(Luận văn) phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang tại tỉnh phú thọ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - Nguyễn PhúTâm lu PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH an KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG va n TANG TẠI TỈNH PHÚ THỌ gh tn to p ie Chuyên ngành vi sinh vật học d oa nl w Mãsố: 60420103 nf va an lu LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC lm ul NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC z at nh oi TS PhíQuyết Tiến z m co l gm @ an Lu n va HÀ NỘI - 2016 ac th si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu vàkết đƣợc công bố luận văn làhồn tồn trung thực, xác chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác HàNội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên lu an n va Nguyễn PhúTâm p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS PhíQuyết Tiến chủ nhiệm đề tài VAST04.07/16-17 hết lòng giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập, nghiên cứu để hồn thành luận văn tốt nghiệp Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn tới thầy, côcủa trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái vàTài Nguyên sinh vật thầy, cô Viện Công nghệ sinh học nhiệt tì nh giảng dạy cho tơi suốt thời lu an gian tham gia khóa học n va Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên, NCS tn to Quách Ngọc Tùng vàcác cán phịng Cơng nghệ lên men – Viện Cơng nghệ gh sinh học bảo nhiệt tình, giúp đỡ tạo điều kiện để thực p ie luận văn tốt nghiệp w Cuối cùng, xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, d tập oa nl người giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện cho tơi suốt qtrì nh học lu nf va an HàNội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên z at nh oi lm ul z Nguyễn PhúTâm m co l gm @ an Lu n va ac th si iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật dƣợc liệu 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh lu an 1.1.2 Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh n va 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật tn to 1.1.3.1 Kháng ung thƣ, kháng viêm p ie gh 1.1.3.2 Kiểm soát sinh học 1.1.3.3 Một số dƣợc chất khác từ xạ khuẩn nội sinh 1.1.4 Tình hì nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh w oa nl 1.1.4.1 Tì nh hình nghiên cứu giới d 1.1.4.2 Tì nh hình nghiên cứu Việt Nam 10 lu nf va an 1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh thực vật 12 1.3 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu15 lm ul 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 15 z at nh oi 1.3.2 Các gen tham gia vào quátrình tổng hợp kháng sinh vàcác hợp chất trao đổi thứ cấp 17 z 1.3.2.1 Gen chức pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa gm @ vòng thơm 17 l 1.3.2.2 Gen chức nrps 18 m co 1.3.2.3 Đánh giá đa dạng gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS 18 nhóm an Lu 1.3.3 Chất kháng sinh kháng sinh điều trị ung thƣ anthracycline 20 n va ac th si iv 1.4 Cây Màng tang vàtiềm khai thác xạ khuẩn nội sinh Màng tang 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật 24 2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 24 2.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Lấy mẫu Màng tang 25 2.2.2 Phƣơng pháp xử lýbề mặt mẫu 25 lu an 2.2.4 Khuếch đại gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS xạ khuẩn 26 n va 2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 26 tn to 2.2.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả sinh p ie gh melanin 26 2.2.5.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử vàbề mặt bào tử 27 w 2.2.5.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 27 oa nl 2.2.6 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa phân tích trì nh tự gen d 16S rDNA 28 lu nf va an CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang tỉnh PhúThọ 30 lm ul 3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang 32 z at nh oi 3.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận Màng tang 32 3.2.2 Đa dạng xạ khuẩn Màng tang theo môi trƣờng phân lập 33 z 3.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 34 gm @ 3.3 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 35 l 3.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 35 m co 3.3.2 Xác định gen mãhóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) an Lu nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 39 n va ac th si v 3.3.3 Khả sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 41 3.4 Đặc điểm sinh học vàphân loại chủng xạ khuẩn MPT28 42 3.4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 43 3.4.1.1 Đặc điểm hình thái vàbề mặt chuỗi bào tử 43 3.4.1.2 Đặc điểm sinh hóa 44 3.4.1.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả sinh trƣởng xạ khuẩn 45 3.4.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT28 46 lu an 3.4.2.1 Khuếch đại gen 16S rDNA 46 n va 3.4.2.2 Giải trì nh tự đoạn gen 16S rDNA 46 tn to CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 gh 4.1 Kết luận 48 p ie 4.2 Kiến nghị 48 PHỤ LỤC 57 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc số kháng sinh điển hì nh thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI vàIDA 21 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập số môi trƣờng đặc hiệu sau tuần nuôi cấy 30 Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố phận Màng tang 32 Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh Màng tang đƣợc phân lập loại môi trƣờng khác 33 lu an Hình 3.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu 35 n va Hình 3.5 Hoạt tí nh kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) tn to Bacillus cereus ATCC 11778 (B) chủng xạ khuẩn nội sinh 37 gh Hình Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II số chủng xạ p ie khuẩn nội sinh đại diện 39 w Hình Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps số chủng xạ khuẩn nội oa nl sinh đại diện 40 d Hình Hình thái khuẩn lạc (A) môi trƣờng ISP1 vàbề mặt chuỗi bào lu nf va an tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần chủng MPT28 44 lm ul Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel z at nh oi agarose 1,0% 46 z m co l gm @ an Lu n va ac th si vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu giới loài xạ khuẩn nội sinh thực vật Bảng 1.2 Xạ khuẩn đƣợc phân lập từ dƣợc liệu 14 Bảng 1.3 Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 16 Bảng 1.4 Tần xuất xuất gen pks-I, nrps phân nhóm xạ khuẩn khác .19 Bảng 2.1 Trì nh tự cặp mồi đƣợc sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA……………………………………………………………… 28 lu an Bảng 3.1 Đặc điểm hì nh thái chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân n va lập từ mẫu Màng tang .31 tn to Bảng 3.2 Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 25 gh chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Màng tang 36 p ie Bảng 3.3 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn 37 w Bảng 3.4 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS khả sinh oa nl anthracycline 14 chủng xạ khuẩn nội sinh 41 d Bảng 3.5 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng MPT28 42 lu nf va an Bảng 3.6 Màu sắc khuẩn lạc chủng MPT28 nuôi cấy môi trƣờng khác 43 lm ul Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn carbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 z at nh oi sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C 44 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng z chủng MPT28 45 @ Bảng 3.9 Trì nh tự gen mãhóa 16S rDNA chủng MPT28 47 m co l gm an Lu n va ac th si viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT an n va Tên đầy đủ ACCd Aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase ACP Acyl carrier protein AT Acyl transferase CA Citrate acid-agar DAB Deacetil baceatin DNA Deoxyribonucleotide acid DNR Daunorubicin DOX1 Doxorubicin EPI Epirubicin 10 HGT Horizontal gene transfer 11 HV Humic acid-agar 12 IAA Indol-3-acetic acid 13 IDA Idarumycin tn to Từ viết tắt gh lu STT KS Ketosynthase w MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 