CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Giới thiệu về con hến
Con hến có tên khoa học là Corbiculidae sp là một họ gồm các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thuộc bộ Veneroida Hến có phân bố rộng rãi ở các khu vực sông và gần cửa sông Hến cũng phân bố tập trung chủ yếu ở các vùng có khí hậu ôn đới và nhiệt đới như phía nam châu Á, phía tây đến phía đông Địa Trung Hải, các đảo Đông Nam Á và phía đông của nước Úc [6]
Con hến có tên tiếng anh là baby clam, tên khoa học là Corbiculidae sp., thuộc họ
Phân loại con hến được trình bày trong bảng 1.1
Bảng 0.1 Phân loại tên khoa học con hến [7]
1.1.3 Đặc điểm sinh học của con hến
Con hến (Corbicula sp.) có kích thước chỉ to hơn đầu ngón tay út, có vỏ hình bầu dục hoặc tam giác giác Vùng đỉnh vỏ của hến nhô cao trong khi phần đầu và đuôi thì gần bằng nhau Phần cạnh bụng của hến cong nhiều hơn trong khi phần cạnh trước và cạnh sau đều tròn Kích thước hến trưởng thành gặp từ 20,5mm đến 28,5mm Trên lớp vỏ có đường vân sinh trưởng thể hiện số tuổi của hến Màu sắc của mặt ngoài vỏ hến thường có màu vàng xanh hay vàng đen Mặt trong thì màu trắng hoặc xám Màu sắc của hến cũng thay đổi phụ thuộc vào nơi chúng sinh sống, vỏ của hến thường có màu từ vàng lục đến nâu nhạt hoặc từ màu trắng đến xanh nhạt Một số hến ở tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc có vỏ màu vàng và nâu trong khi hến được thu hoạch ở phía Tây Nam Hoa Kỳ lại có màu sắc tối [8]
Hến sinh sản khá nhanh, một con hến có thể sinh sản 400 con non trong một ngày Hến sống ở môi trường nước có nhiệt độ từ 2-30 o C Ở Việt Nam, hến sống ở kênh rạch và lớn hơn một tí là ra sông, khi trưởng thành thì thường sống ở vùng cồn cát Lúc hến sống được bên cồn cát là rất mập, trắng lại tròn Ở Việt Nam, từ tháng 3 đến tháng 8 âm lịch là mùa hến sinh sản và phát triển nhiều nhất
Hến sinh sản bằng cách thả các ấu trùng đã nở bên trong vỏ vào các vùng nước xung quanh nó sinh sống, sự thụ tinh diễn ra bên trong vỏ Tuổi thọ của hến khoảng từ 1-7 năm [9].
Dịch thủy phân protein
Dịch thủy phân protein là sản phẩm tạo ra từ quá trình thủy phân protein sử dụng các tác nhân khác nhau như tác nhân hóa học gồm acid và base hoặc tác nhân sinh học (chế phẩm enzyme protease) Bên cạnh đó, dịch thủy phân protein còn được định nghĩa là
5 hỗn hợp của các polypeptide phân tử lượng cao, hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng trung bình, peptone, hỗn hợp các peptide mạch ngắn, hỗn hợp các peptide phân tử lượng thấp và hỗn hợp các acid amin tự do [10]
Dịch thủy phân protein là một hỗn hợp chứa nhiều các peptide có độ dài và trình tự acid amin khác nhau Thông thường, những peptide được tạo ra từ quá trình thủy phân chứa từ 2-20 acid amin cùng với các acid amin tự do [10]
Quá trình thuỷ phân được định nghĩa là quá trình phá vỡ các liên kết peptide trong protein có sự tham gia của nước khi sự có mặt của chất xúc tác như tác nhân hoá học (acid hoặc base) hoặc tác nhân hóa sinh (chế phẩm enzyme)
1.2.1.2 Thủy phân bằng tác nhân hóa học
Trong sản xuất công nghiệp thực phẩm, thủy phân bằng tác nhân hóa học thường được sử dụng do những ưu điểm như giá thành thấp và đơn giản dễ thực hiện Trong sản xuất thực phẩm, phương pháp này thường được áp dụng trong sản xuất nước tương, các sản phẩm lên men Các acid mạnh như HCl hoặc H2SO4 hoặc base mạnh (NaOH) thường được sử dụng để xúc tác ở nhiệt độ cao để cắt đứt liên kết peptide Ngoài các ưu điểm nêu trên, phương pháp này cũng tồn tại các hạn chế Khi thủy phân bằng tác nhân hóa học sử dụng acid mạnh dẫn đến mất các acid amin quan trọng như glutamine, asparagine và tryptophan cũng như các vitamin sẽ bị mất đi Nguyên nhân là do nồng độ acid quá cao (6-10N) và nhiệt độ cao (118 o C) Dẫn đến tính chất chức năng và giá trị dinh dưỡng của dịch thủy phân thu được kém Thêm vào đó, quá trình trung hòa lượng acid và kiềm dư sau khi thủy phân cũng dẫn đến dịch thủy phân chứa một hàm lượng muối cao ảnh hưởng đến cảm quan của sản phẩm [3]
