Phân lập và xá định một số đặ điểm sinh họ ủa xạ khuẩn nội sinh trên ây màng tang (litsea ubeba (lour ) pers )

Vũ Thu Trang, Phó trưởng Khoa Công ngh ệ thực phẩm, Viện Công ngh Sinh h c và Công ngh ệọệ Thực phẩm – Trường Đại h c Bách Khoa Hà ọN i ộ đã tận tình hướng d n và truyẫền đạt nh ng ki n

Hà N - ộ i Năm 201 7

1708330003671079e0020-c260-4ec9-90e2-28a5f2ae2ea2

MÀNG TANG ( Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

NGƯỜI HƯỚ NG D N KHOA H C Ẫ Ọ :

TS PHÍ QUY T TI N Ế Ế PGS.TS VŨ THU TRANG

Hà N - ộ i Năm 201 7

H ọ c viên

Phạ m Ng c Lâm ọ

ngườ i trên con đư ng ng d ng nh ng ki n th c đã đư c h c vào th c ti n ờ ứ ụ ữ ế ứ ợ ọ ự ễ

Viện trưở ng Vi n Công ngh Sinh h c – ệ ệ ọ Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh ệt ệ ọ ệViNam và PSG.TS Vũ Thu Trang, Phó trưởng Khoa Công ngh ệ thực phẩm, Viện

N i ộ đã tận tình hướng d n và truyẫ ền đạt nh ng ki n thữ ế ức quý báu để giúp tôi hoàn

thành luận văn này

s ự chỉ ả ậ b o t n tình v ề chuyên môn, kĩ thuật và s ng viên chân thành c a t p th ự độ ủ ậ ể

Tôi xin được g i l i cử ờ ảm ơn đến Ban lãnh đạo Vi n Công ngh Sinh h c và ệ ệ ọ

Học viên

Phạ m Ng c Lâm ọ

STT Các kí hiệ u/ ch vi t tắt ữ ế Ý nghĩa

rRNA 32

D 

l p x khu n n i sinh 15   

L 2

LI C ii

DANH MC CÁC KÍ HI U, CÁC CH T TT iii  VI DANH MC CÁC BNG iv

DANH MC HÌNH V  TH v   

MC LC vi

M  U 1

Chương I TỔ NG QUAN TÀI LI U Ệ 3

1.1 X ạ khuẩn nộ i sinh trên th ự c vật và cây dược liệ 3 u 1.1.1 Khái nim x khu n n  i sinh 3

1.1.2   n i sinh ca x khu n trong th c vt 4

1.1.3 ng d ng c a x khu n n i sinh trên th  c vt 4

1.2 Phân l ậ p xạ khuẩn nộ i sinh 11

1.2.1 p x khu n n  i sinh 11

1.2.2 ng phân l p 13 

1.2.3 Các nghiên c u c i tin hi u qu phân l p 13   

1.3 S ự đa dạng xạ khuẩn nộ i sinh trên th c v t ự ậ 14

1.3.1 ng thc vt - ngu n ti    s ng x khu n n i sinh 14    1.3.2 S  ng c a x khu n n   p và ch ng lo i 18  

1.4 Khả năng sinh tổ ng h p kháng sinh c a x ợ ủ ạ khuẩ ộ n n i sinh trên cây d ượ c liệ 21 u 1.4.1 Kháng sinh t  x khu n n i sinh 22

1.4.2 Các gen tham gia vào quá trình t ng h p kháng sinh và các h p ch   t i th  c p 23

1.5 Tình hình nghiên c u x ứ ạ khuẩn nộ i sinh trên th ự c vật ở Việ t Nam 24

1.6 Cây Màng tang và ti ềm năng khai thác x ạ khuẩ ộ n n i sinh 25

Chương II VẬ T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 V ậ t liệ u nghiên c u ứ 28

2.1.1 M u Màng tang, ch ng gi ng vi sinh v t 28    

2.1.2 Hóa cht, enzyme, thit b nghiên c u 28 

2.1.3 ng nuôi c y 29 

2.2 Phương pháp nghiên cứ 29 u 2.2.1 Thu thp và chu n b m u 29   

2.2.2 Phân l p x khu n n i sinh trên m u cây Màng tang 29     

2.2.3 Sàng l c các ch ng x khu n có ho t tính kháng vi sinh v     t kinh 30  2.2.4 Nghiên cm sinh hc ca ch ng x khu n MPT28 30   

2.2.5 Phân lo i ch ng x khu n MPT28 d    a trên phân tích trình t gen 16S  rRNA 32

2.1.1 lý s li u 33

Chương III KẾ T QU VÀ TH O LU N Ả Ả Ậ 34

3.1 Phân lập và đa dạ ng x ạ khuẩn nộ i sinh trên cây Màng tang t i các ạ vùng sinh thái khác nhau 34

3.1.1 Phân l p x khu n n i s    inh trên cây Màng tang ti Thanh Hóa, Hà Ni và Phú Th 34 

3.1.2 S phân b x khu n n    i sinh trên cây Màng tang 37

3.2 Khả nă ng kháng vi sinh v t ki ậ ểm đị nh c a các ch ng x ủ ủ ạ khuẩn nội sinh 42  3.2.1 Kh t kinh c a các ch ng x khu n phân b      theo các vùng sinh thái khác nhau 47

3.2.2 Kh t kinh c a các ch ng x khu n phân b      theo v trí trên cây 49

3.3 Đặc điể sinh họ m c và phân lo ạ i củ a ch ủ ng xạ khuẩ n MTP28 50

3.3.1 m sinh h c ch ng x khu n MPT28 51    

3.3.2 Phân loi da trên xánh trình t gen 16S rRNA c a ch ng x khu n      MPT28 55 K T LU N VÀ KI Ế Ậ Ế N NGHỊ 58

G B 59 

TÀI LIU THAM KH O 60 

PH  L C 71

nay

c a x ủ ạ khuẩ ộ n n i sinh trên cây Màng tang ( Litsea cubeba (Lour.) Pers.) ”

M c tiêu c ụ ủa đề tài: Phân la ch n các ch ng x khu n n    i

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

tính kháng sinh nói riêng

1.1.2 

c nh ng l i ích mà x khu n n i sinh mang l i, vi c tìm hi u v m

gi , các ch ng này ch y u thu nh n t cây       Artemisia herba-alba và Echinops

RAW 264.7 Tác dng c ch ph  thuc vào n cht và c ch s hình thành   

vi nghiên c u phân l p x khu n n i sinh và sàng l c các h p ch t có ho t tính c         sinh hc t chúng

Bên c nh kh   ng h p các ch ng, x khu n

m m c a bào t    [22, 25] K t qu c a El-Shatoury c ng s        c

indole là 3-acetonylidene-7-prenylindolin-2-one, axit

cassiicola và F oxysporum  v i các giá tr  IC50 trong kho ng 30,55-89,62 µg/ml 

lá

Kibdelosporangium sp., Kitasatosporia sp., Nocardia sp., Nocardioides sp., Promicromonospora sp., Pseudonocardia sp., Streptomyces sp

Siderophores, Chitinase

lá

Actinopolyspora sp., Micromonospora sp., Saccharopolyspora sp., Streptomyces sp

Siderophore (hydroxamate và catechol), Indole acetic acid (IAA)

TP-Demethylnovobioc, Novobiocin, 6-Prenylindole, Pteridic acids A-B

Ring n p (Alpinia 

galanga)

R  Microbispora sp., Micromonospora sp., Nocardia sp.,

lá

Streptomyces setonii, Streptomyces sampsonii, Streptomyces sp Q21, Streptomyces sp MaB- QuH-8

Celastramycins A

và B

[78]

1.2 P hân lập xạ khuẩn nội sinh

b m t b ng cách s d ng m t ho c nhi u ch t kh trùng khác nhau Hóa ch          c

1.2.2 

vitamin B agar (HV) [39], tap water-yeast extract (TWYE) [17], yeast extract

axit amin (arginine, asparagine, và proline) làm ngu    

c mng l n x khu n thu c chi Promicromonospora,    

lc 14 ch ng v i ti  ng h p kháng sinh cao t 300 m u th c v    t

sinh [6, 70, 110]

sinh hc phân l p t khu v c này [66]   ng s  

Vùng lấy

Vị trí

Cát Lâm-

 Nhân sâm (Panax

ginseng) Leifsonia ginsengi sp nov Vân Nam-

 Sambucusadnata) Glycomyces sambucus sp nov Thân

Cercidiphyllum

japonicum Rhodococcus cercidiphylli sp nov Lá

Dietzia cercidiphylli sp nov 

Schima sp.) Dietzia schmiae Thân

Maytenus

austroyunnanensis) Saccharopolyspora endophyticanov sp

Glycomyces mayteni sp nov

Streptomyces mayteni sp nov

Jiangella alba sp nov

Pseudonocardia tropica sp nov Thân



(Trypterygium wilfordii) Kineosporia mesophila sp nov Thân Trypterygium Saccharopolyspora tripterygii sp nov Thân

(Artemissia annua L.) Nonomuraea endophytica sp nov Thân

Pseudonocardia artemisiae sp nov

Streptomyces artemisiae sp nov

Streptomyces endophyticus sp nov

 Artemissia argyi) Glycomyces artemisiae sp nov 

c   d u v h c v trong m t s li   th t   ng sinh h c, vì th , m  t

c u 



y u (n = 277), theo sau là  Microbispora (n = 14), Nocardia (n = 8) và

Streptomycetaceae (40%), Streptomycetaceae (27%), Thermomonosporaceae

thc này

d ng l n nh t c a x khu n n i sinh di n ra khu v nhi         c i và khu v c có nhi t

1.4.1 K nh

n m gây b nh khác [20] G  - m t polyketide kháng khu c

kháng sinh

1.4.2 



kháng sinh nhóm macrolide (erythromycin, azithromycin), nhóm polyen

ph c hi u, k t h p các chu i axit amin s n có trong m t trình t thành m       t

Salam và c ng s   c 98 ch ng x khu n n i sinh    

1.6 Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh

 Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris, Colletotrichum

nn S aureus và n m gây b nh (  A alternata và C nicotianae) hai ,

nh Th Trang và c ng s    c 32 ch ng x khu n   

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

phenol, methanol, isoamylalcohol, EtBr, glycerol, ethanol, chloroform, ampicillin,

2.2.3  nh

- Kh   tan: c t ng ISP2, ISP5 S c t  

-Kh   d ng ngu n cacbon: X khu  c nuôi nhi  -3028 oC

D-Fructose, L-Rhamnose D-Saccharnose, D-Sorbitol, D-Trehalose Sau 7-14 ngày

- Kh   d ng ngu khuc nuôi nhi  28-30oC trên

-Valine, L-Isoleucin, L-Tryptophan, L-Leucin, 2-amino-2-hydroxy-methyl-1,3

lâm Khoa h c và Công ngh  Vit Nam Trình t gen 16S rR c so sánh vi

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại các vùng sinh thái khác nhau



Nhiu nghiên c u trên th gi i kh   nh, m    ng c a các ch ng x   

Ghi chú: MPT: Màng tang Phú ThTH: Màng tang Thanh Hóa

a b

cao (>50%) trong t ng s x khu n n i sinh phân l p; do v y, vi       i thành

chi m t l l t 20,9%, 9,0% và không phát hi n x khu n thu c nhóm màu    

3.2 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nộ i sinh

kháng P vulgaris CNLM (13,3%); 9 ch ng kháng  S enterica ATCC 14028 (6,3%);

x khu n n i sinh thu c chi     Streptomyces trên m t s   c li u Trung Qu c,   

* S u th hiố liệ ể ện đường kính vòng kháng khu n c a 03 thí nghiẩ ủ ệm độ ậc l p

48

49

3.2.2 trí trên cây

50

53

Nguồn cacbon

(1,0%, w/v)

Khả năng sinh trưở ng

Nguồn nitơ (1,0%, w/v)

Khả năng sinh trưở ng

b Nồng độ muối, pH, nhiệ ộ t đ thích hợp cho sinh trưởng c a x ủ ạ khuẩn

55

3.3.2.1 Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn MPT28

3.11b

chu n (Thermo scientific, 

Mn phm PCR s d ng khuôn DNA  

là b gen c a ch ng   MPT28

57

KIẾ N NGH Ị

1 Nghiên c u x nh c u trúc hoá h c c a h p ch t có ho t tính kháng khu n c       a

2 Ti p t c nghiên c u t       u ki n lên men nh m thu  

59



1 Pham Ngoc Lam, Dang Thi Thuy Duong, Vu Thi Hanh Nguyen, Chu Ky Son, Vu

p.160-168

60



Tiếng Việt

12(2) tr 1-7

tr 1886-1893

Tiếng Anh

6          from the ethnomedicinal plants of Southern India: antioxidant activity and

          J Pure Appl

61

biologically active endophytic actinomycetes isolated from upper Amazonian

10 

18             

19          

62

improvement of a novel antimycotic agent, saadamycin, against dermatophytes and

activities of Actinomycetes inhabiting Achillea fragrantissima (Family:

diversity in endophytic actinomycetes from wild Compositae plant species at South

-three endophytic actinomycetes in relation to plant growth promotion and biological

actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant

26          

27 Finking R and M.A (200

63

31 Opredelitel’aktinomitsetov (Manual on

Determination of Actinomycetes

32          e       

analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine ac Appl

34 Bergey’s manual of systematic

pp 137-147

36 microorganisms, In: Schulz B, Boyle C, Sieber TN (eds) Soil biology, Microbial

37            

39            se J Ferment

65

and characterization of culturable endophytic actinobacteria associated with

           

60 Machavariani N.G., Ivankova T.D., Sineva O.N., Terekhova L.P (2014),

61 

Afr

62           antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of

63 Matsunaga S and F      

64 persistent populations of a major new marine actinomycete taxon in ocean

66

67            endophytic actinomycetes from medicinal plants of the Moscow region, Russia

68           Kurtböke (ed.) Selective isolation of rare actinomycetes, Queensland Complete

       

72          inhibitory activity on alternaria brassicicola of endophytic actinomycetes from

76 natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic

67

577-582

79 

Ngoc-Tung Quach., Quyet-Tien Phi., Manik Prabhu Narsing Rao., Angélique Fontana., Samira Sarter., and Wen-    Associated with Dracaena cochinchinensis Lour.: Isolation, Diversity, and Their

mediated delignification of paddy straw for improved enzymatic saccharification

         Thailand, their phytohormone production potential and plant growth promoting