Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn Peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein của phụ phẩm cá hồi

TÓM TẮTHoạt tính kháng oxy hóa của các phần đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein phụ phẩm cá Hồi Salmo salar sử dụng chế phẩm enzyme được khảo sáttrong nghiên cứu này.. Kết qu

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

0Q0 NGUYEN THANH PHUONG

KHAO SAT HOAT TINH KHANG OXY HOA

CUA CAC PHAN DOAN PEPTIDETHU NHAN TU DICH THUY PHAN

PROTEIN CUA PHU PHAM

CA HOIChuyên ngành: Công Nghệ Thực Pham

Mã số : 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHÍ MINH, 01/2018

CONG TRÌNH DUOC HOÀN THÁNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA ~ÐĐHQG ~TP.HCM

Can bộ hướng dan khoa hoc: TS VO ĐÌNH LE TAMCán bộ châm nhận xét 1: PGS TS: Hoang Thi Kim ẢnhCan bộ chấm nhận xét 2: TS: Lê Thi Nga

Luận văn thạc sĩ được báo vệ tai Trường Đại học Bach Khoa, DHOG Tp HCMNgày 12 tháng 01 nam 2018

Thanh phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm;(Ghi rõ họ, tên, học ham, học vi cha Hoi đông chấm bảo vệ luận văn thạc si)1 Chủ Tịch: GS TS Lê Văn Việt Man

2 Phan biện 1: PSG.TS Hoàng Thi Kim Anh3 Phan biện 2: TS Lễ Thi Nga

4 Ủy viên: TS: Tôn Nữ Minh Nguyệt5, Ủy viên, Thư ký: TS Tran Thị Ngọc Yên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đông đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lýchuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHU TICH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIET NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thành Phương MSHV: 1570436

Ngày, tháng, năm sinh: 06/06/1987 Nơi sinh:Ninh Thuận

Nội dung:Khảo sát thành phân hóa học của phụ phâm cá Hồi.Khảo sát điêu kiện thủy phân nhăm thu dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa cao

nhất.Tối ưu hóa điều kiện thủy phân nhăm thu dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa caonhất

Tách phân đoạn dịch thủy phân và khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn.

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 10-7-2017HI NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 03-12-2017IV CÁN BO HUONG DAN: TS : Võ Đình Lệ Tâm

Tp HCM, ngày 03 thang 01 năm 2018.

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CÁM ƠN

Sau những gi học được cho tới ngày hôm nay, em xin chân thành cam ơn tới

quý thay cô bộ môn Công nghệ thực phẩm và những thay cô giảng dạy em trong thờigian qua Thầy cô không những truyền đạt nhiều trong kiến thức chuyên môn củamình mà còn có cả kiến thức về xã hội Thay cô là nguồn cảm hứng để khơi dạy sáng

tạo, những cái mới, tạo môi trường năng động và những kỹ năng làm việc nhóm mà

thay cô có được dé chỉ dậy cho chúng em

Em muốn cám ơn đặt biệt tới cô TS.Võ Đình Lệ Tâm, đã luôn tận tình theo sáthướng dẫn và giúp đỡ em dé em hoàn thành luận văn một cách tốt nhất Qua đây emcũng muốn cám ơn tới nhóm thí nghiệm được cô Tâm hướng dẫn Các bạn là nhữngngười cộng sự tốt nhất, nhiệt tình và giỏi kiến thức chuyên môn

Em cũng xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm, đặt biệt cô KS.Nguyễn Thị Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cu, hóa chat trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ trongthời gian học tập và nghiên cứu vừa qua Mặt dù có nhiều khó khăng và thiếu xótnhưng nhờ có sự giúp đỡ của thầy cô, các bạn, và sự quan tâm từ gia đình em đã hoànthành luận văn một cách tốt nhất

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đền tat cả thay cô và bạn bè.

TP Hồ Chí Minh, 25 tháng 12 năm 2017

Học viên thực hiện

Nguyễn Thành Phương

TÓM TẮT

Hoạt tính kháng oxy hóa của các phần đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân

protein phụ phẩm cá Hồi (Salmo salar) sử dụng chế phẩm enzyme được khảo sáttrong nghiên cứu này Thành phần hóa học của phụ phẩm cá H6i (Salmo salar) gồmcó độ âm khoảng 61,9%, hàm lượng protein khoảng 44,37%, hàm lượng lipid khoảng45.4% và hàm lượng tro khoảng 10,2% (tính theo hàm lượng chất khô) Sau đó, điềukiện thủy phân được khảo sát nhằm thu nhận dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxyhóa cao nhất Kết quả cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân đạt giá trịcao nhất khi sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme ở pH 7, nhiệt độ 50°C, tỉ lệenzyme/co chất (E/S) 50U/g protein, thời gian thủy phân 8 giờ Tiếp theo, điều kiệnthủy phân được tối ưu hóa sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với 2 yếu tốtỉ lệ enzyme/co chất (E/S) và thời gian thủy phân theo phương pháp bắt gốc tự doDPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Sau khi tối ưu, dịch thủy phân có khả năng bat35,4% gốc DPPH, (cao hon 1,01 lần so với trước tối ưu hóa) tại tỉ lệ E/S 49,83 U/gprotein, thời gian thủy phân 7,97 giờ, nhiệt độ 50°C, pH 7 Cuối cùng, dịch thủy phânđược tach phân đoạn peptide sử dụng thiết bị ly tâm siêu lọc theo kích thước phân tửpeptide lần lượt là 30 kDa, 10 kDa, 3 kDa và 1 kDa Kết quả cho thấy hoạt tính khángoxy hóa của phan đoạn < | kDa cao nhất, giá tri ICso cao hơn 250 lần so với ICso củavitamin C, giá trị FRAP thấp hơn 270 lần so với giá trị FRAP của vitamin C Kết quảnày cho thay tiém năng sử dụng phụ phẩm cá H6i như một nguồn protein tự nhiênnhằm thu nhận các phân đoạn peptide có hoạt tính kháng oxy hóa