1.2.1.3 Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh
Phương pháp thủy phân protein bằng tác nhân hóa sinh phổ biến nhất là sử dụng chế phẩm enzyme protease (còn được gọi là peptidase hay proteinase)
Protease là một tên gọi dùng chung cho một nhóm các enzyme có chức năng phân giải protein bằng việc phân cắt liên kết peptide của protein Protease được tìm thấy ở động vật, thực vật nấm và vi sinh vật Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật là nguồn enzyme lớn nhất, được ứng dụng trong các lĩnh vực công nghiệp, công nghệ sinh học, y dược và phục vụ nghiên cứu các lĩnh vực khoa học cơ bản [3]
Protease được phân loại thành 5 nhóm chính dựa vào nhóm chức chức năng ở trung tâm hoạt động bao gồm serine, thiol, cystein, carboxyl và metallo Bên cạnh đó, protease còn được phân loại thành 2 nhóm là endoprotease và exoprotease dựa theo vị trí phản ứng Nhóm endoprotease, nhóm này thủy phân liên kết peptide trong protein, sinh ra những peptide lớn Và nhóm còn lại là exoprotease (aminopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N và carboxypeptidase thủy phân liên kết peptide đầu C của protein) [3] Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với phương pháp hóa học Ưu điểm lớn nhất là bảo vệ được giá trị dinh dưỡng của các acid amin được tạo ra trong quá trình thủy phân do hạn chế sử dụng hóa chất Ngoài ra dựa vào sự đặc hiệu của vị trí cắt của các enzyme protease khác nhau, từ đó có thể lựa chọn enzyme protease phù hợp để kiểm soát được thành phần peptide và acid amin của dịch thủy phân [11].
Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein
Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân có được có liên quan tới sự cộng hưởng hoạt tính của các thành phần có trong dịch thủy phân như peptide, protein tan trong nước và các acid amin [12] Trong đó, peptide đóng vai trò quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của dịch thủy phân do peptide chiếm phần lớn trong thành phần dịch Tuy nhiên, các peptide chỉ thể hiện được các hoạt tính sinh học như liên kết kim loại, kháng khuẩn, ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE), kháng oxy hóa và các hoạt tính khác khi
7 chúng được giải phóng khỏi trình tự protein thông qua các quá trình như tiêu hóa, thủy phân bằng enzyme [13]
1.3.1 Hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE)
Cao huyết áp là một tình trạng bệnh lý mãn tính, trong đó huyết áp trong động mạch tăng cao Do đó, nó là nguy cơ phổ biến nhất của nhiều bệnh lý liên quan về tim mạch [14]
ACE là một enzyme có vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa huyết áp ACE xúc tác quá trình chuyển đổi angiotensin-I (một hormone peptide) thành angiotensin-II bằng cách loại bỏ hai amino acid ở đầu cuối carboxyl của angiotensin-I Angiotensin-II làm co mạch máu dẫn đến huyết áp cao [15]
Ngoài ra, theo hình 1.2 ACE còn làm phân hủy cả bradykinin- một chất làm giãn mạch máu khi mạch máu bị co quá mức Vì vậy, ức chế ACE là mục tiêu chính cho hoạt động hạ huyết áp, ngăn ngừa các bệnh tim mạch Dựa trên cơ chế điều hòa huyết áp trong cơ thể, rất nhiều thuốc ức chế ACE tổng hợp được điều chế như captopril, lisinopril, enalapril và alacepril Tuy nhiên, những chất này lại có tác dụng phụ khiến người sử dụng bị ho, phát ban da, rối loạn vị giác hay bị viêm Vì thế, các chất ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên được nghiên cứu rộng rãi nhằm thay thế chất ức chế ACE tổng hợp [15]
