TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN NỘI SINH
1.1 Sơ lược về xạ khuẩn nội sinh
1.1.1 Xạ khuẩn nội sinh Định nghĩa đầu tiên về vi sinh vật nội sinh được đưa ra năm 1866 bởi De Bary, sau đó năm 1986 Petrini cũng sử dụng định nghĩa này, định nghĩa được đưa ra như sau:
“ Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong các mô của thực vật” Vi sinh vật nội sinh không gây hại tế bào cây ký chủ mà còn thúc đẩy sự phát triển, cung cấp nguồn dinh dưỡng và bảo vệ cây ký chủ khỏi các tác nhân sinh học (Pandey và cs., 2016)
Xạ khuẩn nội sinh là vi sinh vật nội sinh được quan tâm đặc biệt với khả năng sinh ra chất có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh.Xạ khuẩn nội sinh được định nghĩa là những vi sinh vật sống trong phần bên trong của thực vật, không gây ra những thay đổi cho vật chủ của chúng Xạ khuẩn nội sinh đóng những vai trò cụ thể như bảo vệ cây chủ chống lại côn trùng và bệnh tật Chúng là một phần lớn của sinh quyển, chúng cũng được tìm thấy bên trong thực vật, trong đó các loài được nghiên cứu rộng rãi là từ chi Frankia, có khả năng cố định đạm và một số loài thuộc chi Streptomyces (Benson và cs., 1993) Tóm lại, xạ khuẩn nội sinh chủ yếu thuộc chi Streptomyces, tuy nhiên một vài chi khác như: Streptoverticillium, Nocardia, Micromonospora, Kitasatospora,
Pseudonocardia, Microbispora, Kibdelosporangium, Actinopolyspora, Nocardioides, Brevibromonospium, Actinomadura, Glycomyces cũng được tìm thấy trong thực vật như Palicourea longifolia, Calycophyllum acreanum, Monstera spruceana, Croton lechleri, Cantua buxifolia, Siparuna crassifolia, và Eucharis cyaneosperma (Ranjani Anandan và cs., 2016) Để giải quyết các vấn đề về vi khuẩn kháng kháng sinh và tìm ra loại kháng sinh mới cần phải nghĩ ra các cách tiếp cận mới để tìm kiếm các phân tử mới Một trong số đó là “sự phục hưng trong khám phá kháng khuẩn từ xạ khuẩn” (Baltz, 2008) Việc tìm kiếm các hệ sinh thái mới với các phương pháp phân lập mới của các chi / loài xạ khuẩn mới góp phần cho việc xác định các cụm gen mới và do đó tạo ra các sản phẩm mới (Xu và cs., 2010) Các nhà nghiên cứu hiện đang tập trung vào việc phân lập xạ khuẩn từ các môi trường sống đa dạng như đại dương (Subramani và
Aalbersberg, 2013), môi trường khắc nghiệt (Tang và cs., 2003; Hamedi và cs., 2013), các mô bên trong của thực vật (Chankhamhaengdecha và cs., 2013), phân động vật (Cao và cs., 2012), tảo và địa y (González và cs., 2005; Yamamura và cs., 2011) Do đó, rất khuyến khích việc khám phá các xạ khuẩn sống trong các hệ sinh thái đặc biệt như thực vật ưa cực để phát hiện ra các chủng chưa được khai thác cho đến nay Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái dưới nước , trên cạn và đặc biệt là trong đất có vai trò quan trọng trong việc phân hủy sinh học tạo chất mùn cho cây, bên cạnh đó là khả năng phân hủy các thành phần như kitin, keratin, lignocelluloses và những chất khó phân hủy như polymer (Sharma M, 2014) Bên cạnh các loài vi sinh vật phổ biến như vi khuẩn và vi nấm, xạ khuẩn cũng góp phần không nhỏ trong đời sống của con người Xạ khuẩn chiếm 45% trong tổng số hợp chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi vi sinh vật; 75% trong số các loài xạ khuẩn là nguồn sản xuất ra lượng lớn chất kháng sinh tiềm năng cho nền y học bên cạnh đó là khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn và kháng ung thư (Golinska P và cs., 2015) Trong số các loài xạ khuẩn thì
Streptomyces là chi xạ khuẩn phổ biến nhất và được ứng dụng nhiều nhất, điển hình là thuốc kháng sinh streptomycin Phần lớn các loài xạ khuẩn được phân lập từ đất, bên cạnh đó cũng được phân lập trên các loài cây dược liệu Xạ khuẩn nội sinh với thực vật còn có thêm đặc tính sinh học quý mà các chủng xạ khuẩn khác không có như khả năng chịu stress, có khả năng thích nghi cao, chống chịu với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh trên thực vật, một số chất kháng sinh mới gần đây đều mang nguồn gốc từ xạ khuẩn nội sinh qua đây ta thấy được tiềm năng của xạ khuẩn nội sinh rất lớn (Loria và cs., 1997)
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương do có phần trăm cytosine và guanine cao trong DNA, có dạng sợi, có hình dạng gần giống với nấm nhưng lại có đặc điểm giống cả khuẩn và nấm; chúng được coi là vi khuẩn có giá trị sinh học và khai thác được khoảng 10000 hoạt chất sinh học, hơn nữa chúng còn góp phần quan trọng trong chu trình cacbon Khuẩn lạc của xạ khuẩn có nhiều hạt bụi như vi nấm nhưng chúng bám rất chặt vào mặt thạch, các sợi khuẩn ty và bào tử có cấu tạo như vi nấm (Ranjani Anandan và cs., 2016) Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật đơn bào phân nhánh, hầu hết
6 là vi sinh vật hiếu khí, sinh sản bằng cách phân nhánh hoặc tạo bào tử Hình thái của chúng trên môi trường nuôi cấy thường có dạng hình nón và được bao phủ bởi các sợi khuẩn có cấu tạo như nấm bên trên Ngoài ra các sắc tố sinh ra từ xạ khuẩn và các vòng tròn đồng tâm quanh khuẩn lạc cũng là tiêu chí để phân loại xạ khuẩn
Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ướt như vi khuẩn hay nấm men mà có dạng thô ráp, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ ( Phượng và cs., 2015)
Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường thạch đĩa
(Nguồn:TUBMicrobialculturecollection,http://www.tubcollection.com/pic.html)
Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium) với chức năng dinh dưỡng là chủ yếu và khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) với chức năng sinh sản là chủ yếu Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra thành khuẩn ty khí sinh ( Phượng và cs., 2015)
Khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn khác nhau về kích thước, hình dạng và độ dày Màu sắc của nó trải dài từ trắng hoặc hầu như không màu đến vàng, nâu, đỏ, hồng, cam, xanh lá cây hoặc đen (Ranjani Anandan và cs., 2016)
Khuẩn ty khí sinh thường dày hơn sợi nấm nền Khuẩn ty khí sinh thể hiện sự khác biệt mà có thể dựa vào đó để phân loại các chủng phân lập thành một số nhóm có các đặc điểm hình thái giống nhau trong điều kiện cố định Đây được coi là một trong những tiêu chí quan trọng nhất để phân loại chi Streptomyces thành các loài, bao gồm
7 cấu trúc (bông, nhẵn mịn hoặc bột), sự hình thành các vòng tròn hoặc vùng đồng tâm và sắc tố (Ranjani Anandan và cs., 2016)
Hình 1.2 Sự phát triển khuẩn ty ở xạ khuẩn
(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/Development-of mycelium in
Streptomyces-Modi-fi-ed-from-Vobis 1997_fig2_261661486)
Bào tử của xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử Bào tử của xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục, hình que, hình trụ… Hình dạng kích thước của cuống sinh bào tử và bào tử có vai trò quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn (Phượng và cs., 2015)
2 Hình thành khuẩn ty cơ chất.
3 Hình thành khuẩn ty khí sinh
Hình 1.3 Các cách sắp xếp bào tử của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
(Nguồn:https://www.intechopen.com/chapters/49873)
Straight: thẳng; Flexous: xoắn nhẹ; Fascicied: chia thùy; Monoverticillate, no spirals: cụm không xoắn; Monoverticillate with spirals: cụm xoắn ốc
Open loops, primtive spirals, hooks: vòng lặp mở, xoắn ốc, móc; Open spirals: Xoắn ốc mở; Closed spirals: Xoắn ốc kín; Biverticiillate, no spiral: Chùm bào tử thẳng; Biverticillate, with spirals: Chùm bào tử xoắn ốc
Theo khóa phân loại Bergey, thứ tự Actinomycetales được chia thành bốn họ - Streptomycetaceae, Actinomycetaceae, Actinoplanaceae, và Mycobacteriaceae ( William và cs., 1989) Trong tập năm của khóa phân loại Bergey, hệ thống xạ khuẩn được phân thành 6 lớp gồm: Actinobacteria, Acidimicrobiia, Coriobacteriia, Nitriliruptoria, Rubrobacteria và Thermoleophilia Lớp Actinobacteria được chia thành
TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
2.1 Đặc điểm thực vật học của cây cà gai leo
Tên khoa học: Solanum procumbens Lour
Hình 1.5 Hình ảnh cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.) 2.2 Đặc điểm hình thái và phân bố
Cây dược liệu là nguồn cung cấp nhiều loại thuốc cũng như hợp chất tự nhiên có công dụng chữa bệnh hữu hiệu Cà gai leo (Solanum procumbens L.) cũng là một trong số đó Cà gai leo là một loại cây thuộc họ cà (Solanaceae) có tên khoa học là Solanum procumbens Lour chúng có thân bò, cành có gai dẹp, lá có lông tập trung chủ yếu ở mặt dưới mép phiến lá lượn sóng không đều hoặc có 4-6 thùy cạn, cuống lá dài 2-8 mm; hoa có vành tím, màu trắng hay tím nhạt, đường kính 10-14 mm, cuống hoa dài, rũ xuống; Quả tròn không lông; hột dẹp, vàng, quả non màu lục, nửa phía cuống lục sậm; cuống quả dài 15-20 mm, nhiều lông Loài cây này thường phân bố chủ yếu ở Hải Phòng, Bình Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Bắc Giang ( Yên
Thế), Phú Thọ (Việt Trì) Ngoài ra còn xuất hiện ở Quảng Tây, Hải Nam ( Trung Quốc) Thường mọc thành bụi rải rác ven rừng , ven đường, bãi hoang (Vũ Văn Hợp,
Trong cây cà gai leo có chứa các hợp chất tự nhiên như alkaloid, glycoalkaloid có khả năng ức chế sự nhân lên và làm bất hoạt virus viêm gan B; ngoài ra chúng có khả năng bắt các gốc tự do và ngừa xơ gan hiệu quả; toàn cây có chứa alkaloid, nhiều nhất là ở rễ có chứa solasodin, solanidin
(Nguồn:https://www.researchgate.net
/figure/Chemical-structure-of- solasodine_fig1_287723826)
(Nguồn:https://www.chemfaces.com/n atural/Solanidine-CFN70454.html)
(Nguồn:https://www.pngegg.com/en/s earch?q=flavonoid)
(Nguồn:https://www.sciencedirect.co m/science/article/abs/pii/S0039128X1
Hình 1.6 Một số hợp chất hóa học trong cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.)
Trong dân gian người ta thường sử dụng rễ và trái trị mụt nhọt, lở, phong thấp
( P.H.Hộ; Vũ Văn Hợp, Vũ Xuân Phương, 2003) Bên cạnh việc sử dụng theo liệu pháp dân gian truyền thống để chữa bệnh, thời gian gần đây các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu về loài cây này Trong nghiên cứu của mình ông Hoang Le Tuan Anh năm
2017 cho biết cà gai leo rất giàu saponin steroid và flavonoid, đây là các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học kháng nấm kháng khuẩn và gây độc tế bào (Hoang Le Tuan Anh, 2017) Trong một số nghiên cứu gần đây cũng đã công bố các nhóm hợp chất triterpenoid, steroid, alkaloid và các hợp chất polyphenol phân lập từ cây cà gai leo (Nguyễn Trung Nhân và cs., 2021) Từ cao ethyl acetate của thân cây cà gai leo đã được phân lập được một hợp chất anthraquinone bốn hợp chất polyphenol và một hợp chất indole Bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo, các hợp chất này lần lượt được xác định là ziganein, benzoic acid, salicylic acid, 4-hydroxybenzaldehyde , vanillic acid và indole-3-carbaldehyde (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018) Trong những nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng glycoalkaloid trong các cây họ cà có nhiều hoạt tính sinh học, có khả năng chống khối u, kháng nấm, kháng virus (Zha X và cs., 2007)
2.4 Lợi ích và tác dụng
Cà gai leo là loài cây được biết đến nhiều nhất với công dụng giải độc gan, trước khi có những nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hợp chất cũng như dược tính của cây thì dân gian đã biết sử dụng nó để chữa những bệnh như mụn nhọt, giải rượu,trị rắn cắn, suyễn, phong thấp Trong cây cà gai leo có chứa các chất alkaloid, glycoalkaloid có tác dụng ức chế sự sao chép và làm bất hoạt virus viêm gan B, chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan hiệu quả Glycoalkaloid trong hiện diện nhiều trong rễ cây cà gai leo là một flavonoid có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư và là chất chống oxi hóa mạnh (Martin và cs., 2013)
Cà gai leo còn là thành phần chính của nhiều loại thuốc điều trị viêm gan (Nguyễn Minh Khai và cs., 2001) Trong một số nghiên cứu gần đây còn công bố thêm một số hợp chất phân lập từ cây cà gai leo có khả năng chống tăng sinh các tế bào ung thư, kháng viêm, giảm hàm lượng cholesterol (Friedman và cs., 2000a, 2000b), kháng oxy hóa và ức chế ức chế enzyme alpha-glucosidase (Nguyễn Trung Nhân và cs.,
2021) Nghiên cứu chứng minh cao chiết cà gai leo có tác dụng bảo vệ gan chuột khỏi sự nhiễm độc do tiếp xúc với TNT trong thời gian dài ( Nguyen và cs., 2013).
TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI SINH VẬT THỬ NGHIỆM
3.1 Staphylococcus aureus resistant methicillin (MRSA)
Staphylococcus aureus đề kháng với kháng sinh penicillin được phát hiện lần đầu tiên vào đầu thập niên 1940 sau khi penicillin được đưa vào sử dụng được một thời gian ngắn Nhưng trong nhiều năm sau đó thì những dòng vi khuẩn kháng penicillin này vẫn nhạy với các penicillin bền vững với penicillinase (oxacillin, methicillin, nafcillin), còn gọi là penicillin M Đến giữa thập niên 1960, bắt đầu xuất hiện những dòng vi khuẩn S aureus kháng penicillin M, được gọi là ―methicillin resistant S aureus (MRSA) vì methicillin là kháng sinh đầu tiên được sử dụng để phát hiện oxacillin (Phạm Hùng Vân, 2013) S aureus đề kháng với penicillin thông qua cơ chế β-lactamase và hiện nay đã có một tỷ lệ rất cao S aureus kháng với penicillin bằng cách tiết enzyme β-lactam; MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’) Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β-lactam (Phạm Hùng Vân, 2013) Nhiễm khuẩn do MRSA được ghi nhận thường xuyên ở các trung tâm y tế, đặc biệt ở các bệnh nhân có thời gian điều trị lâu dài trong bệnh viện MRSA là yếu tố gây nhiễm trùng nặng và có thể tử vong (Luong và cs., 2021) Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) thống kê cho thấy các bệnh nhiễm trùng hầu hết do vi khuẩn MRSA gây ra Theo Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (CLSI) chỉ ra MRSA là các chủng S aureus biểu hiện cơ chế kháng qua đột biến gen hoặc qua cơ chế kháng Methicillin khác, ví dụ thay đổi ái lực của protein gắn Penicillin với Oxacillin gây nhễm trùng bệnh viện nặng Ngoài ra, trong 2 thập kỷ vừa qua cũng đã xuất hiện chủng MRSA mới có khả năng lây nhiễm ngoài môi trường bệnh viện hầu hết chúng mang gen kháng kháng sinh (Otto., 2013), lây nhiễm cho những người khỏe mạnh và mang độc lực mạnh hơn Theo Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự (2011) đã nghiên cứu ở 48 bệnh viện tại Canada cho thấy: 11,700/29,000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm trùng
E coli là loài thuộc chi Escherichia, là trực khuẩn Gram âm di động thuộc loại kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng là 37 o C, tuy nhiên có thể tăng trưởng từ 10 – 46 0 C Mọc dễ dàng trong Mac Conkey, EMB…
(Nguồn : https://www.researchgate.net/figure/Biochemical-expression-of-E-coli-on- agar-and-gram-staining-a-arrow-pointing-pink_fig2_361848244)
E coli là một loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong ruột của người và động vật Vi khuẩn E coli có thể gây ra các bệnh như: nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng huyết, viêm màng não ở trẻ sơ sinh và bệnh tiêu chảy ở người và động vật
Việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do E.coli gây ra đang bị đe dọa bởi ngày càng nhiều các chủng E.coli đa kháng thuốc xuất hiện như chủng E coli sinh ESBL đều đề kháng với cephalosporin Kháng ciprofloxacin, trimethoprim, gentamicin và amikacin lần lượt là 91,3; 84,8%; 30,4% và 4,3% Tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đáng kể do vi khuẩn gây ra bởi E coli sản sinh ESBL là 60,8%, so với E coli không sản xuất ESBL (Mark Melzer và cs., 2007)
Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho biết tình trạng kháng thuốc kháng sinh fluoroquinolone ở E coli, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu đang phổ biến, tỷ lệ E coli kháng cephalosporin thế hệ thứ ba là 36,0%
S.typhi là trực khuẩn Gram âm, có lông xung quanh thân, có khả năng di động, không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,4 - 0,6 × 2 – 3 μm S typhi là vi khuẩn hiếu
17 khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 – 4 mm
(Nguồn: https://www.walmart.com/ip/Salmonella-Typhimurium-W-M-Microscope-
S.typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột, do khu trú ở túi mật nên có thể gây nhiễm trùng lâu dài Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Song và cs., 2010)
P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong có đơn mao ở một đầu, nhờ đó di động kích thước 0,6 × 2 μm, hiếu khí tuyệt đối, mọc dễ trên hầu hết các môi trường thông dụng, có thể phát ra mùi thơm giống mùi nho (grapelike odor) Mọc tốt ở nhiệt độ 37 0 C đến 42 0 C và có thể mọc ở nhiệt độ 5 – 42 0 C, không lên men glucose Thử nghiệm oxidase dương tính Gây tiêu huyết β trên thạch máu, P.aeruginosa có thể tiết ra 4 loại sắc tố: pyoverdin, pyocyanin, pyomelanin (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)
(Nguồn:https://www.researchgate.net/figure/Grams-staining-result-of-small-rod- gram-negative-Pseudomonas-aeruginosa-100X-objective_fig1_309241454)
Trực khuẩn mủ xanh tiết ra nhiều enzym và độc tố khác nhau Vi khuẩn này được coi là một mầm bệnh cơ hội, chủ yếu gây nhiễm trùng bệnh viện ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch Vi khuẩn này gây bệnh khi: xạ trị, hóa trị, sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân suy giảm, niêm mạc da và mô của bệnh nhân bị tổn thương, sử dụng các dụng cụ y khoa, lạm dụng kháng sinh, tiêu diệt hết vi khuẩn thường trú ở ruột… chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc,… ngoài ra P aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp Một số Pseudomonas aeruginosa tồn tại trong môi trường nước (Nguyễn
B cereus là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh bào tử, hiếu khí Một số chủng vi khuẩn B cereus gây ngộ độc thực phẩm, trong khi một số chủng lại có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật (Ryan và cs., 2004)
(Nguồn:https://www.researchgate.net/figure/Vegetative-form-of-Bacillus-rod- shaped-and-thin-at-1000X-magnification-Gram-positive_fig2_267244131)
Chủng vi khuẩn B cereus như một mối nguy tiềm ẩn trong ngộ độc thực phẩm, sản sinh ra độc tố gây nôn (cereulide) với nồng độ đọc tố có thể gây nôn dẫn đến ngộ độc thực phẩm là ở mức 10–1280 ng / g (N Agata và cs., 2002)
B cereus cũng đã được báo cáo liên quan đến suy giảm miễn dịch bệnh nhân, trẻ sơ sinh, người nghiện ma túy và bệnh nhân có tiền sử nhiễm trùng vết thương sau phẫu thuật và sau chấn thương (Anja Kotiranta và cs., 2000)
B cereus là một mầm bệnh ở người được tìm thấy là tác nhân truyền nhiễm của endophthalmitis và ngộ độc thực phẩm, đôi khi gây chết người (Drobniewski và cs.,1993).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 10/2021 đến tháng 9/2022 tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh- cơ sở 3 Trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Cây cà gai leo (Solanum procumbes L.) bao gồm rễ, thân, lá được thu hái ở Bình Định
1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
❖ Thiết bị: tủ lạnh, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy vortex, kính hiển vi
❖ Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, becher, que cấy, đũa cấy, đèn cồn, …
❖ Hóa chất: Thuốc nhuộm Crystal violet, lugol, ethanol 96%, Safranin O, cồn 96 o , cồn
70 o , kháng sinh Nystastin và acid Nalidixic, Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1 - 1,5 x 10 8 CFU/mL, tấm TLC,
❖ Môi trường: Gause I, MHA, nước muối sinh lý 0,85%,
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 21
Hình 1.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Thu nhận và xử lý mẫu
Phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Thu cao cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Khảo sát một số hoạt tính sinh học (Enzyme, tiêu huyết, kháng vi sinh vật gây bệnh)
Khảo sát một số hoạt tính sinh học ( chống biofilm, kháng khuẩn)
Khảo sát khả năng chống oxi hóa Định danh chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính mạnh nhất Định danh tên khoa học
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 22
2.2 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu
Mẫu được thu nhận và thực hiện lấy mẫu ở tỉnh Bình Định sau đó được bảo quản và vận chuyển đến phòng thí nghiệm Mẫu thu nhận là mẫu rễ, thân và lá còn nguyên vẹn, không dập úng, không nhiễm sâu bệnh Thực hiện xử lý mẫu sau khi thu nhận
Hình 2.1 Mẫu cà gai leo được thu hái và phân loại
Từ mẫu cây cà gai leo (Solanum procumbes L.) chúng tôi tiến hành xử lý như sau: Rễ, thân, lá và quả cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) được rửa dưới vòi nước sạch trong 3 phút Phân loại mẫu thành 3 phần gồm: rễ, thân và lá rồi tiến hành xử lý mẫu
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 23
Bước 1: Lắc mẫu trong 3-5 phút (*) bằng ethanol 70%
Bước 2: Rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục khử trùng mẫu với Natri hypoclorid 4%, trong 5-10 phút (*)
Bước 3: Lắc mẫu với ethanol 70% trong 3-5 phút (*)
Bước 4: Các mẫu được rửa năm lần với nước cất vô trùng, nước rửa cuối cùng được trải lên môi trường NA để kiểm tra độ vô trùng (Weyens và cs., 2012; Eevers và cs., 2015)
* Chú thích: Đối với từng mẫu sẽ có thời gian khử trùng bề mặt khác nhau
2.3 Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.)
