Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện cần giờ thành phố hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHAN THANH PHƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHAN THANH PHƯƠNG Chuyên ngành : Vi sinh vật Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THỊ THANH TS TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2007 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Lược sử vấn đề nghiên cứu Mục đích nghiên cứu .5 Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu .6 Nhiệm vụ nghiên cứu .6 Phương pháp nghiên cứu .6 Dự kiến cấu trúc luận văn .6 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm sợi khả sinh kháng sinh nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm nấm sợi [6] 1.1.2 Chất kháng sinh từ nấm sợi 16 1.1.3 Ứng dụng nấm sợi CKS từ nấm sợi .24 1.2 Giới thiệu sơ lược rừng ngập mặn huyện Cần thành phố Hồ Chí Minh [24], [25], [42] 31 1.2.1 Đặc điểm chung rừng ngập mặn 31 1.2.2.Đặc điểm RNM huyện Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh: .32 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu .37 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.2 Hóa chất 38 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 39 2.1.4.Các môi trường sử dụng nghiên cứu 39 2.2.Phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1 Phương phápVSV .42 2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi 43 2.2.3.Các phương pháp hóa sinh 44 2.2.4 Thử họat tính đối kháng với chủng nấm sợi gây bệnh cho trồng [15]: .49 2.2.6.Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt chất kháng sinh .50 2.2.8.Phương pháp xử lí số liệu toán thống kê đơn giản 50 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52 3.1 Kết phân lập chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ 52 3.2 Khảo sát khả sinh chất kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ .53 3.3 Tuyển chọn chủng nấm sợi có hoạt tính kháng sinh cao .59 3.4 Khảo sát phổ kháng với VSV gây bệnh .63 3.4.1 Khảo sát khả chống vi khuẩn gây bệnh kháng số chất kháng sinh chủng nấm sợi phân lập 63 3.4.2 Khảo sát khả kháng số nấm gây bệnh trồng chủng nấm sợi phân lập 66 3.5 Các đặc điểm sinh học phân loại chủng nấm sợi tuyển chọn 70 3.5.1.Đặc điểm hình thái, phân loại 70 3.5.1.a Đặc điểm đại thể vi thể chủng nấm sợi T1.2 71 3.5.1.b Đặc điểm đại thể vi thể chủng nấm sợi T’1[46] 72 3.5.1.c Đặc điểm đại thể vi thể chủng nấm sợi T7.1[46] 73 3.5.1.d Đặc điểm đại thể vi thể chủng nấm sợi Đ 33.1[48] 74 3.5.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng nấm sợi nghiên cứu .77 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường đến hoạt tính kháng sinh chủng nấm sợi tuyển chọn 88 3.6 Bước đầu tìm hiểu khả diệt côn trùng chủng nấm nghiên cứu: 95 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong suốt trình phát triển nhân loại, lồi người ln phải đấu tranh vượt qua trở ngại, thách thức khác Bệnh tật số trở ngại nhiều bệnh có nguyên nhân vi sinh vật (VSV) gây Từ xa xưa lịch sử, đường tìm tịi, khám phá tích lũy kinh nghiệm thực tiễn, người phát ứng dụng hiệu nhiều nguồn dược liệu vào mục đích điều trị y học Với phát triển VSV học, với bước ngoặt lịch sử phát minh vĩ đại Alexander Fleming (1928) mở kỷ nguyên y học: khai sinh chất kháng sinh ứng dụng chất kháng sinh vào điều trị cho người Chất kháng sinh (CKS) trở thành thần dược cứu sống người mà ứng dụng rộng rãi trồng trọt, chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm bảo vệ môi trường Để phịng chống nấm hại trồng , nơng nghiệp đại, người ta sử dụng nhiều CKS có nguồn gốc VSV để thay dần hóa chất sử dụng vốn độc người mơi trường Vì vậy, việc thay thuốc trừ sâu hóa học chế phẩm sinh học giải pháp an toàn hiệu quả, khắc phục nhược điểm nông dược bảo vệ thực vật sức khỏe cộng đồng Ở nước ta nước phát triển việc lạm dụng thuốc KS, việc VK gây bệnh người kháng nhiều loại KS thông thường, ngày xuất nhiều chủng VSV kháng thuốc nên việc điều trị kháng sinh trở nên khó khăn cho thầy thuốc lâm sàng.Việc tìm kiếm CKS CKS có nguồn gốc từ thiên nhiên, VSV tiết chống lại VSV gây bệnh lờn thuốc thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học, việc làm vơ cấp thiết quan trọng Trong trình tìm kiếm ln quan tâm đến nhóm VSV sinh CKS hệ sinh thái đặc biệt, có nấm sợi RNM Các nhà khoa học tin với môi trường sống đặc biệt đường trao đổi chất chúng khác so với với sinh vật đất liền Vì sản phẩm trao đổi chất có tính chất khác lạ, có CKS Tuy nhiên hiểu biết VSV RNM hạn chế lãnh vực bỏ ngỏ Nấm sợi đại diện quan trọng hệ VSV RNM