Hình 0.2 Mô tả hoạt động của enzyme chuyển hóa angiotensin trong cơ thể [15]
1.3.2 Cơ chế ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE)
ACE là một glycoprotein có chứa gốc carbohydrate bao gồm mannose, galactose, fructose, N-acetylneuraminic acid và N-acetyl-glucosamine Cấu trúc của ACE bao gồm hai vùng, đó là vùng N và vùng C Mỗi vùng chứa các vị trí mà tại đó liên kết với Zn 2+
Do đó Zn 2+ đóng vai trò là cofactor xúc tác cho các phản ứng của ACE Vì vậy, Zn 2+ đóng vai trò quan trọng và cần thiết cho hoạt động của ACE
Hình 1.3 minh họa cấu trúc của ACE Do đó, ACE có thể bị ức chế bởi các tác nhân tạo phức với kim loại [16]
Hình 0.3 Cấu trúc ACE và vị trí liên kết của ion kẽm tại đầu N và đầu C [17]
Các cơ chế ức chế ACE được phát hiện là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh Trong cơ chế ức chế cạnh tranh, chất ức chế cạnh tranh với cơ chất bằng cách liên kết với vị trí hoạt động của ACE Tương tác nhiều liên kết hydro giữa ACE và peptide có thể thúc đẩy sự ức chế hoạt động của ACE [18] Ngoài ra, các peptide ức chế cạnh tranh
9 với cơ chất thường có độ dài mạch ngắn khoảng từ 2 - 12 amino acid Các peptide lớn không thể liên kết với các vị trí hoạt động của ACE [16] Một yếu tố khác là thành phần acid amin của các peptide,các peptide có các amino acid có tính acid như Glu và Asp tạo điện tích âm cho peptide Vì vậy, peptide hình thành liên kết phối trí với Zn 2+ ở vị trí hoạt động của ACE [16]
Trong cơ chế ức chế không cạnh tranh, chất ức chế liên kết với một vị trí khác với vị trí hoạt động của ACE Sự gắn kết của chất ức chế với ACE làm thay đổi cấu trúc của ACE, điều này ngăn cản cơ chất liên kết với vị trí hoạt động của ACE [16] Thông thường, chất ức chế liên kết với phức hợp cơ chất-enzyme tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất-peptide ức chế, ngăn cản tạo thành sản phẩm và dẫn đến làm giảm Vmax của ACE [19]
1.3.3 Đặc tính của peptide có hoạt tính ức chế ACE
Theo nghiên cứu của Gu và cộng sự (2013), hai mô hình mỗi quan hệ định lượng giữa hoạt tính và cấu trúc đã được xây dựng cho các dipeptide và tripeptide tương ứng dựa trên 168 dipeptide và 140 tripeptide có hoạt tính ức chế ACE mạnh được báo cáo trong các công trình đã xuất bản trước đây Kết quả chỉ ra rằng đối với các dipeptide, ưu tiên các gốc axit amin có chuỗi kích thước lớn cũng như các chuỗi bên kỵ nước như phenylalanin, tyrosine và tryptophan Cấu trúc của đầu cacboxyl của dipeptide có liên quan trực tiếp đến hoạt tính ức chế ACE của dipeptide hơn là đầu N [20] Đối với tripeptide, cấu trúc ức chế ACE phù hợp nhất là bao gồm phần dư acid amin thơm ở đầu C, phần dư acid amin tích điện dương ở giữa và phần dư acid amin kỵ nước ở đầu N Nhiều tripeptide được xác định trong nghiên cứu của Gu và cộng sự (2013) chứa phenylalanin, tryptophan hoặc tyrosine ở đầu C và axit amin kỵ nước như leucine, tryptophan ở đầu N, góp phần vào hoạt tính ức chế ACE cao [21]
Trong báo cáo của Cushman và cộng sự (1973), sự hiện diện của tyrosine, phenylalanine, tryptophan, proline, lysine, isoleucine, valine, leucine và arginine trong peptide có ảnh hưởng mạnh đến liên kết của ACE Vị trí hoạt động của ACE gồm ba vị phụ : vị trí trước
10 áp chót (S1), vị trí áp chót (S1’) và vị trí cuối cùng (S2’) Trong cơ chất, các acid amin Pro, Ala, Val, Leu sẽ liên kết cho S1; Ile liên kết cho S1’; và Pro và Leu liên kết cho S2’
