tạo thành muối (NH ) SO Bay hơi NH khỏi hỗn hợp bằng dung dịch

NaOH Hóa lỏng NH3 bay ra và thu nhận bằng một lượng xác định dung dịch H2SO4

0,1N Định lượng lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu [38]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục ở trang 64

2.4.2.2 Xác định hàm lượng béo bằng phương pháp Folch (Folch và cộng sự, 1957) Nguyên tắc: Dùng dung môi kị nước (chloroform:methanol = 2:1) trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ Loại bỏ phần chất rắn bằng cách lọc hoặc ly tâm Một số thành phần tạp chất sau khi trích ly được loại bỏ bằng cách cho tiếp xúc với nước, khuấy, ly tâm, tách tạp Lipid trong nguyên liệu được tách khỏi dung môi kỵ nước bằng thiết bị bốc hơi chân không [39]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục ở trang 65 2.4.2.3 Xác định hàm ẩm (AOAC, 2000)

Nguyên tắc: sấy mẫu nguyên liệu đã biết khối lượng đến khối lượng không đổi, từ đó xác định được hàm lượng ẩm của mẫu [38]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục ở trang 65 2.4.2.4 Xác định hàm lượng tro (AOAC, 2000)

Nguyên tắc: Mẫu được nung ở nhiệt độ 500-550oC để đốt cháy hết các hợp chất hữu cơ, phần còn lại thu được là tro [38]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục ở trang 66 2.4.3 Quá trình thủy phân

Quy trình chuẩn bị dịch thủy phân được trình bày ở Hình 2.2 theo phương pháp của Bhaskar và Mahendrakar [40] với một vài điều chỉnh Thịt hến (đã xay nhuyễn) sau rã đông được đem cân và phối trộn với nước theo một tỉ lệ thích hợp, hỗn hợp sau đó được gia nhiệt lên 90oC và giữ trong 15 phút để bất hoạt các enzyme nội tại có trong nguyên liệu Chế phẩm enzyme Alcalase được bổ sung vào hỗn hợp với các tỉ lệ mong muốn sau

khi đã hiệu chỉnh pH của dịch về đúng điều kiện tối ưu của enzyme (chỉnh pH sử dụng dung dịch NaOH 1M và HCL 1M) Quá trình thủy phân được thực hiện trong bể điều nhiệt với nhiệt độ tối ưu của enzyme là 55oCvà thời gian theo bố trí thí nghiệm Sau một khoảng thời gian nhất định, kết thúc phản ứng bằng cách gia nhiệt hỗn hợp lên 90oC trong 15 phút để bất hoạt chế phẩm enzyme Dịch thủy phân được đem đi ly tâm ở chế độ 3000vòng/phút trong 20 phút để tách riêng phần rắn và dịch lỏng (supernatant) Phần dịch thủy phân tách béo được tiến hành lọc tinh bằng giấy lọc 0.45µm Whatman và bảo quản trong bao bì PA hàn kín ở -20oC cho đến khi phân tích

Hình 0.2 Quy trình thu nhận dịch thủy phân từ con hến

2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân

Có nhiều nghiên cứu về hoạt tính ức chế ACE sử dụng dịch thuỷ phân protein bằng các loại enzyme khác nhau Các enzyme protease thương mại thường dùng để thu được dịch thuỷ phân protein có hoạt tính ức chế ACE gồm có Alcalase, Neutrase, Protamex và Flavourzyme

Nghiên cứu của Lee và cộng sự (2009) sử dụng các 5 loại enzyme α-chymotrypsin, Neutrase, Papain, Trypsin và Alcalase thủy phân con luân trùng Kết quả cho thấy dịch thủy phân từ enzyme Alcalase cho hoạt tính ức chế ACE cao nhất so với dịch thủy phân từ các enzyme còn lại với giá trị IC50 là 0,63 mg/mL [41]

Bên cạnh đó, của Ahna và cộng sự (2012) sử dụng 6 loại enzyme Alcalase, Protamex, Pepsin, Flavourzyme, Neutrase và Trypsin để thủy phân phụ phẩm cá hồi thu dịch thủy phân có hoạt tính ức chế ACE Kết quả cũng cho thấy dịch thủy phân bằng enzyme Alcalase cho hoạt tính ức chế ACE cao nhất là 56,23% so với các enzyme còn lại ở cùng nồng độ protein khảo sát là 1 mg/mL [42]

N.H.Ishak và cộng sự (2021) sử dụng enzyme Alcalase để thuỷ phân protein cá nục chuối đạt hoạt tính ức chế ACE cao nhất là 94,21% Trình tự amino acid của peptide thu nhận từ dịch thủy phân có hoạt tính ức chế ACE là Arg-Gly-Val-Gly-Pro-Val-Pro-Ala-Ala Trình tự peptide thu nhận được có hoạt tính ức chế ACE có đặc điểm gồm các amino acid kỵ nước hoặc mang điện dương [23] Nghiên cứu của Adamson và Reynolds (1996) cho thấy Alcalase có thể được sử dụng để thủy phân để thu được các peptide có đặc điểm chung là kỵ nước [43]

Do đó, từ các nghiên cứu trên lựa chọn enzyme Alcalase để thủy phân con hến để thu được các peptide có hoạt tính ức chế ACE

Ảnh hưởng của điều kiện thủy phân gồm tỷ lệ nguyên liệu:nước, tỷ lệ E:S và thời gian thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân được khảo sát sử dụng phương pháp thử đơn

yếu tố được thực hiện bằng cách thay đổi một yếu tố với nhiều mức độ khác nhau trong khi cố định các yếu tố khác

Bảng 0.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân protein hến

Yếu tố Tỷ lệ nguyên liệu:nước(w/

v)

Tỷ lệ E:S (U/g protein)

Thời gian (giờ)

Tỷ lệ nguyên liệu:nước

x: Giá trị tốt nhất được chọn sau khi khảo sát

2.4.5 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan (Lowry và cộng sự, 1951) Hàm lượng protein của dịch thủy phân hến được xác định bằng phương pháp Lowry Nguyên tắc: phức chất đồng protein khử hỗn hợp phosphomolipdate–

phosphovonphramate (thuốc thử Folin – Ciocalteau) tạo phức chất màu xanh được đo ở bước sóng 660nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với hàm lượng protein [44]

2.4.6 Phương pháp xác định ACEI (Cushman, D.W và H.S Cheung, 1971)

Nguyên tắc: Hippuryl-L-histidyl-L-leucine (HHL) bị ACE thủy phân thành hippuric acid (HA) và dipeptide histidyl-leucine HA sau đó được trích ly khỏi dung dịch phản ứng bằng ethyl acetate và được hòa tan lại vào nước cất Dung dịch HA trong nước cất được đo độ hấp thu ở bước sóng 228 nm, từ độ hấp thu tính được nồng độ HA trong nước cất Khi có sự xuất hiện của chất ức chế ACE, nồng độ của dung dịch HA giảm đi so với khi