Những mẫu đạt hiệu quả khử trùng bề mặt, tức không có sự xuất hiện của khuẩn lạc ở đĩa trang nước rửa cuối cùng được tiến hành phân lập xạ khuẩn nội sinh
Phương pháp 1: Đặt mẫu trực tiếp
Mẫu sau khi thu thập sẽ được cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 1cm rồi tiến hành xử lý mẫu như mục 2.2.2 sau đó đặt mẫu trực tiếp lên môi trường Gause I có bổ sung acid nalidixic và nystastin để kìm hãm sự phát hiển của vi khuẩn Gram âm và vi nấm Ủ mẫu ở 28 o C trong khoảng thời gian từ 7 ngày đến tối đa 21 ngày và quan sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc xạ khuẩn Làm thuần trên đĩa môi trường Gause I
Phương pháp 2: Phương pháp tiền tăng sinh
Sau khi đã tiến hành xử lý mẫu như mục 2.2.2 đặt mẫu vào môi trường Gause I lỏng có bổ sung acid nalidixic và nystastin để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Gram âm và vi nấm Ủ lắc 200 rpm ở 28 o C trong vòng 5 đến 7 ngày, sau đó tiến hành pha loãng mẫu và trang dịch khuẩn tiền tăng sinh trên môi trường thạch Gause
I, ủ mẫu ở 28 o C trong vòng từ 7 ngày đến tối đa 21 ngày và làm thuần
Phương pháp 3: Thay thế môi trường phân lập
Môi trường phân lập Gause I sẽ được thay thế bằng dịch xay và lọc vô trùng từ cây cà gai leo tươi, sau đó được tiến hành đặt mẫu trực tiếp như phương pháp 1
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 24
Hình 2.3 Quá trình thu lấy dịch lọc để thay thế môi trường phân lập
A: Dịch cây cà gai leo sau khi xay
B: Dịch cây cà gai leo sau khi lọc
Phương pháp 4: Phân lập từ dịch cây cà gai leo
Cây cà gai leo sau khi được khử trùng bề mặt như mục 2.2.2 sẽ được đặt vào túi zip vô trùng đã được chiếu UV 30 phút, nghiền cây với dung dịch đệm phosphate sau đó pha loãng và trang dịch lên môi trường Gause I và môi trường thay thế bằng dịch lọc cây cà gai leo Ủ ở 28 o C trong vòng từ 7 đến tối đa 21 ngày và quan sát sự xuất hiện của xạ khuẩn
Quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước, sắc tố tiết của từng xạ khuẩn khác nhau, tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường Gause I cho đến khi đồng nhất về hình dạng, màu sắc và sắc tố tiết của xạ khuẩn
2.3.2 Quan sát vi thể, đại thể
Quan sát đại thể bằng mắt thường các khuẩn lạc trên các đĩa môi trường để nhận dạng về kích thước, hình dạng, màu sắc của các khuẩn lạc
Quan sát vi thể: quan sát bằng cách nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40X, 100X
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 25
Nhuộm Gram: Nhằm xác định hình dạng tế bào xạ khuẩn hình dạng khuẩn ty, bào tử
- Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh chữ U
- Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
- Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
- Tẩy màu bằng cồn 96 o trong khoảng 15 – 20 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin O trong 30 giây, rửa nước, thấm khổ
- Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1000 lần
- Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương bắt màu tím
Sau khi quan sát đại thể và vi thể các chủng không có dấu hiệu nhiễm được cấy truyền vào các ống thạch nghiêng Gause I Ủ ở 28 o C trong 5-7 ngày, các ống sau khi ủ được bảo quản trong môi trường chứa glycerol ở - 4 o C
2.4 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.)
Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh:
- Vi khuẩn gây bệnh được sử dụng: MRSA, E coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereu
- Cấy vi khuẩn trên môi trường thạch NA ủ ở 37 o C/24 giờ
- Lấy khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh đã được cấy hoạt hóa trên đĩa thạch trong 18 – 24 giờ để pha thành dịch treo trong nước muối sinh lí NaCl 0,85 %
- Vortex dịch khuẩn trong 20 giây Độ đục của dịch vi khuẩn sẽ được đem so sánh với độ đục chuẩn của ống 0,5 McFarland Dịch khuẩn sẽ được chuẩn bị trước 15 phút trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Dịch tăng sinh xạ khuẩn được ly tâm lạnh ở 4 o C, 13000 rpmCách tiến hành:
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 26
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán giếng thạch
- Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước sau đó trải đều lên trên mặt thạch MHA
- Đục lỗ thạch với các giếng có đường kính 6mm và bơm dịch xạ khuẩn đã ly tâm vào các giếng đã đục lỗ
- Ủ ở 37 o C trong 24- 48 giờ, đọc kết quả và đo đường kính vòng kháng khuẩn (vòng trong xung quanh không có sự xuất hiện của vi khuẩn) (IDZ) Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Plus 3.0
2.5 Khảo sát khả năng chống oxi hóa của xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.)
2.5.1 Thu nhận cao chiết thô từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Sau khi đã có chủng xạ khuẩn thuần tiến hành lên men thu nhận cao chiết thô từ các chủng xạ khuẩn nội sinh
2.5.1.1 Lên men chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Xạ khuẩn nội sinh được cấy vào môi trường Gause I lỏng, ủ lắc 180 vòng/phút ở 28 o C trong 72 giờ Dịch ngoại bào từ xạ khuẩn nội sinh được thu thập bằng cách ly tâm 13000 vòng /phút trong vòng 10 phút
2.5.1.2 Chiết lỏng- lỏng và thu nhận cao chiết thô từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY
Mẫu cây thu hái được định danh tại Bộ môn Thực vật trường Đại học khoa học tự nhiên như sau:
Tên khoa học: Solanum procumbens Lour
KẾT QUẢ PHÂN LẬP XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
Từ mẫu cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) đã thu thập và lấy mẫu ở Bình Định chúng tôi tiến hành phân lập xạ khuẩn nội sinh theo 4 phương pháp ở mục 2.3 và kết quả được thể hiện theo bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn 4 phương pháp khác nhau
Mẫu phân lập Rễ Thân Lá
Dịch tiền tăng sinh sau khi đã ủ đủ thời gian, chúng tôi tiến hành pha loãng và trang dịch trên môi trường thạch Gause I để phân lập xạ khuẩn nội sinh và kết quả thể hiện ở bảng 3.1
Từ kết quả thống kê ở bảng 3.1 cho thấy phương pháp tiền tăng sinh (phương pháp 2) phân lập được 25 chủng xạ khuẩn nội sinh và nhiều nhất là ở mẫu lá
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 33
Hình 3.1 Kết quả phân lập bằng phương pháp tiền tăng sinh từ mẫu lá
A: Hình chụp mặt dưới của đĩa phân lập
B: Hình chụp mặt trên của đĩa phân lập
Dựa vào bảng 3.1 đã thống kê cho thấy chúng tôi đã phân lập được 25 chủng xạ khuẩn nội sinh theo phương pháp tiền tăng sinh Trong đó có 1 chủng phân lập từ mẫu rễ và 22 chủng phân lập từ mẫu lá
Kết quả thể hiện ở hình 3.1 cho thấy sự xuất hiện của xạ khuẩn nội sinh sau 7 ngày ủ nuôi Từ đĩa phân lập này chúng tôi bắt đầu làm thuần và giữ chủng để thực hiện khảo sát những nội dung tiếp theo
Tương tự như các tương tác sinh học giữa các quần thể sinh vật trong hệ sinh thái, giữa các vi sinh vật nội sinh cũng sẽ có mối quan hệ tương tác với nhau, phương pháp tiền tăng sinh sử dụng môi trường lỏng để thúc đẩy sự sinh trưởng của vi sinh vật nội sinh cư trú bên trong mô tế bào thực vật giúp chúng có thể sinh trưởng và phát triển trong môi trường tăng sinh từ đó có thể phân lập được các chủng vi sinh vật nội sinh một cách dễ dàng hơn Đối với phương pháp đặt mẫu trực tiếp những vi sinh vật nội sinh sẽ phải tự di chuyển ra ngoài môi trường thạch vì vậy một vài vi sinh vật có thể chưa được phát hiện hết hoặc môi trường thạch có thể thiếu một số thành phần môi trường trong thực vật mà chúng cần Trong khi môi trường tiền tăng sinh là môi trường lỏng và được ủ lắc liên tục tạo điều kiện cho nhiều vi sinh vật nội sinh tiếp xúc với môi
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 34 trường nhiều hơn và trên hết trong quá trình sinh trưởng của các quần thể vi sinh vật có thể tạo ra một số hợp chất, những hợp chất này sẽ được vi sinh vật tiết trực tiếp vào môi trường lỏng tạo điều kiện sinh trưởng cho một số quần thể khác, chẳng hạn hỗ trợ cho các quần thể vi sinh vật khó sinh trưởng trên môi trường thạch có thể sinh trưởng Các phương pháp phân lập còn lại chưa ra được kết quả như mong đợi có thể do phương pháp và mẫu phân lập chưa phù hợp với nhau, từng loại cây và từng đối tượng vi sinh vật sẽ có những cách phân lập tối ưu khác nhau để ra được nhiều vi sinh vật nội sinh nhất Theo như quá trình khảo sát các phương pháp mới và cũ thì kết quả cho thấy đối với cây cà gai leo, phương pháp tiền tăng sinh sẽ phân lập được nhiều xạ khuẩn nội sinh nhất
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 35
Hình 3.2 Kết quả trang nước rửa cuối mẫu sau khi đã khử trùng bề mặt
Sau khi đã khảo sát được thời gian lắc mẫu phù hợp chúng tôi đã chọn ra được thời gian lắc mẫu thích hợp với từng mẫu bộ phận khác nhau trên cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) đạt hiệu quả khử trùng mà vẫn không làm tổn thương đến mô tế bào
Kết quả của mẫu khử trùng bề mặt đạt yêu cầu được ghi nhận và được ghi chú lại để chọn thời gian lắc mẫu thích hợp đối với từng bộ phận của cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) Kết quả khử trùng bề mặt đạt yêu cầu là mẫu nước rửa cuối sau 24 giờ ủ nuôi không có sự xuất hiện khuẩn lạc của vi sinh vật, nếu sau 24 giờ ủ nuôi đĩa môi trường được trang nước rửa cuối có sự xuất hiện của vi sinh vật thì vi sinh vật phân lập được có thể không phải là vi sinh vật nội sinh cần phân lập
Kết quả khử trùng hình 3.2 đạt yêu cầu khử trùng bề mặt chứng tỏ xạ khuẩn phân lập được là xạ khuẩn nội sinh trong cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Từ các chủng xạ khuẩn đã phân lập theo mục, chúng tôi tiến hành làm thuần và giữ chủng
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 36
Hình 3.3 Chủng xạ khuẩn XL19 phân lập được từ cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour) bằng phương pháp tiền tăng sinh sau khi được làm thuần trên môi trường Gause I
A: Mặt trên của xạ khuẩn nội sinh
B: Mặt dưới của xạ khuẩn nội sinh
Hình 3.4 Mặt trên và mặt dưới của chủng xạ khuẩn XL9 có tiết sắc tố làm đổi màu môi trường Gause I
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 37
A: Mặt trên của xạ khuẩn nội sinh
B: Mặt dưới của xạ khuẩn nội sinh
Hình 3.5 Hình ảnh mặt trên mà mặt dưới của chủng XL10 trên môi trường
A: Mặt trên của xạ khuẩn nội sinh
B: Mặt dưới của xạ khuẩn nội sinh
Từ mẫu cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) chúng tôi đã phân lập được 25 chủng xạ khuẩn nội sinh bằng phương pháp tiền tăng sinh (phương pháp 2) Sau khi đã làm thuần, tức là khuẩn lạc xạ khuẩn nội sinh đã đồng nhất về màu sắc và hình dạng, kích thước cũng như hình dạng dưới kính hiển vi, chúng tôi tiến hành quan sát đại thể của từng chủng và ghi nhận lại, kết quả quan sát được thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả quan sát đại thể và của các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập được từ phương pháp tiền tăng sinh STT Kí hiệu chủng Đại thể
1 XR7 Khuẩn lạc màu nâu trắng, tâm trắng,viền răng cưa, khuẩn lạc sinh sắc tố màu nâu nhạt
2 XL1 Khuẩn lạc màu trắng sữa, tâm nhô lên trên mặt
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 38 thạch, viền răng cưa, sinh sắc tố màu nâu tím
3 XL2 Khuẩn lạc màu nâu, viền tròn đều, khuẩn lạc mọc nhô lên mặt thạch, sinh sắc tố màu nâu nhạt
4 XL3 Khuẩn lạc màu trắng đục, hơi xám, tâm nhô lên mặt thạch, viền răng cưa, không sinh sắc tố
5 XL4 Khuẩn lạc màu trắng đục hơi nâu, viền dạng tia màu trắng, tâm nhô, không sinh sắc tố
6 XL4.1 Khuẩn lạc màu trắng đục, viền răng cưa, tâm nhô, sinh sắc tố màu vàng cam nhạt
7 XL5 Khuẩn lạc màu trắng đục, mọc trên mặt thạch, viền răng cưa, không sinh sắc tố
8 XL6 Khuẩn lạc màu xanh xám, nhô lên khỏi mặt thạch, tiết dịch màu đen trên bề mặt khuẩn lạc, sinh sắc tố màu cam nhạt
9 XL8 Khuẩn lạc màu trắng đục, tâm nhô, bề mặt sần sùi, viền răng cưa, khuẩn lạc mọc trên mặt thạch, sinh sắc tố màu nâu
10 XL9 Khuẩn lạc màu nâu nhạt, khuẩn lạc mọc trên mặt thạch sinh sắc tố màu nâu
11 XL10 Khuẩn lạc màu xám, mọc trên mặt thạch, tâm nhô, viền răng cưa, khuẩn lạc sinh sắc tố màu vàng
12 XL11 Khuẩn lạc màu xanh rêu nhạt, tâm nhô, viền dạng tia, khuẩn lạc sinh sắc tố màu nâu cam
13 XL12 Khuẩn lạc màu xám, tâm nhô, viền dạng tia, khuẩn lạc sinh sắc tố màu đỏ nâu
14 XL13 Khuẩn lạc màu nâu, tâm nhô, viền dạng tia, sinh sắc tố màu nâu đậm
15 XL14 Khuẩn lạc màu trắng, tâm nhô màu nâu đục,
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 39 viền răng cưa, sinh sắc tố màu nâu đậm
16 XL15 Khuẩn lạc màu trắng đục, tâm nhô, viền răng cưa, sinh sắc tố đen
17 XL16 Khuẩn lạc màu trắng sữa, tâm nhô, khuẩn lạc sinh sắc tố màu nâu
18 XL17 Khuẩn lạc màu trắng xám, viền to dạng tia màu trắng; không sinh sắc tố
19 XL18 Khuẩn lạc màu trắng xám, viền dạng tia, không sinh sắc tố
20 XL19 Khuẩn lạc màu trắng sữa, hơi xanh nhẹ, viền dạng tia, không sinh sắc tố
21 XL19.1 Khuẩn lạc màu trắng sữa,viền răng cưa, vòng tán xạ nhỏ, không sinh sắc tố
22 XL21 Khuẩn lạc tròn, trắng đục, tâm nhô, bề mặt khô, viền xám răng cưa, tỏa ra xung quanh, mặt dưới màu nâu
23 XL22 Khuẩn lạc tròn, trắng đục, tâm nhô, bề mặt khô, viền xám răng cưa, tỏa ra xung quanh, mặt dưới màu nâu
24 A1 Khuẩn lạc bờ rằng cưa, bề mặt khô, tâm chia 2 thùy, màu xám trắng, không sinh sắc tố
25 A2 Khuẩn lạc tròn màu xám nhạt, bờ răng cưa, tâm chia 5 thùy không sinh sắc tố
XR: Chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ mẫu rễ
XL: Chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ mẫu lá
Từ kết quả quan sát đại thể được thống kê trong bảng 3.2 cho thấy hầu hết các chủng xạ khuẩn phân lập được có khuẩn lạc màu trắng, tâm nhô, và sinh sắc tố làm biến đổi màu sắc môi trường
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 40
Hình 3.6 Kết quả quan sát vi thể chủng xạ khuẩn XL8 phân lập từ lá cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Dựa vào kết quả quan sát được qua vật kính x100 cho thấy xạ khuẩn bắt màu tím chứng tỏ chúng thuộc Gram dương, khuẩn ty dạng xoắn.
KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
Từ các chủng xạ khuẩn nội sinh sau khi làm thuần, xạ khuẩn được lên men trong môi trường lỏng trong vòng 7 ngày và được dùng khảo sát khả năng kháng vi khuẩn MRSA, E.coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus
Kết quả khảo sát cho thấy trong tất cả các chủng xạ khuẩn được khảo sát chỉ có 1 chủng có khả năng kháng vi khuẩn MRSA với đường kính kháng khuẩn là 11,34±0,58 mm Các chủng vi khuẩn còn lại không có khả năng kháng tất cả các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 41
Hình B: Chủng thử nghiệm XL21
Hình 3.7 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn MRSA của chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L ) XL21 đã phân lập được
Từ bộ sưu tập chủng xạ khuẩn nội sinh đã phân lập được, sau khi khảo sát khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh kết quả cho thấy trong tất cả chủng xạ khuẩn nội sinh thử nghiệm có chủng XL21 có khả năng kháng vi khuẩn MRSA (hình 3.7) với đường kính kháng khuẩn là 11,33±0,58mm và không có khả năng kháng tất cả các chủng vi khuẩn thử nghiệm Hiện nay, bên cạnh những nghiên cứu về các cây họ cà có khả năng kháng MRSA thì vẫn chưa có công bố nào về hoạt tính kháng vi khuẩn MRSA của chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) và cũng chưa có nghiên cứu nào về hoạt tính kháng MRSA cũng như các chủng vi khuẩn gây bệnh khác từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) Qua đó cho thấy kết quả của nội dung nghiên cứu này là tiền đề để nghiên cứu sâu hơn về xạ khuẩn nội sinh có khả năng kháng MRSA.
KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 42
Từ các chủng xạ khuẩn nội sinh đã phân lập được, chúng tôi tiến hành lên men, thu lấy dịch lọc và chiết cao thô từ các chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) theo phương pháp như hình 3.8 Cao chiết của các chủng xạ khuẩn nội sinh này tiếp tục được sử dụng để định tính và định lượng khả năng chống oxy hóa
Hình 3.8 Quá trình thu nhận cao chiết thô từ chủng xạ khuẩn đã phân lập được
A: Chiết lỏng- lỏng với Ethyl acetate tỉ lệ 1: 1
B: Cao chiết sau khi đã để bay hơi ở 50 0 C
Bảng 3.3 Kết quả định tính khả năng chống oxy hóa của các chủng xạ khuẩn
Mã chủng Kết quả kháng oxy hóa
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 43
Hình 3.9 Kết quả định lượng khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp hiện hình trên tấm TLC dưới đèn UV
Hình A: Kết quả định tính của chủng XL21
Hình B: Kết quả định tính của chủng XL22
Hình C: Mẫu đối chứng dương
Hình D: Mẫu đối chứng âm
Quan sát kết quả thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy 3 chủng xạ khuẩn XL21, XL22 và A1 có sinh hoạt chất chống oxy hóa vì có xuất hiện màu vàng trên tấm TLC như mẫu đối chứng dương (hình 3.9C) Theo thời gian gốc tự do không ngừng sản sinh và gây hại trong khi hệ thống phòng vệ của cơ thể lại từng bước suy yếu dần Gốc tự do được xem là “ sát thủ giấu mặt ” gây ra quá trình lão hóa và phần lớn các bệnh tật nguy hiểm như: Trầm cảm, tăng huyết áp, ung thư, đái tháo đường, sa sút trí tuệ, Alzheimer (Đặng, 2017) Sự oxy hóa tế bào gây nhiều hậu quả nghiêm trọng, một trong số đó là góp phần tăng thêm các biến chứng phức tạp của bệnh tiểu đường do vậy việc tìm được
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 44 các hợp chất chống oxy hóa cũng góp phần không nhỏ trong việc tìm kiếm các chất hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường ( Xuân và cs., 2012) Do vậy việc bổ sung các hợp chất có khả năng bắt các gốc tự do rất quan trọng, đặc biệt là với những người lớn tuổi khi các chức năng trong cơ thể dần suy yếu Kết quả của khảo sát này là tiền đề để nghiên cứu các hợp chất chống oxi hóa ứng dụng chữa bệnh trên người
4.2 Đánh giá khả năng chống oxi hóa bằng sử dụng DPPH
Từ kết quả định tính khả năng chống oxy hóa từ cao chiết xạ khuẩn nội sinh đã phân lập từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.), chúng tôi tiếp tục định lượng khả năng chống oxy hóa của 3 chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng chống oxi hóa mạnh nhất bằng phương pháp đo độ hấp thụ (OD) kết quả được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chống oxy hóa
Mã chủng Nồng độ mẫu
Giá trị mật độ quang trung bình
Khả năng kháng oxy hóa
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 45
Qua bảng 3.4 cho thấy khả năng bắt gốc tự do của cao chiết từ 2 chủng xạ khuẩn nội sinh XL21 và XL22 tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết thử nghiệm Nồng độ cao chiếc càng cao thì khả năng bắt gốc tự do càng lớn và giá trị IC 50 càng nhỏ Acid ascorbic có giá trị IC 50 là 11,63 được sử dụng làm chất chuẩn để đánh giá khả năng bắt gốc tự do của cao chiết từ 2 chủng xạ khuẩn nội sinh đã khảo sát Khả năng chống oxy hóa (%) của chủng XL22 cao hơn 2 chủng XL21 và A1 với giá trị IC 50 là 18,05 mg/mL Hợp chất chống oxy hóa đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người, phương pháp sử dụng DPPH để xác định khả năng chống oxy hóa của cao chiết được sử dụng rộng rãi, cũng bằng phương pháp này đã xác định được khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Bưởi bung rất cao với giá trị IC 50 là 612,9 (mg/mL) (Phùng và cs., 2021) Qua kết quả đánh giá khả năng chống oxi hóa của 2 chủng cho thấy tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y dược để làm chất chống oxi hóa.
KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIÊU HUYẾT CỦA XẠ KHUẨN NỘI
Các chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) sau khi thu thập được khảo sát khả năng tiêu huyết Kết quả đánh giá khả năng tiêu huyết được thể hiện ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng tiêu huyết
Mã chủng Kiểu tiêu huyết
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 46
Sau khi khảo sát khả năng tiêu huyết của 25 chủng xạ khuẩn nội sinh, kết quả được thể hiện ở bảng 3.5, cho thấy có tổng cộng 7 chủng xạ khuẩn có kết quả tiêu huyết alpha, 18 chủng có kết quả tiêu huyết gamma và không có chủng xạ khuẩn nào có kết quả tiêu huyết beta Các chủng xạ khuẩn có khả năng tiêu huyết beta hoặc tiêu huyết alpha không an toàn để sử dụng cho con người, vì vậy khảo sát khả năng tiêu huyết để loại bỏ các chủng xạ khuẩn có khả năng huyết giải (Singh và cs., 2020).
KẾT QUẢ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO ( Solanum procumbens L.)
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 47
Từ các chủng xạ khuẩn nội sinh đã thu thập được sử dụng để khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào Kết quả sinh enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) được thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
Kí hiệu chủng Amylase Casein
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 48
Qua kết quả thể hiện ở bảng 3.7 cho thấy trong tổng số 25 chủng xạ khuẩn khảo sát có 12 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme amylase phân giải tinh bột, 10 chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh enzyme caseinase phân giải casein và 5 chủng có khả năng sinh cả 2 loại enzyme amylase là các enzym tiêu hóa thủy phân các liên kết glycosidic trong tinh bột thành glucose, maltose, maltotriose và dextrin Chúng có rất nhiều ứng dụng tiềm năng trong cả ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Enzyme amylase có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, tẩy rửa, nhiên liệu và làm thực phẩm hỗ trợ hệ tiêu hóa Các α-amylase của vi khuẩn bây giờ cũng được sử dụng trong các lĩnh vực lâm sàng, y học và hóa phân tích (Singh và cs., 2011) Enzyme caseinase là một loại enzyme protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng rộng rãi phục vụ cho đời sống, trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dệt may, dược phẩm (Nguyễn và cs., 2019)
7 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO ( Solanum procumbens L.) CÓ HOẠT TÍNH MẠNH NHẤT
Từ kết quả khảo sát khả năng chống oxi hóa, kháng khuẩn, sinh enzyme ngoại bào và kết quả tiêu huyết chúng tôi đã lựa chọn được chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) tiềm năng nhất là chủng có mã chủng là XL21 Chủng xạ khuẩn nội sinh này đã được gửi đi định danh bằng công cụ sinh học phân tử giải trình tự 16S rRNA được tiến hành bởi dịch vụ của công ty TNHH dịch vụ và thương mại Nam Khoa dựa trên vùng gen 16S rDNA Sau khi kiểm tra và hiệu chỉnh (những peak tính hiệu xấu) kết quả giải trình tự, chúng tôi tiến hành BLAST để so sánh với các trình tự trên GenBank (NCBI) cho thấy trình tự vùng gen 16S có độ tương đồng cao
(Ident = 99,93%) với trình tự của loài Streptomyces mutabilis ( chỉ số E- value = 0.0 thể hiện độ tin cậy cao)
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 49
Hình 3.10 Kết quả BLAST trên NCBI chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất
Qua kết quả BLAST cho thấy trình tự XL21 có độ tương đồng cao với trình tự thuộc loài Streptomyces mutabilis với mã số truy cập là FJ486421 với các chỉ số Max score = 2529, Total score = 2529, Query cover = 100%, giá trị mong đợi thấp có ý nghĩa E value = 0.0, phần trăm tương đồng 99,93%
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 50
Hình 3.11 Kết quả dựng cây phả hệ Neighbor-Joining method
Dựa trên cơ sở dữ liệu NCBI, 8 trình tự chi Streptomyces và 2 trình tự thuộc loài Candida là nhóm ngoại được thu thập trên Genbank, sau đó đưa bộ dữ liệu vào trong phân tích phát sinh loài Thông tin các trình tự thu thập được trình bày theo bảng sau:
Bảng 3.6 Thông tin trình tự thu thập trên Genbank
STT Loài Mã số truy cập
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 51 heliomycini
10 Candida albicans LC612906 Để xây dựng cây phát sinh loài bộ gen của các trình tự được đồng bộ hóa
Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA X Mẫu sau khi chạy cây phát sinh loài với các trình tự đã chọn được phân nhóm
Nhóm 1 gồm các loài : Streptomyces mutabilis
Nhóm 2 gồm các loài: Streptomyces albidoflavus, Streptomyces albus và Streptomyces heliomycini
Nhóm 3 gồm các loài: Candida albicans và Candid tropicalis được chọn làm nhóm ngoại
Kết quả dựng cây phả hệ cho thấy trình tự của chủng Streptomyces mutabilis XL21 có mức độ gần gũi với loài Streptomyces mutabilis FJ486421 và có độ tương đồng đến
99 % Ngoài ra ở nhóm ngoại Caldida albicans và Caldida tropicalis đã được tách ra riêng biệt và có khoảng cách tiến hóa xa so với loài Streptomyces mutabilis
Theo Hamed và cs., năm 2018 chủng xạ khuẩn Streptomyces mutabilis sp phân lập từ biển Đỏ, cao chiết của chủng xạ khuẩn này phân lập được 9 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau Mutalomycin là một hợp chất kháng khuẩn được tổng hợp từ
Streptomyces mutabilis NRRL 8088 có khả năng chống lại vi khuẩn Gram dương và Eimeria tenella (bệnh cầu trùng ở gà).
THU NHẬN CAO CHIẾT DƯỢC LIỆU TỪ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum
Bên cạnh việc đánh giá khả năng chống oxi hóa và khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) chúng tôi tiếp tục thu nhận cao chiết ethanol và cao nước từ cây cà gai leo và đánh giá khả năng chống oxi hóa cũng như một số hoạt tính sinh học của cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Chúng tôi tiến hành thu nhận cao chiết dược liệu từ cây cà gai leo, mẫu cây sau khi thu thập sẽ được sấy khô đến khi khối lượng không đổi và sau đó đem đi chiết với
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 52
Ethanol 96% và với nước cất, dịch chiết được cô cạn thành cao chiết thô và sử dụng để khảo sát các hoạt tính sinh học
Hình 3.12 Cây cà gai leo xay (trái) và cao chiết cây cà gai leo (phải)
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT CÂY CÀ
CÀ GAI LEO ( Solanum procumbens L.)
Qua quá trình khảo sát khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh (E coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Bacillus cereus và MRSA) của cao chiết ethanol và cao chiết với nước của cây cà gai leo bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, chúng tôi chưa ghi nhận khả năng kháng khuẩn của hai loại cao chiết này Từ kết quả khảo sát 2 loại cao chiết chúng tôi nhận thấy rằng: trong quá trình thực hiện thu nhận cao chiết cà gai leo (Solanum procumbens L.), chúng tôi sử dụng phương pháp ngâm chiết, ở phương pháp này cần thời gian lâu mới có thể chiết được các hợp chất nhưng hiệu suất lại thấp Do đó có thể do thời gian chúng tôi ngâm chiết cà gai leo chưa đủ để tách chiết các hợp chất có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh, bên cạnh đó có thể do chúng tôi sử dụng dung môi tách chiết chưa phù hợp với cấu trúc hợp chất có trong cây cà gai leo nên chưa thể chiết được các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Aliero và cộng sự năm 2006, nhóm tác giả đã thu nhận cao chiết của cây cà Solanum tomentosum bằng phương pháp ngâm chiết, các cao chiết thu được cũng không có khả năng chống lại các chủng vi khuẩn thử nghiệm bao gồm :Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,… Mặc dù đã có vài công bố về các hợp chất của cây
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 53 cà gai leo, nhưng chưa có công bố nào xác định hợp chất cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) có khả năng kháng khuẩn, chủ yếu các nghiên cứu công bố các hợp chất có khả năng ức chế enzyme alpha glucosidase ứng dụng trong đều trị đái tháo đường (Nhân và cs., 2021) Hơn nữa phương pháp chiết cao cũng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên, nếu chiết với các dung môi có độ phân cực kém sẽ không thu được các hợp chất có độ phân cực cao, một số hợp chất dễ bay hơi hay dễ bị biến tính khi nhiệt độ thay đổi hay thời gian chiết không phù hợp cũng làm ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chúng (Thủy và cs., 2020) Vì vậy, chúng tôi sẽ khảo sát thêm về phương pháp chiết cao và dung môi dùng để chiết để đánh giá hoàn thiện hơn về hợp chất thu nhận từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO CHIẾT CÂY CÀ
10.1 Định tính khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp hiện màu trên tấm sắc ký bản mỏng (TLC)
Cao chiết cây cà gai leo với hai dung môi là ethanol và nước được sử dụng để khát khả năng chống oxi hóa, chúng tôi tiến hành chấm sắc ký trên tấm bảng mỏng (TLC) để kiểm tra hợp chất chống oxi hóa trong cao chiết
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 54
Hình 3.13 Kết quả định tính khả năng chống oxi hóa của cao chiết cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.)
Hình A: Giải ly bản mỏng đã chấm cao chiết trong dung môi
Hình B: Kết quả sau khi giải ly
Hình C: Kết quả sau khi nhúng tấm sắc ký vào DPPH
Từ hình 3.11C ta thấy trong cao chiết có chứa 5 phân đoạn hợp chất, cả 5 phân đoạn đều có chứa chất chống oxi hóa do DPPH tại vị trí các phân đoạn của cao chiết trên tấm TLC có màu vàng, tức là có khả năng chống oxi hóa Theo nghiên cứu của Nguyễn Trung Nhân và cộng sự, năm 2021 trong cây cà gai leo có chứa các hợp chất polyphenol và alkaloid là các hợp chất có khả năng chống oxy hóa cao
10.2 Đánh giá khả năng chống oxi hóa bằng sử dụng DPPH
Từ kết quả định tính chúng tôi tiếp tục định lượng khả năng chống oxi hóa của
2 loại cao chiết từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.13; hình 3.14 và bảng 3.6
Hình 3.14 Kết quả định lượng khả năng chống oxi hóa mẫu chứng dương
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 55
Hình 3.15 Kết quả định lượng khả năng chống oxi hóa mẫu cao chiết cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.)(*)
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 55
Bảng 3.7 Kết quả đo mật độ quang và tính giá trị chống oxi hóa của cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Mẫu đo Nồng độ mẫu
Giá trị mật độ quang trung bình
Khả năng kháng oxy hóa
Qua bảng 3.6 cho thấy khả năng chống oxi hóa tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết; trong đó, cao chiết cây cà gai leo bằng ethanol có khả năng chống oxi hóa cao hơn cao nước với giỏ trị IC 50 là 12,28 (àg/mL) Cỏc cõy họ cà cú chứa nhiều hợp chất alkaloid, và giàu polyphenol, đây là các hợp chất chống oxy hóa mạnh ( Theo nghiên cứu của Liu và cộng sự, năm 2003 cho thấy hợp chất polyphenol từ cây cà Solanum tuberosum L.có giá trị IC 50 là 0,582 mg/mL Từ những nghiên cứu trên cho thấy khả năng chống oxy hóa của các cây họ cà đặc biệt là cây cà gai leo (Solanum procumbens L.), từ đó cho thấy tiềm năng của cao chiết cà gai leo trong ứng dụng làm hợp chất chống oxi hóa
11 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG TẠO MÀNG BIOFILM TỪ CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO ( Solanum procumbens L.)
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 56
Sau khi thu nhận cao chiết cây cà gai leo, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng ức chế màng sinh học Cao chiết với ethanol từ cây cà gai leo được sử dụng để khảo sát khả năng chống tạo màng biofilm với vi khuẩn thử nghiệm là vi khuẩn MRSA Kết quả khảo sát thể hiện ở hình 3.13
Hình 3.16 Kết quả khảo sát chống tạo màng biofilm từ cao chiết cây cà gai leo
Hình A: Đối chứng dương (Chống tạo màng biofilm)
Hình B: Đối chứng âm (Không chống tạo màng biofilm)
Từ hình 3.13 cho thấy cao chiết ethanol từ cây cà gai leo không có khả năng chống tạo màng biofilm vì eppendorf vẫn còn giữ màu tím của crystal violet Chúng tôi sẽ bổ sung thêm một số phương pháp chiết cao với một số dung môi khác để tiếp tục khảo sát thêm về hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) Hiện nay, chưa có công bố nào về khả năng chống biofilm của cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) Nhiễm trùng liên quan đến màng sinh học đặt ra một thách thức lớn trong điều trị các bệnh truyền nhiễm vì nó là một trong những yếu tố chính trong việc tăng cường khả năng kháng kháng sinh của S aureus và chủng kháng methicillin Do đó, việc phát hiện ra các loại hợp chất có hoạt tính chống tạo màng sinh học mạnh rất cần để chống lại sự gia tăng trên toàn cầu về tình trạng kháng kháng sinh
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 57 chống lại các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh như S aureus và MRSA (Singh và cs., 2020)
12 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ TỪ CAO CHIẾT XẠ KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO ( Solanum procumbens L.)
Mẫu cao chiết của cây cà gai leo và cao chiết xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính mạnh nhất được đem khảo sát khả năng chống tế bào ung thư gan HepG2 tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử- bộ môn Di truyền - Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh
SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 58
Hình 3.17 Kết quả đánh giá khả năng chống tế bào ung thư
Từ kết quả ở hình 3.17 cho thấy giá trị phần trăm ức chế tế bào ung thư gan HepG2 được xỏc định cú giỏ trị trung bỡnh là 10,95 % ở nồng độ 1000 àg/mL Giỏ trị này cho thấy ở nồng độ 1000 àg/mL khả năng ức chế tế bào ung thư của cao chiết cõy cà gai leo không cao, chưa thể hiện được khả năng ức chế tế bào ung thư gan, có thể do chưa chiết được hết hợp chất với dung môi ethanol nên khả năng chống ung thư chưa cao