Vị trí phụ S1 bao gồm các gốc Ala354, Glu384 và Tyr523; Túi S1’ chứa Glu162; và túi S2 bao gồm Gln281, His353, His513, Lys511 và Tyr520 [22] Có thể thấy các peptide ức chế ACE có độ dài mạch ngắn, thường là tripeptide Các peptide này có các amino acid thường thấy là Tyr, Phe, Trp, Pro hoặc Lys ở đầu C Trong đó, Pro, Trp và Lys cho hiệu quả nhất trong tăng hoạt tính ức chế ACE của peptide Ngoài ra, các amino acid kỵ nước và các amino acid có vòng thơm xuất hiện ở đầu C của peptide cho thấy peptide có hoạt tính ức chế ACE [22]
1.3.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein
1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein trên thế giới
Trên thế giới, có nhiều nghiên cứu về hoạt tính ức chế ACE sử dụng dịch thuỷ phân protein bằng các chế phẩm enzyme protease khác nhau Các chế phẩm enzyme protease phổ biến được sử dụng nhiều nhất là Alcalase, Neutrase, Protamex và Flavourzyme
N.H.Ishak và cộng sự (2021) sử dụng enzyme alcalase để thuỷ phân protein cá nục chuối và đạt mức độ thuỷ phân là từ 67,7% đến 99,52% và hoạt tính ức chế ACE còn 10,16% đến 94,21% Trình tự amino acid của peptide từ cá nục chuối là Arg-Gly-Val-Gly-Pro- Val-Pro-Ala-Ala [23]
Tính chất chức năng của dịch thủy phân protein
1.4.1 Giới thiệu về các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein
Các tính chất chức năng quan trọng của dịch thủy phân gồm: độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ và khả năng giữ nước và giữ dầu Những thay đổi về điều kiện thủy phân ảnh hưởng trực tiếp đến các tính chất chức năng của dịch thủy phân Nghiên cứu của Cho và cộng sự (2014), cũng chỉ ra rằng dịch thủy phân từ các nguồn protein khác nhau như lòng đỏ trứng gà, xương cá ngừ vây vàng có các tính chất chức năng khác nhau Vì vậy, cần thiết để xác định tính chất chức năng của dịch thủy phân bên cạnh hoạt tính sinh học của dịch [28]
1.4.2 Các tính chất chức năng của dịch thủy phân
1.4.2.1 Độ tan Độ hòa tan là một trong những tính chất quan trọng của dịch thủy phân protein Độ hòa tan của dịch thủy phân là một yếu tố thiết yếu cần xem xét và đánh giá đầu tiên nếu sử dụng dịch thủy phân trong sản xuất công nghệ thực phẩm như thức uống giải khát và thức uống cho trẻ em Các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến độ hòa tan của dịch thủy phân là cường độ ion, pH, nhiệt độ và sự hiện diện của các chất phụ gia khác nhau trong dung môi Thay đổi các yếu tố trên dẫn làm tăng độ hòa tan của dịch thủy phân Tuy nhiên việc thay đổi các điều kiện dung dịch không phải luôn luôn phù hợp để tăng độ hòa tan của dịch thủy phân protein đến mức cần thiết [29]
Bên cạnh độ hòa tan, độ bền nhiệt cũng là một tính chất quan trọng của dịch thủy phân cần được quan tâm Xử lý nhiệt là một quy trình quan trọng, thiết yếu trong công nghệ chế biến và sản xuất thực phẩm Vì vậy, dựa vào độ bền nhiệt có thể xác định được mức độ ứng dụng của dịch thủy phân vào công nghệ chế biến thực phẩm Sự thay đổi độ tan của protein trong quá trình xử lý nhiệt là bằng chứng của sự thay đổi cấu hình trong cấu trúc của protein Protein bị thay đổi cấu hình dẫn đến hình thành phản ứng kết tủa phức
13 tạp và bất thuận nghịch Vì vậy dựa vào độ tan có thể xác định được độ bền nhiệt của dịch thủy phân [3]
Khả năng tạo bọt của dịch thủy phân protein rất quan trọng vì trực tiếp ảnh hưởng đến cấu trúc của sản phẩm Khả năng tạo bọt của dịch thủy phân bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như nguồn protein, phương pháp tạo bọt và các thông số quá trình như nhiệt độ, pH, nồng độ protein, thời gian khuấy Bên cạnh đó, khả năng tạo bọt của protein còn phụ thuộc vào khả năng hình thành màng bao mềm dẻo, đàn hồi và cố kết để bao bọc và giúp bọt chống lại tác động cơ học [29]
