KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO Solanum procumbens L....472.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 09 năm
2022 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Mẫu cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour) được thu nhận từ các tỉnh Bình Định, Bình Dương và được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh.
Các chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh-Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh, gồm các chủng: E coli, S aureus, S typhi, P aeruginosa, Staphylococcus aureus kháng methicillin
1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường
⮚ Thiết bị: cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy, máy ly tâm, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, máy vortex, lò vi sóng,
⮚ Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette, micropipette, bông gòn, bình scotte, erlen, que cấy vòng, đũa khuấy, kéo, kẹp sắt, …
⮚ Hóa chất: ethanol 70 o , ethanol 96 o , sodium hypochlorite 5 %, thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet), thuốc nhuộm lugol, thuốc nhộm safranin O
⮚ Môi trường: NA, NB, TSA, MHA, SDA
BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM…
Sơ đồ 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Thu nhận và xử lý mẫu (mẫu rễ, thân, lá)
Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo
Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo
Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo
Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo
Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo
Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo
Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo
Phân lập vi sinh vật nội sinh Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học Định danh tên khoa học
Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ các chủng vi khuẩn nội sinh cà gao leo
Làm thuần trên môi trường
Làm thuần Định danh sinh học phân tử chủng vi khuẩn nội sinh tiềm năng Định danh chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng MRSA mạnh nhất Định danh chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng MRSA mạnh nhất
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào Khảo sát khả năng tiêu huyết của các chủng vi khuẩn nội sinh
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu được thu hái vào lúc sáng sớm, bảo quản lạnh trước và sau khi di chuyển đến nơi làm thực nghiệm
3.1.2 Xử lý mẫu Để loại trừ đất và các vi sinh vật còn bám trên bề mặt, mẫu sau khi được thu thập được tiến hành xử lý như bảng sau:
Bảng 2.1 Quy trình xử lý mẫu
Thời Gian thực hiện (phút)
Rễ, thân, lá của cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) được rửa dưới vòi nước chảy mạnh trong 5 phút, cắt mẫu thành các đoạn nhỏ 2-4 cm để dễ thao tác
2 Ngâm mẫu trong ethanol 70 % và lắc nhẹ 3 7 10
Khử trùng mẫu với Natri hypoclorid
4 Ngâm mẫu trong ethanol 70 % và lắc nhẹ 3 5 5
5 Rửa mẫu với nước cất vô trùng 5 lần
6 Đặt mẫu trên giấy hút ẩm đã được hấp vô trùng
7 Kiểm tra quy trình khử trùng bề mặt
Kiểm tra quy trình khử trùng bề mặt mẫu, nước rửa cuối cùng được trải lên môi trường NA, ủ ở 37 o C, trong 24 giờ để kiểm tra độ vô trùng (Weyens và cs., 2013; Eevers và cs., 2015)
3.1.3 Phân lập vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
Thực hiện phân lập theo 3 phương pháp sau:
⮚ Phương pháp 1 đặt mẫu trực tiếp trên môi trường TSA: Mẫu sau khi đã được xử lý xong, tiến hành đặt mẫu trên môi trường TSA Các đĩa petri đã đặt mẫu được ủ ở 37 o C Sau 3-5 ngày tiến hành quan sát các khóm khuẩn mọc lên từ vị trí mẫu đặt trên đĩa petri
⮚ Phương pháp 2 trải dịch chiết cà gai leo trên môi trường TSA: Các bước thực hiện được tham khảo từ quy trình của Nxumalo và cộng sự (2020) Bước 1: Nghiền nát các mẫu đã được khử trùng trong túi vô trùng và trộn với 1 ml dung dịch đệm phosphat vô trùng (PBS, pH 7,0)
Bước 2: Hút 1 ml dịch chiết trải trên môi trường TSA, ủ ở 37 o C trong tối đa 5 ngày, quan sát sự sinh trưởng của khóm vi sinh vật và làm thuần (Nxumalo và cs., 2020)
⮚ Phương pháp 3 trải dịch chiết cà gai leo trên môi trường bổ sung dược liệu: Thay thế môi trường dinh dưỡng thông thường bằng môi trường có bổ sung dịch xay cây cà gai leo
Bước 1: Chuẩn bị môi trường phân lập, cây cà gai leo sau khi thu nhận sẽ được rửa sạch dưới vòi nước mạnh để loại bỏ đất Sau đó, nghiền mẫu với nước cất bằng máy xay (1:1/v:v), bổ sung 2 % agar và đem hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 20 phút
Bước 2: Nghiền nát các mẫu đã được khử trùng trong túi vô trùng và trộn với 1 ml dung dịch đệm phosphat vô trùng (PBS, pH 7,0)
Bước 3: Hút 1 ml dịch chiết trải trên môi trường đã chuẩn bị ở bước 1, ủ ở 37 o C trong tối đa 5 ngày, quan sát sự sinh trưởng của khóm vi sinh vật và làm thuần
Ghi nhận lại hình dạng, màu sắc, kích thước, … kết quả vi khuẩn nội sinh mọc trên mẫu được phân lập theo 3 phương pháp trên Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA/TSA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về kích thước, hình dạng, màu sắc
- Quan sát đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét về kích thước, hình thái, màu sắc,… của khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh
- Quan sát vi thể: quan sát bằng cách nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100 X Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn
Các bước làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn:
Bước đầu tiên trong quá trình nhuộm Gram là chuẩn bị vết bôi: sử dụng que cấy vô trùng để lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ thạch nuôi cấy (sau 24 giờ cấy) và hòa vào một giọt nước muối sinh lý đặt trên giữa lam kính Sau đó, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để cố định tế bào vi khuẩn trên lam kính.
