Luận văn thạc sĩ sinh học phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang tại tỉnh phú thọ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  Nguyễn Phú Tâm PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG TẠI T[.]

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - Nguyễn PhúTâm PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG TẠI TỈNH PHÚ THỌ Chuyên ngành vi sinh vật học Mãsố: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS PhíQuyết Tiến HÀ NỘI - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu vàkết đƣợc cơng bố luận văn làhồn tồn trung thực, xác chƣa đƣợc công bố công trình khác HàNội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn PhúTâm ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS PhíQuyết Tiến chủ nhiệm đề tài VAST04.07/16-17 hết lòng giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn tới thầy, côcủa trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái vàTài Nguyên sinh vật thầy, cô Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tì nh giảng dạy cho tơi suốt thời gian tham gia khóa học Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên, NCS Quách Ngọc Tùng vàcác cán phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học bảo nhiệt tình, giúp đỡ tạo điều kiện để thực luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, người giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện cho tơi suốt qtrì nh học tập HàNội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn PhúTâm iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật dƣợc liệu 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh 1.1.2 Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật 1.1.3.1 Kháng ung thƣ, kháng viêm 1.1.3.2 Kiểm soát sinh học 1.1.3.3 Một số dƣợc chất khác từ xạ khuẩn nội sinh 1.1.4 Tình hì nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 1.1.4.1 Tì nh hình nghiên cứu giới 1.1.4.2 Tì nh hình nghiên cứu Việt Nam 10 1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh thực vật 12 1.3 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu15 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 15 1.3.2 Các gen tham gia vào quátrình tổng hợp kháng sinh vàcác hợp chất trao đổi thứ cấp 17 1.3.2.1 Gen chức pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa vòng thơm 17 1.3.2.2 Gen chức nrps 18 1.3.2.3 Đánh giá đa dạng gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS 18 1.3.3 Chất kháng sinh kháng sinh điều trị ung thƣ nhóm anthracycline 20 iv 1.4 Cây Màng tang vàtiềm khai thác xạ khuẩn nội sinh Màng tang 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Mẫu Màng tang, chủng giống vi sinh vật 24 2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 24 2.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Lấy mẫu Màng tang 25 2.2.2 Phƣơng pháp xử lýbề mặt mẫu 25 2.2.4 Khuếch đại gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS xạ khuẩn 26 2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 26 2.2.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả sinh melanin 26 2.2.5.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử vàbề mặt bào tử 27 2.2.5.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 27 2.2.6 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa phân tích trì nh tự gen 16S rDNA 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang tỉnh PhúThọ 30 3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang 32 3.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận Màng tang 32 3.2.2 Đa dạng xạ khuẩn Màng tang theo môi trƣờng phân lập 33 3.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 34 3.3 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 35 3.