16 NaOCl Sodium hypochlorite 17 NRPS 18 PKS 19 PKS-I 20 PKS-II Polyketide synthase II 21 RNA Ribonucleic acid 22 RA Raffinose-histidine agar 23 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 24 VSV Vi sinh vật d oa nl 15 p ie 14 nf va an lu Nonribosomal peptide synthetase Ppolyketide synthase z at nh oi lm ul Polyketide synthase I z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỞ ĐẦU Vi khuẩn gây bệnh có khả kháng thuốc kháng sinh vấn đề nghiêm trọng vàthu hút mối quan tâm lớn cộng đồng Vìvậy, việc nghiên cứu, lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ƣu tiên hàng đầu nhàkhoa học vàcác công ty dƣợc phẩm giới Cho đến nay, nhàkhoa học khơng ngừng tìm kiếm nguồn hợp chất tự nhiên khác để phát triển loại thuốc kháng sinh nhƣ loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu tác dụng phụ tới sức khỏe ngƣời bệnh số thuốc tổng hợp hóa học gây Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật nguồn tự nhiên quan lu trọng điều trị bệnh gây vi sinh vật vàhỗ trợ điều trị chống an n va ung thƣ Chẳng hạn, Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) làcây bụi tn to thuộc họ Lauraceae, Màng tang giàu tinh dầu, lƣợng tinh dầu tối gh đa làkhoảng 5% trọng lƣợng tƣơi Thành phần tinh dầu p ie làcitral cóhoạt tính sinh học nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, diệt trùng, w kháng khuẩn, chống ung thƣ Cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dƣợc chất oa nl tinh dầu lá, vỏ vàquả với 90% làcinnamaldehyde cóhoạt tí nh d kháng khuẩn cao vi khuẩn Gram (+) vàvi khuẩn Gram (-) Ngoài lu nf va an giá trị khoa học, thành phần mang lại, dƣợc liệu môi trƣờng cho xạ khuẩn nội sinh (sống loại mơ thực vật) có khả lm ul sinh tổng hợp chất kháng sinh Theo nghiên cứu, ƣớc tí nh khoảng z at nh oi 70% kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sử dụng y học lâm sàng đƣợc sinh tổng hợp xạ khuẩn Gần đây, số công bố cho z thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuẩn nội sinh tạo gm @ dƣợc liệu khơng có số lƣợng phong phú màcịn có đa dạng chức l nhƣ tính kháng vi sinh vật, chống ơxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát m co sinh học Tuy nhiên, số lƣợng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh an Lu Màng tang nói riêng dƣợc liệu nói chung Việt Nam cịn hạn chế Xuất phát từ định hƣớng trên, thực nghiên cứu đề n va ac th si 44 A B Hình Hì nh thái khuẩn lạc (A) môi trƣờng ISP1 vàbề mặt chuỗi bào lu an tử (B) dƣới kí nh hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần chủng va MPT28 n tn to Kết bảng 3.6 vàhì nh 3.8 cho thấy chủng MPT28 thuộc nhóm xạ ie gh khuẩn màu xám, không sinh melanin vàsắc tố tan, chuỗi gồm 12-20 bào tử, p cấu trúc cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử hình trụ, gai (sp) w 3.4.1.2 Đặc điểm sinh hóa oa nl Việc nghiên cứu khả sử dụng nguồn carbon, nitơ nhằm đánh giá d đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn, bên cạnh giúp định hƣớng tìm lu nf va an nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho quátrì nh lên men Kết nghiên cứu khả sử dụng nguồn carbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 trình bày lm ul bảng 3.7 z at nh oi Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn carbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C Khả (1,0%, w/v) sinh trƣởng (1,0%, w/v) sinh trƣởng D-Glucose + L-Asparagin monohydrat + D-Glactose + L-Histidine monohydrat - D-Mantose + L- Phenylalanin m Nguồn nitơ Khả + α-Lactose + L-Leucin L-Arabinose + L-Tryptophan z Nguồn carbon co l gm @ an Lu + n va - ac th si 45 D-Glucosamine - L-Arginine + Myo-Inositol + L-Isoleucin + D-Manitol + L-Valine + D-Fructose + L-Methionin + L-Rhamnose + L-Lysin - D-Saccharnose + L-Threonine + D-Sorbitol + L-Cystein + amino hydroxy- - D-Trehalose + Đối chứng âm methyl 1,3 promo Đối chứng âm - - lu Ghi :(+) Sinh trưởng tốt; (-) Không sinh trưởng an Kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóa cho thấy, chủng MPT28 cókhả va n đồng hóa đƣợc nhiều nguồn carbon nhƣ D-Glucose, D-Glactose, Myo- gh tn to Inositol, D-Manitol, D-Fructose, D-Saccharnose, D-Sorbitol nitơ nhƣ LLeucin, L-Arginine, L-Valine, L-Threonine (Bảng 3.7) ie p 3.4.1.3 Ảnh hưởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả sinh trưởng nl w xạ khuẩn d oa Nhiệt độ, pH, nồng độ muối đặc điểm có ý nghĩa quan trọng an lu việc ứng dụng xạ khuẩn lên men thu nhận hợp chất có hoạt tính nf va kháng sinh, kháng ung thƣ Sinh trƣởng chủng MPT28 môi trƣờng lm ul Bennett điều kiện thínghiệm thay đổi nồng độ muối, pH vànhiệt độ đƣợc thể bảng 3.8 z at nh oi Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng chủng MPT28 0-3 6-11 m co l pH ban đầu 30-37 gm Nồng độ muối (%) @ Nhiệt độ (oC) Dải sinh trƣởng z Điều kiện an Lu Kết bảng 3.8 cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu thuộc n va nhóm ƣa ấm; sinh trƣởng tốt dải nhiệt từ 30-37 oC vàpH từ 6-11 Khi nồng ac th si 46 độ muối ≥ 3,0%, chủng MPT28 sinh trƣởng yếu không sinh trƣởng Kết phù hợp với tí nh chất điều kiện khíhậu mẫu thu thập tỉnh PhúThọ 3.4.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT28 3.4.2.1 Khuếch đại gen 16S rDNA Kết DNA tổng số chủng xạ khuẩn MPT28 (Phụ lục 2) đƣợc sử dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, kết thể hình 3.9 lu an n va p ie gh tn to oa nl w d Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel an lu agarose 1,0% nf va Băng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); Băng 1: Sản phẩm PCR lm ul khuếch đại gen 16S rDNA chủng MPT28 z at nh oi Kết khuếch đại gen 16S rDNA chủng MPT28 cho thấy, sản phẩm DNA phản ứng PCR cho băng rõ nét có kích thƣớc z khoảng 1400 bp (Hì nh 3.9) Nhƣ vậy, sản phẩm PCR thu đƣợc thí m co 3.4.2.2 Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA l rDNA gm @ nghiệm đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh giải trình tự gen 16S trình bày bảng 3.9 an Lu Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng xạ khuẩn đƣợc n va ac th si 47 Bảng 3.9 Trì nh tự gen mãhóa 16S rDNA chủng MPT28 Trì nh tự gen 16S rDNA chủng Mãsố truy cập Độ tƣơng MPT28 sau blast NCBI GenBank đồng (%) Streptomyces albogriseolus 71.1 KX454152.1 97% Streptomyces albogriseolus T8 KU324449.1 97% Streptomyces griseorubens AU2 KX156364.1 97% Streptomyces sp DB21 KX443347.1 97% Streptomyces sp NCD21 KU382328.1 97% Kết phân tí ch trì nh tự gen 16S rDNA vàso sánh với trình tự lu gen công bố GenBank công cụ BLAST (NCBI) cho thấy gen mã an va hóa 16S rDNA chủng MPT28 có độ tƣơng đồng chƣa cao so với gen n tƣơng ứng chủng Streptomyces albogriseolus 71.1 (Bảng 3.9) Dựa vào gh tn to kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý– sinh hóa vàphân tích trì nh p ie tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn MPT28 đƣợc định danh làStreptomyces d oa nl w albogriseolus MPT28 nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ 03 mẫu (rễ, thân, lá) Màng tang tỉnh Phú Thọ, phân lập đƣợc 25 chủng xạ khuẩn nội sinh Đánh giá đa dạng xạ khuẩn dựa tỷ lệ phân lập từ phận (rễ, 40%; thân, 32%; lá, 28%); môi trƣờng phân lập (cao môi trƣờng HV, SPA đạt từ 16% đến 20 %); nhóm màu xạ khuẩn (nhóm màu vàng, trắng (10 chủng, 40%) chiếm ƣu thế) Sàng lọc đƣợc 14 chủng xạ khuẩn có khả kháng loại VSV kiểm định, chủng mang gen pks-I (chiếm 57,1%), 11 lu an chủng mang gen pks-II, nrps (chiếm 78,6%), chủng sinh kháng sinh n va thuộc nhóm anthracycline tn to Chủng MPT28 có khả sinh kháng sinh phổ rộng, hoạt tính cao MPT28 đƣợc định danh làStreptomyces albogriseolus MPT28 p ie gh Dựa phân tích đặc điểm sinh học vàtrì nh tự gen 16S rDNA, chủng 4.2 Kiến nghị w oa nl Tách dòng xác định trình tự gen PKS-II, NRPS chủng S d albogriseolus MPT28 lu nf va an Nghiên cứu sâu đặc điểm hệ gen khả ứng dụng chủng S albogriseolus MPT28 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học Kĩ Thuật, Hà Nội Egorov NX (1976), Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Lê Mai Hƣơng, Trần Thị Nhƣ Hằng, Trần Huy Thái, Dƣơng Đức Huyến (2005), “Phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chủng nấm nội ký sinh thực vật phân lập từ số vƣờn thuốc lu phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, tr 352, 20-23 an n va Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh tn to chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập gh Việt Nam, HàNội p ie Hoàng Hoa Long, Dorothea M, Ian TB (2013), “Vi khuẩn nội sinh w Bacillus sp B55 phân lập từ Nicotiana attenuata kích thích sinh trƣởng oa nl tăng khả thích nghi chủ điều kiện tự nhiên”, Hội d nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 2, tr 329-333 lu học, HàNội nf va an Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y lm ul Văn Thị Phƣơng Nhƣ, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập đặc tí nh vi z at nh oi khuẩn nội sinh lúa (Oryza sativa L.) trồng đất tỉnh Phú Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc, z tr.450 – 454 gm @ Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kì Sơn, Vũ Thị Hạnh l Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá sàng lọc m co xạ khuẩn nội cộng sinh quế có khả kháng vi sinh vật gây an Lu bệnh”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 12(2), tr.1 – n va ac th si 50 Tiếng Anh Adhikari A, Basnyat R “Phenotypic (1999), characteristics of Xanthomonas campestris pv campestris from Nepal”, EJPP, 105(3), pp.303 - 305 10 Araujo WL, Marcon J, WJr M, Van Elsas JD, JWVan V, Azevedo JL (2002), “Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants”, Appl Environ Microbiol., 68, pp.4906 – 4914 11 Bacon CW, White JF (2000), Microbial endophytes, New York, Marcel Dekker lu 12 Berdy J (2005), “Bioactive microbial metabolites”, J Antibiot., 58, pp.1 an n va – 26 tn to 13 Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM, Zhou S (2005), “Isolation and wilt pathogen from surface-sterilized banana roots”, FEMS Microbiol p ie gh characterization of endophytic Streptomycete antagonists of fusarium w Lett., 247, pp.147-152 oa nl 14 Castillo U, Harper JK, Strobel GA, Sears J, Alesi K, Ford E, Lin J, d Hunter M, Maranta M, Ge H, Yaver D, Jensen JB, Porter H, Robison R, lu nf va an Miller D, Hess WM, Condron M, Teplow D (2003), “Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL 30566, an endophyte of lm ul Grevillea pteridifolia”, FEMS Microbiol Lett., 234, pp.183–190 z at nh oi 15 Chen HH, Qin S, Lee JC, Kim CJ, Xu LH, Jiang CL, Li WJ (2009a), “Streptomyces mayteni sp nov., a novel endophytic actinomycete z isolated from Chinese medicinal plant”, Antonie Leeuwenhoek, 95, gm @ pp.47–53 growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: m co plant l 16 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005), “Use of Microbiol., 71, pp.4951–4959 an Lu principles, mechanisms of action, and future prospects”, Appl Environ n va ac th si 51 17 Conn VM, Walker AR, Franco CMM (2008), “Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana”, Mol Plant Microbe Interact., 21, pp.208–218 18 Coombs JT, Michelsen PP, Franco CMM (2004), “Evaluation of endophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var tritici in wheat”, Biol Control., 29, pp.359–366 19 Coppen JJW (1995), Non-Wood Forest Products 1: Flavours and Fragrances of Plant Origin, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome 20 Davis KE, Joseph SJ, Janssen PH (2005), “Effects of growth medium, lu an inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil n va bacteria”, Appl Environ Microbiol., 71, pp.826–834 tn to 21 Denmain A, Davies J (1999), Manual of industrial microbiology and gh biotechnology, ASM, Washington DC p ie 22 El-Bondkly AM, El-Gendy MM (2010), “Keratinolytic activity from w new recombinant fusant AYA2000, derived from endophytic oa nl Micromonospora strains”, Can J Microbiol., 56, pp.748 – 760 d 23 El-Tarabily KA (2003), “An endophytic chitinase-producing isolate of lu nf va an Actinoplanes missouriensis, with potential for biological control of root rot of lupine caused by Plectosporium tabacinum”, Aust J Bot., 51, lm ul pp.257–266 z at nh oi 24 El-Tarabily KA, Sivasithamparam K (2006), “Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens z and as plant growth promoters”, Soil Biol Biochem., 38, pp.1505– gm @ 1520 l 25 Gangwar M, Dogra S and Sharma N (2011), “Antagonistic bioactivity an Lu 2(4), pp.154-157 m co of endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants”, JALRP, 26 Garrity GM, Holt JG (2001), The road map to the manual In Bergey’s n va manual of systematic bacteriology, Springer, pp.119-166 ac th si 52 27 Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004), “Anthracyclines: Molecular Advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity”, Pharmacol Rew., 56, pp.185 – 229 28 Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010), “Sequencebased analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria”, Appl Environ Microbiol, 76(8), pp.2487 – 2499 29 Gonzalez I, Ayuso-Sacido A, Anderson A, Genilloud O (2005), “Actinomycetes isolated from lichens: evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene sequences”, FEMS Microbiol Ecol., 54, lu pp.401 – 415 an n va 30 Hasegawa S, Meguro A, Shimizu M, Nishimura T, Kunoh H (2006), tn to “Endophytic actinomycetes and their interactions with host plants”, gh Actinomycetologica, 20, pp.72–81 p ie 31 Ho C, Jie-Pinge O, Liu Y, Hung C, Tsai M, Liao P, Wang E, Chen Y, w Su Y (2010), “Compositions and in vitro anticancer activities of the leaf oa nl and fruit oils of Litsea cubeba from Taiwan”, Nat Prod Commun., 5, d pp.617–620 lu nf va an 32 Igarashi Y (2004), “Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes”, Actinomycetologica, 18, pp.63–66 lm ul 33 Khieu Thi Nhan (2015) Exploring diversity and antimicrobial, z at nh oi antitumor activities of culturable endophytic actinomycetes associated with Dracaena cochinchinensis Lour, China z 34 Kizuka M, Enokita R, Takanashi K, Okamoto Y, Otsuka T, Shigematsu gm @ Y, Inoue Y, Okazaki T (1998), “Studies on actinomycetes isolated l from plant leaves”, Actinomycetologica, 12, pp.89–91 m co 35 Küster E, Williams ST (1964), “Media for the isolation of an Lu Streptomycetes: starch casein medium”, Nature, 202, pp.928–929 36 Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY, Xu LH, Jiang va n CL, Li WJ (2008), “Antitumour and antimicrobial activities of ac th si 53 endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”, Lett Appl Microbiol, 47, pp.574 – 580 37 Li J, Zhao GZ, Huang HY, Qin S, Zhu WY, Zhao LX, Xu LH, Zhang S, Li WJ, Strobel G (2012), “Isolation and characterization of culturable endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua L Antonie van Leeuwenhoek, 101, pp.515-527 38 Li WR, Shi QS, Liang Q, Xie XB, Huang XM, Chen YB (2014), “Antibacterial activity and kinetics of Litsea cubeba oil on Escherichia coli”, PLOS one, 9(11), pp.1 – 39 Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), “Plant pathogenecity lu in the genus Streptomyces”, Plant Dis., 81, pp.836 – 846 an n va 40 Lu CH, Shen YM (2004), “Two new macrolides produced by 41 Madhurama G, Sonam D, Urmil PG, Ravindra NK (2014), “Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal p ie gh tn to Streptomyces sp CS”, J Antibiot., 57, pp.597–600 w plants in India”, Afr J Microbiol Res., 8(2), pp.184 – 191 oa nl 42 Mahera MS, Sulaiman AA, Ismet A, Milton W (2013), “Evaluation of d antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert lu nf va an environment of Saudi Arabia”, Life Sci J., 10(4), pp.974 – 980 43 Merzaeva Shirokikh (2010), “The production of auxins by the lm ul endophytic bacteria of Winter Rye”, Appl Biochem and Microbiol., 3, z at nh oi pp.44 - 50 44 Nguyen Hai Van, Vu Thi Hanh Nguyen, Vu Thu Trang, Phi Quyet z Tien, Khieu Thi Nhan, Samira Sarter, Chu Ky Son (2016), gm @ “Antimicrobial activities and interaction effects of vietnamese Litsea l cubeba (Lour.) Pers essential oil and its endophytic actinobacteria”, m co Journal of Science and Technology, 54(4A), pp.234 – 241 an Lu 45 Noosidum N, Prabaripai A, Charoenviriyaphap T, Chandrapatya A (2008), “Excito-repellency properties of essential oils from Melaleuca va n leucadendron L., Litsea cubeba (Lour.) Persoon, and Litsea salicifolia ac th si 54 (Nees) on Aedes aegypti (L.) mosquitoes”, J Vector Ecol., 33, pp.305–312 46 Nor Azah MA, Susiarti S (1999), Litsea cubeba (Lour.) Persoon In Plant Resources of South-East Asia, Backhuys Publishers, Leiden, pp 47 Okazaki T (2003), Studies on actinomycetes isolated from plant leave, Queensland Complete Printing Service, Nambour 48 Onuma Kaewkla, Christopher MMF (2013), “Rational approaches to improving the isolation of endophytic actinobacteria from Australian native trees”, Microb Ecol., 65, pp.384-393 49 Priham TG and Tenser HD (1974), “Streptomyces Waksman and first lu an and second studies”, Int J Syst Bacteriol., 18, pp.279 n va 50 Pullen C, Schmitz P, Meurer K, Bamberg DD, Lohmann S, Franc SDC, tn to Groth I, Schlegel B, Möllmann U, Gollmick F, Gräfe U, Leistner E residing in the wood of Celastraceae”, Planta, 216, pp.162–167 p ie gh (2002), “New and bioactive compounds from Streptomyces strains w 51 Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011), “Biodiversity, oa nl bioactive natural products and biotechnological potential of plant- d associated endophytic actinobacteria”, Appl Microbiol Biotechnol., 89, lu nf va an pp.457 – 473 52 Qin S, Zhao GZ, Klenk HP, Li J, Xu LH, Li WJ (2009d), “Nonomuraea lm ul antimicrobica sp nov., an endophytic actinomycete isolated from 59, pp.2453–2457 z at nh oi leaves of Maytenus austroyunnanensis”, Int J Syst Evol Microbiol., z 53 Quadt-Hallmann A, Benhamou N, Kloepper JW (1997), “Bacterial @ endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant”, Can J l gm Microbiol., 43, pp.577-582 m co 54 Rojas DJ, Sette LD, Araujo WL, Lopes MSG, Silva LF, Furlan RLA, an Lu Padilla G (2012), “The diversity of polyketide synthase genes from sugarcane-derived fungi”, Microb Ecol., 63, pp.565 – 577 n va ac th si 55 55 Sacido-Ayuso A and Genilloud O (2004), “New PCR primer for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: Detection and distribution of these biosynthetic gene sequence in major taxonomic groups”, Microbial Ecology, 38, pp.10 – 14 56 Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular cloning A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork 57 Shimizu M, Suzuki T, Mogami O, Kunoh H (2005), “Disease resistance of plants induced by endophytic actinomycetes In: Tsuyumu S, Leach JE, Shiraishi T, Wolpert T (eds) Genomic and genetic analysis of plant parasitism and defense”, APS, St Paul, (3), pp.292–293 lu 58 Shirling EG and Gottlieb D (1966), “Methods for characterization of an n va Streptomyces species”, Int J Syst Bacteriol., 16, pp.313 – 340 tn to 59 Smith GE (1957), “Inhibition of Fusarium oxysporum f sp lycopersici a species of Micromonospora isolated from tomato”, Phytopathology, 47, pp.429–432 p ie gh by w 60 Sri P, Yulin L, Antonius Su, Sri B, Latifah KD (2012), “Alpha- oa nl glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic d actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medicinal, lu nf va an plants”, IJPSR, 4(1), pp.327 – 334 61 Strobel G, Daisy B (2003), “Endophytes as sources of bioactive lm ul products”, Microbes Infect., 5, pp.535–544 z at nh oi 62 Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004),” Natural products from endophytic microorganisms”, J Nat Prod., 67, pp.257–268 z 63 Taechowisan T, Lu C, Shen Y, Lumyong S (2005), “Secondary @ metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 gm l and their antifungal activity”, Microbiology, 151, pp.1691–1695 m co 64 Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007a), “4- 18, pp.203–211 an Lu arylcoumarin inhibits immediate-type allergy”, Food Agric Immunol., n va ac th si 56 65 Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007b), “Antitumor activity of 4-arylcoumarins from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130”, J Cancer ResTrer., 30, pp.86–91 66 Tan HM, Cao LX, He ZF, Su GJ, Lin B, Zhou SN (2006), “Isolation of endophytic actinobacteria from different cultivars of tomato and their activities against Ralstonia solanaceraum in vitro”, World J Microbiol Biotechnol., 22, pp.1275 – 1280 67 Trease GE, Evans WC (1996), A textbook of Pharmacognosy, London 68 Trenser HD and Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by Streptomyces as criteria for species differentiation”, J Bacteriol, 76, lu an pp.239 n va 69 Tuntiwachwuttikul P, Taechowisan T, Wanbanjob A, Thadaniti S, tn to Taylor WC (2008), “Lansai A–D, secondary metabolites from gh Streptomyces sp SUC”, Tetrahedron, 64, pp.7583–7586 p ie 70 Yang TS, Liou ML, Hu TF, Peng CW, Liu TT (2013), “Antimicrobial w activity of the essential oil of Litsea cubeba on cariogenic bacteria”, oa nl The Journal of Essential Oil Research, 25(2), pp.120 – 128 d 71 Zhang W, Hu JF, Zhao QC, Shi GB (2012), “Antibacterial, antifungal lu nf va an and cytotoxic isoquinoline alkaloids from Litsea cubeba”, Molecules, 17, pp.12950 – 12960 lm ul 72 Zhao K, Penttinen P, Guan T, Xiao J, Chen Q, Xu J, Lindstro K, Zhang z at nh oi L, Zhang X, Strobel GA (2011), “The Diversity and Anti-Microbial Activity of endophytic actinomycetes Isolated from Medicinal Plants in z Panxi Plateau, China”, Curr Microbiol., 62, pp.182–190 gm @ 73 Zhao PJ, Fan LM, Li GH, Zhu N, Shen YM (2005), “Antibacterial and m co Res., 28, pp.1228–1232 l antitumor macrolides from Streptomyces sp ls9131”, Arch Pharm an Lu n va ac th si 57 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy - Môi trƣờng TWYE (g/L): Cao thịt 0,25; K2HP04 0,5; agar 15,0; H2O 1000mL; pH 7,2 - Môi trƣờng STA (g/L): Tinh bột 15,0; K2HP04 0,5; MgSO4.7H2O 0,05; FeSO4.7H2O 0,01; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trƣờng HV (g/L): Humic acid 8,0; Na2HPO4 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; CaCO3 0,02; NaNO2 0,9; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 - Môi trƣờng TA (g/L): Trehalose 18,0; CaCl2 0,3; Na2HPO4 0,3; CaCO3 0,02; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 lu - Môi trƣờng SA (g/L): Sodium succinate 15,0; K2HPO4 0,6; an n va FeSO4.7H2O 0,001; CaCl2.2H2O 0,2; KCl 0,3; agar 15,0; H2O tn to 1000 mL; pH 7,2 Môi trƣờng CA (g/L): Citrate acid 12,0; K2HPO4.3H2O 0,4; CaCl2.H2O 0,05; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2 p ie gh - w - Môi trƣờng SPA (g/L): peptone 12,0; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O Môi d - oa nl 0,1; agar 15,0; H2O 1000 mL, pH 7,2 trƣờng LBA (Luria-Bertani) (g/L): Cao nấm men 5,0; lu 7,0 nf va an Tryptone 10,0; NaCl 10,0; agar 15,0; Nƣớc cất 1000 mL; pH= 6,5- lm ul - Môi trƣờng ISP1 (g/l): Tryptone 5,0, cao nấm men 3,0; agar 18,0; z at nh oi H2O 1000 mL; pH 7,0 - Môi trƣờng ISP2 (g/L): cao nấm men 3,0; cao malt 10,0; dextrose z 4,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 l mL; pH-7,2 gm @ - Môi trƣờng ISP3 (g/L): Bột kiều mạch 20,0; agar 20,0; H2O 1000 m co - Môi trƣờng ISP4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1,0; 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 an Lu MgSO4.7H2O 1,0; NaCl 1,0; (NH4)2SO4 2,0; CaCO3 2,0; agar n va ac th si 58 - Môi trƣờng ISP5 (g/l): L-Asparagin monohydrate 1,0; glycerol 10,0; K2HPO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7,0-7,4 - Môi trƣờng ISP6 (g/L): Peptone 10,0; cao nấm men 1,0; xitrat sắt 0,5; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2 - Môi trƣờng ISP7 (g/L): Glycerol 15,0; L-tyrosine 0,5; LAsparagin monohydrate 1,0; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5; MgSO4 7H2O 0,5; Nacl 0,5; agar 20; H2O 1000 mL; pH 7,2-7,4 - Môi trƣờng ISP9 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 6,8-7,0 Phụ lục 2: DNA tổng số chủng xạ khuẩn sử dụng nghiên cứu lu an PCR n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu lm ul z at nh oi Băng 1-13: DNA tổng số chủng xạ khuẩn MPT08, MPT14, MPT21, MPT22, MPT25, MPT26, MPT28, MPT29, MPT30, MPT33, MPT34, MPT35, MPT45 z m co l gm @ an Lu n va ac th si