Bước 2: đặt lam kính đã phết vi khuẩn và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ
U Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô
Bước 3: nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Bước 4: tẩy màu bằng ethanol 96 o , khoảng 15-30 giây (cho đến khi vừa thấy giọt cuối trên lam mất màu), rửa nước, thấm khô
Bước 5: nhuộm bằng dung dịch safranin O trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Bước 6: nhỏ dầu soi và quan sát bằng vật kính 100 X
Kết quả: vi khuẩn Gram dương bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng safranin
Trả lời tiêu bản nhuộm Gram: hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp các vi khuẩn, cách bắt màu của vi khuẩn
3.2 Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh của vi khuẩn nội sinh
⮚ Chuẩn bị dịch ly tâm từ vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo:
Các chủng vi khuẩn nội sinh được nuôi cấy trong môi trường NB, ủ ở 37 o C trong 24 giờ
Ly tâm dịch nuôi vi khuẩn 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu lấy dịch nổi
⮚ Chuẩn bị dịch vi sinh vật gây bệnh:
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh: Vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa, Salmonnela typhi, E coli, MRSA, Staphylococcus aureus được hoạt hóa trong môi trường NA ủ ở 37 o C, trong 24 giờ Pha dịch treo trong nước muối vô trùng và điều chỉnh dịch khuẩn tương ứng với mật độ vi khuẩn là 10 8 CFU/ml (0,5 McFarland)
- Chuẩn bị dịch vi nấm gây bệnh: Vi nấm gây bệnh Trichophyton rubrum,
Microsporum canis được cấy trên môi trường SDA ủ 37 o C trong 7 ngày, pha loãng trong nước muối vô trùng đến mật độ tế bào tương đương 10 6 CFU/ml
Dịch vi khuẩn và vi nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
⮚ Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch:
- Hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh:
Bước 1: Dùng tăm bông vô trùng trải điều dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị trên mặt thạch MHA
Bước 2: Đục 4 lỗ có đường kính 6 mm trên thạch đã trải dịch khuẩn bằng dụng cụ đục lỗ
Bước 3: Dùng micropipet hút 70 μl dịch nổi vi khuẩn nội sinh đã chuẩn bị vào
3 giếng, giếng còn lại làm đối chứng ủ ở 37 o C, đọc kết quả sau 24 giờ
Chứng dương: kháng sinh Ofloxacin
Kết quả kháng vi khuẩn gây bệnh là đường kính của vùng ức chế đo bằng mm (Sharma và cs., 2019)
- Hoạt tính kháng vi nấm gây bệnh:
Bước 1: Dùng tăm bông vô trùng trải điều dịch vi nấm gây bệnh đã chuẩn bị trên mặt thạch SDA
Bước 2: Đục 4 lỗ có đường kính 6 mm trên thạch đã trải dịch vi nấm bằng dụng cụ đục lỗ
Bước 3: Dùng micropipet hút 70 μl dịch nổi vi khuẩn nội sinh đã chuẩn bị vào
3 giếng, giếng còn lại làm đối chứng ủ ở 37 o C, đọc kết quả sau 5-7 ngày
Kết quả kháng vi nấm gây bệnh là đường kính của vùng ức chế đo bằng mm (Kumar và cs., 2009)
Thử nghiệm kháng vi sinh vật gây bệnh được lặp lại 3 lần
3.2.2 Khảo sát khả năng tiêu huyết của vi khuẩn nội sinh
Các chủng vi khuẩn nội sinh được cấy trên môi trường thạch BA bổ sung 10 % máu cừu Ủ nuôi trong 18-24 giờ ở 37°C
Sau khi ủ quan sát khả năng tiêu huyết α (vùng xanh xung quanh khuẩn lạc), tán huyết β (vùng sáng xung quanh khuẩn lạc) hoặc tán huyết γ (không có vùng xung quanh khuẩn lạc)
3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh
Theo phương pháp của Nxumalo và cộng sự (2020):