ABSTRACTThe antioxidant activity of peptide fractions isolated from protein hydrolysate ofsalmon by — product (Salmo salar) using enzyme preparation was investigated in thisstudy The chemical composition of the by — product includded moisture of 61.9%,the protein contnet of 44.4%, the lipid content of 45.4% and the mianeral content of10.2% (on dry weight basis) After that, the hydrolysis condition was examined toobtain the proteolysate with highest antioxidant activity The result revealed reached

the highest value when using Flavourzyme at pH 7, 50°C, enzyme/subtrate (E/S) ratio

of 50 U/g protein and hydrolysis time of 8 hours (h) Then, the hydrolysis conditionwas optimized using reponse suface methodology (RSM) via enzyme/subtrate ratioand hydrolysis time using DPPH (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl) free radicalscavenging assay (DPPH method) After optimization, the hydrolysate could scavenge35.4% DPPH, higher 1.13% than before optimization with E/S ratio of 49.83 U/gprotein, hydrolysis time of 7.97 hours, at 50°C, pH 7 Finally, the hydrolysate wasfractionated using centrifugal ultrfiltration devices with molecular sizes of 30kDa,10kDa, 3kDa and | kDa The result showed that the < IkDa peptide fractions showedhighest antioxidant activity, with the ICs) 250 — fold higher than that of vitamin C,FRAP value 270 — fold lower than that of vitamin C These findings indicated that thepotential in using salmon by — product as a natural protein source to obtain theantioxidative peptide fractions.

9009 iv¡90v ,Ô V

ABSTRACT uu vi

DANH MỤC CÁC TU VIET TAT uu.ecccccccecescssscececesescevecscececssvesscececsessvacaceceavacsceceeveves xiDANH MUC BANG 2 xiiDANH MỤC HINH.Q.u ccececscecescsscsscscececsevevscscececsevevscecscsevevavacecesseavavacecesavavacaceceavacees XỈVChương 1 TONG QUAN - <5 CS 1 E2 1 121 1513111111115 111101111111 11 11.1 rk 2LL GiGi thigu VE 00 ố 2VDL C8 0n Ả 2

1.1.2 Phân loạI - - CC E1 1110000001211 1111111 ng re 2

1.1.3 Đặc điểm sinh hỌC -G- Gv 519121 1E 111915111 111211 1g creg 31.1.4 Tình hình nuôi, chế biến và thị trường cá Hồi trên thé giới 31.1.5 Phụ phẩm chế biến cá HỒI ¿- ¿+ + 252 SE2E+E2E2EEEEEEEEEEEEEEEErErkrrre, 4

1.2 Dịch thuỷ phân prOf€1T - << G0019 9000 1n re 5

1.2.1 Tính chất của dịch thuỷ phân profein - +5 + s22 £s+s+xzs+xsrsrs¿ 5

1.2.2 Hoạt tính của dịch thuỷ phân - (<< S999 Y1 kg 61.2.3 Các phương pháp thuỷ phân protein 5 5< +ssssseeeeerse 71.24 Dịch thuỷ phân protein tÙỪ Cá sgk 8

1.2.5 Ứng dụng dịch thuỷ phân protein từ Cd ccccccsesessssesesesesesessesesseseseeeeees 8

1.3 Peptide có hoạt tính sinh hỌC - << 00 0n ke 101.3.1 Peptide kháng oxy hÓa - - - c0 ke 10

1.3.2 Peptide khang vi sinh VẬTK - - - - <5 c0 ke II

1.3.3 Peptide liên kết Canxi ¿62-52 SE t2 2E E2 2321212111111 re 121.3.4 Peptide ức chế enzyme chuyển đổi Angiotensin-Ï -5- 5+: 13

L.A Enzym DFO(AS€ 0 nọ ve 14

[4.1 Giới thiỆU G00 kh 14

l.4.2 Phân lOạI - Ă G0 vn 14

1.4.3 Cơ chế xúc tác của PTOt€asSe + St t 1 S13 1115111111111 re 161.5 Chất kháng oxy hod vocccccccscscsssssscssssssesscscsesscsesessssessscsesecscsesessesesecseseeesseaeees 17

l.5.I Git thiỆU -G Ăn ke 17

1.5.2 Một số phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hố 18

1.5.3 Dịch thuỷ phân va peptide kháng oxy hố «c5 se 201.6 Thu nhận peptIe - <0 nọ re 221.6.1 Phương pháp thu nhận phần đoạn peptide -««« «<< s«2 22

1⁄7 Tổng quan tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hố của dịch thủy phân

protein từ cá và các phân đoạn pepfIe - - - 55 991 ng re 23

Chuong 2 NGUYÊN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.[ NguyêÊn lIỆU - G G00 27

2.1.1 Phụ phẩm cá hồi : EE SE S121 191911 1211121111171 11111 1111111 y0 272.1.2 Ché pham À1 ::Ữ1 272.1.3 Hố chất KAA we eeeeeseesseesseeeseesseeesecssessessessessecesecsseesseeesesseeseeeseeeseeen 28

2.2 Phương pháp nghiÊn CUu G0 ke 29

2.2.1 Sơ đồ nghiên CỨU - 26 S223 E3 2312121111111 11k 292.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên CỨU +- + 2252 S2+E+E££+E+Ee£zxexerereesee 29

2.3 Các phương pháp nghiÊn UU - - - < G5 G3001 119999 1 ng ke 332.3.1 Phương pháp xử lý nguyên lIỆU - 5G Ă S1 ke 33

2.3.2 Phương pháp xác định thành phan hố học nguyên liệu 332.3.3 Quy trình sản xuất dịch thuỷ phân từ phụ phẩm chế biến cá Hồi sử dụngchế phầm CNZYME ¿+ + +%++SE+E+E#EE£E£EEEEEEEEEEEEEEEE1211111 2111111 34

2.34 Phương pháp thuỷ phân (<< + 190 ng vn 36

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hoá - << << <««2 36

2.3.6 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện thủy phân - 25-55555255: 37

2.3.7 Phuong pháp tách phân đoạn peptide cua dịch thuỷ phân 40

2.3.8 Phân tích thong kê ¿2 S2 SE+ESESE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrkrrrrkrree 41Chương3_ KẾT QUA VA BAN LUẬN - << 2 Sex EEEEErrrerrreg 423.1 Kết quả khảo sát thành phan hoá học của phụ phẩm chế biến cá Hồi 423.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân đến hoạt tính khángoxy hoá của dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và phương

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng oxy hoá của dichthuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và phương pháp FRAP 453.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxy hoá củadịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và phương pháp FRAP473.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hoạt tính kháng oxy hoá củadịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và phương pháp FRAP493.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxyhoá của dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và phương pháp

3⁄7 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân dé thu dich thủy phân có hoạt tính kháng oxi

42 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIET TAT

DPPH:

FRAP:Trolox:

ORAC:TBA:

CPP:RP — HPLC:OPA:

DIT:

SDS:AOAC:

Oxygen radical absorbance capacityThiobarbituric acid

Casein Phospho Peptide

Reverse Phase — High Performance Liquid Chromatographyortho-Phthalaldehyde

1,4 — Dithiothreitol

Sodium Dodecyl SulfateAssociation of Official Analytical Chemists

Central Composite Circumscribed

Fractional factorial designs

DANH MỤC BANGBang 1.1 Phân loại tên khoa học cá HỒÀI SG 112121 E5 91112111 911121511 1xx rrrrei 2Bang 1.2 Thanh phan của dịch thuỷ phân từ protein của cá [ 18] -. - 8Bang 1.3 Tên thương mai, tác dung của thực phẩm chức năng trên thế giới sử dung

dịch thuỷ phân protein từ cá [ [ Ì - < s3 19900 9.0 ng ke 9

Bang 1.4 Peptide kháng oxy hoá từ động vật biến [13] - 2 5 5+c+c<cscsee II

Bang 1.5 Peptide khang vi sinh vat [ ÍỐ Ì << 1 1119999311111 1 1 ve rre 12

Bang 1.6 Peptide liên Kết Canxi ¿5-5522 SE 2393 1239132121211 2121 111121111 cxeeU 13Bảng 1.7 Peptide ức chế enzyme chuyển đổi Angiotensin-[ - - 555552: 13

Bang 1.8 Phân loại enzyme theo VỊ tri XUC tC - 5G 9 1 99 1 ke 16

Bang 1.9 Hoạt tính kháng oxy hoá của một số dịch thuỷ phân protein 20Bảng 2.1 Chế phẩm enzyme được sử dụng + 5-52 62+ E+E+EzEcrerrsrrereee 27Bang 2.2 Các mức yếu tô trong ma trận thiết kế sàng lọc - +5 + s+szsze: 37Bảng 2.3 Ma trận thiết kế thí nghiệm sàng lọc - + 2 25+ 2£E+E+E+Ezrrxrercee 38Bang 2.4 Các mức yếu tố thí nghiệm trong tối ưu hóa của hai thông số được sàng lọc

là thời gian thủy phân và tỉ lệ E/S ¿2-5252 SE+E 2x93 E233 1211111211 cxeee 39

Bảng 2.5 Ma trận thiết kế thí nghiệm tối ưu - + ¿5£ 2 2 2 +E+E+E+E££E£E£E£EeEzrereei 40Bang 3.1 Thành phan hoá học của phụ phẩm chế biến cá Hồi - 42Bang 3.2 Kết qua thí nghiệm sang lọc các yếu tố đến phan trăm bắt gốc tự do DPPH53Bảng 3.3 Mức độ ảnh hưởng của các thông số của điều kiện thủy phân sử dụngphương pháp giai thừa phân số (FED) - - ¿2E + E2 EESE£E+E#EEEEEEEEE E111 EEE re, 54

Bang 3.4 Ma trận thực nghiỆm - -G ĂĂ Q99 01H ke 55

Bảng 3.5 Hệ số phương trình hồi quy và độ tin cậy của các hệ số tương ứng với cácthông số của quá trình thuỷ phân ¿+ 55% 2E+EEE2E#EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrkrrerrred 56Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy so với thực

Bảng 3.7 Giá trị ICso của các phân đoạn peptide và chất kháng oxy hoá chuẩn Bảng 3.8 Giá trị FRAP của các phân đoạn peptide và chất kháng oxy hoá

DANH MỤC HÌNH508$: 3Hình 1.2 Phụ phâm chế biến cá Hồi - - 2 22 E+E+E2EEEE£E£E#EEEEEEEEEEEESEEEErkrkrree 4Hình 1.3 Một số cơ chế hoá học và vật lý đại diện cho quá trình kháng oxy hoá của

PCPlIde 1 10

Hình 1.4 So đồ phản ứng của gốc tự do DPPH và chat kháng oxy hoá 18Hình 1.5 Sơ đồ phan ứng của phương pháp FRAP - + 22 5555+S+££££e+£zescee 19Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng của phương pháp ABTS ccccecccccseeseeeseeseeeeeseeeeen 19Hình 1.7 Sơ đồ điện di SDS - PAGPE E311 11121 3E 11g ng ree 22Hình 2.1 Sơ đồ nghiên CỨU - - 2 SE SE9E SE 2393 EEEEEEE2EE11 2121111111111 32Hình 2.2 Quy trình sản xuất dịch thuỷ phân từ phụ phẩm chế biến cá hôi 35Hình 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân đến hoạt tính bắt gốc

tự do DPPH của dịch thủy phân - - - - - 5G 1930111990 0g nen 43

Hình 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân đến hoạt tính kháng

oxy hóa theo phương pháp FRAP .- - << 900g re 43

Hình 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của

dịch thủy phan G000 45

Hình 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch

thuỷ phân theo phương pháp FR.APP - - G ch 45

Hình 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

của dịch thuỷ phẩn œ2 1190011190 0 47

Hình 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của dịch thuỷ phân

theo phương pháp FRAP - G0 re 47

Hình 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

của dịch thuỷ phẩn œ2 1190011190 0 49

Hình 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hoạt tính của dịch thuỷ phân

theo phương pháp FRAP - G0 re 49

Hình 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính bắt gốc tự

do DPPH của dịch thuỷ phân - - .- << 5 1010199990 11900 và 51

Hình 3.10 Kết quả khảo sát anh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tinh của dịch

thuỷ phan theo phương pháp FR.APP - G re 51

Hình 3.11 Biểu đồ thé hiện mức độ ảnh hưởng của các yếu tô của điều kiện thủy phânđến hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH 54Hình 3.12 Đồ thị bề mặt đáp ứng cho hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thuỷ phân phụphẩm cá Hồi với phương pháp bắt gốc tự do DPPH 5-5- 55 2 2 s£s+ezescee: 58

ĐẶT VAN DECá Hỏi là nguôn lợi thủy sản có giá trị kinh tế cao Thịt cá Hỏi có nhiều giá trịđịnh dưỡng chứa nhiều hàm lượng protein, acid béo cần thiết như DHA , các vitaminvà nhiều nguyên t6 vi lượng [1] Nguôn phụ phẩm chế biến từ cá Héi chiếm khoảng45% khối lượng con cá nên lượng phụ phẩm thải ra ngoài môi trường là rất lớn [2].[3] Trong đó, nội tang và thịt vụn chiếm phan lớn với hon 50% lượng phụ phẩm,phân đầu và xương có tỉ lệ lần lượt là 7% và 8% [4] Hiện nay, phụ phẩm cá hồi chủyếu đang được sử dụng để sản xuất bột cá, bột xương, dầu sinh học, chế phẩmenzyme, Việc nghiên cứu dé tận dụng nguồn phụ phẩm cá hồi tao các sản phẩm có

giá tri gia tăng đã và dang là một trong những xu hướng được các nhà khoa học quan

tâm nhằm sử dụng hiệu qua hơn nguồn phụ phẩm này.Quá trình oxy hóa là một trong những quá trình thiết yếu trong tất cả sinh vật vàlà nguồn gốc sinh ra gốc tự do Gốc tự do được tạo ra trong quá trình trao đôi chất, dostress kéo dài trong cơ thể, peroxide hóa lipid Việc dư thừa gốc tự do dẫn đến gây pháhoại các mô sống dẫn đến tốn thương tế bào, bệnh tật, ung thư, xơ vữa động mạnh, lãohóa Đối với thực phẩm, quá trình oxy hóa làm giảm thời gian bảo quản thực phẩmvà sinh ra những độc tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng [5] Sự ức chếquá trình oxy hoá trong thực phẩm và trong cơ thể người sẽ ngăn ngừa được vẫn đề hưhỏng của thực phẩm và ngăn ngừa các căn bệnh nghiêm trọng cho cơ thể Hiện nay,để giải quyết vấn để trên, các chất kháng oxy hoá tổng hợp như butylated

hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), tert — butylhydroquinone

(TBHQ) hay propyl gallate được sử dung như là phụ gia dé bảo vệ thực phẩm khỏi sựhư hỏng do quá trình oxy hóa gây ra [6] Mặc dù các chất này có hoạt tính cao hơnnhững chất kháng oxy hoá tự nhiên như a-tocopherol, ascorbic acid nhưng lại chứanhiều mối nguy về van dé an toàn với sức khoẻ con người [7] Vì thế, mối quan tâm

vê việc tìm ra chat kháng oxy hoá có nguồn gôc tự nhiên được đặt lên hang dau.Vì vậy, nghiên cứu “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của các phân đoạn

peptide thu nhận từ dịch thuỷ phân protein phụ phẩm cá Héi” được thực hiện nhằmtìm ra chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên từ việc tận dụng phụ phẩm chế biến

hải sản.

Chuong1 TONG QUAN1.1 Giới thiệu về cá Hồi

1.1.1 Cá HồiCá hồi là tên chung cho nhiều loài cá có tên khoa học là Salmo salar Sự khácbiệt về tên gọi thường được cho là cá hồi di cu (salmon) và cá hồi không di cu (trout)

Cá hồi sống dọc các bờ biến tại cả Bac Đại Tây Dương (các họ di cư Salmosalar) và Thái Bình Dương, và cũng đã từng được đưa tới Hồ lớn ở Bac Mỹ Cá hồi

được sản xuât nhiêu trong ngành nuôi trong thủy sản ở nhiêu nơi trên thé giới.

Về đặc trưng cá hồi là cá ngược sông dé đẻ Chúng sinh ra tại khu vực nướcngọt, di cư ra biển, sau đó quay trở lại vùng nước ngọt để sinh sản Chúng phân bốrộng ở Đại Tây Dương, Bac Mỹ, Bắc Au, [8], [9]

1.1.2 Phan loại

Cá Hồi có tên tiếng Anh là Salmon, tên khoa học là Salmo salar, thuộc ho

Salmonidea trong bộ Salmoniformes [10]

Phân loại cá Hỏi (Salmo salar) được trình bày trong bảng 1.1

Bang 1.1 Phân loại tên khoa hoc cá HồiCá Hồi (Salmo salar)

Gidi (regnum) AnimaliaNganh (phylum) ChordataPhan nganh (subphylum) VertebrataLop (class) ActinopterygiiPhân lớp (subclass) TeleostelLiên bộ (superordo) ProtacanthopterygIBộ (ordo) SalmoniformesHo (familia) Salmonidea

1.1.3 Đặc điểm sinh họcCá hồi được nuôi ở các thủy vực tự nhiên và trong các hệ thống nước chảy Đặcđiểm sinh trưởng và phát triển của cá Hỗi tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ nước từ 10

— 20°C Chúng cũng có khả năng chịu nhiệt độ cao hơn tới 24°C trong một thời gian

ngăn Hàm lượng oxy hòa tan trong nước cần đạt > 7mg/1, pH thích hợp cho cá hồi từ6,7 đến 8,6

1.1.4 Tình hình nuôi, chế biến và thị trường cá Hồi trên thế giớiỞ Việt Nam, cá hồi được ươm, nuôi ở Sapa (Lào Cai), Đà Lạt (Lâm Đồng),Lạng Sơn, Bac Giang và một số địa phương khác Bộ Nông nghiệp và Phát triển nôngthôn ước tính tong sản lượng nuôi cá nước lạnh đến năm 2015 đạt 3460 tan (cá hồi là

1448 tan), đến năm 2020, sản lượng nuôi đạt 10000 tan (cá hồi là 2713 tan) [11].Theo ước tính, ở Mỹ có ba nhà cung cấp lớn là Canada, Na Uy và Chile Tuynhiên, mỗi nhà cung cấp lại tập trung vào các thị trường ngách khác nhau Canadachiếm khoảng 44% tổng giá trị nhập khẩu cá hồi Đại Tây Dương của Mỹ, chủ yếucung cấp cá hồi nguyên con tươi sống (chiếm 91% tổng doanh thu sang thị trườngMỹ) Na Uy đứng ở vị trí thứ hai, chiếm 20% về lượng, tập trung ở phân khúc sảnphẩm phile 66% kim ngạch xuất khẩu cá hồi phile đông lạnh và 33% kim ngạch xuấtkhẩu cá hồi tươi của Na Uy sang thị trường Mỹ Với các nhà cung cấp Chile, khuynh

hướng phát triển thị trường có sự tương đồng lớn với Na Uy Tuy nhiên, khác với NaUy, 78% tong kim ngạch xuất khẩu cá hồi phile tươi của Chile đến thị trường Mỹ,trong khi ty trong cá hồi phile đông lạnh chỉ chiếm 16% [9], [12].

1.1.5 Phụ phẩm chế biến cá Hồi

Theo Cục chế biến nông lâm thuỷ sản và nghề muối, hiện nay cá hồi Việt Namtrên thị trường thế giới với 90% thị phần Các sản phẩm chế biến từ cá hồi hiện chủyếu là sản phẩm cá hồi đông lạnh chiếm trên 92% (phi lê, nguyên con, cắt khúc), sốcòn lại cũng chỉ là các sản phẩm có hình thức khác hơn một ít so với phi lê Loại sảnphẩm giá trị gia tăng như sản phẩm cao cấp, chế biến sâu, phối chế, làm san, ăn liềntuy bước đầu có sản xuất (cá kho t6, cá viên, chả cá, chà bông, bánh phông khô ăn

liên, ) nhưng với sô lượng còn hạn chê.

Một số sản phẩm từ phụ phẩm cá hồi trên thị trường hiện nay gồm có: dầu đặc,dầu lỏng, axit béo tự do FFA (công ty cô phần Dau tư va phát triển đa quốc gia — IDIcorp); bột cá (công ty cô phần Gò Dang — Godaco) Các phụ phẩm trong chế biến cáhồi tuy đã tận dụng để sản xuất ra các sản phẩm mới, nhưng những sản phẩm cao cấpdùng trong dược phẩm hoặc mỹ phẩm, thực phẩm chức năng chứa vi chất có ápdụng khoa học công nghệ và giá trị gia tăng cao chưa nhiều [4]

1.2 Dịch thuỷ phân protein

Dịch thuỷ phân protein là sản phẩm của quá trình thuỷ phân tạo thành cácpeptide có phân tử lượng nhỏ hơn, chứa 2-20 amino acid [13] Một số dịch thuỷ phân

protein là hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng cao; hỗn hợp của các

oligopeptide phan tử lượng trung bình; peptone; hỗn hợp các peptide mạch ngăn, hỗnhợp các amino acid và các peptide phân tử lượng thấp hoặc hỗn hợp các amino acid tự

do [14].

1.2.1 Tính chat của dịch thuỷ phân proteinTính tan và sự bên nhiệt là một trong những tính chất quan trọng của dịch thuỷphân Độ tan của dịch thuy phan nằm trong khoảng rộng của pH, nhiệt độ, nông độchất khô, nồng độ muối [14] Dịch thuỷ phân với mức độ thuỷ phân thấp vẫn có thể

tan ở pH 4-5 vì nó không chỉ chứa các peptide có phân tử lượng nhỏ ma còn có sự ion

hoá mạnh hơn của các nhóm amino và carboxyl làm tăng tính ưa nước Tính chất nàycủa dịch thuỷ phân là đặc biệt quan trọng trong sản xuất thực phẩm, nước ép trái cây,thức uống cho trẻ em vì cho phép kiểm soát độ thâm thấu của sản phẩm

Dịch thuỷ phân thì bền nhiệt hơn protein của nguyên liệu Tính chất nay quantrọng trong sản xuất dịch thuỷ phân có sử dụng quá trình tiệt trùng Dịch thuỷ phân ởmức độ thuỷ phân thấp (3-10%) với sự có mặt của ion kim loại hoá trị II như CaCl,bền nhiệt ở nhiệt độ 100-130°C trong khoảng pH 3-11 Tính tan và sự bền nhiệt có théđược gia tăng bằng việc tạo thành phức chất với polysaccharide như acid galacturonic

[15].

1.2.1.1 Tinh nhũ hoá

Tính chất nhũ hóa của dịch thủy phân đặc biệt quan trọng trong sản xuất thựcphẩm Nhiều nghiên cứu cho thay sự phụ thuộc của khả năng nhũ hoa vào mức độthuỷ phân của dịch thuỷ phân Chăng hạn, khả năng nhũ hoá của dịch thủy phân giatăng đáng kế ở mức độ thuỷ phân 5-7% [14] Dịch thuỷ phân có chứa peptide khoảng20 gốc amino acid hoặc hon cho thay khả năng nhũ hoá mạnh hơn Nhiéu dịch thuỷphân có khả năng nhũ hoá nhất định với thành phần peptide có khối lượng phân tử từ2.4-2.5 kDa [14] Nhiều bằng chứng cho thay tính ki nước là tác nhân quan trọng của

hưởng mạnh tới khả năng nhũ hoá của dịch thuỷ phân Vì khả năng nhũ hoá thấp củadịch thuỷ phân có mức độ thuỷ phân cao, một giải pháp được đề xuất là trộn dịchthủy phân với những dẫn xuất của tỉnh bột biến tinh Hỗn hợp nay không chỉ tạo ra hệnhũ tương 6n định, nó còn cho thay sự bền nhiệt trong quá trình tiệt trùng, lạnh đônghoặc bảo quản nhiều giờ ở nhiệt độ phòng [15].

1.2.1.2 Sự thẩm thấuĐây là tính chất hoá lý quan trong đặc trưng cho chất lượng sản phẩm thực phẩmdành cho trẻ em và chế độ ăn của người gia Thực phẩm có độ thâm thấu cao làm tănglượng chất lỏng trong ruột non, gây rối loạn đường ruột và mất nước của ruột, rỗi loạncần bang dién giai, buôn nôn, oi mửa, và tác dụng phụ khác Sự thâm thấu của dịchthuỷ phân protein tăng đáng kể khi tăng mức độ thủy phân tạo thành hỗn hop peptidevà các amino acid Độ thâm thấu của sản phẩm có chứa dịch thủy phân proteincó théđược điều chỉnh băng cách bổ sung tinh bột, điều này không chỉ làm giảm mức độthâm thấu mà còn đảm bảo sự 6n định của sản phẩm khi chế biến [14]

1.2.1.3 Tinh chất cảm quanDịch thuỷ phân được biết là có mùi vị đặc biệt và có thé được sử dụng dé taohương Tuy nhiên, sản phẩm được thuỷ phân từ casein, lactalbumin và các proteinkhác có vị đăng và không thé bồ sung trực tiếp vào sản phẩm thực phẩm Các nghiêncứu gan đây cho thấy vi đăng là do các peptide [16] Tuy nhiên, vị đắng giảm ở mứcđộ thuỷ phân cao Vị đăng có thé được giảm bằng việc cat các peptide gây vi dang

thành amino acid tu do.1.2.2 Hoạt tinh cua dịch thuỷ phân

Hoạt tính sinh học của dịch thuỷ phân bao gồm sự cộng hưởng hoạt tính của cácprotein tan, các đoạn peptide, các amino acid, vitamin Vi peptide chiém phan lontrong dich nên nó đóng vai trò quan trọng nhất Peptide có hoạt tính sinh hoc hầu nhưbị vô hoạt khi năm trong trình tự của protein [16] Tuy nhiên, khi giải phóng cácpeptide này ra khỏi protein thì nó sẽ thể hiện các hoạt tính sinh học như kháng oxyhoá, kháng vi sinh vật, liên kết Canxi, hạ huyết áp, chống đông máu [17]-[19]

1.2.3 Các phương pháp thuỷ phan protein

Quá trình thuỷ phân là quá trình phá vỡ các liên kết peptide khi có sự tham giacủa nước Đề cho quá trình thuỷ phân diễn ra thuận lợi, sự có mặt của chất xúc tác làcần thiết (vì các liên kết peptide khá bên) Các tác nhân xúc tác: tác nhân hoá học

(acid hoặc base), tác nhân sinh học (enzyme hoặc vi sinh vật).

1.2.3.1 Thuy phân bằng tác nhân hoá học (acid hoặc base)Phương pháp thuỷ phân băng tác nhân hoá học và sinh học là các phương phápphố biến trong công nghiệp thực phẩm, nhưng thường tác nhân hoá học sẽ được sửdụng nhiều hơn, vì giá thành thấp và dễ tiến hành Hiện nay, quá trình thủy phânprotein được ứng dụng rộng rãi vào các quá trình sản xuất thực phẩm như sản xuấtnước tương, các sản phẩm lên men Đây là phương pháp thuỷ phân protein dưới xúctác của acid mạnh (HCI, H;SOx) ở nhiệt độ cao để cắt đứt liên kết peptide [20]

Khi thuỷ phân bang acid; Tryptophan, Serine va Threonine bi phá huỷ,Asparagine, Glutamine bị chuyển thành dang acid va hau hết các vitamin bi pha hủy.Nguyên nhân là do điều kiện tiễn hành của thuỷ phân bang acid thường diễn ra ở nồng

độ acid cao (6 — 10N) và nhiệt độ phản ứng cao (100-180°C) [14].

Khi thuỷ phân băng kiềm, hiện tượng racemic hoá làm giảm giá trị dinh dưỡng,giảm lượng lysine có trong thành phần mặc dù vẫn bảo toàn được tryptophan, nênphương pháp này hạn chế sử dụng trong công nghiệp [21]

1.2.3.2 Thuy phân bằng tác nhân sinh hoc (vi sinh hoặc enzyme)Đây là phương pháp thuỷ phân protein bang enzyme sinh ra từ quá trình nuôi cayvi sinh vật Ở phương pháp nay, điều kiện yêu câu của quá trình thuỷ phân ôn hoa,không yêu cau nhiệt độ cao

Khi thuỷ phân bang vi sinh, protein được thuỷ phân nhờ xúc tác enzyme từ visinh vật Các enzyme này có thể được tạo ra từ việc nuôi cây vi sinh vat trong môitrường riêng sau đó được đưa vào nguyên liệu giàu đạm như trong sản xuất nướctương hoặc tận dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệu ban đầu như sản xuất nướcmam Thanh phần thu được trong dung dich bao gồm cả protein, pepton, peptide và

amino acid [20], [22].

Khi thuỷ phân bằng enzyme, phương pháp sử dụng từ các nguồn chế phẩmenzyme thương mại, nhiều loại enzyme thường được dùng kết hợp để tăng hiệu suấtquá trình thuỷ phân Các amino acid sinh ra trong quá trình thuỷ phân bằng enzymenày được bảo toàn do phương pháp này hạn chế dùng hoá chất, dẫn đến sản phẩm thuđược an toàn và có giá trị dinh dưỡng cao hơn Đặc biệt khác với thuỷ phân bằngphương pháp hoá học, phương pháp sử dụng enzyme thuỷ phân các liên kết peptide có

tính đặc hiệu [13].1.2.4 Dịch thuỷ phan protein từ cá

Nhiều nghiên cứu thu nhận dịch thuỷ phân trên nhiều loài cá khác nhau cho thayhàm lượng protein nằm trong khoảng 60 — 90% tổng thành phan Khi thuỷ phân,protein bị biến tính nên khả năng hoà tan sẽ tăng lên Hàm lượng protein hòa tan trongdịch thủy phân cao là một ứng dụng tiềm năng dé bồ sung vào thực phẩm

Bang 1.2 Thành phan của dịch thuỷ phân từ protein của cá [18]

Bang 1.3 Tên thương mại, tác dụng của thực phẩm chức năng trên thé giới sử

dung dịch thuỷ phân protein từ cá [18]

Tên sản Đặc điểm Ứng dụng dinh dưỡng Quốc giaphẩm

Seacure” Chế phẩm từ dịch thuỷ Thực phẩm bồ sung giúp US và

phân cá bién trắng hỗ trợ các tế bào trong Canadavùng nước sâu đường tiêu hóa và điều

tiết chức năng đường ruội.Amizate” Được sản xuất từ Thực phẩm dinh dưỡng Bắc Mĩ

protein cá hồi bằng quá trong thé thao

trình thuỷ phân protein chống căng thăng (rồi

cá trăng loạn cân nặng, áp lực

công việc, khó ngủ, khó

tập trung)

Vasotensin® Được san xuất từ quá Hỗ trợ chức năng mạch US và Nhat

trình thủy phân cángừ mau, làm cho lưu lượng Ban

soc bang enzyme máu tối wu va mức huyếtthermolysin áp ôn định

PEPTACEŸỸ Được sản xuấttừquá Giúp én định hàm lượng UK và USA

trình thuy phan protein glucose trong mau vaca tuyét bang enzyme kiêm soát can nang

1.3 Peptide có hoạt tính sinh học

1.3.1 Peptide kháng oxy hóa

Chất kháng oxy hoá được định nghĩa là chất có tác dụng ức chế hoặc làm chậmquá trình oxy hoá của một cơ chat Chất kháng oxy hoá tổn tại trong thực phẩm đóngvai tro quan trọng như là một tác nhân có lợi cho sức khỏe bảo vệ cơ thể trước sự mấtcân bang oxy hoá Peptide kháng oxy hoá bao gồm 2 — 20 amino acid Những peptidekháng oxy hoá từ thực phẩm được xem là an toàn và tốt cho sức khoẻ, kèm theo đó làkhối lượng phân tử thấp, hoạt tính cao và dễ hấp thu [18] Peptide kháng oxy hóa ưuviệt hon enzyme kháng oxy hoá do có cấu trúc đơn giản, 6n định trong các điều kiệnkhác nhau và không gây hại cho hệ miễn dịch [23]

Hình 1.3 Một số cơ chế hoá học và vat ly đại diện cho quá trình kháng oxy hoá

cua peptide

Co chế kháng oxy hóa chính xác của các peptide chưa được nghiên cứu rõ rang.Tuy nhiên, rất nhiều nghiên cứu cho thấy peptide là tác nhân bắt gốc tự do, khả năng

khử và ngăn cản quá trình peroxyde hoá có enzyme hoặc phi enzyme Các peptide

kháng oxy hoá sở hữu khả năng bat gốc tự do, cho nhận electron/hydrogen nên có khảnăng tương tác với gốc tự do hoặc các ion có tính oxy hóa để chấm dứt chuỗi phảnứng và tạo thành các hợp chất bền hơn hoặc các ion có tính khử [24]

Hiện nay mối quan hệ giữa các tính chất cau trúc của peptide như khối lượngphân tử, tính ki nước, thành phan và trình tự amino acid với từng cơ chế kháng oxy

hóa vẫn chưa được giải thích rõ ràng Các amino acid kị nước như Histidine, Proline,Methionine, Cysteine, Tyrosine, Tryptophan va Phenylalanine có thé nâng cao hevfoat

tinh khang oxy hoa [13].

