Luận án nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (cinnamomum cassia presl) ở việt nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng streptomyces cavour

LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Phí Quyết Tiến, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam PGS TS Chu Kỳ Sơn, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt sở vật chất giúp tơi thực hồn thành luận án Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Thu Trang, TS Khiếu Thị Nhàn Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giúp đỡ, hợp tác nghiên cứu đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Gia Hy cán phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm với tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin gửi lời cám ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt cán phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa sinh biển giúp đỡ, hợp tác nghiên cứu hỗ trợ trang thiết bị kỹ thuật tốt để thực thành công nghiên cứu thực nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn tơi hồn thành thủ tục suốt trình học tập làm nghiên cứu sinh Viện Cuối xin cảm ơn bạn bè gia đình ln bên tơi, cổ vũ động viên tơi lúc khó khăn để hồn thành tốt luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn nội sinh thực vật dược liệu 1.1.1 Giới thiệu vi sinh vật xạ khuẩn nội sinh 1.1.2 Tương tác xạ khuẩn nội sinh thực vật 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội sinh công nghệ sinh học y dược 1.1.4 Phân lập xạ khuẩn nội sinh dược liệu 1.2 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh dược liệu 11 1.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh mô thực vật 11 1.2.2 Đa dạng di truyền xạ khuẩn nội sinh 12 1.2.3 Đánh giá đa dạng sinh học xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ cấp 15 1.3 Sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn nội sinh số nghiên cứu loài Streptomyces cavourensis 17 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh dược liệu 17 1.3.2 Các gen mã hóa enzyme tham gia q trình tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn 19 1.3.3 Nghiên cứu đặc tính xác định cấu trúc kháng sinh 24 1.3.4 Một số cấu trúc kháng sinh sinh tổng hợp xạ khuẩn 26 1.3.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn nội sinh 27 iii 1.3.6 Một số nghiên cứu xạ khuẩn Streptomyces cavourensis 30 1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Việt Nam tiềm khai thác xạ khuẩn nội sinh quế (Cinnamomum cassia Presl) 31 1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Việt Nam 31 1.4.2 Đặc điểm quế (Cinnamomum sp.) 33 1.4.3 Tiềm phân lập xạ khuẩn nội sinh quế (Cinnamomum sp.) 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu nghiên cứu 37 2.1.1 Mẫu nghiên cứu, chủng giống vi sinh vật dòng tế bào ung thư 37 2.1.2 Hóa chất thiết bị 37 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 38 2.2.1 Xác định thành phần số lượng vi sinh vật mẫu quế 38 2.2.2 Xác định khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 40 2.2.3 Phân loại chủng xạ khuẩn dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 42 2.2.4 Xác định đặc điểm sinh học xạ khuẩn 43 2.2.5 Tách chiết, giải trình tự phân tích hệ gen chủng xạ khuẩn YBQ59 44 2.2.6 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men thích hợp cho xạ khuẩn 46 2.2.7 Tách chiết, tinh xác định cấu trúc chất kháng khuẩn chủng xạ khuẩn 47 2.2.8 Xử lý thống kê 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Đa dạng khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) 48 3.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) 48 iv 3.2.1 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) 49 3.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn nội sinh 55 3.2.3 Phân tích trình tự gen 16S rDNA xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh 57 3.2.4 Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 61 3.2.5 Khả sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 62 3.3 Đặc điểm sinh học điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 63 3.3.1 Đặc điểm sinh học chủng S cavourensis YBQ59 64 3.3.2 Đặc điểm di truyền số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 67 3.3.3 Lựa chọn môi trường thích hợp sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 70 3.3.4 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh kháng sinh 71 3.3.5 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 73 3.3.6 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 75 3.3.7 Hoạt tính kháng sinh gây độc tế bào ung thư chủng S cavourensis YBQ59 76 3.4 Tách chiết, tinh đặc tính hoạt chất thứ cấp từ chủng S cavourensis YBQ59 78 3.3.1 Tách chiết tinh hoạt chất thứ cấp 78 3.3.2 Hoạt tính sinh học hợp chất tách từ chủng S cavourensis YBQ59 83 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 86 v 4.1 Đa dạng khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) 86 4.1.