hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein

TÓM TẮT LUẬN VĂN Nghiên cứu này tận dụng con hến, là nguồn nguyên liệu có giá trị kinh tế thấp, để thu dịch thuỷ phân protein có hoạt tính ức chế lipase và các tính chất chức năng gồm độ

GIỚI THIỆU

Giới thiệu về hến

Hến là loài động vật thân mềm hai mảnh, tương đối nhỏ sinh sống tại các vùng nước khác nhau, chủ yếu ở các vùng nước lợ (cửa sông) và nước ngọt (hồ, sông, suối), ngoài ra còn có ở vùng nước mặn (ven biển) Hến phân bố ở Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, tập trung nhiều ở Nam Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Philippine, Ấn Độ, Việt Nam… [8, 9]

Bảng 1.1 Phân loại khoa học của hến [10]

Việt Nam có các loài chủ yếu là: Corbicula baudoni, Corbicula moreletiana,

Corbicula bocuri, Corbicula cyreniformis, Corbicula fluminea… Chúng phân bố khắp cả nước, có nhiều ở miền Trung (Quảng Trị, Thừa Thiên Huế…) và Đông Nam

Bộ (Đồng Nai, Bến Tre, Tiền Giang…)

Hến có hình bầu dục hay tam giác, có khi gần tròn, cân đối, phồng to và dày

Vỏ hình trứng và sâu nhất ở khớp nối hai mảnh vỏ, vùng đỉnh nhô cao, phần đầu và đuôi gần bằng nhau Cạnh trước và sau đều tròn, cạch bụng cong nhiều hơn Mặt ngoài của vỏ thường là màu xanh vàng tới nâu, trên vỏ có nhiều đường vân sinh trưởng thể hiện số tuổi của hến Mặt trong của vỏ được bao phủ bởi lớp xà cừ nhẵn bóng, ánh tím Kích thước hến trưởng thành thường gặp từ 20,5 đến 28,5 mm [11]

Hến là loài động vật ăn lọc, thường sinh sống ở môi trường nước chảy và kiếm ăn bằng cách lọc các vật thể lơ lửng như mùn bã hữu cơ, sinh vật phù du hay tảo nhỏ Tốc độ tăng trưởng của hến phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ, hệ sinh thái, thức ăn và chất lượng nguồn nước, được biểu hiện rõ trên các đường vân trên vỏ của chúng.

Theo bảng thành phần dinh dưỡng Việt Nam, trong nguyên liệu hến tươi có một số thành phần như sau:

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của thịt hến tươi [12]

Thành phần Khối lượng (mg/100g ăn được)

Dịch thủy phân protein

DTP được định nghĩa là hỗn hợp của oligopeptides, peptides và acid amins tự do bằng cách thủy phân một phần hay toàn bộ nguồn protein trong điều kiện được kiểm soát, theo sau đó là quá trình xử lý sau thủy phân để phân lập các peptide có hoạt tính sinh học [13] DTP được sản xuất cho nhiều mục đích sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, bao gồm chất thay thế sữa, chất bổ sung protein, chất ổn định trong đồ uống và chất điều vị trong các sản phẩm bánh kẹo [14] Gần đây, lợi ích của việc thủy phân protein thực phẩm để tạo thành các peptide có hoạt tính sinh học và thành phần bổ sung dinh dưỡng đang nhận được nhiều sự quan tâm

1.2.2 Phương pháp thu nhận dịch thủy phân protein

Nhìn chung, DTP có thể được thu nhận bằng cách sử dụng phương pháp thủy phân trong môi trường acid/kiềm, thủy phân bằng chế phẩm enzyme protease hoặc lên men bằng vi sinh vật [15]

Thủy phân hóa học có thể được thực hiện bằng cách cắt đứt liên kết peptide trong môi trường acid hoặc kiềm [16] Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp, nhanh và cho hiệu suất thu hồi protein cao [17] Tuy nhiên, các sản phẩm không mong muốn có thể được hình thành do quá trình xử lý không đặc hiệu như chuyển hóa đồng phân L-acid amin thành D-acid amin và có thể hình thành chất độc như lysino-alanine [18]; một số acid amin có thể bị ảnh hưởng như Trp thường bị phá hủy hoàn toàn khi thủy phân bằng acid; Cys, Ser và Thr bị mất một phần và Asn và Gln được chuyển đổi thành dạng acid của chúng trong quá trình thủy phân bằng acid [19] Từ đó làm giảm giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của sản phẩm khi thủy phân bằng acid hoặc kiềm Do sự thay đổi lớn trong quá trình thủy phân dẫn đến sự thay đổi cao về hoạt tính sinh học của các peptide thu được đã hạn chế đáng kể các ứng dụng có giá trị của các sản phẩm thủy phân protein theo phương pháp này [13]

Lên men bằng vi sinh vật cũng là một cách thu nhận các peptide có các hoạt tính sinh học nhất định [20] Các vi khuẩn hoặc nấm men đang phát triển sẽ tiết ra các enzyme phân giải protein vào nguyên liệu để giải phóng các peptide từ các protein mẹ [21] Ưu điểm của quá trình lên men là quá trình thủy phân bằng enzyme được thực hiện bởi các protease của vi sinh vật, và do đó, các peptide có hoạt tính sinh học có thể được tinh chế mà không cần thủy phân thêm [22] Tuy nhiên, nhược điểm của quá trình lên men là hiệu suất tạo thành peptide thấp [23] Trên thực tế, trong quá trình lên men, một số peptide có hoạt tính sinh học và acid amin được giải phóng từ protein, thông qua tác động của các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật phân giải protein, sẽ được chủng vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon hoặc nitrogen cho sự phát triển của chúng [13]

Quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme chuyển đổi protein thành các peptide có kích thước khác nhau và các acid amin tự do [24] Thủy phân in vitro cơ chất protein bằng cách sử dụng các chế phẩm enzyme phân giải protein thích hợp là quá trình được sử dụng rộng rãi để sản xuất DTP và peptide với các hoạt tính sinh học mong muốn [25] So với phương pháp thủy phân hóa học, phương pháp thủy phân protein bằng chế phẩm enzyme là một cách tiếp cận phù hợp để sản xuất peptide có hoạt tính sinh học, do quy trình yêu cầu điều kiện nhẹ nhàng hơn (pH 6,0-8,0; nhiệt độ 40-60℃) và quá trình thủy phân được kiểm soát tốt hơn [13] Hơn nữa, trái ngược với thủy phân hóa học, thành phần acid amin của DTP bằng chế phẩm enzyme gần như tương tự với thành phần của protein ban đầu Ngoài ra, quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme không có các dung môi hữu cơ hoặc hóa chất độc hại, do đó nó phù hợp cho các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [26].

Hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein

1.3.1 Giới thiệu hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein

Béo phì là một căn bệnh toàn cầu và là yếu tố nguy cơ chính gây ra các bệnh mạn tính và bệnh đi kèm [27] Tổ chức Y tế Thế giới dự đoán rằng số người béo phì và thừa cân trên toàn cầu có thể lên tới khoảng 3,3 tỷ người vào năm 2030 [28] Béo phì là kết quả của sự tích tụ quá nhiều chất béo trong cơ thể và chuyển hóa lipid bất thường Các enzyme tham gia vào các quá trình này có thể được sử dụng làm mục tiêu được lựa chọn để phát triển các chất chống béo phì Một số phương pháp đã được đề xuất để điều trị bệnh béo phì, bao gồm ức chế quá trình đồng hóa chất béo trong chế độ ăn uống thông qua ức chế lipase đường tiêu hóa và tuyến tụy để giảm quá trình thủy phân chất béo trong chế độ ăn uống, giảm hấp thu monoglyceride và acid béo tự do Orlistat đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt để điều trị béo phì, vì Orlistat có thể ức chế hoạt động của lipase tuyến tụy và ức chế hấp thu khoảng 30% chất béo trong chế độ ăn uống [29]

Pancreatic lipase (Lipase tuyến tụy) (EC 3.1.1.3) là một enzyme chủ yếu để chuyển hóa lipid, tiêu hóa triglyceride trong chế độ ăn uống, ở người Tính đến thời điểm hiện tại đã có những loại dược phẩm thương mại ức chế lipase tuyến tụy, ngăn chặn hoạt động của enzyme này làm giảm hấp thu chất béo, thúc đẩy quá trình giảm cân [30] Tuy nhiên, gần đây, các lựa chọn thay thế tự nhiên đã được đánh giá với khả năng có tác dụng tương tự như các loại thuốc thương mại ức chế lipase [31, 32] Việc ức chế hoạt động của lipase tuyến tuỵ đã đạt được thông qua việc đưa vào các chất ức chế lipase tuyến tuỵ như polyphenols [33], polysaccharides [34], peptides [35]

1.3.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein

1.3.2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Fan và cộng sự [31] đã cô lập và tinh sạch peptide chống béo phì từ protein tảo Spirulina Họ sử dụng 5 loại chế phẩm enzyme khác nhau để thủy phân protein trích ly, trong đó chế phẩm Pepsin cho phân đoạn 3-5 kDa có hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất (72%).

Mudgil và cộng sự [32] đã nghiên cứu khả năng ức chế dipeptidyl peptidase-

IV (DPP-IV), α-amylase tuyến tụy lợn và lipase tuyến tụy của peptide thủy phân từ protein sữa lạc đà bằng các chế phẩm enzyme khác nhau Kết quả cho thấy, protein sữa lạc đà có khả năng ức chế DPP-IV và lipase tuyến tụy tốt, trong khi đó, khả năng ức chế α-amylase tuyến tụy lợn được cải thiện không nhiều

Nghiên cứu của Gil-Rodríguez và Beresford [36] về khả năng ức chế lipase tuyến tụy của sữa tách béo lên men bằng vi khuẩn lactic acid Kết quả cho thấy phân đoạn < 3 kDa từ sữa lên men bằng chủng Lactobacillus helveticus tại 42°C cho khả năng ức chế lipase tuyến tụy cao nhất đạt 49%

Abdelhedi và cộng sự [37] đã sử dụng chế phẩm enzyme Purafect® để thuỷ phân nội tạng cá mập Mustelus Nghiên cứu phát hiện ở nồng độ 7,5 mg/mL, phân đoạn < 1 kDa của DTP từ nội tạng cá mập thể hiện hoạt tính ức chế lipase đạt 85%

Garzón và cộng sự [38] đã nghiên cứu DTP từ bã bia lên hoạt tính ức chế cholesterol esterase và ức chế lipase tuyến tụy Peptide Trp-Asn-Ile-His-Met-Glu- His-Gln-Asp-Leu-Thr-Thr-Met-Glu cho khả năng ức chế cholesterol esterase cao nhất Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện 2 peptide Asp-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Phe và Leu-Ala-Ala-Val-Glu-Ala-Leu-Ser-Thr-Asn-Gly ức chế lipase tuyến tụy mạnh nhất

Zielińska và cộng sự [39] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE, ức chế lipase tuyến tụy và ức chế α-glucosidase từ các phân đoạn peptide của các loài côn trùng ăn được Trong đó, phân đoạn peptide < 700 Da từ châu chấu sa mạc cho khả năng ức chế ACE, ức chế lipase tuyến tụy và ức chế α-glucosidase cao nhất

Złotek và cộng sự [40] đã nghiên cứu đặc tính gây độc tế bào, ảnh hưởng đến enzyme hoạt động liên quan đến hội chứng chuyển hóa và hoạt tính kháng khuẩn của peptide từ DTP hạt kê bao gồm Gly-Gln-Leu-Gly-Glu-His-Gly-Gly-Ala-Gly-Met- Gly, Gly-Glu-His-Gly-Gly-Ala-Gly-Met-Gly-Gly-Gly-Gln-Phe-Gln-Pro-Val, Glu- Gln-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-Pro-Glu-Glu-Ser-Gly-Arg, Arg-Leu-Ala-Arg-Ala-Gly- Leu-Ala-Gln, Tyr-Gly-Asn-Pro-Val-Gly-Gly-Val-Gly-His, và Gly-Asn-Pro-Val- Gly-Gly-Val-Gly-His-Gly-Thr-Thr-Gly-Thr Kết quả cho thấy những peptide này không có độc tính lên tế bào Bên cạnh đó, peptide Gly-Gln-Leu-Gly-Glu-His-Gly- Gly-Ala-Gly-Met-Gly cũng cho thấy hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy và ức chế α- amylase cao nhất

Baba và cộng sự [41] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế cholesterol esterase và ức chế lipase tuyến tụy từ DTP whey protein lạc đà Kết quả cho thấy, Phe-Cys-Cys-

Leu-Gly-Pro-Val-Pro-Pro là peptide có hoạt tính ức chế cholesterol esterase cao nhất, trong khi đó, các peptide Pro-Ala-Gly-Asn-Phe-Leu-Pro-Pro-Val-Ala-Ala-Ala-Pro- Val-Met, Met-Leu-Pro-Leu-Met-Leu-Pro-Phe-Thr-Met-Gly-Tyr, và Leu-Arg-Phe- Pro-Leu cho hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất

Suwanangul và cộng sự [42] đã nghiên cứu DTP hạt Sacha Inchi bằng 3 loại chế phẩm khác nhau, bao gồm Pepsin, Papain và Flavourzyme lên hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase Kết quả cho thấy các peptide được phân đoạn có khả năng ức chế lipase thấp hơn (nồng độ ức chế 50%, IC50 > 3,0 mg/mL) so với DTP ban đầu (IC50 < 3,0 mg/mL)