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn 35 3.3.2 Xác định gen mãhóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 39 v 3.3.3 Khả sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 41 3.4 Đặc điểm sinh học vàphân loại chủng xạ khuẩn MPT28 42 3.4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 43 3.4.1.1 Đặc điểm hình thái vàbề mặt chuỗi bào tử 43 3.4.1.2 Đặc điểm sinh hóa 44 3.4.1.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả sinh trƣởng xạ khuẩn 45 3.4.2 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn MPT28 46 3.4.2.1 Khuếch đại gen 16S rDNA 46 3.4.2.2 Giải trì nh tự đoạn gen 16S rDNA 46 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 PHỤ LỤC 57 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc số kháng sinh điển hì nh thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI vàIDA 21 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập số môi trƣờng đặc hiệu sau tuần ni cấy 30 Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố phận Màng tang 32 Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh Màng tang đƣợc phân lập loại môi trƣờng khác 33 Hình 3.4 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu 35 Hình 3.5 Hoạt tí nh kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) chủng xạ khuẩn nội sinh 37 Hình Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II số chủng xạ khuẩn nội sinh đại diện 39 Hình Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps số chủng xạ khuẩn nội sinh đại diện 40 Hình Hình thái khuẩn lạc (A) môi trƣờng ISP1 vàbề mặt chuỗi bào tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần chủng MPT28 44 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 46 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu giới loài xạ khuẩn nội sinh thực vật Bảng 1.2 Xạ khuẩn đƣợc phân lập từ dƣợc liệu 14 Bảng 1.3 Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 16 Bảng 1.4 Tần xuất xuất gen pks-I, nrps phân nhóm xạ khuẩn khác .19 Bảng 2.1 Trì nh tự cặp mồi đƣợc sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA……………………………………………………………… 28 Bảng 3.1 Đặc điểm hì nh thái chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu Màng tang .31 Bảng 3.2 Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 25 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ Màng tang 36 Bảng 3.3 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn 37 Bảng 3.4 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS khả sinh anthracycline 14 chủng xạ khuẩn nội sinh 41 Bảng 3.5 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng MPT28 42 Bảng 3.6 Màu sắc khuẩn lạc chủng MPT28 nuôi cấy môi trƣờng khác 43 Bảng 3.7 Khả đồng hóa nguồn carbon, nitơ chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy 30°C 44 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng chủng MPT28 45 Bảng 3.9 Trì nh tự gen mãhóa 16S rDNA chủng MPT28 47 viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ ACCd Aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase ACP Acyl carrier protein AT Acyl transferase CA Citrate acid-agar DAB Deacetil baceatin DNA Deoxyribonucleotide acid DNR Daunorubicin DOX1 Doxorubicin EPI Epirubicin 10 HGT Horizontal gene transfer 11 HV Humic acid-agar 12 IAA Indol-3-acetic acid 13 IDA Idarumycin 14 KS Ketosynthase 15 MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 16 NaOCl Sodium hypochlorite 17 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 18 PKS Ppolyketide synthase 19 PKS-I Polyketide synthase I 20 PKS-II Polyketide synthase II 21 RNA Ribonucleic acid 22 RA Raffinose-histidine agar 23 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 24 VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Vi khuẩn gây bệnh có khả kháng thuốc kháng sinh vấn đề nghiêm trọng vàthu hút mối quan tâm lớn cộng đồng Vìvậy, việc nghiên cứu, lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ƣu tiên hàng đầu nhàkhoa học vàcác công ty dƣợc phẩm giới Cho đến nay, nhàkhoa học khơng ngừng tìm kiếm nguồn hợp chất tự nhiên khác để phát triển loại thuốc kháng sinh nhƣ loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu tác dụng phụ tới sức khỏe ngƣời bệnh số thuốc tổng hợp hóa học gây Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật nguồn tự nhiên quan trọng điều trị bệnh gây vi sinh vật vàhỗ trợ điều trị chống ung thƣ Chẳng hạn, Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) làcây bụi thuộc họ Lauraceae, Màng tang giàu tinh dầu, lƣợng tinh dầu tối đa làkhoảng 5% trọng lƣợng tƣơi Thành phần tinh dầu làcitral cóhoạt tính sinh học nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, diệt trùng, kháng khuẩn, chống ung thƣ Cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dƣợc chất tinh dầu lá, vỏ vàquả với 90% làcinnamaldehyde cóhoạt tí nh kháng khuẩn cao vi khuẩn Gram (+) vàvi khuẩn Gram (-) Ngoài giá trị khoa học, thành phần mang lại, dƣợc liệu môi trƣờng cho xạ khuẩn nội sinh (sống loại mơ thực vật) có khả sinh tổng hợp chất kháng sinh Theo nghiên cứu, ƣớc tí nh khoảng 70% kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sử dụng y học lâm sàng đƣợc sinh tổng hợp xạ khuẩn Gần đây, số công bố cho thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuẩn nội sinh tạo dƣợc liệu khơng có số lƣợng phong phú màcịn có đa dạng chức nhƣ tính kháng vi sinh vật, chống ơxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát sinh học Tuy nhiên, số lƣợng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Màng tang nói riêng dƣợc liệu nói chung Việt Nam hạn chế Xuất phát từ định hƣớng trên, thực nghiên cứu đề tài: “Phân lập, đánh giá đa dạng khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh Màng tang tỉnh PhúThọ” Đề tài đƣợc thực phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, gồm nội dung chính: - Phân lập đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang thu thập tỉnh Phú Thọ - Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn nội sinh xác định có mặt ba gen mã hóa enzyme tham gia vào trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases I (PKS-I), polyketide synthases II (PKS-II) vànonribosomal peptide synthetase (NRPS) - Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao 3 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật dƣợc liệu 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh Hiện nay, nhiều cơng trì nh nghiên cứu giới công bố tƣơng tác thực vật vàvi sinh vật (VSV), VSV đóng vai trị nhƣ tác nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật, phân giải phospho khóhồtan, cố định nitơ tự do, tăng độ phìcủa đất [16], [53] Phần lớn VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc vàxạ khuẩn đƣợc phân lập từ đất, vùng rễ, bề mặt môthực vật Khái niệm xạ khuẩn nội sinh đƣợc đƣa Smith cộng (1957) phân lập thành cơng xạ khuẩn Micromonospora sp có khả ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum môcây càchua không nhiễm bệnh [58] Từ đó, có nhiều định nghĩa khác VSV nội sinh nhƣng định nghĩa Bacon vàWhite (2000): „„VSV nội sinh lànhững VSV sinh trƣởng mô tế bào thực vật, không gây hiệu ứng xấu tới chủ‟‟ đƣợc nhàVSV học thừa nhận [11] Theo tài liệu, định nghĩa hàm chứa ý quan trọng: VSV nội sinh khơng khơng gây ảnh hƣởng màcịn tăng cƣờng khả trao đổi chất, kích thích sinh trƣởng, miễn dịch cho vật chủ cách tổng hợp sản phẩm trao đổi chất [9] Trong số VSV nội sinh, xạ khuẩn đƣợc ý khả tổng hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [39] Song