Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (cinnamomum cassia presl) ở việt nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng streptomyces cavourensis YBQ59

VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ Cinnamomum cassia Presl Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Strep

VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG

SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN

CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ

ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG

Streptomyces cavourensis YBQ59

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Phí Quyết Tiến

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Chu Kỳ Sơn

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Hà Nội, năm 2019

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Phí Quyết Tiến, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS TS.

Chu Kỳ Sơn, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội đã tận tnh hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vậtchất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thànhluận

án

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Thu Trang, TS Khiếu Thị

Nhàn Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách

khoa Hà Nội đã giúp đỡ, hợp tác nghiên cứu đề tài luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Gia Hy và các cán bộ phòng Công nghệ

lên men, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinhnghiệm với tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cám ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt và các cán bộ phòng Hoạt chất

sinh học, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ, hợp tác trong nghiên cứu và hỗ trợ cáctrang thiết bị kỹ thuật tốt nhất để tôi thực hiện thành công các nghiên cứu thựcnghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào

tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tnh hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủtục trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và độngviên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với cáccộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và chophép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên

ii

LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 4

1.1.1 Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh 4

1.1.2 Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật 6

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược 7

1.1.4 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 9

1.2 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 11

1.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật 11

1.2.2 Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh 12

1.2.3 Đánh giá đa dạng sinh học của xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ cấp 15

1.3 Sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu về loài Streptomyces cavourensis

17 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 17

1.3.2 Các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn

19 1.3.3 Nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc kháng sinh 24

1.3.4 Một số cấu trúc kháng sinh sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn 26

iii

1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tại Việt Nam và tềm năng khai

thác xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) 31

1.4.1 Tình hình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam 31

1.4.2 Đặc điểm của cây quế (Cinnamomum sp.) 33

1.4.3 Tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum sp.) 34

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu nghiên cứu

37 2.1.1 Mẫu nghiên cứu, chủng giống vi sinh vật và các dòng tế bào ung thư 37

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 37

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu

38 2.2.1 Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu quế 38

2.2.2 Xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh 40

2.2.3 Phân loại các chủng xạ khuẩn dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 42

2.2.4 Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 43

2.2.5 Tách chiết, giải trình tự và phân tích hệ gen của chủng xạ khuẩn YBQ59 44

2.2.6 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp cho xạ khuẩn 46

2.2.7 Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn 47

2.2.8 Xử lý thống kê 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48

3.1 Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl)

48 3.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) 48

3.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh 553.2.3 Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh 573.2.4 Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và

nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp khángsinh 613.2.5 Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 62

3.3 Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng

Streptomyces cavourensis YBQ59 63

3.3.1 Đặc điểm sinh học của chủng S cavourensis YBQ59 64

3.3.2 Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh

của chủng S cavourensis YBQ59 67 3.3.3 Lựa chọn môi trường thích hợp sinh kháng sinh của chủng S cavourensis

YBQ59 703.3.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh kháng sinh 71

3.3.5 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S

3.3.1 Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp 78

3.3.2 Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng S cavourensis

YBQ59 83

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 86

4.1.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) 86

4.1.2 Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh 89

4.1.3 Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh kháng sinh 92

4.2 Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 93

4.2.1 Đặc điểm sinh học của chủng S cavourensis YBQ59 93

4.2.2 Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 94

4.2.3 Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 96

4.3. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S cavourensis YBQ59

102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ 116

LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 116

TÀI LIỆU THAM KHẢO 125

Bảng 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về đa dạng sinh học của xạ

khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 13

Bảng 1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược

liệu 16

Bảng 1.3 Các chất chuyển hóa được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn được sử dụng

trong y học với các cơ chế sinh tổng hợp 22

Bảng 3.1 Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ

khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế 56

Bảng 3.2 Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình,

Lai Châu và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA 58

Bảng 3.3 Sự phân bố của các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế 60

Bảng 3.4 So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59

với các chủng S cavourensis với các chủng tham chiếu 65

Bảng 3.5 Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của chủng S cavourensis YBQ59 66 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chủng S cavourensis YBQ59 76

Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của từ dịch lên men của chủng

YBQ59 77

Bảng 3.8 Tổng hợp các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng S cavourensis YBQ59 80 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn các hợp chất tinh sạch từ chủng S cavourensis

YBQ59 84

Bảng 3.10 Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các chất tách được từ

chủng S cavourensis YBQ59 (IC50, μM) 85

vii

Hình 1.1 Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S galbus MBR-5 trên lá

đỗ quyên sau 60 ngày quan sát 6

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6) 18 Hình 1.3 Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn polyketide bởi synthase gồm bốn mô đun

riêng biệt A synthase bao gồm một protein đa mô đun đơn được mãhóa bởi một gen duy nhất chứa bốn mô đun enzyme, đặc trưng của loạiPKS-

I B Mỗi mô đun có mặt trên một protein của loại PKS-II 21

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn peptide gồm 4 mô đun và được mã hóa bởi

hai gen khác nhau Sản phẩm tạo ra là tetrapeptide 22

Hình 1.5 Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline

DOX, DNR, EPI và IDA 27

Hình 1.6 Một số bộ phận của cây quế đơn (C cassia Presl) 33 Hình 3.1 Khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) tại Hòa

Bình (A), Lai Châu (B) và Yên Bái (C) phân lập trên một số môi trường đặc

hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy 49

Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây quế (C cassia Presl): số

liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 50

Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các môi trường phân lập khác nhau: số liệu

tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 51

Hình 3.4 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp tại ba

vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 53

Hình 3.5 Đa dạng di truyền của 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa trên phân tích đa

hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR Giếng M: Thang DNA chuẩn (100

HBQ62 54

Hình 3.6 Hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 (A), P vulgaris (B), P aeruginosa

(C), S epidermidis kháng methicillin (D) tại Hòa Bình; hoạt tính kháng S Typhimurium (E), S epidermidis kháng methicillin (F) tại Lai Châu P.

vulgaris (G), S epidermidis kháng methicillin (H) tại Yên

Bái 55

Hình 3.7 Số lượng xạ khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ,

thân, lá trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái 57

Hình 3.8 Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của 96 chủng

xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái 62

Hình 3.9 Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng xạ khuẩn A: bổ

sung acid; B: bổ sung kiềm 63

Hình 3.10 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng tuyển chọn ở Hòa

Bình, Lai Châu và Yên Bái 64

Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trường ISP2 và hình ảnh chuỗi bào tử

và bề mặt chuỗi bào tử của chủng YBQ59 được quan sát dưới kính kiển

vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 3000 X (B) và 20.000 X (C) 65

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại dựa trên quan hệ di truyền giữa các trình tự

gen 16S rRNA của chủng S cavourensis YBQ59 và các chủng xạ khuẩn

đại diện Bootstrap = 1000 lần lặp; Bar = 0,02 đại diện cho sự thay thếcho mỗi nucleotide 67

Hình 3.13 Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp kháng ung thư

bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) và kháng sinh macrotetrolide (ctg1114_1) (B) 69

ix

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính kháng sinh của chủng S

cavourensis YBQ59 72

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 72

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 73

Hình 3.18 Ảnh hưởng của độ thông khí bề mặt (A) và tỷ lệ tiếp giống (B) đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 74

Hình 3.19 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 75

Hình 3.20 Sơ đồ phân lập và tinh chế các chất sạch từ chủng S cavourensis YBQ59 78

Hình 4.1 Cấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein (1) (C21H38O4) 103

Hình 4.2 Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất M2B5.0: bafilomycin D (2) (C 35 H 56 O 8 ) 105

Hình 4.3 Cấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4) 106

Hình 4.4 Cấu trúc hợp chất M2B8.3: 4’,7-dihydroxyisoflavone (daidzein (4)) (C15H10O4) 107

Hình 4.5 Cấu trúc hợp chất M2B7.5: 3'-hydroxydaidzein (5) (3',4',7- trihydroxyisoflavone) (C15H10O5) 107

Hình 4 6 Cấu trúc hợp chất M2B3.8: 5,11-Epoxy-10-cadinanol (6) (C15H26O2) 108

Hình 4.7 Cấu trúc hợp chất M2B4.3: prelactone B (7) (C9H16O3) 109

Hình 4.8 Cấu trúc hợp chất M2B6.17: daucosterol (8) (C35H60O6) 110

x

Chữ viết tắt Chú thích

DEPT Detortionless enhancement by polarization transfer (Phổ

DEPT)

xi

ESI-MS Khối phổ lượng ion hóa phun mù điện tử

FT-IR Phổ hồng ngoại Fourtier

GC-MS Sắc ký khí-khối phổ

GISA Glycopeptides intermediate và Staphylococcus aureus

GO Dữ liệu gene ontology

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HepG2 Tế bào ung thư gan ở người

Hep3B Tế bào ung thư gan ở người

HGT Chuyển gen ngang (Horizontal gene transfer )

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation (Phổ HMBC)

HMEC Ung thư vú ở người

HSQC Heteronuclear single quantum coherence (Phổ HMQC)

IAA Indole-3-acetic acid

IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm

ITC Isatin-3-thiosemicarbazone

KB Ung thư cổ tử cung ở người

GEGG Kyoto encyclopedia of genes and genomes

MDA-MB-435 Tế bào ung thư tuyến vú ác tính ở người

ME-180 Tế bào ung thư cổ tử cung

MIC Nồng độ ức chết tối thiểu (Minimum inhibitory concentration)

MS Khối phổ

MRSA Staphylococcus aureus kháng methicillin

MRSE Staphylococcus epidermidis kháng methicillin

MTT 3-(4,5-d i m e t h y l thi a zol-2-yl)-2,5-diphe n y ltetrazolium bromideN50 Đánh giá chất lượng lắp ráp

NCBI Ngân hàng cơ sở dữ liệu

NR Cơ sở non-redundant

xiii

NRPs nonribosomal peptide

OD Mật độ quang

Ox Oxy hóa

P388 Ung thư bạch cầu

PCP Peptidyl carrier protein

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction)

PGAP Prokaryotic genome annotation pipeline

PK Polyketide

PKS Polyketide synthase

PKS-I Polyketide synthase type I

PKS-II Polyketide synthase type II

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SEM Kính hiển vi điện tử quét

SK-BR-3 Tế bào ung thư vú ở người

SK-LU-1 Tế bào ung thư phổi ở người

SKK Sinh khối khô

MỞ ĐẦU

Một trong những thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất khángsinh và kháng vi sinh vật (VSV) Cho đến nay, sử dụng kháng sinh là phương thứcquan trọng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV gây ra Tuy nhiên việc lạmdụng thuốc kháng sinh đã trở thành yếu tố chính dẫn tới xuất hiện các chủng VSVgây bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012) Theo Demain và Sanchez (2009), VSV đã vàđang thay đổi tính kháng với các thuốc kháng sinh hiện đang sử dụng trong điều trịnhờ xuất hiện các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền Vì vậy, hướngnghiên cứu và phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là ưu tiên của nhiềunhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới (Alekshun, 2007) Bên cạnhđiều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV, việc tìm kiếm và phát hiện các hợp chất cóhoạt tính sinh học như có hoạt tính kháng tế bào ung thư, kháng viêm cũng lànhững vấn đề mang tính toàn cầu

Trong khoảng 20 năm gần đây, nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh (XKNS) trêncây dược liệu đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học, công ty dược phẩm

do XKNS cho thấy tiềm năng lớn sinh tổng hợp các chất kháng sinh, kháng u,chất kích thích tăng trưởng thực vật, các loại enzym và chính XKNS cũng có thể gópphần tăng cường sức sống của cây chủ cũng như mang lại những tính chất dược lýcho cây dược liệu Theo Bérdy (2012), khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc

tự nhiên được sử dụng trong lâm sàng được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn Trongsố

33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces đóng vai trò quan trọng và cho thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp

chất Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự nhiên nói chung và XKNS nói riêngrất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và ứng dụng các hợp chất có hoạt tínhsinh học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều lĩnh vực của đời sống Ngoài ra,nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn được sinh tổng hợpbởi các enzyme polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase

(NRPS) nên việc nghiên cứu những gen pks, nrps liên quan đến quá trình trao đổi

chất thứ cấp

rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ

xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005) Cho đến nay, rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNStrên cây dược liệu Việt Nam được công bố và cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn,lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa

Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã

được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chốngung thư (Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNStrên cây quế chưa được công bố nhiều Trong nghiên cứu này, các XKNS đượcphân lập trên các môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánhgiá qua đặc điểm sinh học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm ditruyền Các chủng XKNS có hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế

bào ung thư phổi, mang các gen chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc Từ đó,

nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp

chất và giải trình tự, lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được

tuyển chọn để tìm kiếm thông tin về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp

kháng sinh Từ những lý do trên nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự

đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế

(Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59”

MỤC TIÊU

Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh

trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh

sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và

các gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces

cavourensis YBQ59.

NỘI DUNG

1 Phân lập và nghiên cứu sự đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh

trên cây quế (C cassia Presl) tại các điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, Yên Bái và Lai

Châu

2 Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao và xác định một số genliên quan đến tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn

3 Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết và xác định một số cấu

trúc kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CHO LUẬN ÁN

- Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng

sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam.

- Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ

rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2), nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7), daucosterol (8), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện

lần đầu từ loài S cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng

kháng sinh cao (MIC50 8,5-30,3 g/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thưA549, MCF, Hep3B (IC50 3,6-24,7 M)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu

1.1.1 Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh

Thuật ngữ nội sinh “endophytic” lần đầu tiên được định nghĩa bởi de Barynăm 1866, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sựkhác biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật” (deBary, 1866) Khái niệm khác về XKNS được đưa ra khi Smith (1957) phân lập

thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp có khả năng ức chế nấm gây bệnh

Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh Tuy nhiên, định

nghĩa được các nhà VSV học thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000)

“VSV nội sinh là VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra nhữnghiệu ứng xấu tới cây chủ”; VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng màcòn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, chống côntrùng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất (Staniek và cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017) Các hợp chất có hoạt tính sinh học

từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh họcnhư các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, ức chếphát triển tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kíchthích sinh trưởng (Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011; Kaishing và cs., 2018).Nấm, vi khuẩn và XKNS đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất

có hoạt tính sinh học như alkaloid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone,flavonoid, quinol, phenol và thuốc trừ sâu tự nhiên azadirachtin cũng được sảnxuất bởi VSV nội sinh hiện đang được ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và

y dược (Li và cs., 2008; Molina và cs., 2012; Golinska và cs., 2015; Ganapathy vàNatesan, 2018; Singh và Dubey, 2018)

Vi khuẩn: hơn 200 chi từ 16 ngành vi khuẩn đã được công bố là nội sinh

trong thực vật, phần lớn các loài thuộc ngành Actnobacteria, Proteobacteria và

Firmicutes (Golinska và cs., 2015) Vi khuẩn nội sinh thuộc nhóm vi khuẩn Gram

dương và Gram âm: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus,

Brevibacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Enterobacter, Gluconobacter… (Sun và cs., 2013) Saini và cs (2016) đã phân lập được 166

chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ của các loại cây lương thực như: đậu hồi (Cicer

arietnum), đậu (Pisum satvum), lúa mì (Tritcum aestvum) và yến mạch (Avena satva) Vi khuẩn nội sinh đa dạng trong tự nhiên và có khả năng sinh các chất

chuyển hóa sinh học khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn và chống tế bào ung thư

Xạ khuẩn: Trong những năm gần đây, XKNS thu hút sự quan tâm của các

nhà khoa học, nhiều báo cáo khoa học về XKNS trên nhiều loại thực vật khác nhau

đã được công bố như các loại từ cây lương thực như lúa mì, ngũ cốc, gạo, cà chua,

cà rốt và khoai tây, cam quýt (Araújo và cs., 2000; Coombs và Franco, 2003) đếncác cây dược liệu (Taechowisan và cs., 2003; Golinska và cs., 2015; Nalini và

Prakash, 2017) XKNS phân lập được chủ yếu thuộc chi Streptomyces,

Microbispora, Micromonospora, Nocardioides, Nocardia và Streptosporangium.

XKNS được chứng minh mang lại nhiều lợi ích như cải thiện hoặc thúc đẩy quátrình tăng trưởng thực vật, làm giảm các triệu chứng bệnh thực vật thông qua mộtloạt các cơ chế như sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp có khả năng tiêu diệtcác loại mầm bệnh do nấm hay côn trùng gây ra (Igarashi và cs., 2002) Nhiều chất

kháng sinh mới được tm thấy do xạ khuẩn Streptomyces spp sinh tổng hợp như

alnumycin, munumbicin A, D hay coronamycin (Castillo và cs., 2007; Nalini vàPrakash, 2017) Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu về việc tm kiếm XKNS mới

đã được công bố (Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017)

Vì vậy, XKNS được kỳ vọng như một nguồn cung cấp tiềm năng trong việc phát hiện

ra các hợp chất có hoạt tính sinh học mới

Nấm nội sinh: trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770

loại nấm nội sinh đã được phân lập Các loài đã được định tên nhiều nhất là:

Altenaria spp.; Altenaria infectoria; Aspergillus spp.; Colletrotrichum spp.; C gloeosporioides; Guignardia spp.; Nigrospora oryzae; N sphaerica; Penicillium

spp.; Phomopsis spp.; Rhizoctonia spp.; Xylaria spp Gần đây, Daisy và cs (2002)

đã phân lập được hai chủng nấm nội sinh mới là chủng Muscodor albus từ cây quế (Cinnamomun zeylanicum) và Muscodor roseus từ hai cây trong rừng nhiệt đối tại

Úc Hai chủng nấm sản sinh một số hợp chất trao đổi thứ cấp hoạt tính ức chế, tiêudiệt nấm và vi khuẩn hại cây

1.1.2 Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật

Nhiều nhà khoa học đã đưa ra các hình ảnh mô tả sự xâm nhập của các xạkhuẩn trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế nội sinh của VSVnội sinh vẫn là một ẩn số (Sardi và cs., 1992)

Hình 1.1 Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S galbus MBR-5 trên lá

đỗ quyên sau 60 ngày quan sát

(Nguồn: Clark và Mattews, 1987)

Ghi chú: (a) quá trình xâm nhập vào lỗ khí Khuẩn ty được gắn trên vật liệu electron (G: tế bào bảo vệ) (b) các tế bào hệ sợi (mũi tên) trong khoang gian bào bên dưới lớp biểu bì (E: tế bào biểu bì; IS: khoang gian bào; M: tế bào mesophyll).

Suzuki và cs (2005) đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá và thân cây

đỗ quyên của chủng S galbus MBR-5 bằng cách quan sát qua kính hiển vi điện tử, cho hệ khuẩn ty của chủng S galbus MBR-5 vào lá thông qua các lỗ khí nhưng

không thông qua lớp biểu bì, vì lớp biểu bì còn nguyên vẹn (Hình 1.1) Ngoài ra,chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân nhưxylanase, cellulase và pectinase VSV nội sinh đã tự thích nghi trong suốt thời giandài cùng với sự đồng tiến hóa của cây chủ qua gen điều hòa (Qin và cs., 2010) Mộtgiả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho các chất có hoạt tính sinh họcđược sinh ra từ quá trình trao đổi giữa VSV và thực vật thông qua chuyển genngang (HGT - horizontal gene transfer) VSV nội sinh sản sinh ra một số hợp chất

để duy

trì mối quan hệ cộng sinh với cây chủ, thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúpchúng tồn tại được trong cây chủ (Golinska và cs., 2015).

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược

Trong thời gian gần đây, XKNS liên quan đến thực vật, đặc biệt là cây dượcliệu đã được chứng minh là tạo ra các hợp chất có giá trị trị liệu cao (Singh vàDubey, 2018) Các nghiên cứu về XKNS đã xác định được nhiều sản phẩm tự nhiênmới, đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học như: 9-hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycinB1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide,bafilomycin C2 amide; caryolane-1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-

1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8-(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, tripstretine… (Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017)

Các chất kháng ung thư và chống viêm từ xạ khuẩn nội sinh

Hoạt chất paclitaxel từ Kitasatospora sp được phân lập từ cây thanh tùng Ý (Taxus baccata) (Caruso và cs., 2000; Janso và Carter, 2010) là báo cáo đầu tiên về

sản xuất taxol từ XKNS có hoạt tính kháng tế bào ung thư Trong số các hợp chất cóhoạt tính chống ung thư, nhiều hợp chất có chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt,chưa từng phát hiện từ các nguồn tự nhiên khác naphthomycin K (dẫn xuất củakháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phân lập đầu tiên từ

chủng Streptomyces sp CS nội sinh trên cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) –

loại cây thuốc có tác dụng điều trị hung thư, hoạt huyết… Kết quả kiểm tra hoạttính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc với hai dòng tế bàoung thư: ung thư bạch cầu (P388) và ung thư phổi (A549) ở người với giá trị IC50

thấp là 0,07 và 3,17 μM, nhưng không có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và

vi khuẩn lao (Lu và Shen, 2007) Năm hợp chất macrolide 16 thuộc họ bafilomycincũng được phân lập từ XKNS và cho thấy hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú

ở người (MDA-MB-435) bằng in vitro (Li và cs., 2010) Hai hợp chất

anthraquinone mới là lupinacidin A và B được chiết từ dịch lên men của chủng xạ

khuẩn Micromonospora lupine Lupinacidin có khả năng ức chế sự phát triển của tế

bào ung thư biểu mô ruột kết ở người 26-L5 (Igarashi và cs., 2007) Kim và cs.(2006) đã phân lập được hoạt chất 2 6-alkylsalicylic acid mới là salaceyin A và B từ

chủng S laceyi MS53 nội sinh trên cây thầu dầu Các kết quả khảo sát hoạt tính

chống ung thư cho thấy, salaceyin A và B thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư

vú ở người (SK-BR-3) với IC50 thấp lần lượt là 3,0 và 5,5 μg/ml Mặt khác,

pterocidin được phân lập từ chủng S hygroscopicus TP-A0451, cho thấy hoạt tính

gây độc với một số dòng tế bào ung thư ở người với giá trị IC50 trong khoảng 7,1 µM (Igarashi và cs., 2006)

2,9-Trước đây, hai hợp chất 5, phenylcoumarin và 5, p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh, thường thu

7-dimetoxy-4-nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau Nhưng gần đây, Chủng S aureofciens CMUAcl30 phân lập từ cây gừng (Zingiber officinale Rose) có khả năng sinh tổng

hợp các hợp chất kháng nấm và chống ung thư như 4-arylcoumarin (5, dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin và 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin).Hơn nữa, hoạt chất 4-acrylocoumarin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tếbào ung thư phổi Lewis (LLC) ở chuột BDF-1, bằng cách tiêm hoạt chất này vào ổbụng của chuột Giá trị ức chế sự tăng trưởng của khối u (T/C treatment-to-control) của

7-5, 7 dimhoxy1-4-p methoxylphenylcoumarin là 80,8 và 50,0% ở liều 1 và 10 mg/kg,trong đó 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin là 81,6 và 44,9% ở liều 1 và 10 mg/kg.Hai hợp chất chống ung thư này có độc tính thấp trong đường ruột ở chuột vàchỉ gây độc với các dòng tế bào ác tính và không gây độc tế bào thường(Taechowisan và cs., 2007)

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Ngày nay, nhiều loại thuốc kháng sinh mới được tổng hợp từ XKNS trên câydược liệu có khả năng kháng khuẩn, nấm và virus Năm 2005, Guan và cs đã phânlập được ba nhóm hoạt chất mới có khả năng kháng khuẩn là p-aminoacetophenic

của 7-(4-aminophenyl)-2,4-dimethyl-7-oxo-hept-5-enoic acid,

(9-(4-aminophenyl)-7-hydroxy-2,4,6-trimethyl-9-oxo-non-2-enoic acid và hydroxy-6-(1-hydroxyethyl)-7,9-dimethyl-12-oxo-dodeca-2,4 dienoic acid từ chủng

12-(4-aminophenyl)-10-S griseus subsp., nội sinh trên cây ngập mặn (Kandelia candel) (Guan và cs.,

2005) Taechowisan và cs (2005) đã công bố một số chất có hoạt tính kháng khuẩn

từ chủng S aureofaciens CMUAc130 nội sinh trên cây gừng (Zinger officinale) như

5,7-dimethoxy-4-(p-methoxy)-phenylcoumarin, 5,7-dimethoxy-4- phenylcoumarin,vanillin, 3-methoxy-4-hydroxytoluene và các chất kháng sinh kaempferol,

isoscutellarin, umbelliferone và cichorii từ chủng Streptomyces sp Tc052 nội sinh trên cây giềng nếp (Alpinia galangal).

1.1.4 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

Năm 1886, chi xạ khuẩn Frankia đã được phân lập từ nốt sần của một cây

không thuộc họ đậu (Okazaki, 2003) Tiếp đó, Baker và cs (1980) lần đầu tiên phân

lập được XKNS từ rễ cây Elaeagnus umbellate Như vậy, số lượng XKNS phân lập

được phụ thuộc vào cây thực vật, độ tuổi, loại mô, phân bố địa lý, môi trườngsống, mùa lấy mẫu, cách khử trùng bề mặt, lựa chọn môi trường và điều kiện nuôicấy (Coombs và Franco, 2003; Hallmann và cs., 2006) Theo các công bố, quátrình phân lập XKNS cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấmtrên bề mặt Thông thường, việc xử lý bề mặt được thực hiện bằng cách xử lý các

mô thực vật với chất oxy hóa hoặc chất khử trùng nói chung trong một khoảng thờigian, sau đó mô thực vật được rửa với nước cất khử trùng Các chất khử trùng sửdụng phổ biến là ethanol (70-95%), NaClO (3-10%) và H2O2 Một số chất hoạt động

bề mặt như tween 20, tween 80 và triton X-100 có thể được thêm vào để tăng hiệuquả khử trùng bề mặt (Hallmann và cs., 2006) Việc phân lập bao gồm một quytrình ba bước như được mô tả bởi Coombs và Franco (2003) Qin và cs (2009) đềxuất quy trình 5 bước và thêm dung dịch Na2S2O3 sau khi được xử lý bằng NaClO đểtrung hòa NaClO dư trên bề mặt thực vật, giúp cho quá trình phân lập không

bị ảnh hưởng bởi chất khử trùng bề mặt Sau khi xử lý, các mô thực vật có thểđược ngâm trong dung dịch NaHCO3 10% (Nimnoi và cs., 2010) Sau mỗi lần xử lý,phải kiểm tra xác nhận khử trùng bề mặt để chứng minh rằng các VSV ký sinh trên

bề mặt đã

được khử trùng hoàn toàn và VSV phân lập được là nội sinh, có thể được chứngthực bằng cách trang nước rửa cuối cùng vào đĩa môi trường tương tự Việc bổsung các kháng sinh như nalidixic acid và trimethoprim, nystatin hoặccycloheximide là cần thiết để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năngphát triển chọn lọc của xạ khuẩn, vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn

và nấm (Qin và cs.,

2009)

Li và cs (2012) áp dụng cách xử lý nhiệt khô và xử lý mẫu thực vật với nitơ

lỏng, đã phân lập được 228 chủng xạ khuẩn từ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia

annua L.) trong đó 31 chủng có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, 07 chủng có hoạt

tính amylase mạnh, 10 chủng sinh protease cao, 01 chủng sinh lipase cao và 19

chủng có hoạt tính ức chế sự phát triển của cây lồng vực (Echinochloa crusgalli) Cùng trên đối tượng cây lồng vực (Echinochloa crusgalli) tại tỉnh Vân Nam, Trung

Quốc, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các cách xử lý bề mặt khác và các loại môitrường khác đã phân lập được 312 chủng XKNS (Qin và cs., 2012) Waheeda vàShyam (2017) đã phân lập được 32 chủng XKNS trên 3 loại cây: cây húng quế

(Ocimum basillicum), sâm Ấn Độ (Withania somnifera) và cây ba gạc bốn lá (Rauvolfa tetraphylla).

Các loại môi trường phân lập XKNS đã được mô tả bởi các tác giả về thànhphần môi trường như môi trường tinh bột casein (Küster và Williams, 1964), tinhbột casein nitrat (SCNA), đậu tương (Williams và Davies, 1965), chitin-vitamin B(Hayakawa và Nonomura, 1987), môi trường cao nấm men (TWYE) (Qin và cs.,2009); humic acid vitamin B (HV), cao nấm men casamino acid (YECA), tổng hợp(Mincer và cs., 2002), Gause cải tiến (Ivantiskaya và cs., 1978) và glycine-glycerol(Küster, 1959) Machavariani và cs (2014) đã cải tiến phương pháp phân lập là tiền

xử lý lá với dung dịch heteroauxin và zircon, giúp tăng số lượng XKNS hiếm từ câydược liệu Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng môi trường bổ sung humic acid vàvitamin để phân lập xạ khuẩn hiếm thường cho hiệu quả cao (Tiwari và Gupta,

asparagine và proline) làm nguồn nitơ và cellulose, natri propionat, natri succinatvà

xylan như các nguồn carbon, cũng cho hiệu quả phân lập cao đối với một số loại xạkhuẩn hiếm (Qin và cs., 2009) Zhao và cs (2011) đã nhấn mạnh sự cần thiết củaviệc sử dụng các phương pháp và môi trường phân lập mới để phát hiện và nghiêncứu về sự đa dạng của các loài XKNS trên cây dược liệu.

1.2 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

Như đã đề cập ở trên, XKNS là một trong những nhóm VSV đa dạng và còn ítđược nghiên cứu, có khả năng sinh chất có ích cho cây chủ (Golinska và cs., 2015;Nalini và Prakash, 2017) Theo quan niệm đó, XKNS có sự đa dạng về thành phầnloài, chi về các taxon và về sinh tổng hợp các hợp chất sinh học Mức độ đa dạngXKNS có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu, các loài thực vật khác nhau và phụthuộc vào phương pháp, môi trường phân lập (Qin và cs., 2011; Nalini và Prakash,2017)

1.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật

Dựa trên kết quả phân lập của một số nghiên cứu cho thấy, số lượng XKNSđược phân lập nhiều nhất từ rễ, tiếp theo là thân và ít nhất trong lá (Qin vàcs.,

2009; Gangwar và Khushboo, 2014) Sự đa dạng của quần thể XKNS phụ thuộc vào

ba yếu tố chính gồm: loài thực vật, vị trí mô thực vật (rễ, thân, lá) và vị trí địa lý(khí hậu, độ ẩm, dinh dưỡng) (Nimnoi và cs., 2010; Golinska và cs., 2015).Taechowisan và cs (2003) đã phân lập được 330 chủng xạ khuẩn từ 7 cây dược liệu

ở Chiang Mai, Thái Lan, thuộc 4 chi: Streptomyces, Microbispora, Nocardia và

Micromonospora Verma và cs (2009) đã phân lập 55 XKNS từ 20 mẫu cây Azadirachta indica, trong đó chi Streptomyces thường gặp nhất (49,09%), sau đến

là chi Streptosporangium (14,5%), Microbispora (10,9%), Streptovertcillium (55%), Saccharomonospora (5,5%) và Nocardia (3,6%) Hai mươi sáu cây dược

liệu từ tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc đã phân lập được 60 chủng XKNS, trong đó

thuộc chi Streptomyces chiếm 50% số chủng phân lập, các chủng còn lại thuộc các chi Micromonospora, Oerskovia, Nonomuraea, Promicromonospora và

Rhodococcus (Yuan và cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017) So với thân và lá, tập

hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ đa dạng hơn

Các nghiên cứu về số lượng xạ khuẩn trên các bộ phận các loài dược liệuthường mang lại kết quả trái ngược nhau Taechowisan và cs (2003) đã phân lậpđược 212 chủng xạ khuẩn ở rễ, 97 chủng ở lá và 21 chủng ở thân, tương tự XKNS

từ cây Azadirachta indica cho số lượng XKNS ở rễ là cao nhất 54,6%, thân và lá

lần lượt là 23,6% và 21,8% Verma và cs (2009) Nhưng một số nghiên cứu đưa rakết quả, XKNS phân lập từ lá là thấp nhất và trong một vài nghiên cứu khác chothấy, không có một chủng xạ khuẩn nào được phân lập từ lá (Zhao và cs., 2011;Akshatha và cs., 2016) Mặt khác một số nghiên cứu phân lập XKNS nhiều nhất từthân, đặc biệt trên các mô lớn (Castillo và cs., 2002; Castillo và cs., 2003; Bascom-Slack và cs., 2009)

1.2.2 Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh

Sự đa dạng của XKNS trên thực vật rất phong phú được đánh giá từ cácnhóm nghiên cứu trên thế giới tại Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Mỹ,Nga… (Bảng 1.1) Ka e wkla và Franco ( 2013) đã đưa ra sự đa dạng XKNS trên thựcvật tại Úc cho thấy, đã phân lập được trên 500 chủng XKNS, thuộc 16 chi khácnhau phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen mã hóa 16S

rRNA, trong đó chi Streptomyces phổ biến nhất (chiếm trên 50% tổng số XKNS

phân lập được) Tuy nhiên, rất nhiều loài mới, hiếm khác được phát hiện thêm như

Microbispora, Microbacterium, Micrococcus, Micromonospora, Rhodococcus, Streptacidiphilus, Arthrobacter, Dietzia, Herbiconiux, Kitasatospora, Nocardia,

Verrucosispora, Isoptericola và Kytococcus (Kaewkla và Franco, 2013; Golinska và

cs., 2015) Tại miền Nam Ấn Độ đã phân lập được 135 chủng XKNS từ bốn cây

dược liệu (Cajanus lineatus, Leucas ciliata Benth., Rauwolfia densiflora Benth và

Gomphostemma heyneanum Wall.) thuộc các chi Streptomyces (68%), Arthrobacter (15%), Patulibacter (3%), Rhodococcus (9%) và Promicromonospora (5%)

Quốc gia Loài thực vật Chi xạ khuẩn Đặc tinh sinh h ọ c Tài liệu tham k h ả o

Ấn Độ

Đ ộ , cây Cây húng quế, cây sâm Ấn gạ c bố n lá S tr e p t o m yces K h á ng k hu ẩ n (Waheeda và Sh y a m , 2017)

Ai Cập 10 cây họ hoa cúc (Achillea

Kháng khuẩn (El-Shatoury

và cs., 2013)

Brazil Ngô (Zea mays) S tr Microbispora, Streptomyces, e p t o s po r a n g i um n ấmKháng khuẩn, 20(Araújo và cs., 0 0)

Irelan 7 cây dược liệu M Streptomyces, Brevibacterium, i c r oba c t e ri u m, L e if s on i a n ấmKháng khuẩn, 20(Passari và cs., 1 5)

Indonesia Cây họ la bố ma, cây nghệ,

cây lỗ danh, cây dung lá táo Streptomyces

Kháng khuẩn (Sunaryanto

và cs., 2014)

Malaysia 4 cây dược liệu Streptomyces Kháng khuẩn 20(Zin và cs., 1 0)

Hàn Quốc

c ab Cây cải thảo (Chinese b ag e ) M Microbispora, Streptomyces, i c r o m ono s p o ra n ấ m Kháng khuẩn, 20(Lee và cs., 0 8)

Mỹ 21 loài thực vật nhiệt đới. Streptosporangiaceae,

k hu ẩ n)

(Panitch và cs., 2017)

Phần Lan 13 loài cây dược liệu Streptomyces và Micromonospora. n ấ m Kháng khuẩn, 20(Yuan và cs., 0 8)

Kunasakdakul,

2 01 5 )

Úc 5 loài cây thực vật Streptomyces, Microbispora Kháng khuẩn (Misk vàFranco, 2011)

(Akshatha và cs., 2016) Phân bố loài và đa dạng sinh học của VSV nội sinh trêncây dược liệu chịu ảnh hưởng khá nhiều từ môi trường sinh thái (Nalini và Prakash,2017)

Bảng 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về đa dạng sinh học của xạ

khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu

xạ khuẩn mới trên thế giới, đưa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng XKNS phân

lập từ hơn 100 loài thực vật (Qin và cs., 2011) Zhao và cs (2005) đã phân lập được

560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dược liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi,Trung Quốc Các chủng XKNS phân lập được thuộc nhiều chi khác nhau như

Streptomyces, Micromonospora, Oerskovia, Nonomuraes, Promicromonospora, Rhodococcus, trong đó, 60 chủng có hoạt tính kháng ít nhất một loại VSV kiểm

định (chiếm 10,7%), 15 chủng có hoạt tính kháng mạnh với S aureus, 38 chủng

kháng ít nhất 5 loại VSV gây bệnh và tất cả các chủng có hoạt tính kháng khuẩn đều

thuộc chi Streptomyces Tỷ lệ XKNS mang gen pks-I, pks-II, nrps liên quan tới quá

trình sinh tổng hợp kháng sinh chiếm tỷ lệ cao, đạt lần lượt 53%, 82%, 53% (Zhao

và cs., 2011)

Tại Trung Quốc đã điều tra và lấy mẫu trên 90 cây dược liệu cho thấy, XKNS

phân lập được khá đa dạng về mức độ loài và chi (Streptomycetes,

Pseudonocardia, Nocardiopsis, Micromonospora) (Qin và cs., 2009) Kết quả phân

lập cho thấy, một số chủng XKNS thuộc các chi hiếm như Lentzea, Tsukamurella,

Gordonia, Dietzia, Kineosporia, Janibacter, Kineococcus, Dactylosporangium, Nonomuraea, Herbidospora và Glycomyces spp Từ năm loài thực vật rừng ngập

mặn tại Khu bảo tồn thiên nhiên quốc gia Beilun Estuang ở Trung Quốc, đã phân lập

được 101 chủng thuộc 7 bộ, 15 họ và 28 chi gồm Streptomyces, Curtobacterium,

Mycobacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Mycobacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Kocuria, Nocardioides, Kronococcus, Gordonia, Isoptericola, Janibacter, Leucobacter, Nocardia, Nocardiopsis, Pseudokineococcus, Sanguibacter

và Verrucosispora Trong đó đã phát hiện 07 loài mới thuộc các chi Nocardioides,

Streptomyces, Amnibacterium, Marmoricola và Mycobacterium Từ 101 chủng

XKNS đã tuyển chọn được 31 chủng khả năng kháng ít nhất một chủng VSV kiểmđịnh (Jiang và cs., 2018) Do đó, có thể thấy tính mới, tính đa dạn và các chất cóhoạt tính sinh học sinh tổng hợp bởi các chủng XKNS ứng dụng trong y học, nôngnghiệp và môi trường (Singh và Dubey, 2018) XKNS rất đa dạng và mức độ đa dạng

có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau Sự đa

dạng về chi và số lượng nuôi cấy XKNS phần lớn phụ thuộc vào phương pháp phânlập (Golinska và cs., 2015).

1.2.3 Đánh giá đa dạng sinh học của xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ cấp

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mớitrên XKNS khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất, nước hoặc bề mặt thực vật.Nhóm nghiên cứu của Matsumoto và Takahashi (2017) đã phân lập được 22 chủngXKNS thuộc 12 chi từ 8 loại thực vật, trong đó hoạt chất aranciamycin được tmthấy trong

7 chủng XKNS, thuộc các chi Sphaerisporangium, Kibdelosporangium,

Planomonospora và Actnophytocola Tiếp đó, Matsumoto và Takahashi (2017) đã

tách chiết được các chất hoạt tính sinh học từ các chủng XKNS như: actinoallolide

(mạch vòng 12-macrolid) từ dịch lên men của chủng Actinoallomurus fulvus

MK10-036; trehangelin bao gồm hai phân tử trehalose và một angelic acid phân lập từ

chủng Polymorphospora rubra K07-0510; spoxazomicin, pyochelin phân lập từ

Streptosporangium oxazolinicum K07-0460T Sự đa dạng các chất trao đổi thứ cấp

từ các chủng XKNS được phân lập trên cây dược liệu được thống kê trong Bảng1.2 Castillo và cs (2002) đã phân lập được bốn chất kháng sinh mới dạng peptide

có phổ kháng khuẩn rộng là munumbicin A, B, C, D từ Streptomyces NRRL 30562.

Từ lá cây dương xỉ (Grevera pteridifolia) đã phân lập được chủng Streptomyces sp.

NRRL 30566 nội sinh có khả năng sinh chất kháng sinh kakadumycin (Castillo và

cs., 2003) Hoạt chất xiamycin A được phân lập từ chủng Streptomyces sp.

HKI0595 nội sinh trên cây vẹt dìa (Kandelia candel) Trong đó, xiamycin A có hoạttính kháng virus HIV (Ding và cs., 2010) Theo công bố của Ding và cs (2011) bahoạt chất indolosesquiterpene mới gồm xiamycin B, indosespene và sespenine,cũng như xiamycin A được phân lập từ dịch lên men của chủng

kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) và Enterococcus

faecalis kháng vancomycin (VRE) Như vậy, tiếp tục nghiên cứu, sàng lọc các hợp

chất có hoạt

tính kháng sinh kháng vi khuẩn kháng đa kháng sinh, kháng virux và chống ung thư

từ XKNS trên cây dược liệu tự nhiên là hướng nghiên cứu đầy triển vọng

Bảng 1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây

dược liệu

học

Nguồn tham khảo

Kitasatospora sp Taxus baccata Gỗ/vỏ Paclitaxel (Caruso và cs.,

Streptomyces sp Kennedia nigriscans

NRRL 30562 Rễ Munumbicin E-4 và E-5 (Castillo và cs.,2007)

MS53 Ricinus communis Thân 6-Alkylsalicylic acids(salaceyin A và B) (Kim và cs.,2006)

Streptomyces sp Maytenus hookeri CS Nuôi cấy mô Naphthomycin K, A và E (Lu và Shen,

MaB-QuH-8 Maytenus aquifoliaMart. Rễ, thân, lá Celastramycin A và B (Pullen và cs.,2002)

Sự đa dạng của XKNS trong thực vật là phong phú hứa hẹn tiềm năng ứngdụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra Tuynhiên, so với sự đa dạng của thực vật, số lượng các nghiên cứu về XKNS vẫn cònhạn chế, vì vậy cơ hội để phân lập được các loài xạ khuẩn từ các cây dược liệu hứahẹn tiềm năng khai thác trong y học, nông nghiệp, và các ngành công nghiệp khác

1.3 Sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu về

loài Streptomyces cavourensis

1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

XKNS đã được chứng minh là tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính

ở nồng độ thấp, chống lại các VSV Một lượng lớn các hợp chất kháng VSV thuộccác lớp như alkaloid, peptide, steroid, terpenid, phenol, quinines và flavonoid đãnghiên cứu được chiết xuất từ XKNS (Singh và Dubey, 2015) Như vậy, có rấtnhiều ứng dụng giá trị để phát triển các loại thuốc kháng sinh từ XKNS Chủng

Streptomyces sp TP-A0595 nội sinh sinh tổng hợp hợp chất 6-prenylindole (1) có

hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên thực vật Trước đó,

6-prenylindole (1) đã được tinh sạch từ cây rêu tản (Hepatcae) Đây là ví dụ điển

hình về khả năng thu nhận các hợp chất hoặc các dẫn xuất trong thực vậtnhờ XKNS (Igarashi, 2004) Ứng dụng của các hợp chất có hoạt tính sinh học đượctách từ XKNS được làm rõ từ các công bố khác và sự đa dạng của xạ khuẩn cũngđược nghiên cứu và công bố ở các điều kiện môi trường khác nhau từ điều kiệnthường đến các điều kiện khắc nghiệt

Cho đến nay, nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện từ XKNSnhư gồm munumbicin A-D (Castillo và cs., 2002), celastramycin A-B (Pullen vàcs., 2002), kakadumycin (Castillo và cs., 2003) và demethylnovobiocin (Igarashi,

2004) Coronamycin được tách từ dịch lên men của chủng Streptomyces NRRL

30562 có hoạt tính kháng nấm Pythiaceous sp (MIC 2 µg/ml) và Cryptococcus

neoformans (MIC 4 µg/ml) gây bệnh ở người (Ezra và cs., 2004) Hai hợp chất mới

cedarmycin A (2) và B (3) được tách từ dịch lên men của chủng Streptomyces sp TP-A0456 nội sinh trên cây tuyết tùng (Cryptomeria japonica) Cedarmycin A (2)

cho hoạt tính kháng nấm Candida glabrata với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 0,4 μg/ml (Igarashi, 2004) Chủng Streptomyces sp Tc022 nội sinh trên rễ cây riềng nếp (Alpinia galangal) có hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichum

musae và Candida albicans Hoạt chất actinomycin D (4) từ dịch lên men của

chủng Streptomyces sp Tc022 có hoạt tính kháng nấm cao (Hình 1.2) (Taechowisan

và cs., 2006)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6)

Castillo và cs (2006) đã phân lập được 2 kháng sinh peptide mới là

munumbicin E-4 và E-5 từ chủng Streptomyces NRRL 30562 nội sinh trên cây lõi tiền (Kennedia nigriscans) có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm và Gram dương.

Hoạt tính chống sốt rét của hoạt chất munumbicin E-4 và E5 được công bố cao gấp

đôi so với chloroquine Chủng Streptomyces NRRL sinh tổng hợp munumbicin A,

B, C và D với khối lượng phân tử 1269,6; 1298,5; 1312,5 và 1326,5 Da có hoạt tính

kháng vi khuẩn Bacillus anthracis đa kháng thuốc, Mycobacterium tuberculosis, MRSA, Staphylococcus aureus (GISA) và kháng nấm gây bệnh trên thực vật.

Munumbicin A có khả năng kháng VRE Munumbicin B có hoạt tính kháng

Mycobacterium tuberculosis với giá trị IC50 là 10 và 46 ng/ml Munumbicin C có

hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với nồng độ IC50 là 6,5ng/ml so với IC50 của chloroquine là 7 ng/ml Munumbicin B và C hoạt tính chốngung thư cao nhất ở các dòng tế bào ung thư ME-180 (ung thư biểu mô cổ tửcung)