Tạo nhũ là khả năng của protein tham gia vào hình thành và làm bền hệ nhũ tương mới được hình thành Khả năng tạo nhũ được thể hiện qua hai giá trị EAI và ESI
Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ của dịch thủy phân như thành phần amino acid của dịch Các dịch thủy phân có khả năng tạo nhũ tốt cần có sự cân bằng tối ưu giữa các amino acid nhóm phân cực và không phân cực trong dịch để tăng khả năng hòa tan trong nước và hoạt động bề mặt thích hợp Ngoài ra, pH của môi trường của dịch thủy phân làm thay đổi điện tích của protein và ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ của dịch Mức độ thủy phân protein cũng ảnh hưởng đến EAI vì khi mức độ thủy phân cao sẽ tạo nhiều peptide mạch ngắn Các peptide mạch ngắn này có khả năng tái sắp xếp kém hơn so với peptide mạch dài tại bề mặt phân pha dầu-nước dẫn đến EAI và ESI thấp [30] Ngoài ra, EAI cũng phụ thuộc vào tính đặc hiệu của enzyme-cơ chất trong quá trình thủy phân Một số nghiên cứu chỉ ra rằng các enzyme protease như trypsin, flavouzyme và subtilisin thủy phân whey protein tạo ra các dịch thủy phân có EAI và ESI khác nhau
Vì vậy, khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của dịch thủy phân phụ thuộc vào nguồn protein, loại enzyme sử dụng, điều kiện thủy phân, mức độ thủy phân, pH môi trường [30]
1.4.2.5 Khả năng giữ nước và giữ dầu
Khả năng giữ nước (WHC) cũng là một tính chất quan trọng của dịch thủy phân WHC của bột dịch thủy phân có được là nhờ vào khả năng cố định, giữ nước trong mạng protein chống lại lực hút vật lý và hóa lý của protein WHC có ảnh hưởng đến cấu trúc và độ cứng của sản phẩm [31] WHC của dịch thủy phân phụ thuộc thành phần acid amin và kích thước peptide của dịch thủy phân Nước tương tác với protein thông qua nhiều con đường, chủ yếu là liên kết hydro với các nhóm ưa nước như sulfhydryl, amino, imino, carboxyl và carbonyl Bên cạnh đó, peptide có khối lượng phân tử lớn hơn thường giữ nước kém hơn peptide có khối lượng phân tử nhỏ hơn Nguyên nhân là do peptide có khối lượng phân tử nhỏ có tính ưa nước cao hơn Vì vậy protein/peptide có WHC cao có thể sử dụng như một chất giữ ẩm trong quá trình sản xuất thực phẩm [32]
Khả năng giữ dầu OHC cũng là một yếu tố thiết yếu và là cơ sở quan trọng ảnh hưởng đến hương vị thực phẩm Cơ chế giữ dầu của protein có được là nhờ vào bẫy vật lý Protein có khối lượng riêng càng cao thì OHC càng cao [33] Ngoài ra OHC dịch thủy phân còn bị ảnh hưởng bởi điều kiện xử lý, nguồn protein, kích thước protein và các thành phần phụ gia Thêm vào đó, các yếu tố khác như mức độ thủy phân, bề mặt kỵ nước của peptide và tính đặc hiệu enzyme-cơ chất cũng ảnh hưởng tới OHC của bột dịch thủy phân [34]
1.4.3 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng
1.4.3.1 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng trên thế giới
Trên thế giới, nghiên cứu của Putra và cộng sự (2018) về độ tan, khả năng tạo nhũ (EAI), khả năng tạo bọt (FC) , khả năng giữ nước (OHC) của dịch thủy phân ốc bươu vàng Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch thủy phân ốc bươu vàng có độ tan cao nhất là 77,78% EAI và FC cao nhất lần lượt là 19,90 m 2 /g và 34,67% OHC của dịch thủy phân ốc bươu vàng cũng đạt cao nhất với giá trị là 4,24 ml nước/g bột dịch thủy phân [31]
Một nghiên cứu khác của Taheri và cộng sự (2011) sử dụng enzyme Alcalase thủy phân phụ phẩm gia cầm và cá hồi vân Nghiên cứu đánh giá các tính chất chức năng của hai dịch thủy phân với các tính chất gồm độ hòa tan, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC và OHC Kết quả cho các tính chất như khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, độ hòa tan của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi vân cao hơn so với dịch thủy phân phụ phẩm gia cầm Tuy nhiên, OHC và WHC của hai dịch thủy phân lại không có sự chênh lệch nhiều [35]