song với tác dụng dƣợc lý thu nhận từ xạ khuẩn nội sinh, số nhà sinh vật học nghiên cứu khả kiểm soát sinh học (biocontrol) xạ khuẩn nội sinh suốt hai thập kỷ qua [61], [62] Xạ khuẩn đƣợc chứng minh khả tăng cƣờng, thúc đẩy tăng trƣởng chủ, giảm nguy nhiễm mầm bệnh tăng cƣờng khả sống sót chủ điều kiện khác [4] Những hiểu biết sinh lý vàmối tƣơng tác phân tử xạ khuẩn vàthực vật lànhững đặc tí nh quan trọng để khai thác đặc tí nh cólợi xạ khuẩn nội sinh kích thích sinh trƣởng thực vật lĩnh vực khác 4 Nhiều nghiên cứu giới khẳng định vai tròquan trọng xạ khuẩn sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh môthực vật làrất phong phú, hứa hẹn tiềm khai thác hợp chất cóhoạt tính sinh học chủng xạ khuẩn sinh nhiều lĩnh vực đời sống Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh đƣợc chứng minh làrất đa dạng mặt số lƣợng vàhoạt tính sinh học nhƣ: chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thƣ, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng [11], [51] Vìvậy, nghiên cứu sàng lọc hợp chất cóhoạt tính sinh học nói chung vàhoạt tí nh kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu tự nhiên hƣớng nghiên cứu triển vọng nhàkhoa học giới 1.1.2 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn cƣ trú mô thực vật bị ảnh hƣởng lớn yếu tố môi trƣờng nhƣ: pH đất, thành phần chất vô chất hữu đất, lƣợng mƣa, cƣờng độ ánh sáng mặt trời, khơng khí, nhiệt độ Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội sinh nhìn chung thấp phụ thuộc vào loại mơ khác thực vật [50] Theo cơng trình cơng bố, qtrình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần xử lýbề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm bề mặt Do đó, phải khử trùng bề mặt mẫu cắt mẫu thành mảnh dụng cụ khử trùng trƣớc phân lập Sodium hypochlorite (NaOCl) làmột tác nhân oxy hóa phổ biến đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt Mẫu thực vật đƣợc ngâm ethanol 70-99% từ 1-5 phút và1-5% NaOCl khoảng 3-20 phút, rửa nhiều lần nƣớc vô trùng nhằm loại bỏ lƣợng NaOCl cịn dƣ Ngồi ra, hydro peroxide clorua thủy ngân đƣợc sử dụng nhƣ chất khử trùng bề mặt hiệu [43] Năm 1992, Sardi cộng công bố sử dụng propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vìhóa chất khử trùng dạng lỏng [62] Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt với ethanol không hiệu với qua trì nh phân lập VSV nội sinh Nếu tăng gấp hai ba lần bƣớc khử trùng bề mặt hỗn hợp ethanol vàmột số chất khử trùng khác thìkhơng phân lập đƣợc xạ khuẩn nội sinh Hiệu khử trùng bề mặt đƣợc tăng cƣờng việc sử dụng chất hoạt hóa bề mặt nhƣ Tween 20 Tween 80, làm tăng hiệu tác động chất khử trùng với bề mặt thực vật [13] Phần mẫu khử trùng đƣợc đặt vào môi trƣờng thạch thí ch hợp, ni cấy nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C Trong qtrì nh phân lập, nhà nghiên cứu thƣờng gặp phải làVSV phát triển mạnh hai tuần vi khuẩn nấm tạp nhiễm phần mẫu thực vật Để ngăn chặn sinh trƣởng vi khuẩn vànấm không mong muốn nhƣ tìm kiếm lồi xạ khuẩn mới, số môi trƣờng chọn lọc đƣợc sử dụng nhƣ: môi trƣờng thạch humic acid-vitamin, môi trƣờng thạch casein tinh bột, cao nấm men, mơi trƣờng S… [14], [35], [39] Ngồi ra, bổ sung hợp chất kháng sinh nhƣ acid nalidixic trimethoprim, nystatin cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh vànâng cao khả phát triển chọn lọc xạ khuẩn xạ khuẩn phát triển chậm so với vi khuẩn vànấm [30], [51] 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh thực vật Phần lớn xạ khuẩn nội sinh cóthể sống môthực vật vàkhông gây bệnh tác động bất lợi tới qtrình phát triển bình thƣờng Ngồi ra, xạ khuẩn nội sinh đƣợc nhiều nhàkhoa học nghiên cứu khả sinh kháng sinh, chất kháng ung thƣ, enzyme, chất kí ch thích sinh trƣởng thực vật, ức chế vàkiểm soát bệnh thực vật 1.1.3.1 Kháng ung thư, kháng viêm Trong năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tí nh kháng, ức chế tế bào ung thƣ từ xạ khuẩn nội sinh hƣớng nghiên cứu nhàkhoa học giới Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với chủ Một số giả thuyết nhận định gen liên quan tới tổng hợp hợp chất cóhoạt tí nh sinh học đƣợc tiếp nhận từ q trình trao đổi chất VSV thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT) Nhờ nhà VSV học mở triển vọng sản xuất hợp chất sinh học cónguồn gốc từ thực vật nhờ qtrì nh ni cấy VSV, vídụ nhƣ chất kháng tế bào ung thƣ paclitaxel phổ biến thông đỏ (Taxus sp.) đƣợc tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatospora sp vàmột số nấm cộng sinh khác [39] Một số nghiên cứu gần cho thấy, tỷ lệ phát kháng sinh xạ khuẩn nội sinh có tỷ lệ khácao so với xạ khuẩn phân lập từ đất bề mặt thực vật Chẳng hạn kháng sinh cótên naphthomycin K (dẫn xuất kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) đƣợc phát lần từ Streptomyces sp CS nội sinh mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại thuốc cótác dụng điều trị ung thƣ, hoạt huyết Kết kiểm tra hoạt tí nh sinh học naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc ức chế dòng tế bào P388 vàA-549 nồng độ ức chế lần lƣợt là0,07 3,17 µM, nhƣng khơng có hoạt tí nh kháng Staphylococcus aureus vi khuẩn lao [40], [72] Ngoài ra, năm chất thuộc phân lớp 16 nhóm macrolide đƣợc tách chiết vàcho kết ức chế mạnh dòng tế bào MDA-MB-435 điều kiện in vitro [72]; hai chất thuộc nhóm macrolide thu nhận từ Streptomyces sp ls9131 gần đƣợc phân lập mỹ đăng mộc (M hookeri), hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thƣ mạnh vàhoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao [40] Trƣớc đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin 5, 7dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh, thƣờng thu nhận từ nhiều loài thực vật khác Nhƣng gần đây, nhiều cơng trì nh cơng bố hai hợp chất đƣợc tìm thấy S aureofaciens CMUAc130 nội sinh [63], [64] Hoạt tính kháng ung thƣ hai chất khơng hì nh thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 tác nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà cảm ứng nitric oxide synthase cyclooxygenase-2 lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW 264,7 Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất vàức chế hì nh thành TNF-α [63] 7 Do vậy, xạ khuẩn nội sinh lànguồn tiềm cần đƣợc quan tâm nhằm khai thác chất cóhoạt tí nh sinh học thúc đẩy tìm kiếm loại thuốc 1.1.3.2 Kiểm sốt sinh học Trong năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh thu hút ý nhàVSV khả kiểm soát sinh học mầm bệnh đặc tí nh nội sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh Nhiều nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ chủ xạ khuẩn nội sinh chống lại VSV gây bệnh từ đất nhƣ Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var tritici, F oxysporum, Pythium aphanidermatum Colletotrichum orbiculare [13], [18], [23], [24] Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào sản phẩm trao đổi chất nhƣ chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone Ngoài ra, chủng xạ khuẩn giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch thực vật nhờ kí ch thích thụ thể tế bào Vídụ nhƣ chủng S galbus R-5 khơng sinh cellulase, pectinase mà cịn sản xuất actinomycin X2 fungichromin giúp tăng cƣờng sức đề kháng đỗ quyên, tăng cƣờng sản sinh jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [57] Conn cộng (2008) công bố kết nghiên cứu gây nhiễm Streptomyces sp EN27 Micromonospora sp EN43 hạt giống Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia carotovora vàF oxysporum; kí ch hoạt biểu gen tổng hợp acid jasmonic, acid salicilic vàetylen [17] Mối liên hệ xạ khuẩn nội sinh với chủ vàcác sản phẩm tự nhiên cóhoạt tí nh sinh học đƣợc sinh xạ khuẩn nội sinh giúp tìm loại thuốc đặc hiệu cótiềm ứng dụng bảo vệ tăng suất trồng 1.1.3.3 Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh Ngồi đóng vai trị quan trọng chu trình tuần hồn vật chất thơng qua enzyme thủy phân ngoại bào khả sinh chất kháng sinh đƣợc khoa học biết đến từ lâu Gần đây, nghiên cứu xạ khuẩn phát nhiều sản phẩm trao đổi chất nhóm VSV có ý nghĩa quan trọng sức khỏe ngƣời Một số chủng xạ khuẩn cókhả sinh chất pháhủy tế bào hồng cầu động vật (nhƣ haemolysin Rhodococcus equi) Các nhà khoa học phát tiềm lớn hợp chất xạ khuẩn cótác dụng làm tan phần máu đông tụ ngƣời bị bệnh tim mạch Trong phịng thínghiệm, việc sàng lọc chất có hoạt tính chống đơng máu (phá hủy hồng cầu) từ xạ khuẩn đƣợc tiến hành mẫu máu động vật nhƣ máu ngựa, máu thỏ [53] Một vídụ khác làviệc tạo hợp chất cókhả chống lại tác nhân gây oxy hóa, làm tăng tuổi thọ tế bào Nguyên lýhoạt động chất chống ơxy hóa tìm thấy xạ khuẩn tƣơng tự nhƣ axit ascorbic (vitamin C) hay tocopherol (vitamin E), tức làtrung hịa thể oxy hóa cao hợp chất oxy hóa (đƣợc tạo q trình trao đổi chất tế bào hay dƣới tác dụng tia cực tím) vàlàm giảm tác dụng oxy hóa chúng [61] Năm 2011, nhóm nghiên cứu Sri phân lập 65 xạ khuẩn nội sinh 13 dƣợc liệu chữa bệnh tiểu đƣờng nhƣ lô hội (Alloe vera), dây ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ xanh (Curcuma aeruginosa), rau má(Centela asiatica) Trong đó, chủng thể hoạt tính alpha glucosidase ức chế quátrì nh thủy phân tinh bột thành glucose thẩm thấu vào ruột non Kết nghiên cứu tuyển chọn đƣợc chủng BWA65 có hoạt tí nh ức chế alpha glucosidase gấp hai lần so với chất cóhoạt tính tƣơng tự thu đƣợc từ dịch chiết dây kýninh [60] Mặc dù ý nghĩa khoa học hợp chất trao đổi chất kể sinh trƣởng cạnh tranh xạ khuẩn mơi trƣờng tự nhiên cịn chƣa rõ ràng nhƣng tác dụng màchúng mang lại lĩnh vực y dƣợc, dƣợc phẩm, nơng nghiệp đƣợc chứng minh Chính vìlý này, nhàkhoa học quan tâm tới việc sàng lọc hợp chất cóhoạt tí nh sinh học cao từ xạ khuẩn nói chung vàxạ khuẩn nội sinh nói riêng 1.1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới Trong vài thập kỷ qua chứng kiến nhiều thành tựu tìm kiếm lồi xạ khuẩn vàcác hợp chất cóhoạt tính sinh học từ xạ khuẩn môtế bào thực vật Do tiềm ứng dụng lớn xạ khuẩn nội sinh nên đối tƣợng VSV đƣợc quan tâm vànghiên cứu nhiều nƣớc giới nhƣ: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản… Sơ lƣợc tì nh hì nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh thực vật 10 năm gần đƣợc thể bảng 1.1 [51] Bảng 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu giới loài xạ khuẩn nội sinh thực vật Loài thực vật Chi xạ khuẩn Tài liệu tham khảo Cây trồng Lúa mì Streptomyces, Microbispora, [18] (Triticum aestivum) Micromonospora, Nocardioides Dƣa leo Streptomyces [57] Ngô Microbispora, Streptomyces, [10] (Zea mays) Streptosporangium (Cucumis sativus) Cây dƣợc liệu Cơm cháy Glycomyces [51] Riềng nếp Streptomyces, Nocardia, Microbispora, [64] (Alpinia galangal) Micromonospora Mộc lan Streptomyces [14] Sầu đâu Streptomyces, Streptosporangium, [31] (Azadirachta indica) Microbispora, Streptoverticillium, (Sambucus adnata) (Kennedia nigricans) Saccharomonospora, Nocardia 10 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh môthực vật phong phúhứa hẹn tiềm ứng dụng hợp chất có hoạt tí nh sinh học chủng xạ khuẩn sinh nhiều lĩnh vực đời sống Tuy nhiên, so với đa dạng giới thực vật, số lƣợng nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh thực vật hạn chế Trong 10 năm gần (2001-2012), nhàkhoa học thuộc Viện VSV học Vân Nam, Trung Quốc không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ƣu hóa điều kiện phân lập đƣa vào bảo tàng giống 5.000 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ 100 loài thực vật [50] Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp chủng xạ khuẩn sinh đƣợc chứng minh làrất đa dạng mặt số lƣợng vàhoạt tính sinh học nhƣ chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng tế bào ung thƣ, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng… Khi nghiên cứu đa dạng sinh học xạ khuẩn nội sinh, nhóm nghiên cứu Chen cộng thuộc Viện VSV học Vân Nam, Trung Quốc khẳng định xạ khuẩn nội sinh dƣợc liệu rừng nhiệt đới vơ phong phú Theo đó, Chen vàcộng thu nhận 2174 chủng xạ khuẩn môi trƣờng khác từ 90 loại dƣợc liệu rừng nhiệt đới Xishuangbanna xác định đƣợc có 19 lồi xạ khuẩn [15] Cũng từ chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập dƣợc liệu vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, nhiều hợp chất đƣợc phát nhƣ: 9-hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine … [12] 1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu VSV nội sinh nói chung xạ khuẩn nói riêng Một số nghiên cứu khác vi khuẩn, nấm nội sinh đƣợc tóm tắt nhƣ sau: 11 Nhóm nghiên cứu Lê Mai Hƣơng Viện Hóa hợp chất thiên nhiên thăm dò khả tạo chất taxol từ thông đỏ (Taxus sp.) Việt Nam tách chiết chất gần giống 10-deacetil baceatin III (10-DAB)-chất chuyển hóa thành taxol Từ thân cây, nhóm nghiên cứu phân lập đƣợc chủng nấm, chủng thuộc loài Mucor circinolloides var tieghem Chất tách chiết từ dịch lên men chủng nấm nội sinh có đặc điểm gần giống với 10-DAB từ thông đỏ Từ kết đó, khẳng định sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học khơng đƣợc tạo từ chủ mà cịn tạo VSV nội sinh [3] Từ 54 mẫu lúa (Oryza sativa L.) trồng huyện thành phố Tuy Hịa, Phú n, nhóm nghiên cứu Cao Ngọc Điệp phân lập 191 chủng vi khuẩn nội sinh, 27 chủng thuộc chi Burkholderia, Enterobacter, Bacillus có khả cố định đạm, hịa tan lân tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) tốt [7] Năm 2013, Hoàng Hoa Long cộng phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp B55 thuốc (Nicotiana attenuata) làm tăng khả sống sót kích thích sinh trƣởng chủ điều kiện tự nhiên thơng qua số chế nhƣ tổng hợp IAA, 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid deaminase (ACCd) hòa tan phosphat vơ Ngồi ra, đặc tính kích thích sinh trƣởng chủ chủng vi khuẩn có quan hệ mật thiết mật độ chúng bên mô chủ [5] Năm 2014, Quách Ngọc Tùng cộng phân lập đƣợc 78 chủng xạ khuẩn nội sinh mẫu quế thu thập xã Thung Nai, huyện Cao Phong, tỉnh Hịa Bình Đánh giá khả kháng vi sinh vật 78 chủng xạ khuẩn nội sinh cho thấy 16 chủng có khả sinh kháng sinh [8] Năm 2015, Khieu Thi Nhan cộng phân lập đƣợc 98 chủng xạ khuẩn nội sinh mẫu Long huyết thu thập Cúc Phƣơng, Ninh Bình 33 chủng xạ khuẩn nội sinh mẫu Long huyết thu thập Bạch Mã, Thừa Thiên Huế [33]  ... 3.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh Màng tang tỉnh Ph? ?Thọ 30 3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang 32 3.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận Màng tang 32 3.2.2 Đa dạng xạ khuẩn Màng tang. .. nghệ Việt Nam, gồm nội dung chính: - Phân lập đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh Màng tang thu thập tỉnh Phú Thọ - Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn nội sinh xác định có mặt... môi trƣờng phân lập 33 3.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 34 3.3 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 35 3.3.1 Khả kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn