Phân lập và xá định một số đặ điểm sinh họ ủa xạ khuẩn nội sinh trên ây màng tang (litsea ubeba (lour ) pers )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM NGỌC LÂM PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2017 1708330003671079e0020-c260-4ec9-90e2-28a5f2ae2ea2 1708330003671e0f3d991-f06c-4437-80fc-038d0ae15180 17083300036710a2eb4c3-beb5-4256-82c3-864393903547 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM NGỌC LÂM PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHÍ QUYẾT TIẾN PGS.TS VŨ THU TRANG Hà Nội - Năm 2017  Hc viên: Phạm Ngọc Lâm i hc Bách Khoa Hà Ni Chuyên ngành: Cơng ngh Sinh hc ng dn : TS Phí Quyết Tiến PGS.TS Vũ Thu Trang Tên lu―Phân lnh mt s m sinh hc ca x khun ni sinh Màng tang (Litsea cubeba  Nt trình nghiên cu lun i s ng dn ch bo tn tình cng dn hành nghiên cu lut cách trung thc, toàn b ni dung báo cáo lun c trc tip thc hin Tt c nghiên cu không chép t báo cáo khoa hc, lua bt c tác gi Học viên Phạm Ngọc Lâm I  Đối với học viên cao học, luận văn tốt nghiệp cơng trình khoa học nhỏ mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành người đường ứng dụng kiến thức học vào thực tiễn Trước hết, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam PSG.TS Vũ Thu Trang, Phó trưởng Khoa Cơng nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức q báu để giúp tơi hồn thành luận văn Trong thời gian thực tập làm việc phịng Cơng nghệ Lên men - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, nhận quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn, kĩ thuật động viên chân thành tập thể cán phịng Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên khuyến khích tơi suốt trình học tập để đạt kết ngày hôm Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên Phạm Ngọc Lâm II  STT Các kí hiệu/ chữ viết tắt Ý nghĩa DNA Deoxyribonucleic acid FISH Fluorescent insitu hybridization IAA Indole acetic acid IC 50 Inhibitory concentration 50% - Nng  c ch ng th KTCC Khut KTKS Khun ty khí sinh MIC Minimum inhibitory concentrationN c ch ti thiu NRP Nonribosomal peptide NRPS Nonribosomal peptide synthetase 10 PKS Polyketide synthase 11 PKS-I Polyketide synthase type I 12 PKS-II Polyketide synthase type II 13 RNA Ribonucleic acid III  Bng 1.1 Mt s hot chc tìm thy  x khun nc liu .10 Bng 1.2 Mt s loài x khun ni sinh hic phân lp t c liu .16 Bng 2.1 Trình t cp mc s dng phn ng PCR khui gen 16S rRNA 32 Bng 3.1 m hình thái ca chng x khun nn hình phân lp t mu Màng tang ti Thanh Hóa, Hà Ni Phú Th .35 Bng 3.2 Kh t kinh ca mt s chng x khun 45 Bng 3.3 Kh t kinh ca chng MPT28 .51 Bng 3.4 Màu sc khun lc ca chng MPT28 ni cng 52 Bng 3.5 Kh ng hóa ngua chng x khun MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cy  30°C 53 Bng 3.6 Nng  NaCl, nhi , pH thích h   ng ca chng MPT28 .54 Bng 3.7  ng ca trình t gen 16S rRNA ca x khun MPT28 vi trình t ng ca chng x khuc  .56 IV D Hình 1.1 B v trí 34 vùng có s ng thc vt cao vic ly m phân lp x khun ni sinh .15 Hình 3.1 Hình nh khun lc chng x khun ni sinh lng ISP5 (a), SPA (b), HV (c), TA (d), STA (e), CA (f) sau tun ni cy 34 Hình 3.2 S phân b x khun ni sinh b phn ca Màng tang: s liu tng s ca 03 vùng (a); s liu thng kê theo tng vùng (b) 38 Hình 3.3 S phân b ca x khun ni sinh long phân lp khác 39 Hình 3.4 T l chng x khun ni sinh phân b theo nhóm màu sc khun ty  Thanh Hóa, Hà Ni Phú Th 41 Hình 3.5 Bi thng kê kh t kinh ca 143 chng x khun ni sinh 42 Hình 3.6 Kh t kinh ca 47 chng x khun ni sinh (XKNS) 43 Hình 3.7 Hot tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) ca mt s chng x khun ni sinh 44 Hình 3.8 T l chng x khun kháng nht mt chng vi sinh vt kinh phân b  Thanh Hoá, Hà Ni Phú Th 47 Hình 3.9 T l chng kháng nht mt vi sinh vt kinh phân b theo v trí r, thân, 49 Hình 3.10 Hình thái khun lc (a) trêng ISP1 b mt chui bào t (b) i kính hin vi quang h i 7.500 ln ca chng MPT28 .52  DNA tng s (a) sn phm PCR (b) gel agarose 1,0% .55 Hình 3.12 Cây phát sinh chng loi ca chng MPT28 .57 V  L .2 LI C ii DANH MC CÁC KÍ HIU, CÁC CH VIT TT iii DANH MC CÁC BNG iv DANH MC HÌNH V  TH .v MC LC vi M U .1 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật dƣợc liệu 1.1.1 Khái nim x khun ni sinh 1.1.2  ni sinh ca x khun thc vt 1.1.3 ng dng ca x khun ni sinh thc vt .4 1.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 11 1.2.1 p x khun ni sinh 11 1.2.2 ng phân lp .13 1.2.3 Các nghiên cu ci tin hiu qu phân lp 13 1.3 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh thực vật 14 1.3.1 ng thc vt - ngun ti s ng x khun ni sinh 14 1.3.2 S ng ca x khun np chng loi 18 1.4 Khả sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu 21 1.4.1 Kháng sinh t x khun ni sinh 22 1.4.2 Các gen tham gia vào trình tng hp kháng sinh hp cht i th cp 23 1.5 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh thực vật Việt Nam .24 1.6 Cây Màng tang tiềm khai thác xạ khuẩn nội sinh 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1.1 Mu Màng tang, chng ging vi sinh vt .28 2.1.2 Hóa cht, enzyme, thit b nghiên cu 28 VI 2.1.3 2.2 ng nuôi cy .29 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Thu thp chun b mu .29 2.2.2 Phân lp x khun ni sinh mu Màng tang 29 2.2.3 Sàng lc chng x khun có hot tính kháng vi sinh vt kinh 30 2.2.4 Nghiên cm sinh hc ca chng x khun MPT28 .30 2.2.5 Phân loi chng x khun MPT28 da phân tích trình t gen 16S rRNA 32 2.1.1  lý s liu 33 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang vùng sinh thái khác 34 3.1.1 Phân lp x khun ni sinh Màng tang ti Thanh Hóa, Hà Ni Phú Th 34 3.1.2 3.2 S phân b x khun ni sinh Màng tang .37 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn nội sinh 42 3.2.1 Kh t kinh ca chng x khun phân b theo vùng sinh thái khác 47 3.2.2 Kh t kinh ca chng x khun phân b theo v trí .49 3.3 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn MTP28 .50 3.3.1 m sinh hc chng x khun MPT28 51 3.3.2 Phân loi da xánh trình t gen 16S rRNA ca chng x khun MPT28 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 G B 59 TÀI LIU THAM KHO 60 PH LC 71 VII  S xut hin ca nhng vi khun gây bnh kháng nhiu loi kháng sinh vi s lây lan rng ln ca nghiêm trng thu hút mi u ca cng S a nhng tác nhân gây b cho thy nhiu loi thuc kháng sinh hi li thi khơng cịn hiu qu Trong  nhng thành công ca gii pháp thay th  tng hp hóa hc vn cịn rt hn ch  o mt khong tr   ng tìm loi thuc mi Vì vy, cn nay, nhà khoa hc doanh nghip c phm th gii vn khơng ngng tìm kim ngun hp cht t  phát trin loi kháng sinh mi nhm khc phc tình trng kháng thun X khung quan tâm nghiên cu ca rt nhiu nhà khoa hc th gii v   ng hot cht sinh hc c  c bit cht kháng sinh Các loài x khun ni sinh sng mô thc vt to mt s hp chy s phát trin ca ch giúp chúng tn tc ch Trong s hp cht này, cht có hot tính sinh h  hot tính kháng khung oxy hóa, chng st rét ha hn nhiu ting dng y hc Vic phân lp x khun ni sinh sàng lc chng x khun có kh ng hp cht có hot tính kháng khun mng nghiên cu ti Cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) mt loi c liu phân b  c ct Nam Chúng cha nhiu tinh du mà thành phn citral, có tác dng kháng khung oxy hóa Mc dù tinh dc s dng nhiu cuc sn s ng nghiên cu v x khun ni sinh Màng tang kh n ca chúng ti Vit Nam vn rt hn ch Xut phát t nhng trên, thc hin nghiên cu: “Phân lập xác định số đặc điểm sinh học xạ khuẩn nội sinh Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)”