Tìm hiểu nấm sợi có khả sinh KS, vai trị chúng hệ sinh thái RNM việc làm cần thiết Đặc biệt nấm sợi sinh KS việc nghiên cứu tìm chất kháng sinh đề tài hấp dẫn thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học thuộc lãnh vực khác chất kháng sinh vuợt khỏi phạm vi y học So với y học việc sử dụng chất kháng sinh sinh từ nấm sợi bảo vệ thực vật, bảo quản thực phẩm v v cịn hạn chế Để góp phần nghiên cứu, tìm hiểu giá trị tài nguyên từ nấm sợi RNM tiềm chúng thực tiễn, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát khả sinh kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh” Lược sử vấn đề nghiên cứu - Chưa có tác giả nghiên cứu "Nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ TPHCM có khả sinh kháng sinh" - Có số đề tài nghiên cứu có liên quan nấm sợi RNM như: + “ Tổng kết kết nghiên cứu tính đa dạng vai trị nhóm nấm sợi phân lập từ số RNM hai tỉnh Nam Định Thái Bình” tác giả Mai Thị Hằng (2002) + “ Khảo sát hoạt tính đối kháng tiềm ứng dụng chủng nấm sợi phân lập từ số khu RNM Nam Định Thái Bình” tác giả Mai Thị Hằng, Lê Thanh Huyền (2002) +“ Khảo sát khả ký sinh gây bệnh trùng tiềm kiểm sốt sinh học nấm RNM Nam Định tác giả Mai Thị Hằng, Nguyễn Vĩnh Hà (2002) Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh kháng sinh sử dụng vào ức chế VSV gây bệnh người, trồng Đối tượng nghiên cứu - Các chủng nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần có hoạt tính kháng sinh - Các VSV kiểm định nhận từ viện Pasteur, Viện khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam, khoa Nông học Đại học Nông Lâm TPHCM, khoa xét nghiệm Bệnh viện Bình Dân - Sâu tơ nhận từ công ty Vipesco; tằm nhận từ công ty Dâu tằm tơ, Bảo lộc Phạm vi nghiên cứu Các chủng nấm sợi sinh kháng sinh có nguồn gốc từ RNM Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả kháng sinh từ RNM huyện Cần Giờ - Nghiên cứu đặc điểm chủng nấm sợi tuyển chọn (đặc điểm sinh học phân loại) - Bước đầu tìm hiểu khả ứng dụng chủng nấm sợi tuyển chọn phòng chống bệnh, sâu hại cho trồng Phương pháp nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng nấm sợi phương pháp vi sinh - Nghiên cứu đặc điểm bản, phân loại chủng nấm sợi phương pháp hóa sinh - Xử lý số liệu thu thập phương pháp sử dụng toán học thống kê đơn giản Dự kiến cấu trúc luận văn Gồm: - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết bàn luận - Kết luận kiến nghị Thời gian thực đề tài từ tháng năm 2006 đến tháng năm 2007 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm sợi khả sinh kháng sinh nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm nấm sợi [6] Nấm sợi vi sinh vật có nhân chuẩn thuộc nhóm vi nấm, phân bố khắp nơi đất, nước, khơng khí, sản phẩm từ sinh vật, thân sinh vật kể người Nấm sợi sống kí sinh động, thực vật hoại sinh chất hữu từ xác động, thực vật, chúng lồi hơ hấp hiếu khí bắt buộc, khơng chứa diệp lục tố, khơng có khả quang hợp [13] Nấm sợi VSV ưa mát (Psychrotroph), có nhiệt độ tối ưu khoảng 250C, thích nghi với 00C Nấm sợi sống mơi trường có pH axít đến trung tính (pH 3- 6) Mặc dù sinh trưởng nấm sợi không cần ánh sáng ánh sáng lại có tác dụng hình thành bào tử, tổng hợp sắc tố [8] 1.1.1.1 Hình tháí, cấu tạo [54] Nấm sợi có cấu tạo sợi, phân nhánh khơng phân nhánh, có vách ngăn ngang khơng có vách ngăn ngang Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên chứa chất nguyên sinh lưu động Về chiều dài chúng có sinh trưởng vơ hạn (nhưng đường kính thường thay đổi phạm vi 130µm thơng thường 5-10 µm) Sợi nấm tăng trưởng ngọn, vừa dài không ngừng phân nhánh bào tử nẩy mầm môi trường đặc phát triển thành hệ sợi nấm, sau 3-5 ngày tạo thành đám nhìn thấy gọi khuẩn lạc (colony) Tùy theo môi trường chất mà hệ sợi nấm phát triển thành dạng khác Vào giai đoạn cuối phát triển, khuẩn lạc xảy kết mạng (anastomosis) khuẩn ty với nhau, làm cho khuẩn lạc hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn hệ sợi nấm Hiện tượng kết mạng thường gặp nấm bậc cao lại gặp sợi nấm dinh ... 3.1 Kết phân lập chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ 52 3.2 Khảo sát khả sinh chất kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ .53 3.3 Tuyển chọn chủng nấm sợi có... tài nguyên từ nấm sợi RNM tiềm chúng thực tiễn, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát khả sinh kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh? ?? Lược sử... tính kháng sinh cao .59 3.4 Khảo sát phổ kháng với VSV gây bệnh .63 3.4.1 Khảo sát khả chống vi khuẩn gây bệnh kháng số chất kháng sinh chủng nấm sợi phân lập 63 3.4.2 Khảo sát