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) 86 4.1.2 Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn nội sinh 89 4.1.3 Phân tích trình tự gen 16S rDNA xạ khuẩn nội sinh kháng sinh 92 4.2 Đặc điểm sinh học điều kiện ni cấy thích hợp sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 93 4.2.1 Đặc điểm sinh học chủng S cavourensis YBQ59 93 4.2.2 Đặc điểm di truyền số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 94 4.2.3 Lựa chọn môi trường điều kiện nuôi cấy sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 96 4.3 Tách chiết, tinh đặc tính hoạt chất thứ cấp từ chủng S cavourensis YBQ59 102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ 116 LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 125 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu giới đa dạng sinh học xạ khuẩn nội sinh thực vật dược liệu 13 Bảng 1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh dược liệu 16 Bảng 1.3 Các chất chuyển hóa sinh tổng hợp xạ khuẩn sử dụng y học với chế sinh tổng hợp 22 Bảng 3.1 Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 297 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ quế 56 Bảng 3.2 Kết phân loại chủng xạ khuẩn nội sinh quế Hịa Bình, Lai Châu Yên Bái dựa kết phân tích trình tự gen 16S rRNA 58 Bảng 3.3 Sự phân bố chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ quế 60 Bảng 3.4 So sánh đặc điểm phân loại chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 với chủng S cavourensis với chủng tham chiếu 65 Bảng 3.5 Khả đồng hóa nguồn nitơ chủng S cavourensis YBQ59 66 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng S cavourensis YBQ59 76 Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư từ dịch lên men chủng YBQ59 77 Bảng 3.8 Tổng hợp hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng S cavourensis YBQ59 80 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất tinh từ chủng S cavourensis YBQ59 84 Bảng 3.10 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư chất tách từ chủng S cavourensis YBQ59 (IC50, μM) 85 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Q trình xâm nhập vào lỗ khí gian bào S galbus MBR-5 đỗ quyên sau 60 ngày quan sát Hình 1.2 Cấu trúc hóa học số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6) 18 Hình 1.3 Sơ đồ mơ tả hình thành chuỗn polyketide synthase gồm bốn mô đun riêng biệt A synthase bao gồm protein đa mơ đun đơn mã hóa gen chứa bốn mô đun enzyme, đặc trưng loại PKSI B Mỗi mơ đun có mặt protein loại PKS-II 21 Hình 1.4 Sơ đồ mơ tả hình thành chuỗn peptide gồm mơ đun mã hóa hai gen khác Sản phẩm tạo tetrapeptide 22 Hình 1.5 Cấu trúc số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline DOX, DNR, EPI IDA 27 Hình 1.6 Một số phận quế đơn (C cassia Presl) 33 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) Hịa Bình (A), Lai Châu (B) n Bái (C) phân lập số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy 49 Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phận quế (C cassia Presl): số liệu tổng hợp ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 50 Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh môi trường phân lập khác nhau: số liệu tổng hợp ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 51 Hình 3.4 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 53 Hình 3.5 Đa dạng di truyền 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa phân tích đa hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR Giếng M: Thang DNA chuẩn (100 viii bp); Giếng 1÷16 là: HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11; HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40; HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49; HBQ55; HBQ56; HBQ62 54 Hình 3.6 Hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 (A), P vulgaris (B), P aeruginosa (C), S epidermidis kháng methicillin (D) Hịa Bình; hoạt tính kháng S Typhimurium (E), S epidermidis kháng methicillin (F) Lai Châu P vulgaris (G), S epidermidis kháng methicillin (H) Yên Bái 55 Hình 3.7 Số lượng xạ khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ, thân, quế Hịa Bình, Lai Châu n Bái 57 Hình 3.8 Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS 96 chủng xạ khuẩn nội sinh quế Hòa Bình, Lai Châu Yên Bái 62 Hình 3.9 Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường chủng xạ khuẩn A: bổ sung acid; B: bổ sung kiềm 63 Hình 3.10 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng tuyển chọn Hịa Bình, Lai Châu Yên Bái 64 Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc (A) mơi trường ISP2 hình ảnh chuỗi bào tử bề mặt chuỗi bào tử chủng YBQ59 quan sát kính kiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 3000 X (B) 20.000 X (C) 65 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại dựa quan hệ di truyền trình tự gen 16S rRNA chủng S cavourensis YBQ59 chủng xạ khuẩn đại diện Bootstrap = 1000 lần lặp; Bar = 0,02 đại diện cho thay cho nucleotide 67 Hình 3.13 Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia q trình sinh tổng hợp kháng ung thư bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) kháng sinh macrotetrolide (ctg1114_1) (B) 69 ix Hình 3.14 Hoạt tính kháng S Typhimurium ATCC 14028 MRSE ATCC 35984 chủng S cavourensis YBQ59 môi trường lên men khác 71 Hình 3.15 Ảnh hưởng nguồn carbon đến hoạt tính kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 72 Hình 3.16 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 72 Hình 3.17 Ảnh hưởng nhiệt độ (A) pH (B) đến khả sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 73 Hình 3.18 Ảnh hưởng độ thơng khí bề mặt (A) tỷ lệ tiếp giống (B) đến khả sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 74 Hình 3.19 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 75 Hình 3.20 Sơ đồ phân lập tinh chế chất từ chủng S cavourensis YBQ59 78 Hình 4.1 Cấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein (1) (C21H38O4) 103 Hình 4.2 Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất M2B5.0: bafilomycin D (2) (C35H56O8) 105 Hình 4.3 Cấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4) 106 Hình 4.4 Cấu trúc hợp chất M2B8.3: 4’,7-dihydroxyisoflavone (daidzein (4)) (C15H10O4) 107 Hình 4.5 Cấu trúc hợp chất M2B7.5: 3'-hydroxydaidzein (5) (3',4',7trihydroxyisoflavone) (C15H10O5) 107 Hình Cấu trúc hợp chất M2B3.8: 5,11-Epoxy-10-cadinanol (6) (C15H26O2) 108 Hình 4.7 Cấu trúc hợp chất M2B4.3: prelactone B (7) (C9H16O3) 109 Hình 4.8 Cấu trúc hợp chất M2B6.17: daucosterol (8) (C35H60O6) 110 x 46 Hình Phổ 13C NMR hợp chất M2B5.0 Hình Phổ HSQC hợp chất M2B5.0 Hình Phổ HMBC hợp chất M2B5.0 47 Hình Phổ ESI-MS hợp chất M2B5.0 48 PHỤ LỤC 12 CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT NONACTIC ACID - M2B9.8 (3) Hình Phổ 1H NMR hợp chất M2B9.8 Hình Phổ 13C NMR hợp chất M2B9.8 49 Hình Phổ DEPT hợp chất M2B9.8 Hình Phổ HMBC hợp chất M2B9.8 50 PHỤ LỤC 13 CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT DAIDZEIN - M2B8.3 (4) (4’,7DIHYDROXYISOFLAVONE) Hình Phổ 1H NMR hợp chất M2B8.3 51 Hình Phổ 13C NMR hợp chất M2B8.3 Hình Phổ HSQC hợp chất M2B8.3 Hình Phổ HMBC hợp chất M2B8.3 52 Hình Phổ ESI-MS hợp chất M2B8.3 53 PHỤ LỤC 14 CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT 3′-HYDROXYDAIDZEIN - M2B7.5 (5) (3',4',7-TRIHYDROXYISOFLAVONE) Hình Phổ 1H NMR hợp chất M2B7.5 Hình Phổ ESI-MS hợp chất M2B7.5 54 PHỤ LỤC 15 CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT 5,11-EPOXY-10-CADINANOLM2B3.8 (6) Hình Phổ 1H NMR hợp chất M2B3.8 Hình Phổ 13C NMR hợp chất M2B3.8 55 Hình Phổ HSQC hợp chất M2B3.8 Hình Phổ HMBC hợp chất M2B3.8 56 Hình Phổ ESI-MS hợp chất M2B3.8 57 PHỤ LỤC 16 CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT PRELACTONE B - M2B4.3 (7) Hình Phổ 1H NMR hợp chất M2B4.3 Hình Phổ 13C NMR hợp chất M2B4.3 58 Hình Phổ HSQC hợp chất M2B4.3 Hình Phổ HMBC hợp chất M2B4.3 59 Hình Phổ ESI-MS hợp chất M2B4.3 60 PHỤ LỤC 17 PHỔ CỦA HỢP CHẤT DAUCOSTEROL - M2B6.17 (8) Hình Phổ 1H NMR hợp chất M2B6.17 PHỤ LỤC 18 PHIẾU GIÁM ĐỊNH MẪU CÂY QUẾ TẠI HỊA BÌNH, LAI CHÂU, N BÁI ... tổng hợp kháng sinh Từ lý nghiên cứu sinh thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đa dạng, khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh quế (Cinnamomum cassia Presl) Việt Nam đặc tính sinh học hoạt chất từ chủng Streptomyces. .. hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Việt Nam tiềm khai thác xạ khuẩn nội sinh quế (Cinnamomum cassia Presl) 1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Việt Nam Nguồn tài nguyên rừng Việt Nam bao... Streptomyces cavourensis YBQ59” MỤC TIÊU Đánh giá đa dạng, khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập miền Bắc Việt Nam tinh số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh,