Phân lập, tuyển họn, khảo sát đặc điểm chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase từ bã dong riềng sau khi trồng nấm và ứng dụng cho sản xuất phân bón

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** NGUYỄN PHƢƠNG ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG NẤM VÀ ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT PHÂN BÓN LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HÀ NỘI, 2018 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057204842971000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** NGUYỄN PHƢƠNG ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG NẤM VÀ ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT PHÂN BĨN Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐẶNG MINH HIẾU HÀ NỘI, 2018 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè đồng nghiệp Trước tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Minh Hiếu PGS.TS Trần Liên Hà công tác Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, thầy cô người hướng dẫn, giúp đỡ tơi tận tình, chu đáo suốt trình nghiên cứu thực luận văn Đồng thời cảm ơn sinh viên Trương Thị Phượng – K58 khoa Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tơi thực q trình nghiên cứu luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, đồng nghiệp gia đình giúp đỡ suốt thời gian vừa qua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nôi, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Phương Anh LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu chúng tơi thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Liên Hà TS Đặng Minh Hiếu công tác trường Đại học Bách khoa Hà Nội, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc phịng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Phương Anh LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .3 Tình hình sử dụng dong riềng Việt Nam Thực trạng môi trường làng nghề sản xuất miến dong .4 Khả tái sử dụng bã thải dong riềng 3.1 Thành phần bã thải 3.2 Những nghiên cứu tái sử dụng bã thải dong riềng Enzyme cellulase vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 10 4.1 Enzyme cellulase 10 4.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 13 Tình hình sử dụng phân bón hữu Việt Nam 14 Vai trò vi khuẩn phân giải cellulose phân bón hữu 16 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng phân bón hữu 17 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Đối tượng nghiên cứu 19 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 19 2.1 Thiết bị dụng cụ 19 2.2 Hóa chất mơi trường 19 Phương pháp nghiên cứu .21 3.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn 21 3.2 Phương pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase 21 3.3 Định danh vi khuẩn 23 3.3.1 Phương pháp định danh dựa đặc tính sinh lý, sinh hóa 23 3.3.2 Định danh phương pháp sinh học phân tử 25 3.4 Phương pháp xác định khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 26 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển chủng .26 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 27 4.2 Ảnh hưởng pH 27 4.3 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống 27 4.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc .27 4.5 Ảnh hưởng hàm lượng pepton 27 Ứng dụng vi khuẩn ủ phân bón hữu 27 5.1 Quy trình thử nghiệm ủ phân bón 27 5.2 Phương pháp phân tích số tiêu phân bón 28 5.2.1 Xác định nhiệt độ 28 5.2.2 Phương pháp xác định độ ẩm 28 5.2.3 Phương pháp xác định pH .28 5.2.4 Phương pháp xác định nitơ tổng phân bón 28 5.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng cacbon hữu phân bón 29 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 Kết phân lập 31 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase .32 2.1 Tuyển chọn dựa phương pháp cấy chấm điểm .32 2.2 Tuyển chọn dựa phương pháp đục lỗ thạch 34 2.3 Tuyển chọn dựa phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase 34 Định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn .35 3.1 Đặc tính hình thái sinh lý – sinh hóa chủng NDK5 35 3.2 Định danh sinh học phân tử 36 Xác định khả sinh chất kích thích sinh trưởng 3-indol acetic acid (IAA) 38 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .39 5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 39 5.2 Ảnh hưởng pH 41 5.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống .42 5.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc .43 5.5 Ảnh hưởng nồng độ pepton 44 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ứng dụng vi khuẩn ủ phân bón hữu 45 6.1 Độ sụt giảm thể tích 46 6.2 Nhiệt độ 47 6.3 pH 48 6.4 Độ ẩm .48 6.5 Hàm lượng Cacbon tổng số 49 6.6 Hàm lượng Nitơ tổng số 49 KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC BẢNG 58 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chú thích Ký hiệu BOD Biochemical Oxygen Demand CMC Cacboxyl methyl cellulose C/N Tỷ lệ Cacbon / Nitơ COD Chemical Oxygen Demand DNA Deoxyribonucleic Acid DNS 3,5-dinitrosalicylic IAA Acid 3-indol acetic PCR Polymerase Chain Reaction TCCP Tiêu chuẩn cho phép TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN Quy chuẩn Việt Nam LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Nguyên liệu đầu vào bã thải rắn làng nghề Dương Liễu .5 Bảng 1.2 Thành phần bã dong Bảng 1.3 Khả tái sử dụng bã thải rắn làng nghề Dương Liễu Bảng 3.1: Các chủng phân lập từ nguồn bã dong riềng sau trồng nấm khác 31 Bảng 3.2: Khả phân giải cellulose chủng chọn lọc thông qua phương pháp cấy chấm điểm 33 Bảng 3.3: Khả phân giải cellulose qua phương pháp đục lỗ thạch 34 Bảng 3.4: Hoạt lực enzyme chủng tuyển chọn 35 Bảng 3.5: Đặc tính sinh lý - sinh hóa chủng NDK5 .36 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hiện trạng mơi trường làng nghề sản xuất miến dong Hình 1.2 Mơ hình enzyme cellulase 11 Hình 1.3 Ba loại phản ứng xúc tác cellulose 12 Hình 3.1: Các chủng tuyển chọn theo phương pháp cấy chấm điểm .33 Hình 3.2: Các chủng tuyển chọn theo phương pháp đục lỗ thạch 34 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chuỗi bào tử chủng vi khuẩn NDK5 .35 Hình 3.4: Sản phẩm PCR chủng NDK5 (Với: -ve:mẫu nước; +ve: chủng E.coli) 37 Hình 3.5: Tương quan cấu trúc 16S rRNA chủng NDK5 với chủng khác 38 Hình 3.6 Thử định tính khả sinh IAA chủng NDK5 39 Hình 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 theo thời gian 40 Hình 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 48 .40 Hình 3.9: Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .41 Hình 3.10: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 48 42 Hình 3.11: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .42 Hình 3.12: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 48 .43 Hình 3.13: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .44 Hình 3.14: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 24 44 Hình 3.15:Ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 24 45 Hình 3.16: Sự thay đổi thể tích q trình ủ .47 Hình 3.17: Sự thay đổi nhiệt độ trình ủ 47