Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (cinnamomum cassia presl) ở việt nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng streptomyces cavourensis YBQ59 tt

viện hàn lâm khoa học công nghệ việt nam viƯn c«ng nghƯ sinh häc VŨ THỊ HẠNH NGUN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59 Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 42 01 07 tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học hà nội - 2019 Cơng trình hồn thành Viện Cơng nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phí Quyết Tiến Viện Cơng nghệ sinh học PGS TS Chu Kỳ Sơn Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án phiên thức Viện Cơng nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Trang web Bộ GD&ĐT MỞ ĐẦU Một thành tựu y học đại phát triển chất kháng sinh kháng vi sinh vật (VSV) Cho đến nay, sử dụng kháng sinh phương thức quan trọng điều trị bệnh truyền nhiễm VSV gây Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc kháng sinh trở thành yếu tố dẫn tới xuất chủng VSV gây bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012) Theo Demain Sanchez (2009), VSV thay đổi tính kháng với thuốc kháng sinh sử dụng điều trị nhờ xuất đột biến thay đổi thơng tin di truyền Vì vậy, hướng nghiên cứu phát triển tác nhân kháng khuẩn ưu tiên nhiều nhà khoa học công ty dược phẩm giới (Alekshun, 2007) Theo Bérdy (2012), khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên sử dụng lâm sàng sinh tổng hợp xạ khuẩn Trong số 33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces đóng vai trò quan trọng cho thấy sinh tổng hợp 10.400 hợp chất Vì vậy, đa dạng xạ khuẩn tự nhiên nói chung XKNS nói riêng phong phú, hứa hẹn tiềm khai thác ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp xạ khuẩn nhiều lĩnh vực đời sống Ngồi ra, nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn sinh tổng hợp enzyme polyketide synthase (PKS) nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên việc nghiên cứu gen pks, nrps liên quan đến trình trao đổi chất thứ cấp hữu ích việc đánh giá tiềm sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ xạ khuẩn (Ayuso cs., 2005) Cho đến nay, nghiên cứu tài nguyên XKNS dược liệu Việt Nam công bố cần nghiên cứu nhằm bảo tồn, lưu giữ khai thác nguồn gen VSV địa Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu quế (Cinnamomum sp.) chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm chống ung thư (Singh cs., 1995; Tariq cs., 2006) nghiên cứu XKNS quế chưa công bố nhiều Trong nghiên cứu này, XKNS phân lập môi trường chọn lọc đa dạng sinh học XKNS đánh giá qua đặc điểm sinh học, phân bố, khả sinh kháng sinh đặc điểm di truyền Các chủng XKNS có hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế bào ung thư phổi, mang gen chức pks-I, pks-II, nrps sàng lọc Từ đó, nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp tách chiết, tinh hợp chất giải trình tự, lắp ráp de novo, dự đoán giải hệ gen XKNS tuyển chọn để tìm kiếm thơng tin gen liên quan đến q trình tổng hợp kháng sinh Từ lý nghiên cứu sinh thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng, khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh quế (Cinnamomum cassia Presl) Việt Nam đặc tính sinh học hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59” Mục tiêu Đánh giá đa dạng, khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập miền Bắc Việt Nam tinh số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 Nội dung nghiên cứu - Phân lập nghiên cứu đa dạng sinh học chủng XKNS quế (C cassia Presl) thu thập điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, n Bái Lai Châu - Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao xác định số gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn - Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết xác định số cấu trúc kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59 Những đóng góp luận án - Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng sinh XKNS quế (C cassia Presl) miền Bắc Việt Nam - Sàng lọc chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ rộng phân lập hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2), nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7), daucosterol (8), hợp chất 1, 3-8 phát lần đầu từ loài S cavourensis hợp chất 1, có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng kháng sinh cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư A549, MCF, Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM) Bố cục luận án Luận án gồm 150 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang, bảng, hình); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (11 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (37 trang, 10 bảng, 20 hình); Chương 4: Bàn luận kết (28 trang, hình); Kết luận kiến nghị (2 trang); Danh mục cơng trình cơng bố (2 trang); Tóm tắt luận án tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (28 trang với tài liệu tiếng Việt, 243 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (63 trang) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Thuật ngữ nội sinh “endophytic” đưa de Bary (1866), theo định nghĩa ông, “VSV nội sinh VSV sống bên mơ thực vật có khác biệt đáng kể so với loại VSV tìm thấy bề mặt thực vật” Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS chứng minh đa dạng mặt số lượng hoạt tính sinh học chất kiểm sốt sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, tiêu diệt tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng (Bacon White, 2000; Qin cs., 2011) Cho đến nhiều kháng sinh tìm munumbicin A-D (Castillo cs., 2002), celastramycin A-B (Pullen cs., 2002), kakadumycin (Castillo cs., 2003) demethylnovobiocin (Igarashi, 2004) từ XKNS có ứng dụng nông nghiệp, công nghiệp y dược (Golinska cs., 2015) XKNS nhóm VSV đa dạng nghiên cứu, có khả sinh chất có ích cho chủ (Golinska cs., 2015; Nalini Prakash, 2017) Theo quan niệm đó, đa dạng sinh học XKNS đa dạng thành phần loài, chi taxon, đồng thời đa dạng hợp chất tự nhiên có hoạt tính chúng sinh XKNS đa dạng mức độ đa dạng thay đổi vùng lấy mẫu loài thực vật khác Sự đa dạng chi số lượng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp môi trường phân lập (Qin cs., 2011; Nalini Prakash, 2017) Nghiên cứu mở hướng nghiên cứu VSV học ứng dụng Việt Nam, mà góp phần quan trọng việc xác định mức độ đa dạng sinh học nguồn tài nguyên XKNS số dược liệu Việt Nam Việc phát nguồn gen xạ khuẩn mới, tiềm nhằm ứng dụng phát triển sản phẩm chuyển hóa thứ cấp chúng sản sinh lĩnh vực nông nghiệp, y dược thực phẩm cách bền vững, không dẫn đến việc huỷ hoại chủ, bảo vệ đa dạng tài nguyên thực vật VSV Việt Nam cấp thiết CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu - Mẫu nghiên cứu: mẫu (rễ, thân, lá) quế thu thập từ xã Thung Nai, Cao Phong, Hòa Bình (20°47’21”N;105°21’20”E) độ cao 399 m, tháng 12/2013; mẫu từ xã Tân Hợp, Văn Yên, Yên Bái (21°53’14”B;104°35’9”Đ) độ cao 700 m, tháng 02/2014 mẫu từ xã Phăng Sơ Lin, Sìn Hồ, Lai Châu (22°21’41”B;103°16’4”Đ) độ cao 800 m, tháng 02/2014 Mẫu thực vật Cinnamomum cassia Presl lưu trữ tiêu phân loại vào tháng 01/2106 TS Nguyễn Thế Cường Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện HL KH&CN VN - Các chủng VSV kiểm định: Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 (viết rút gọn Salmonella Typhimurium ATCC 14028), Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus ATCC 11778, Proteus vulgaris ATCC 49132, Pseudomonas auroginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) ATCC 33591 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV Phòng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Các dòng tế bào ung thư: Hep3B (tế bào ung thư gan người); MCF7 (tế bào ung thư vú người) A549 (ung thư phổi người) cung cấp GS JeongHyung Lee, trường ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc 2.2 Phương pháp nghiên cứu Xử lý bề mặt mẫu thực vật phân lập XKNS theo Qin cs (2009) Đánh giá đa dạng di truyền DNA phản ứng BOX-PCR (Nurjasmi cs., 2009) Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định theo phương pháp Saadoun Muhana (2008) nồng độ ức chế tối thiểu (MIC50) theo Andrews (2001) Đánh giá khả sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline chủng xạ khuẩn phép thử màu theo Trease Evans (1996) Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II NRPS khuếch đại phản ứng PCR dựa mồi suy biến K1F ⁄M6R, KSaF ⁄KSaR, A3F ⁄A7R theo Li cs (2008) Xác định hoạt tính gây độc tế bào phương pháp so mầu MTT (3-(4,5dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) theo Cree (2011) Phân loại VSV phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA theo Sambrook cs (2001); so sánh độ tương đồng phần mềm Clustal W (Thompson cs., 1997); phát sinh loài theo phương pháp Maximum-likelihood, thuật toán gamma Kimura với giá trị bootstrap 1000 (Felsenstein, 1985; Tamura cs., 2013) Xác định đặc điểm sinh học xạ khuẩn định tên xạ khuẩn theo Sổ tay phân loại VSV Bergey (Holtet cs., 1989) Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (Shirling Gottlieb, 1966) Tách chiết giải trình tự hệ gen xạ khuẩn máy giải trình tự gen hệ IonTorrent PGM; hệ gen lắp ráp phần mềm VelvetOptimiser (Gladman Seemann, 2012); dự đoán gen theo phần mềm Prodigal (Hyatt cs., 2010), GeneMarkS (Besemer cs., 2001) antiSMASH (Blin cs., 2013; Weber cs., 2015) 10 Xác định cấu trúc CKS từ dịch lên men xạ khuẩn theo phương pháp đo phổ, phân tích cấu trúc phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR DEPT, HSQC, HMBC theo Nguyễn Đình Triệu (2005) 11 Xử lý thống kê: dùng toán thống kê, phần mềm Excel 2010 phần mền XLSTAT 2016 để phân tích độ sai lệch chiều (ANOVA) thực để phân tích khác biệt đáng kể (P=0,05) CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Sự đa dạng khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) 3.1.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) Từ 27 mẫu quế (C cassia Presl) thu thập từ vùng Tây Bắc, Việt Nam, sau xử lý bề mặt nuôi cấy môi trường phân lập đặc hiệu (TWYE, STA, HV, TA, SA, CA, SPA, RA ISP5), 6-8 tuần 28°Ccho thấy tỷ lệ chủng XKNS phân bố khơng (Hình 3.1) Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn nội sinh Hòa Bình (A), Lai Châu (B) n Bái (C) phân lập số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần ni cấy Nhìn chung, chủng xạ khuẩn phát triển chậm loại môi trường với số lượng đạt 2-3 chủng/mẫu Sau thời gian nuôi cấy từ 4-6 tuần, 297 chủng XKNS phân lập khiết từ phận cây, môi trường phân lập đặc hiệu khác (Phụ lục 5) Trong đó, 111 chủng từ mẫu quế Hòa Bình, chiếm 37,3%; 81 chủng từ Lai Châu, chiếm 27,3% 105 chủng từ Yên Bái, chiếm 35,4% Đặc điểm hình thái màu sắc khuẩn lạc XKNS đĩa thạch môi trường YIM38 cho thấy, số lượng xạ khuẩn khác tùy thuộc vào khu vực lấy mẫu 3.1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) 3.1.2.1 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo phận quế (C cassia Presl) Trong số 297 chủng xạ khuẩn phân lập Hòa Bình số lượng xạ khuẩn thu từ thân, rễ, đạt 60,4% (n=67), 26,1% (n=29) 13,5% (n=15) tổng 111 chủng XKNS; Yên Bái số lượng xạ khuẩn thu từ thân cao 38,2% (n=40), rễ 35,2% (n=37) thấp 26,7% (n=28) tổng 105 chủng XKNS (Hình 3.2A) Ngược lại số lượng xạ khuẩn phân lập từ quế Lai Châu đạt cao rễ 43,2% (n=35), tiếp đến thân 34,6% (n=28) thấp 22,2% (n=18) tổng 81 chủng XKNS Tuy nhiên, theo số liệu tổng hợp khu vực cho thấy, số lượng XKNS cao thân 45,5% (n=135) rễ 34,0% (n=101) thấp 20,5% (n=61) (Hình 3.2B) Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phận quế: số liệu tổng hợp ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 3.1.2.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) theo môi trường phân lập Theo nghiên cứu XKNS, phương pháp xử lý mẫu thành phần mơi trường yếu tố định đến kết phân lập, đánh giá đa dạng XKNS tìm lồi xạ khuẩn (Okazaki, 2003) Kết đánh giá đa dạng xạ khuẩn phân lập loại môi trường thể Hình 3.3 Số lượng XKNS vùng lấy mẫu đạt cao môi trường CA, STA đạt 20,5% 19,2%, số lượng XKNS mơi trường lại đạt từ 3,0-16,5% tổng số chủng xạ khuẩn phân lập (n=297) TA 19.2% SA 16.5% CA 7.7% 12.8% SPA HV 12.1% 3.0% 4.0% 4.0% ISP5 20.5% TWYE RA A STA Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh môi trường phân lập khác nhau: số liệu tổng hợp ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) B 3.1.2.3 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh quế (C cassia Presl) theo nhóm mầu khuẩn ty Mầu khuẩn ty coi tiêu chí để chọn lọc chủng xạ khuẩn môi trường phân lập, tránh chọn lọc chủng có đặc điểm hình thái, màu sắc giống Sự khác biệt màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn hình thành nhiều nguyên nhân khác như: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng, pH, (Shirling Gottlieb, 1966) Số lượng xạ khuẩn phân lập khu vực có màu sắc hệ khuẩn ty thuộc 6/7 nhóm mầu xuất với tỷ lệ khác Trong đó, tỷ lệ chủng xạ khuẩn phân lập thuộc nhóm màu xám cao (42,1%; n=125), vàng (22,6%; n=67), trắng (17,8%; n=53), đỏ (14,5%; n=43), xanh (2,00%; n=6)và tím(1,00%; n=3) tổng số chủng xạ khuẩn (n=297) (Hình 3.4) Xám Đỏ Trắng Xanh Vàng Tím 2.0% 1.0% 14.5% 0.0% 42.1% 22.6% 17.8% A B Hình 3.4 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 3.1.2.4 Sự đa dạng di truyền DNA số chủng xạ khuẩn nội sinh Trên sở 297 chủng XKNS chọn ngẫu nhiên 16 chủng XKNS phân lập quế HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11; HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40; HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49; HBQ55; HBQ56; HBQ62 lựa chọn để đánh giá đa dạng di truyền DNA phản ứng BOX-PCR Phân tích sản phẩm phản ứng BOX-PCR 16 chủng xạ khuẩn lựa chọn cho 15 băng có kích thước khác điện di tương ứng với 15 vùng gen khác hệ gen chủng xạ khuẩn (Hình 3.5) Xác định quan hệ di truyền cho thấy đa số chủng xạ khuẩn có độ tương đồng di truyền 90%, chứng tỏ chủng XKNS nghiên cứu có độ sai khác di truyền hệ gen XKNS Kết nghiên cứu bước đầu đánh giá đa dạng XKNS, cho thấy chủng XKNS phân lập từ quế có độ đa dạng di truyền cao hay tần suất phân lập chủng trùng lặp di truyền thấp Ngoài ra, đặc điểm hình thái 16 xạ khuẩn cho thấy tính đa dạng mầu sắc khuẩn lạc, hình dạng tế bào Hình 3.5 Đa dạng di truyền 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa phân tích đa hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR Băng M: Thang DNA chuẩn (100 bp) 3.1.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn nội sinh Kết nghiên cứu hoạt tính kháng 09 VSV kiểm định 297 chủng XKNS tổng hợp Bảng 3.1 Bảng 3.1 Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 297 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ quế Chủng vi sinh vật kiểm định Vi khuẩn Gram âm E coli ATCC 11105 P vulgaris ATCC 49132 S TyphimuriumATCC 14028 E aerogenes ATCC 13048 P aeruginosa ATCC 9027 Vi khuẩn Gram dương S lutea ATCC 9341 MRSE ATCC 35984 B cereus ATCC 11778 Nấm men C albicans ATCC 10231 Số chủng xạ khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định Hòa Lai Yên Bình Châu Bái (111) (81) (105) Tỷ lệ (%) Hòa Bình Lai Châu n Bái Tổng số 25 29 28 6 20 19 16 22,5 26,1 0,9 25,2 0,0 7,4 6,2 7,4 4,9 7,4 8,6 19,0 18,1 7,6 15,2 13,5 18,2 8,8 13,5 7,4 28 28 28 10 22 15 25,2 25,2 25,2 4,9 12,3 9,9 3,8 21,0 14,3 12,1 20,2 17,2 10 13 9,0 3,7 12,4 8,4 11 3.1.6 Khả sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline sinh tổng hợp xạ khuẩn phần lớn cho thấy độc tính khối u người dòng tế bào ung thư (Minotti cs., 2004; Nakashima cs., 2013) Ngồi ra, nhóm chất anthracycline từ xạ khuẩn nhóm chất có hiệu sử dụng phổ biến điều trị nhiều loại ung thư (McGowan cs., 2017) Trong số 96 chủng XKNS tuyển chọn có 70 chủng (72,9%) có khả sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline (chuyển màu cam với mơi trường acid tím mơi trường kiềm) Trong đó, chủng phân lập từ quế Yên Bái sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline chiếm tỷ lệ cao (31,3%), Hòa Bình (28,1%), Lai Châu (13,5%) Đặc biệt, 14/96 chủng XKNS khơng có khả sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline, 14 chủng lại có hoạt tính kháng khuẩn chống lại VSV kiểm định, hợp chất tạo xạ khuẩn khơng thuộc nhóm anthracycline 3.2 Đặc điểm sinh học điều kiện ni cấy thích hợp sinh kháng sinh chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 Từ kết sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định khả mang gen liên quan tới trình sinh tổng hợp kháng sinh sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin, luận án nghiên cứu sinh lựa chọn chủng S cavourensis YBQ59 thể phổ kháng rộng, kháng mạnh với 8/9 chủng VSV kiểm định cho nghiên cứu Đồng thời, chủng YBQ59 mang gen mã hóa PKSI, PKS-II, NRPS sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline Trong vi khuẩn gây bệnh E coli, P vulgaris, S Typhimurium P aeruginosa tác nhân gây bệnh cần ưu tiên kiểm soát phát triển kháng sinh điều trị theo khuyến cáo tổ chức y tế giới (WHO) công bố vào tháng 2/2017 Ngồi ra, chủng YBQ59 thể tính kháng khuẩn mạnh với S epidermidis kháng methicillin gây bệnh hội phổ biến người khó điều trị (Otto, 2009) Vì vậy, chủng YBQ59 tuyển chọn cho nghiên cứu đặc điểm sinh học, khai thác hệ gen, điều kiện lên men, thu hồi tách chiết chất có hoạt tính sinh học 3.2.1 Đặc điểm sinh học chủng S cavourensis YBQ59 Chủng YBQ59 phát triển tốt môi trường ISP2 pH 7,0, nhiệt độ 30°C với nồng độ NaCl 2% Nhiệt độ, pH, nồng độ muối đặc điểm có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng xạ khuẩn lên men thu nhận hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Kết nghiên cứu khả sử dụng nguồn carbon, nitơ chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 sử dụng hầu hết nguồn carbon (11/13) thử nghiệm ngoại trừ D-glucosamine, D-sorbitol, sử dụng 6/13 nguồn nitơ thử nghiệm (L-asparagin monohydrat, L-arginin, L-valin, L-methionin, Lthreonin, L-cystein) chủng YBQ59 có khả sinh số enzyme ngoại bào 12 urease, gelatinase, amylase, cellulase xylanase Dựa đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 có đặc diểm hình thái sinh lý-sinh hóa giống lồi S cavourensis (El-Naggar cs., 2016) Dựa vào so sánh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân tích trình tự gen 16S rRNA chủng YBQ59 định danh Streptomyces cavourensis YBQ59 với mã số GenBank MF950891 3.2.2 Đặc điểm di truyền số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 Dữ liệu giải trình tự máy giải trình tự gen hệ IonTorrent PGM chủng YBQ59 thu 2.856.000 đoạn DNA ngắn (read, từ 25-373 bp) với tổng dung lượng liệu 512.914.080 bp Tiền xử lý liệu tinh với 2.042.979 (71,5%) đoạn trình tự có điểm chất lượng 20 độ dài từ 36 đến 211 Lắp ráp de novo liệu tinh chủng S cavourensis YBQ59 phần mềm VelvetOptimser với kích thước k-mer = 87, ghép nối liệu cho thấy kích thước genome dự đốn 10.232.294 bp, bao gồm 4.428 đoạn ghép nối (contig), số N50=12.307 bp, contig dài nhất: 161.472 bp với độ bao phủ trung bình 26X tỷ lệ GC hệ gen 64% Dự đốn thích gene nhờ kết hợp ba phần mềm Prodigal, GeneMarkS (Besemer cs., 2001) NCBI Prokaryotic genome annotation pipeline (PGAP) version 4.5 (Tatusova cs., 2016) Đã giải 8.958 trình tự gen mã hố protein (protein-coding), 76 gen tRNA, operons rRNA 3.145 gen giả định (pseudogene) Trong số gen giải NCBI có 6758 gen có kết giải sở liệu Gene Ontology (GO) chiếm 73% số lượng gen thu chia thành 03 nhóm: nhóm Biological Process (các trình sinh học) chứa thơng tin q trình mà gen giải tham gia, nhóm Cellular component (thành phần tế bào bào quan) cung cấp thông tin vị trí hoạt động gen nhóm Molecular Function (chức phân tử) cho biết chức gen Thống kê kết thu từ Blast2GO PRO (Conesa cs., 2005), cho thấy nhóm Biological Process có số lượng gen thực q trình chuyển hóa nhiều với 6292 gen, nhóm Cellular component có nhiều gen hoạt động tế bào so với vị trí khác với 3083 gen nhóm Molecular Function cho biết số lượng gen thực hiên chức chuyển hóa chiếm phần lớn với 5961 gen Ngồi ra, giải hệ gen chủng S cavourensis YBQ59 sử dụng sở liệu KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa Goto, 2000) có 140 đường chuyển hóa (pathway) liên quan đến sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp Bên cạnh đó, tổng cộng 717 enzyme liên quan đến trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp, 158 enzyme trực tiếp liên quan đến 13 trình tổng hợp kháng sinh macrolide, ketolide (12, 14, 16 macrolide), cấu trúc peptide nonrobosomal, cấu trúc polyketide loại I loại II dự đoán khả sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 bao gồm penicillin, cephamycin C, nocardicin A, clavaminate, erythromycin A/B, oleandomycin, picromycin, methymycin, neomethymycin, avermectin, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, mithramycin, tetracenomycin C, elloamycin, rebeccamycin, vancomycin validamycin A A A B Hình 3.7 Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia q trình sinh tổng hợp kháng ung thư bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) kháng sinh macrotetrolide (ctg1114_1) (B) Ghi chú: Màu tím đậm ORF, mũi tên chiều tổng hợp protein A: Nhóm gen bao gồm gen ctg328_1 ctg328_2 dự đốn mang chức tổng hợp beta-ketoacyl, ngồi có NRPS/PKS motif tên PKSI-KS_m6 PKSI-KS_m3, domain vùng hoạt động cysteine B: gen ctg1114_1 mã hóa cho 3-oxoacyl synthase III, gen ctg1114_2 theo blast chưa xác định chức Hơn nữa, phân tích hệ gene chủng S cavourensis YBQ59 phần mềm antiSMASH v3.0 (Weber cs., 2015) cho thấy, hệ gene chủng S cavourensis YBQ59 chứa 37 nhóm gene liên quan đến trình sinh tổng hợp hợp chất trao đổi thứ cấp, 14 đường sinh tổng hợp liên quan tới sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học NRPS, PKS-II, hybrid PKS-NRPS, PKS-III, Beta-ketoacyl synthase hoạt chất dự đoán từ hệ gene chủng S cavourensis YBQ59 bao gồm bacteriocin, bleomycin, calyculin, coelimycin, colonic acid, chlorizidine A, desferrioxamine B, ectoine, arylpolyene, macrotetrolides, naringenin, landepoxcin, terpene svaricin Dữ liệu giải hệ gen chủng S cavourensis YBQ59 đăng ký NCBI mã số QLNH00000000 14 Trong số nhóm gen có gen ctg328_1 tham gia vào đường sinh tổng hợp chất kháng ung thư bleomycin có độ tương đồng 59% với gen bleom_AAG02357_H nguồn gốc từ Streptomyces verticillus ATCC 15003 (Du cs., 2000) ctg328_2 tham gia vào đường sinh tổng hợp chất kháng sinh jamaicamide với ctg328_1 có độ tương đồng 51% với gen JamM_AAS98784_H nguồn gốc từ Lyngbya majuscula (Edwards cs., 2004) (Hình 3.7A) Hai gen ctg1114_1 ctg1114_2 khác tham gia vào đường sinh tổng hợp kháng sinh macrotetrolide (Hình 3.7B) 3.2.3 Lựa chọn mơi trường sở điều kiện lên men thích hợp sinh kháng sinh chủng S cavourensis YBQ59 Chủng S cavourensis YBQ59 sinh tổng hợp chất kháng khuẩn cao mơi trường lên men MT6 với đường kính vòng vơ khuẩn kháng S Typhimurium ATCC 14028 MRSE ATCC 35984 đạt 25,6 mm 27,1 mm MT6 (g/l): CaCO3 1,0; tinh bột tan 10,0; bột đậu tương 10,0; nước cất 1000 ml lựa chọn làm môi trường lên men chủng YBQ59 nghiên cứu Điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng S cavourensis YBQ59 nuôi 25-37°C, pH 6,0-8,0; tỷ lệ tiếp giống 5%, độ thơng khí bề mặt (surface aeration) 20%, chủng cho hoạt tính kháng khuẩn cao Khi khảo sát độ thái lên men chủng S.cavourensis YBQ59 bình lên men Bioflo 110 lít kết cho thấy thời điểm thích hợp thu hồi kháng sinh 72-78 lên men với đường kính VVK VSV kiểm định S Typhimurium ATCC 14028 MRSE ATCC 35984 đạt 34,0 41,2 mm 3.2.4 Hoạt tính kháng sinh gây độc tế bào ung thư chủng S cavourensis YBQ59 Chủng S cavourensis YBQ59 có khả kháng 7/8 chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính VVK 20 mm hoạt tính kháng sinh mạnh chủng MRSE ATCC 35984 (đường kính VVK đạt 41,2 mm), S Typhimurium ATCC 14028 có hoạt tính kháng khuẩn với đường kính VVK 34,0 mm Chủng S cavourensis YBQ59 có hoạt tính kháng nấm men C albicans ATCC 10231 cao (đường kính VVK đạt 21,5 mm) (Bảng 3.3) Kết cho thấy chủng S cavourensis YBQ59 có tiềm sinh hợp chất kháng sinh ứng dụng điều trị nhiễm khuẩn người Chủng S cavourensis YBQ59 có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư mức độ khác (Bảng 3.4) Hoạt tính gây độc tế bào thể thông qua phần trăm tế bào sống sót, hai nồng độ 30 µg/ml 100 µg/ml lượng tế bào ung thư sống nhỏ 50% dòng tế bào A549 Hep3B, riêng với dòng tế bào ung thư vú MCF7 chủng S cavourensis YBQ59 ức chế nồng độ 30 15 µg/ml Từ đó, ta nghiên cứu ứng dụng để sản xuất loại thuốc có khả ức chế hoạt động dòng tế bào ung thư gan Hep3B, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF7 Trong khuôn khổ luận án hợp chất tách bước đầu sàng lọc khả kháng tế bào ung thư Việc đánh giá khả gây độc tế bào thường nghiên cứu sâu hoạt chất lựa chọn phát triển nghiên cứu lâm sàng Bảng 3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch lên men chủng S cavourensis YBQ59 Chủng vi sinh vật kiểm định Vi khuẩn Gram âm E coli ATCC 11105 Đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm)* 25,3e ± 0.12 P vulgarisATCC 49132 27,5d ± 0.11 S Typhimurium ATCC 14028 34,0c ± 0.08 P aeruginosa ATCC 9027 23,6f ± 0,21 E aerogenes ATCC 13048 25,5e ± 0.09 Vi khuẩn Gram dương S lutea ATCC 9341 0h MRSAATCC 35984 41,2a ± 0.14 B cereus ATCC 11778 30,2b ± 0.17 Nấm men 21,5g ± 0.13 C.albicans ATCC 10231 Ghi chú: Các chữ a, b, c, d, e, f, g, h cột khác có ý nghĩa thống kê theo đánh giá Fisher (p 100a >100a M2B8.3 Daidzein (4) 30,8b ± 1,91 >100a >100a M2B7.5 3′-Hydroxydaidzein (5) 7,8b ± 1,23 >100a >100a M2B3.8 5,11-Epoxy-10cadinanol (6) 65,1a ± 2,12 >100a >100a M2B4.3 Prelactone B (7) 15,6b ± 1,02 >100a >100a Camtothecin (Đối chứng dương) 2,4b ± 0,56 36,1b ± 2,94 18,3c ± 2,32 Ghi chú: Các chữ a, b, c cột khác có ý nghĩa thống kê theo đánh giá Fisher (p