Ketprayoon và cộng sự [43] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy từ cám gạo, chế phẩm Alcalase được dùng để thu nhận DTP Phân đoạn peptide

< 0,65k Da được kết luận là có hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất

Esfandi và cộng sự [44] nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của peptide thủy phân từ cám yến mạch và khả năng ức chế lipase và ức chế α-amylase Peptide Tyr- Phe-Asp-Glu-Gln-Asn-Glu-Gln-Phe-Arg được kết luận là có khả năng ức chế α- amylase cao nhất, trong khi đó, Ser-Pro-Phe-Trp-Asn-Ile-Asn-Ala-His có khả năng ức chế lipase cao nhất

Zhang và cộng sự [45] đã nghiên cứu hoạt tính ức chế ACE và α-amylase từ peptide có nguồn gốc từ hải sâm Kết quả cho thấy peptide Phe-Glu-Asn-Leu-Leu- Glu-Glu-Leu-Lys có khả năng ức chế ACE và α-amylase theo cơ chế khác nhau Một peptide khác được tìm thấy là Ala-Pro-Phe-Pro-Leu-Arg cũng thể hiện hoạt tính ức chế ACE, α-amylase và lipase

Nghiên cứu của Mudgil và cộng sự [46] đã đánh giá hoạt tính ức chế cholesterol esterase và lipase tuyến tụy của các peptide phái sinh từ casein bò và lạc đà Các peptide được thu được thông qua quá trình thủy phân men xúc tác bằng Alcalase và Pronase-E Kết quả cho thấy các peptide Met-Met-Met-Leu, Phe-Asp-Met-Leu, His-Leu-Pro-Gly-Arg-Gly có nguồn gốc từ casein bò và Ala-Ala-Gly-Phe, Met-Ser-Asn-Tyr-Phe, Phe-Leu-Trp-Pro-Glu-Tyr-Gly-Ala-Leu từ casein lạc đà thể hiện hoạt tính ức chế lipase tuyến tụy cao nhất.

Tính chất chức năng của dịch thuỷ phân protein

1.4.1 Độ tan Độ hòa tan của protein là lượng protein được phân tán trong dung dịch đệm, nhạy cảm với sự kết tụ và biến tính của protein [50]

1.4.2 Độ bền nhiệt (Độ tan ở các pH sau khi xử lý nhiệt)

Bên cạnh độ hòa tan, độ bền nhiệt cũng là một tính chất quan trọng của DTP cần được quan tâm Xử lý nhiệt là một quy trình quan trọng, thiết yếu trong công nghệ chế biến và sản xuất thực phẩm Vì vậy, dựa vào độ bền nhiệt có thể xác định được mức độ ứng dụng của DTP vào công nghệ chế biến thực phẩm Độ bền nhiệt của DTP có thể xác định thông qua độ tan ở các pH sau khi xử lý nhiệt [51]

1.4.3 Khả năng tạo bọt và bền bọt

Bọt là sự phân tán của khí, thường là các tế bào khí, trong một pha liên tục, thường là chất lỏng Bề mặt phân chia pha khí-nước không ổn định về mặt nhiệt động lực học vì tương tác giữa các phân tử nước thuận lợi hơn nhiều so với tương tác giữa các phân tử nước và khí [24, 52] Bọt nhanh chóng bị tan ra chủ yếu do hai cơ chế gây mất ổn định: sự mất cân bằng do gradient áp suất gây ra sự khuếch tán khí từ các bọt khí nhỏ hơn đến các bọt khí lớn hơn [53], và sự thoát nước của lớp màng nước giữa các bọt khí [54] Tiềm năng tạo bọt thường được đánh giá dựa trên khả năng tạo bọt (FC), cụ thể là lượng bọt ban đầu được tạo thành sau khi khuấy hoặc đánh bông, và độ bền bọt (FS), là lượng bọt còn lại sau một thời gian nhất định

1.4.4 Khả năng tạo nhũ và bền nhũ

Nhũ tương là hệ gồm hai pha không tan vào nhau, thường gặp trong thực phẩm với hai thành phần chính là dầu và nước Nhũ tương không ổn định về mặt nhiệt động lực học do các yếu tố như kết dính, tạo kem và khuynh hướng dầu nổi lên Để đánh giá đặc tính nhũ hóa, người ta sử dụng hai chỉ số: khả năng tạo nhũ (EAI) và độ bền nhũ (ESI).

1.4.5 Khả năng giữ nước và giữ dầu

Khả năng giữ nước (WHC) là tổng lượng nước có thể được liên kết hoặc giữ lại bởi peptide, khả năng giữ dầu (OHC) được định nghĩa là lượng chất béo được peptide giữ lại [57, 58]

Ngoài ra, DTP còn có các tính chất chức năng khác như khả năng tạo màng, khả năng tạo gel,…

1.4.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu dịch thủy phân protein có tính chất chức năng

1.4.6.1 Nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu của Putra và cộng sự [59] về độ tan, EAI, FC, WHC của DTP ốc bươu vàng Kết quả nghiên cứu cho thấy DTP ốc bươu vàng có độ tan cao nhất là 77,78% EAI và FC cao nhất lần lượt là 19,90 m 2 /g và 34,67% WHC của DTP ốc bươu vàng cũng đạt cao nhất với giá trị là 4,24 mL nước/g bột DTP

Cá mè lúi là một loại cá có nguồn gốc từ Indonesia vốn có giá trị kinh tế thấp hơn khi so với cá tra và cá rô phi Một trong số các hướng đi để tạo giá trị gia tăng cho cá mè lúi là tận dụng protein từ DTP của cá mè lúi Theo Junianto và cộng sự [60], kết quả đánh giá các tính chất chức năng của DTP protein cá mè lúi bao gồm: WHC, OHC, EAI và khả năng tan trong nước lần lượt là 3,1 mL/g; 1,94 mL/g; 23,60% và 78,2%

Nghiên cứu của Islam và cộng sự [61] đã thuỷ phân đậu xanh với 2 loại chế phẩm enzyme là Alcalase và Protamex DTP từ chế phẩm enzyme Protamex tại pH 2 thể hiện tốt độ tan, EAI và FC lần lượt là 83,83%; 95,03 m 2 /g và 93,84% WHC đạt 4,52 g/g đối với DTP từ chế phẩm enzyme Alcalase, và OHC đạt 4,91 g/g đối với DTP từ chế phẩm Protamex

Hiện tại trên thế giới chưa có công bố nào về tính chất chức năng của DTP từ thịt hến có hoạt tính ức chế lipase

Nguyen và Nguyen [62] đã thu nhận DTP từ đầu cá hồng mím bằng chế phẩm enzyme Flavourzyme, kết quả thu được cho thấy DTP từ đầu cá hồng mím thể hiện các tính chất chức năng bao gồm độ tan, EAI, WHC và FC lần lượt là 93,6%; 32,0 mL/g; 1,9 mL/g và 43,5%

Cao và Tran [63] đã khảo sát ảnh hưởng của mức độ thuỷ phân (DH), thời gian thuỷ phân lên tính chất chức năng và hoạt tính liên kết calcium của DTP từ phụ phẩm cá tra Pangasius hypophthalmus Tại 75 phút thuỷ phân với DH là 18,38%; DTP thu được thể hiện EAI cao nhất là 20,99 mL dầu/ g bột protein phân lập từ cá Sau 90 phút thuỷ phân, FC cao nhất là 94,59% tại DH là 20,21%

DTP từ con ruốc Acetes japonicus thu được bằng phương pháp thuỷ phân với chế phẩm enzyme Flavourzyme thể hiện các tính chất chức năng như độ tan đạt 80% ở pH 5, độ bền nhiệt đạt 80% sau khi xử lý ở 63℃ trong 30 phút và độ bền nhiệt đạt

60% sau khi xử lý ở 93℃ trong 30 giây, EAI và ESI đạt giá trị cực đại tại pH 8 với giá trị lần lượt là 15,92 m 2 /g và 48,08 phút; FC của DTP là 31,84% và FS là 10,18% tại pH 5; OHC đạt 1,59 mL dầu/g bột DTP và WHC là 1,95 mL/g bột DTP [64]

Hiện tại ở Việt Nam chưa có công bố nào về tính chất chức năng của DTP từ thịt hến có hoạt tính ức chế lipase.

Ứng dụng của dịch thủy phân protein

DTP với các hoạt tính sinh học và tính chất chức năng nổi trội như ức chế lipase, liên kết khoáng, ức chế tiểu đường, tạo nhũ, tạo bọt, giữ nước, giữ dầu, tạo màng, tạo gel, được ứng dụng rộng rãi trong chế phẩm bổ sung thực phẩm có hoạt tính sinh học.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu và hóa chất

Hến sau khi được thu mua, vận chuyển lạnh đến phòng thí nghiệm Hến được rửa với nước sạch để loại bỏ bùn đất, tạp chất còn dính lại trên vỏ trước khi chần qua nước nóng với tỷ lệ hến:nước 1:10 (w/w) (90-95℃) trong 5 phút Trong quá trình chần, khuấy đảo mạnh để phần thịt có thể tách ra khỏi vỏ và nổi lên trên Tiếp theo, phần thịt tươi được thu nhận và rửa với nước sạch để loại bỏ hoàn toàn phần cát, vỏ hến còn dính vào nguyên liệu Thịt hến sau khi để ráo được xay nhuyễn 2 lần (để đảm bảo đồng nhất kích thước) Thịt hến xay nhuyễn được trữ trong túi polyamide và bảo quản ở -20℃ trong tủ đông đến khi phân tích

Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme Alcalase® 2.5 L của hãng Novozyme (Đan Mạch) Chế phẩm enzyme có dạng lỏng, hoạt tính 2,5 AU-A/g, nhiệt độ tối ưu 30-65℃ và pH tối ưu 7-10

2.1.3 Hóa chất khác p-nitrophenyl butyrate, pancreatic lipase enzyme và các hóa chất khác được mua từ công ty Sigma-Aldrich, Merck Các hóa chất có mức độ tinh sạch ở mức độ phân tích Nước cất một lần được sử dụng trong các thí nghiệm.

Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu

Giải thích sơ đồ nghiên cứu

Theo Hình 2.2, nghiên cứu được thực hiện như sau:

Xử lý thịt hến: Hến sau khi được thu mua, vận chuyển lạnh đến phòng thí nghiệm Hến được rửa với nước sạch để loại bỏ bùn đất, tạp chất và chần qua nước nóng Phần thịt tươi được thu nhận, rửa với nước sạch và để ráo Thịt hến sau khi để ráo được xay nhuyễn 2 lần Thịt hến xay nhuyễn được trữ trong túi polyamide và bảo quản ở -20℃ trong tủ đông đến khi phân tích

Phân tích thành phần acid amin của DTP Đánh giá DH Đánh giá FC, FS,

Xác định hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide nhằm tìm kiếm các peptide tiềm năng có thể sử dụng làm chất ức chế lipase Đánh giá độ tan và độ bền nhiệt của bột DTP để đảm bảo bột có thể hòa tan tốt và chịu được nhiệt độ cao khi sử dụng trong các ứng dụng thực phẩm Xác định WHC và OHC của bột DTP để đánh giá khả năng giữ nước và giữ dầu của bột, đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng liên quan đến cấu trúc thực phẩm Cuối cùng, đánh giá độ bền hoạt tính sinh học của bột DTP để đảm bảo bột vẫn duy trì hoạt tính ức chế lipase trong quá trình bảo quản và sử dụng.

Xử lý thịt hến Xác định hàm lượng kim loại nặng

DTP có hoạt tính ức chế lipase cao nhất

Xác định hàm lượng kim loại nặng của thịt hến: Hàm lượng kim loại nặng của thịt hến được xác định gồm Cd, Pb, Hg

Thủy phân: Thịt hến được thủy phân bằng chế phẩm enzyme Alcalase với các điều kiện thủy phân về tỷ lệ thịt hến : nước (w/v), tỷ lệ enzyme : cơ chất (E:S, U/g protein) và thời gian thủy phân (h) để thu DTP có hoạt tính ức chế lipase cao nhất; điều kiện pH và nhiệt độ của quá trình thuỷ phân được lựa chọn nằm trong khoảng tối ưu của chế phẩm enzyme

DTP có hoạt tính ức chế lipase cao nhất cao nhất được lọc phân đoạn và hoạt tính ức chế lipase của từng phân đoạn được xác định Đồng thời, giá trị DH và thành phần acid amin của DTP cũng được xác định DTP cũng được khảo sát các tính chất chức năng, độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch theo nhiệt độ và pH.

Phương pháp nghiên cứu

Hến sau khi được thu mua, vận chuyển lạnh đến phòng thí nghiệm Hến được rửa với nước sạch để loại bỏ bùn đất, tạp chất còn dính lại trên vỏ trước khi chần qua nước nóng với tỷ lệ hến:nước 1:10 (w/w) (90-95℃) trong 5 phút Trong quá trình chần, khuấy đảo mạnh để phần thịt có thể tách ra khỏi vỏ và nổi lên trên Tiếp theo, phần thịt tươi được thu nhận và rửa với nước sạch để loại bỏ hoàn toàn phần cát, vỏ hến còn dính vào nguyên liệu Thịt hến sau khi để ráo được xay nhuyễn 2 lần (để đảm bảo đồng nhất kích thước) Thịt hến xay nhuyễn được trữ trong túi polyamide và bảo quản ở -20℃ trong tủ đông đến khi phân tích

Quy trình thủy phân được tiến hành theo phương pháp của Vo và cộng sự [64] với một vài điều chỉnh Thịt hến sau khi rã đông được đem cân và phối trộn với nước theo tỷ lệ 1:4 (w/v), hỗn hợp sau đó được gia nhiệt lên 90℃ và giữ trong 10 phút để bất hoạt các enzyme nội tại có trong nguyên liệu Enzyme Alcalase được bổ sung vào hỗn hợp với tỷ lệ E:S là 30 U/g protein sau khi đã hiệu chỉnh pH của dịch về pH 7,5 bằng HCl 1M hoặc NaOH 1M, giữ ở 55℃ để tiến hành thủy phân

Sau 4 h thuỷ phân, kết thúc phản ứng bằng cách gia nhiệt hỗn hợp lên 90℃ trong 10 phút để bất hoạt chế phẩm enzyme DTP được đem đi ly tâm để tách riêng phần rắn và dịch lỏng (supernatant) Phần DTP sau khi ly tâm được tiến hành lọc bằng giấy lọc Whatman no.3 và bảo quản ở -20℃ bằng tủ đông DTP sau đó được sử dụng cho các thí nghiệm

2.4.3 Xác định mức độ thủy phân

Mức độ thuỷ phân được xác định theo phương pháp của Yao và cộng sự [65] Nguyên tắc: DH được định nghĩa là tỷ lệ % giữa số liên kết peptide bị cắt đứt và tổng số liên kết peptide Trong nghiên cứu này, việc xác định DH được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ formol Trong quá trình thủy phân protein, cứ một liên kết peptide bị cắt đứt giải phóng một nhóm amino (-NH2) và một nhóm carboxyl (-COOH) Formol (HCHO) phản ứng với nhóm amino của acid amin sinh ra proton (H + ) H + sinh ra được chuẩn độ với NaOH Lượng nhóm amino được định lượng dựa vào lượng NaOH dùng để chuẩn độ H + , đại diện cho số liên kết peptide bị cắt đứt Tổng số liên kết peptide được thể hiện thông qua lượng nitơ tổng Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.4 Xác định hàm lượng protein hòa tan

Hàm lượng protein hoà tan được xác định theo phương pháp của Lowry và cộng sự [66] Nguyên tắc: Phương pháp này kết hợp phản ứng giữa ion đồng với liên kết peptide trong môi trường kiềm (phản ứng Biuret) và phản ứng oxy hóa vòng thơm trong protein (chủ yếu là mạch nhánh của Trp và Tyr) Phương pháp Lowry dựa trên phản ứng ion đồng (I), sinh ra bởi phản ứng oxy hóa của liên kết peptide, với thuốc thử Folin–Ciocalteu (hỗn hợp phosphotungstic acid và phosphomolybdic acid) Phản ứng sinh ra phân tử màu xanh là xanh heteropolymolybdenum có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 660 nm Do đó, tổng nồng độ protein trong mẫu có thể được suy ra từ nồng độ của mạch nhánh Trp và Tyr thông qua độ hấp thu ở bước sóng 660 nm Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.5 Xác định hoạt tính ức chế lipase

Hoạt tính ức chế lipase được xác định theo phương pháp của Jafar và cộng sự [67] Nguyên tắc: Enzyme lipase thủy phân p-nitrophenyl butyrate tạo thành p- nitrophenol Do môi trường có đệm natri phosphate pH 7,3; p-nitrophenol tồn tại dạng p-nitrophenolate có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 405 nm Khi có mặt chất ức chế, hoạt tính enzyme lipase giảm, giảm độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 405 nm Thông qua đó, hoạt tính ức chế enzyme lipase của chất ức chế được xác định Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.6 Xác định thành phần acid amin (TCVN 8764:2012)

DTP thủy phân hoàn toàn thành các acid amin tự do, được phân tách bằng sắc ký trao đổi ion Các acid amin sau khi được xử lý với ninhydrin sẽ tạo thành sản phẩm có màu tím, với độ hấp thụ cực đại ở 440 nm (Proline) và 570 nm (các acid amin khác).

2.4.7 Đánh giá tính chất chức năng của dịch thủy phân

2.4.7.1 Đánh giá độ hoà tan của bột dịch thuỷ phân Độ hoà tan của bột DTP được thực hiện theo phương pháp của Li và cộng sự [68] Bột DTP được pha loãng với nước cất và được điều chỉnh pH trong khoảng 3,

4, 5, 6, 7, 8 Sau đó khảo sát độ hoà tan các mẫu đã xử lý pH Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.7.2 Đánh giá độ bền nhiệt của bột dịch thuỷ phân Độ bền nhiệt (độ tan ở các pH sau khi xử lý nhiệt) của bột DTP được thực hiện theo phương pháp của Li và cộng sự [68] Bột DTP được pha loãng với nước cất và được điều chỉnh pH trong khoảng 3, 4, 5, 6, 7, 8 Sau đó khảo sát độ bền nhiệt các mẫu đã xử lý pH này ở 2 mức nhiệt độ là 63℃ trong 3 phút và 93℃ trong 30 giây Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.7.3 Đánh giá khả năng tạo bọt và độ bền bọt của dịch thuỷ phân

Khả năng tạo bọt và độ bền bọt của DTP được thực hiện theo phương pháp của Li và cộng sự [68] Mẫu DTP được điều chỉnh pH trong khoảng 3, 4, 5, 6, 7, 8 Sau đó xác định FC và FS Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.7.4 Đánh giá khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của dịch thuỷ phân

Khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của DTP được xác định bằng phương pháp của Li và cộng sự [68] Theo đó, mẫu DTP sau khi điều chỉnh pH (pH 3, 4, 5, 6, 7 và 8) được sử dụng để xác định chỉ số hoạt động nhũ hóa (EAI) và chỉ số ổn định nhũ hóa (ESI) Quy trình thực hiện và tính toán chi tiết được trình bày trong Phụ lục A.

2.4.7.5 Đánh giá khả năng giữ nước của bột dịch thuỷ phân

Khả năng giữ nước của bột dịch thuỷ phân được đánh giá dựa theo phương pháp của Putra và cộng sự (2010) Mẫu bột sấy đông khô được pha với nước cất rồi xác định khả năng giữ nước (WHC) Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được nêu chi tiết trong Phụ lục A.

Khả năng giữ dầu của bột DTP được thực hiện theo phương pháp của Putra và cộng sự [59] Mẫu bột sấy đông khô được trộn với dầu thực vật và được xác định OHC Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.8 Đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase

2.4.8.1 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo pH Độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo pH được thực hiện theo phương pháp của Sripokar và cộng sự [69] Mẫu DTP được khảo sát độ ổn định hoạt tính ức chế lipase sau khi đã được điều chỉnh pH từ 1 đến 11 Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

2.4.8.2 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo nhiệt độ Độ ổn định hoạt tính ức chế lipase theo nhiệt độ được thực hiện theo phương pháp của Sripokar và cộng sự [69] Mẫu DTP được khảo sát độ ổn định hoạt tính ức chế lipase sau khi đã xử lý ở 100℃ từ 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 phút Quy trình thực hiện và tính toán kết quả được trình bày trong phụ lục A

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xác định hàm lượng kim loại nặng của thịt hến

Kết quả phân tích cho thấy thịt hến An Giang sử dụng trong nghiên cứu này (Bảng 3.1) có hàm lượng Cd và Pb lần lượt đạt 0,20 mg/kg và 0,14 mg/kg, thấp hơn so với giới hạn ô nhiễm Cd và Pb trong thực phẩm được quy định trong QCVN 8- 2:2011/BYT (mức tối đa (ML: maximum limit) cho nhuyễn thể hai mảnh vỏ đối với

Trong khi hàm lượng cadmium (Cd) vào khoảng 2,0 mg/kg và chì (Pb) là 1,5 mg/kg, thủy ngân (Hg) không được phát hiện trong thịt hến với ngưỡng phát hiện của phương pháp là 0,01 mg/kg.

Bảng 3.1 Hàm lượng kim loại nặng trong thịt hến

Kim loại Hàm lượng (mg/kg)

Đánh giá thành phần acid amin và tính chất chức năng của dịch thủy phân

3.2.1 Thành phần acid amin của dịch thuỷ phân

DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất đạt 36,83 ± 1,17% (cao hơn Orlistat 1,16 lần) với điều kiện thủy phân bao gồm chế phẩm enzyme Alcalase, tỷ lệ thịt hến : nước là 1:4 (w/v); tỷ lệ E:S 30 U/g protein; pH 7,5; nhiệt độ 55℃ và thời gian thủy phân 4 h có giá trị DH là 12,66 ± 0,26% DH là một yếu tố ảnh hưởng đến các thành phần và trình tự acid amin có thể ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế lipase

DH quá cao hoặc quá thấp đều không thích hợp cho hoạt tính ức chế lipase [43] Lý do của hiện tượng này là do quá trình thủy phân thuận lợi cho sự phơi bày của các nhóm kỵ nước, góp phần vào sự tương tác giữa peptide và lipase [70]

Kết quả ước tính và phân tích sơ bộ thành phần acid amin của DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất được thể hiện ở Bảng 3.2 Đứng trên góc độ dinh dưỡng, DTP từ hến có thể cung cấp 8 trong số 9 acid amin cần thiết cho con người

Hàm lượng axit amin thiết yếu chiếm 44,86% tổng lượng axit amin trong dịch tiết tụy hến Axit amin Glu (284,74 mg/100 g) là thành phần phổ biến nhất, tiếp theo là Lysine (176,48 mg/100 g) Các axit amin thường gặp khác gồm Aspartic acid, Threonine, Leucine Tỷ lệ axit amin ưa béo Valine, Alanine, Glycine, Leucine trong dịch tiết tụy hến cũng đáng kể Kết quả xác định thành phần axit amin cho thấy dịch tiết tụy hến có tiềm năng ứng dụng làm chế phẩm bổ sung axit amin, nâng cao giá trị dinh dưỡng của thực phẩm.

Bảng 3.2 Đánh giá sơ bộ thành phần acid amin trong DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất

Acid amin thiết yếu Hàm lượng

(mg/100 g) Acid amin không thiết yếu Hàm lượng

Lipase tuyến tuỵ của người có 449 acid amin với trung tâm xúc tác bao gồm Ser-152, His-263 và Asp-176 Thông thường, khi cấu trúc của enzyme lipase bắt đầu thay đổi và “nắp” mở ra sẽ làm lộ ra phần kỵ nước của trung tâm xúc tác Việc mở nắp này làm tăng khả năng liên kết giữa cơ chất và lipase Đồng thời, cơ chất có thể dễ dàng đi vào vùng kỵ nước và liên kết với trung tâm xúc tác [71] Nghiên cứu của Winkler và cộng sự [72] đã biến đổi hóa học Ser-152 và nhận thấy rằng hoạt động của enzyme giảm đáng kể, điều đó chứng minh Ser-152 là một gốc nucleophile rất quan trọng cho quá trình xúc tác

Các peptide khối lượng phân tử thấp (< 5 kDa) được phân lập từ các DTP của cơ cá, tảo Spirulina platensis và cả từ các sản phẩm sữa lên men thể hiện hoạt tính chống béo phì in vitro bằng cách giảm hoạt động thủy phân của enzyme lipase tuyến tụy [31, 32, 36] Hoạt tính ức chế lipase của DTP được cho là do thành phần acid amin và cấu trúc của các peptide có trong DTP Một số nghiên cứu nhận thấy rằng các peptide ức chế lipase tuyến tụy sở hữu một số gốc Pro, Gly, Arg, Leu, Met, Glu, Phe trong trình tự của chúng [35, 39, 40, 73]

Các peptide thể hiện hoạt tính ức chế lipase thông qua việc tương tác với lipase tuyến tuỵ bằng tương tác ưa nước, liên kết hydro, tương tác kỵ nước, tương tác/xếp chồng π-π và tương tác Van der Waals [70, 74] Các peptide có thể tương tác với trung tâm xúc tác, bằng cách này, ở xung quanh các vị trí liên kết cơ chất mà cơ chất sẽ ít có khả năng tiếp cận lipase do hiện tượng án ngữ không gian Bên cạnh đó, gốc Gly-77 trong vùng nắp mở của lipase tuyến tuỵ có khả năng liên kết cao với các peptide Sự tương tác làm giảm tính linh hoạt của nắp enzyme, làm cho enzyme khó mở nắp hơn và do đó enzyme vẫn ở dạng không hoạt động Cuối cùng, enzyme không thể lộ trung tâm xúc tác hoặc chuyển sang dạng hoạt động một phần [70]

Chế phẩm enzyme Alcalase có tính đặc hiệu rộng, nghĩa là nó có thể cắt nhiều liên kết peptide trong một phân tử protein [75] Trong quá trình thuỷ phân, Alcalase phân cắt các liên kết peptide tại vị trí ở đầu carboxyl của Glu, Met, Tyr, Phe, Trp, Lys, Leu, Ala và Ser [76, 77]; tạo ra các peptide có các acid amin này tại đầu carboxyl và các peptide này thể hiện hoạt tính ức chế lipase Sự khác biệt về hoạt tính ức chế lipase giữa các DTP khác nhau là do sự khác biệt về thành phần acid amin, trình tự và độ dài của các peptide được tạo ra sau quá trình thủy phân tùy thuộc vào enzyme và nguồn protein [78] Thành phần và trình tự của các phân đoạn peptide phụ thuộc rất nhiều vào enzyme thủy phân được sử dụng [79]

3.2.2 Tính chất chức năng của dịch thuỷ phân

3.2.2.1 Độ tan và độ bền nhiệt

Quá trình thủy phân protein tạo thành các peptide nhỏ có độ tan tốt; tuy nhiên, không phải tất cả các peptide đều có độ tan và khả năng solvate hóa tốt vì khả năng này phụ thuộc vào tính kỵ nước toàn phần và điện tích của các peptide [80, 81]

*Các cột có màu giống nhau với các chữ cái khác nhau cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

Hình 3.1 Ảnh hưởng của pH đến độ tan và độ bền nhiệt của bột DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất

Từ Hình 3.1, bột DTP hến có hoạt tính ức chế lipase cao nhất đạt giá trị độ tan thấp nhất tại pH 5 với 76,18 ± 0,91% Nguyên nhân của hiện tượng này là do khoảng giá trị pH từ 4 đến 6 là khoảng pI của hầu hết các DTP protein [82] Tại điểm đẳng b b a c d b a b f e c d a b d c d c

3 4 5 6 7 8 Độ tan (%) pH Độ tan Độ tan sau khi xử lý nhiệt ở 63oC Độ tan sau khi xử lý nhiệt ở 93oC điện pI, protein đạt giá trị trung hoà về điện tích nên lực đẩy tĩnh điện giữa những phân tử peptide là nhỏ nhất dẫn đến các phân tử protein có xu hướng hình thành các tương tác giữa protein-protein khiến chúng kết tụ dẫn đến độ tan của DTP giảm đi [83] Độ hòa tan tăng lên ở ngoài điểm pI là do lúc này phân tử protein có khả năng tích điện âm hoặc dương và sự tiếp xúc giữa các nhóm có khả năng ion hóa (nhóm amino và carboxyl) với dung môi [84], dẫn đến tương tác tĩnh điện đẩy giữa các peptide cũng như hình thành liên kết hydro giữa peptide và phân tử nước [83, 85] Giá trị độ tan đạt giá trị cao nhất tại pH 7 với 98,45 ± 0,02 %, cao hơn 1,27 lần so với DTP từ ốc bươu vàng [59], cao hơn 1,31 lần so với DTP từ buồng trứng con mực [86] Điều này có thể giải thích là do sự khác biệt về điện tích, kích thước, sự cân bằng các gốc ưa nước và kỵ nước của peptide giữa các DTP nêu trên [87] Từ kết quả trên, DTP thịt hến có tiềm năng để ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sản xuất chế biến thực phẩm

Xử lý nhiệt là quá trình quan trọng ảnh hưởng đến tính chất của thực phẩm Ở nhiệt độ 63℃ trong 30 phút và 93℃ trong 30 giây, độ tan vẫn cao hơn 70% trong khoảng pH từ 3 đến 8 Sự khác biệt độ tan sau xử lý nhiệt giữa các nguồn thủy sản do cấu trúc protein khác nhau và độ bền nhiệt của protein thủy sản sống vùng nước nóng cao hơn vùng nước lạnh Thay đổi cấu trúc protein thể hiện qua quá trình kết tụ, trong khi sự hiện diện của các acid amin như Pro, Hyp và các acid amin cùng điện tích ngăn ngừa sự hình thành cấu trúc bậc 2 làm tăng độ bền nhiệt Độ bền nhiệt cũng có thể do liên kết kỵ nước bên trong phân tử protein.

3.2.2.2 Khả năng tạo bọt và độ bền bọt

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến chỉ số FC và FS của DTP hến được thể hiện trong Hình 3.2 và Hình 3.3 FC của DTP đạt giá trị cao nhất là 26,44 ± 1,29%, cao hơn albumin 3,50 lần FC của DTP hến thấp hơn 3,71 lần so với FC của DTP

Acetes japonicus [90] Sự khác biệt này có thể do sự khác nhau về độ dài chuỗi peptide, thành phần acid amin

*Các cột có màu giống nhau với các chữ cái khác nhau cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến FC của DTP hến c a ab b b a b b c c a a

FC (%) pHDịch thuỷ phân hến Albumin

Một số peptide đóng vai trò là chất hoạt động bề mặt, chúng ổn định tính động học các bề mặt bọt khí bằng cách khuếch tán và hấp phụ tại bề mặt phân chia pha, từ đó làm giảm sức căng bề mặt và diện tích bề mặt Sức căng bề mặt thấp hơn dẫn đến bề mặt phân chia pha ổn định hơn [91] Sự cản trở vật lý giữa các phân tử peptide bị hấp phụ tại bề mặt phân cắt của hai bọt khí khác nhau và lực đẩy tĩnh điện giữa các peptide nói trên ngăn cản các bọt khí hợp nhất hoặc xẹp xuống [92] Peptide tương tác với nhau tại bề mặt phân chia và tạo thành một màng nhớt-đàn hồi giúp ổn định các bọt khí [93]

Độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein hến

3.3.1 Độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein hến theo pH

Hình 3.6 thể hiện kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính ức chế lipase của DTP thịt hến theo pH từ 1-11 Tại giá trị pH 2, độ ổn định hoạt tính ức chế lipase của DTP thịt hến đạt giá trị cao nhất là 98,56 ± 0,40% Độ ổn định hoạt tính của DTP tăng dần từ 67,73 ± 0,06% tại pH 1 tới 98,56 ± 0,40% tại pH 2 Trong khoảng pH 3-4, độ ổn định hoạt tính của DTP thay đổi không đáng kể trong khoảng từ 93,64 ± 0,04% đến 94,90 ± 0,14% và giảm xuống 65,52 ± 0,09% tại pH 5

Các cột ghép với chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Hình 3.6 minh họa ảnh hưởng của độ pH đến độ bền hoạt tính ức chế lipase của DTP hến.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Độ bền hoạt tính ức chế lipase (%) pH

Peptide có hoạt tính sinh học cần bảo toàn được hoạt tính trong quá trình chế biến và trong con đường tiêu hóa trước khi đến được trung tâm họat động và thể hiện hiệu quả sinh lý học của chúng Do đó, độ bền của các peptide có hoạt tính sinh học đối với pH là tiêu chí quan trọng để đánh giá, vì giá trị môi trường pH của thực phẩm (thường 4-7) có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của peptide hoặc thực phẩm trải qua các giá trị pH khác nhau ở các giai đoạn tiêu hóa Thời gian tiêu hóa trong dạ dày ít nhất 2 h, và pH trong dạ dày là khoảng 2-5 Trong khi đó, dịch mật tại ruột già duy trì pH hầu như trung tính [122] Do vậy, một số nghiên cứu đã tiến hành khảo sát mức độ ảnh hưởng của pH 1-11 trong 30 phút trước khi điều chỉnh về pH 7 [69]

Tại vùng pH gần trung tính và pH kiềm, độ ổn định hoạt tính ức chế lipase của DTP hến thấp hơn vùng pH acid Trong khoảng pH 6-8, độ ổn định hoạt tính của DTP hến tăng từ 39,21 ± 0,04% đến 64,45 ± 0,04% Tại giá trị pH 11, độ ổn định hoạt tính của DTP hến đạt giá trị thấp nhất là 29,38 ± 0,06% Điều này có thể giải thích là tại pH kiềm, các peptide có hoạt tính ức chế lipase bị racemic hóa dẫn đến thay đổi cấu trúc, dẫn đến độ ổn định hoạt tính giảm tại giá trị pH 11 Ngoài ra, ở pH kiềm xảy ra hiện tượng khử amin ở các peptide và làm thay đổi cấu trúc, hoạt tính của peptide dẫn đến giảm khả năng ức chế lipase của DTP [123]

Bên cạnh đó, môi trường acid mạnh và pH kiềm làm cho các peptide có hoạt tính ức chế lipase có thể bị thuỷ phân hoá học từ đó ảnh hưởng đến cấu trúc, thành phần acid amin và các gốc kỵ nước của peptide Vì vậy, ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế lipase của DTP [124] Do đó, độ ổn định hoạt tính của bột DTP ở các giá trị pH

1 và khoảng pH 6-11 thấp hơn so với các khoảng pH 2-5

Theo nghiên cứu của Yu và cộng sự [124], độ ổn định hoạt tính ức chế ACE của bột DTP con ngao duy trì ổn định ở như pH 4 và pH 8 Bên cạnh đó, dịch vị dạ dày trong cơ thể con người có pH nằm trong khoảng từ 1-7 [125], và thường trong khoảng pH 1,5-3,5 đối với người khoẻ mạnh [126] Theo kết quả đạt được, DTP thịt hến vẫn giữ được hoạt tính trong khoảng pH 1-11 Do đó, có thể ứng dụng bột DTP thịt hến vào các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm và dược phẩm như một chất bổ sung với hoạt tính ức chế lipase có nguồn gốc tự nhiên

3.3.2 Độ bền hoạt tính ức chế lipase của dịch thuỷ phân protein hến theo nhiệt độ Độ bền hoạt tính ức chế lipase của DTP thịt hến được xử lý ở 100℃ từ 0 đến

120 phút có độ ổn định trên 85% (Hình 3.7) Khi xử lý nhiệt từ 120 đến 180 phút, hoạt tính ức chế lipase của DTP giảm xuống và duy trì ổn định trong khoảng 25,72 ± 0,06% đến 28,19 ± 0,13%

*Các cột có chữ cái khác nhau cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt ở 100℃ đến độ bền hoạt tính ức chế lipase của DTP hến

Quá trình chế biến nhiệt ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của DTP do làm biến tính protein, thay đổi cấu trúc bậc hai, bậc ba, hình thành liên kết cộng hóa trị mới Việc giảm hoạt tính có thể do thoái hóa, phân giải peptide ức chế lipase hoặc thay đổi cấu trúc bậc hai của peptide mạch ngắn.

0 15 30 45 60 90 120 150 180 Độ bền hoạt tính ức chế lipase (%)

Thời gian xử lý nhiệt (phút)

3, bậc 4 và chỉ những protein có khối lượng phân tử ³ 50 kDa có thể hình thành cấu trúc bậc 4) [128] Theo nghiên cứu của Yu và cộng sự (2018), độ ổn định hoạt tính ức chế ACE của bột DTP con ngao cũng giảm sau khi xử lý nhiệt ở 100℃ trong 2 h [124] Độ bền nhiệt của các peptide có hoạt tính sinh học là rất quan trọng vì nhiều sản phẩm thực phẩm sẽ trải qua các công đoạn xử lý nhiệt trước khi ra thị trường Từ kết quả trên, có thể thấy rằng DTP hến vẫn duy trì được hoạt tính ức chế lipase sau khi xử lý nhiệt 100℃ trong 180 phút Như vậy, khảo sát này đã mở ra tiềm năng ứng dụng như một chất có hoạt tính ức chế lipase, có thể ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm và dược phẩm.

Xác định hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide

Hoạt tính ức chế lipase của từng phân đoạn peptide được thể hiện trong Hình 3.8 Kết quả cho thấy phân đoạn peptide < 1 kDa có hoạt tính ức chế lipase cao nhất đạt 37,28 ± 0,35%, theo sau đó là phân đoạn peptide 1-3 kDa với hoạt tính ức chế lipase là 35,40 ± 0,07%

*Các cột có chữ cái khác nhau cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Hình 3.8 Hoạt tính ức chế lipase của các phân đoạn peptide thu nhận từ DTP hến d c c b a

Hoạt tính ức chế lipase (%)

Nhóm tác giả Chia và cộng sự [70] đã công bố khi nghiên cứu về mô hình phân tử của các peptide có hoạt tính ức chế lipase, kết quả cho thấy các peptide chứa

< 10 acid amin có thể tương tác với trung tâm xúc tác và nắp mở của enzyme lipase tốt hơn, từ đó thể hiện tốt khả năng ức chế enzyme lipase Nghiên cứu của Ketprayoon và cộng sự [43] cũng cho thấy kết quả tương tự khi phân đoạn peptide < 0,65 kDa của DTP cám gạo bằng chế phẩm enzyme Alcalase thể hiện hoạt tính ức chế lipase cao nhất Nghiên cứu của Abdelhedi và cộng sự [37] về DTP nội tạng cá mập Mustelus bằng chế phẩm enzyme Purafect® cũng cho thấy phân đoạn < 1 kDa của DTP có hoạt tính ức chế lipase đạt 85% ở nồng độ 7,5 mg/mL

Orlistat hoạt động như một chất ức chế thuận nghịch của lipase dạ dày và tuyến tụy và do đó ức chế quá trình thủy phân chất béo trung tính thành acid béo tự do, kết quả là chất béo trung tính trong chế độ ăn uống không được tiêu hoá và được bài tiết ra bên ngoài Điều này làm giảm hấp thu chất béo khoảng 30% ở liều điều trị thông thường [129]

Trong thí nghiệm này, Orlistat (Odistad 120, STELLA), được sử dụng làm đối chứng Kết quả cho thấy Orlistat có hoạt tính ức chế lipase 31,70 ± 0,36% (thấp hơn phân đoạn < 1 kDa của DTP hến 1,18 lần) Tuy nhiên, Orlistat lại có nhiều tác dụng phụ từ nhẹ đến nặng như phân có dầu, phân lỏng, đại tiện gấp hoặc không tự chủ, đầy hơi và đau bụng do phương thức tác dụng của Orlistat [130, 131]; ngoài ra, Orlistat còn kích thích sự thèm ăn và cảm giác đói [132] Đồng thời, đã có những nghiên cứu báo cáo về tác dụng phụ của Orlistat liên quan đến thận, gan [133] Vì vậy cần phải xem xét đến độc tính của thuốc khi kê đơn Orlistat, đặc biệt ở bệnh nhân cao tuổi, bệnh thận và gan Do đó, với khả năng ức chế lipase tương đối tốt, DTP hến có thể được coi là một chất ức chế lipase tiềm năng, với ít/hoặc không tác dụng phụ.