1.4.3.2 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng ở Việt Nam Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Võ Đình Lệ Tâm và cộng sự (2020) khảo sát các tính chất chức năng của dịch thủy phân con ruốc khô Các tính chất được khảo sát gồm: độ hòa tan, độ bền nhiệt, tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC và OHC Kết quả cho thấy trong khoảng pH khảo sát từ 3 đến 8, hầu hết dịch thủy phân đạt độ tan trên 74% và đạt cực đại tại giá trị 94,63±2,47% tại pH 8 Độ tan của dịch thủy phân con ruốc khô đạt trên 73% sau quá trình xử lý nhiệt ở 93 o C trong 30 giây và 63 o C trong 30 phút FC của dịch thủy phân con ruốc đạt giá trị cực đại là 97,98±9,08% tại giá trị pH 7 EAI của dịch thủy phân cũng đạt giá trị cực đại tại giá trị pH 7 là 24,15±1,66 m 2 /g ,trong khi ESI đạt cực đại tại giá trị pH 8 là 51,64±2,71 phút WHC và OHC của dịch thủy phân lần lượt là 2,52±0,16 mL nước/g bột dịch thủy phân và 5,47±0,41 ml dầu/g bột dịch thủy phân [36]
Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của Võ Đình Lệ Tâm và cộng sự (2020) khảo sát các tính chất chức năng gồm độ hòa tan, độ bền nhiệt, tạo bọt, khả năng tạo nhũ, OHC và WHC của dịch thủy phân từ phụ phẩm cá hồi Kết quả cho thấy dịch thủy phân trong khoảng pH từ 3 đến 8 đạt độ tan trên 85% Độ tan của dịch thủy phân cũng đạt trên trên 65% khi xử lý nhiệt 93 o C trong 30 giây và trên 85% sau khi xử lý nhiệt ở 63 o C trong 30 phút Giá trị FC và FS của dịch thủy phân cũng cao hơn thấp hơn lần lượt từ 1,4-4,7 lần và 1,8-12,8 lần so với albumin EAI và ESI của dịch cũng thấp hơn lần lượt là 1,1-2,7 và
16 4,1-11,1 lần so với natri caseinate WHC và OHC của bột dịch thủy phân lần lượt là 2.00 ± 0.09 mL nước/g bột dịch thủy phân và 6.47 ± 0.25 mL dầu/g bột dịch thủy phân [37]
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.1 Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu hến sông được thu mua từ chợ đầu mối và vận chuyển lạnh đến nơi xử lý
2.1.2 Chế phẩm enzyme và hóa chất
Chế phẩm enzyme Alcalase ® 2.5L được mua từ Novozymes (Đan Mạch) Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 0.1 Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme Alcalase®2.5L
Loại enzyme pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu Phân loại enzyme
Các loại hóa chất được sử dụng: Angiotensin converting enzyme từ phổi thỏ có hoạt độ 0.1U/mg được mua từ Sigma-Aldrich (Mỹ) (Trong đó 1U được định nghĩa là số đơn vị enzyme tại điều kiện 37 o C, pH 8,3 trong 50mM Natri borat chứa 500 mM NaCl giải phúng 1àmol hippuric acid từ Hippuryl-L-histidyl-L-leucine trong 1 phỳt) Hippuryl-L- histidyl-L-leucine được mua từ Sigma-Aldrich (Mỹ) Các hóa chất đồng sulphate (CuSO4), NaOH, HCl được mua tại công ty Hóa Nam (Việt Nam), Folin Ciocalteu, Albumin, Tyrosin, Ethyl acetate và các hóa chất khác được mua từ công ty Merck, Schuchardt (Đức) Tất cả chất trên đều đạt chuẩn phân tích Nước cất được dùng trong nghiên cứu này
Hình 0.1 Sơ đồ nghiên cứu
1.3 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ nghiên cứu được thể hiện trên hình 2.1 Đầu tiên, thành phần hóa học của con hến sẽ được khảo sát nhằm sát định thành phần protein, lipid, carbonhydrate, ẩm và tro Tiếp đó, dịch thủy phân con hến sẽ được khảo sát ba yếu tố là tỷ lệ nguyên liệu:nước, tỷ lệ E:S và thời gian thủy phân Mục tiêu là thu được điều kiện tốt nhất của dịch thủy phân có hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân protein con hến Sau đó, dịch thủy phân sẽ được tách phân đoạn nhằm xác định phân đoạn có hoạt tính ức chế ACE cao nhất Dịch thủy phân cũng được khảo sát các thành phần amino acid, tính chất chức năng cũng như độ bền hoạt tính của dịch theo nhiệt độ và pH và mức độ thủy phân
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân con hến
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1.1 Kết quả thành phần hóa học của con hến
Thành phần hóa học của hến được khảo sát và cho kết quả trong bảng 3.1
Bảng 0.1 Thành phần hóa học của con hến
Thành phần Hàm lượng (%) Ẩm 77,5 ± 0,5
Kết quả (% hàm lượng chất khô)
Thành phần hóa học của con hến được khảo sát và thể hiện kết quả ở bảng 3.1 Kết quả cho thấy hàm lượng ẩm chiếm 77,5±0,5%, protein chiếm 64,4±1,3% (theo hàm lượng chất khô) Hàm lượng lipid và tro lần lượt chiếm 11,8±0,4% và 4,2±0,2% (theo hàm lượng chất khô) Cuối cùng là carbohydrate chiếm 20,9±0,4% (theo hàm lượng chất khô) Như vậy, con hến được sử dụng trong nghiên cứu này là nguồn nguyên liệu giàu protein, có tiềm năng lớn cho việc thu nhận dịch thủy phân protein/peptide có hoạt tính ức chế ACE cũng như các hoạt tính sinh học khác
1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân con hến
3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:nước
Hình 0.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:nước đến ACEI của dịch thủy phân con hến
Các ký tự khác nhau trên cột cùng màu thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
Kết quả của hình 3.1 cho thấy ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:nước đến ACEI của dịch thủy phân con hến Kết quả cho thấy ACEI của dịch thủy phân cao nhất là 54,9±2,7% tại tỷ lệ nguyên liệu:nước là 1:10 (w/v) và đạt giá trị thấp nhất là 27,3±0,5% tại tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:02 (w/v) Khi tăng tỷ lệ nguyên liệu:nước từ 1:02-1:10 (w/v), hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân tăng Tuy nhiên khi tăng từ 1:10-1:14 (w/v) thì hoạt tính ức chế ACE giảm từ 54,9±2,7% tới 40,0±1,6% Điều này có thể giải thích là lượng nước thêm vào có ảnh hưởng tới sự tạo ra các peptide có hoạt tính ức chế ACE của enzyme trong quá trình thủy phân Do đó, khi tăng tỷ lệ nguyên liệu:nước thì càng nhiều nước được thêm vào đẫn dến tạo ra nhiều peptide ức chế ACE Vì vậy, hoạt tính ức chế ACE dịch thủy phân được cải thiện Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỷ lệ nguyên liệu:nước thì có thể dẫn đến dung dịch bị pha loãng Do đó, làm hạn chế sự tương tác giữa protein và enzyme thủy phân Vì vậy, tạo ra ít các peptide có hoạt tính ức chế ACE Nghiên cứu của Lin và cộng sự (2018), sử dụng enzyme Protamex để thủy phân vi tảo a b c d e d c
Hoạt tính ức chế ACE (%)
Tỷ lệ nguyên liệu:nước (w/v)
31 cũng lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu:nước là 1:10 (w/v) để thu dịch thủy phân có hoạt tính ức chế ACE [49]
Do đó, tỷ lệ nguyên liệu:nước được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo là 1: 10 (w/v) 3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ E:S
Hình 0.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ E:S đến ACEI của dịch thủy phân con hến
Các ký tự khác nhau trên cột cùng màu thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
Kết quả từ hình 3.2 cho thấy, ACEI cao nhất ở tỷ lệ E:S 50 U/g protein là 71,7% ±0.3 Khi tăng tỷ lệ E:S từ 30 đến 50 U/g protein, ACEI của dịch thủy phân tăng từ 54,8% đến 71,7% Nhưng khi tăng tỷ lệ E:S lên từ 50 đến 70 U/g protein hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân giảm từ 71.7% đến 61.3% Điều này có thể giải thích là khi tăng tỷ lệ E:S thì lượng enzyme thủy phân tăng lên, làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân protein tăng, giải phóng một lượng lớn peptide có hoạt tính ức chế ACE Do đó, làm tăng hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân [50] Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỷ lệ E:S tới 80 U/g protein thì ACEI của dịch thủy phân giảm a b d c b
Hoạt tính ức chế ACE (%)
32 xuống Kết quả này có thể được giải thích là khi tốc độ phản ứng đạt cân bằng, hầu như tất cả cơ chất chuyển thành sản phẩm, việc tăng tỷ lệ E:S gần như không cải thiện ACEI của dịch thủy phân Theo một nghiên cứu của Gao và cộng sự (2019) cho rằng khi tăng tỷ lệ E:S trong giai đoạn đầu quá trình thủy phân, enzyme thủy phân và giải phóng lượng lớn các peptide có hoạt tính ức chế ACE, sau đó hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân giảm dần do peptide tiếp tục bị cắt ngắn dẫn đến giảm hoạt tính ức chế ACE [50] Nghiên cứu của Wu và cộng sự (2015) sử dụng enzyme Trypsin thủy phân tảo Kết quả cũng cho thấy xu hướng tương tự khi tăng tỷ lệ E:S từ 2-6% thì ACEI dịch thủy phân tảo tăng, tiếp tục tăng tỷ lệ E:S đến 8% cho thấy ACEI dịch thủy phân tảo giảm [49]
Do đó, tỷ lệ E:S được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo là 50 U/g protein
3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Hình 0.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân con hến
Các ký tự khác nhau trên cột cùng màu thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
Hoạt tính ức chế ACE (%)
Thời gian thủy phân (giờ)
Hình 3.3 thể hiện ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến ACEI của dịch thủy phân được khảo sát ở 2, 3, 4, 5, 6 ,7 giờ Tại thời gian thủy phân là 5 giờ, ACEI của dịch thủy phân đạt giá trị cao nhất là 85,9±2.8% Khi thời gian thủy phân tăng từ 2 giờ đến 5 giờ, ACEI của dịch thủy phân tăng từ 58,3% đến 85,9%, tăng 27,6% Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian thủy phân từ 5 giờ đến 7 giờ, ACEI của dịch giảm từ 85,9% xuống tới 67,2%, giảm 18,7% Điều này có thể giải thích là khi tăng thời gian thủy phân từ 2 giờ đến 5 giờ, enzyme phân cắt tạo ra các phân đoạn peptide có ái lực mạnh với trung tâm hoạt động của ACE dẫn đến hoạt tính ức chế ACE dịch thủy phân tăng [51] Một số phân đoạn peptide có đặc điểm như có chứa các gốc amino acid kỵ nước, amino acid vòng thơm, mang tính acid như Glu và Asp có hoạt tính ức chế ACE cao [16] Do đó, khi tăng thời gian thủy phân từ 5 giờ đến 7 giờ, các phân đoạn peptide có hoạt tính ức chế ACE tiếp tục bị cắt ngắn làm giảm hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân Nghiên cứu của Ghanbari và cộng sự (2015) về hoạt tính ức chế ACE của dịch thủy phân từ hải sâm cũng cho thấy xu hướng tương tự, hoạt tính ức chế ACE đạt giá trị cao nhất tại 8 giờ, tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân sau 8 giờ hoạt tính ức chế ACE của dịch giảm đi [4] Như vậy, thời gian thủy phân 5 giờ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo
1.3 Kết quả ACEI của phân đoạn dịch thủy phân con hến
Hình 0.4 ACEI phân đoạn dịch thủy phân con hến
Các ký tự khác nhau trên cột cùng màu thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
Kết quả hình 3.4 cho thấy ACEI của 5 phân đoạn peptide >30, 30-10, 10-3, 3-1 và 30 kDa là thấp nhất Như vậy, ACEI của các phân đoạn peptide tăng lên khi khối lượng phân tử của các phân đoạn giảm đi Các peptide có khối lượng phân tử nhỏ có hoạt tính ức chế ACE cao hơn so với các peptide có khối lượng phân tử lớn [52] Nghiên cứu của Ngo và cộng sự (2016) thu nhận các phân đoạn peptide từ dịch thủy phân da cá đuối Kết quả cho thấy phân đoạn