Bang 1.4 Peptide khang oxy hoá từ động vật biến [13]Nguồn nguyên liệu Trình tự amino acid

Ca rô phi Leu-Ser-Gly-Tyr-Gly-Pro

1.3.2 Peptide khang vi sinh vat

Thanh phan kháng vi sinh vật có nguồn gốc tự nhiên được ứng dung để hỗ trợsức khoẻ cũng như kháng khuẩn trong thực phẩm Peptide kháng khuẩn giàu Cystine,CgPep33 được thu nhận từ dịch thuỷ phân protein của Hau, thé hiện hoạt tính khángkhuẩn đối với vi khuẩn gram âm, gram dương và ké cả nấm [19] Da số các peptidekháng vi sinh vật chứa cau trúc vòng xoắn a là ationic va amphiphathic Các peptidekháng vi sinh vật có tinh cationic dé dàng liên kết với mang phospholipid tích điện âmcủa vi sinh vật, khởi đầu cho sự phân giải màng tế bào [22], [25]

Bang 1.5 Peptide khang vi sinh vat [16]

Nguồn nguyên liệu Trình tự amino acid hoặc loại amino acid chủ yếu

Hàu Cys, Leu, Glu, Asp, Phe, Tyr, Ile, and Gly

Tôm hum Mi Gln-Tyr-Gly-Asn-Leu-Leu-Ser-Leu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Arg

Tôm Pro-Arg-Pro

1.3.3 Peptide liên kết CanxiTrong tất cả những kim loại hoá trị II tham gia vào quá trình trao đối chất, canxiđóng vai trò quan trọng như việc tạo độ cứng cho xương, chất truyền dẫn xung thầnkinh, một cofactor cho nhiều loại enzyme giúp các quá trình hóa lý và hóa sinh trongcơ thé được diễn ra bình thường [26] Sự thiếu hụt canxi sẽ dẫn đến hiện tượng loãngxương nên việc bố sung canxi trong khẩu phan ăn là điều cần thiết Sữa và các sảnphẩm từ sữa là nguồn cung canxi phô biến Casein phosphopeptide (CPP) từ quá trìnhtiêu hoá trong ruột non của casein có khả năng bắt canxi, tăng cường lượng canxi hoàtan có thé hap thu vào cơ thé Tuy nhiên, có nhiều người không thé sử dụng sữa và cácsản phẩm từ sữa do không thé hap thu hoặc dị ứng với lactose Vì thế, nhiễu nguồncanxi thay thế được nghiên cứu để khác phục tình trạng trên, như protein đậu nành,fructo-oligosaccharides, bột cá Hiện nay, một số nghiên cứu đã chứng minh các di —hoặc tripeptide có kha năng liên kết canxi và dé hap thu vào trong tế bào nhờ vào hệthống vận chuyển peptide cu thé [26]-[29]

Báng 1.6 Peptide liên kết CanxiNguồn nguyên liệu Trình tự amino acid Tài liệu tham khảoPhụ phẩm chế biến tôm Thr-Cys-His [30]

Cá rô phi Trp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp [27]

: Phu pham ca hoki [26]

Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Thr-Thr-Met-Tyr-Ala-Ser-Leu-Tyr-Ala-Glu

Huyét heo Val-Ser-Gly-Val-Glu-Asp-Val-Asn [29]1.3.4 Peptide ức chế enzyme chuyền đối Angiotensin-I

Angiotensin converting enzyme (ACE) là một enzyme thuỷ phân angiotensin I

tao thành angiotensin II có tac dụng làm co mach máu Ngoài ra, ACE con ức ché cabradykinin — một chất làm giãn mạch máu khi mạch máu bị co quá mức ACE đượcxem như là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh cao huyết áp ở người.Dựa trên cơ chế điều hòa huyết áp trong cơ thể, rất nhiều chất ức chế ACE tổng hợpđược điều chế như captopril, lisinopril, enalapril và alacepril Tuy nhiên, những chấtnay lại có tác dụng phụ khiến người sử dụng bị ho, phát ban da, rối loan vị giác hay bịviêm Vì thế, các chất ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên được nghiên cứu rộng rãinhăm thay thế chất ức chế ACE tổng hợp [31] Một số peptide ức chế ACE từ cácnguồn nguyên liệu giàu protein được đã và đang được thu nhận ở bảng 1.6

Bang 1.7 Peptide ức chế enzyme chuyền đối Angiotensin-INguồn Trình tự amino acid Tài liệu tham khảo

Ser-Asn-Trp-Ser-Pro-Pro-Lys-Try-Lys-Asp-Thr-Pro

1.4 Enzym protease1.4.1 Giới thiệu

Protease là tên dùng chung cho một nhóm enzyme các thuỷ phan thực hiện phan

giải protein bằng việc phân cắt liên kết peptide của protein Protease được tìm thấy ởđộng vật, thực vật, nam, vi sinh vat Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật la nguồnenzyme lớn nhất, chúng được nghiên cứu rộng rãi và sử dụng phố biến cho mục đíchthương mại [35] Một số enzyme đạt yêu cầu dùng trong chế biến thực phẩm và tuânthủ các tiêu chuẩn của các tổ chức quốc tế Protease (EC 3.4.21-25) là một nhóm lớn

trong công nghệ enzyme, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, công nghệ sinh

học, y dược và một số ngành nghiên cứu co bản [35]

1.4.2.2 Phan loại theo vi trí phan ứngDựa theo vị trí phản ứng, Protease được chia thành endopeptidase và

exopeptidase Theo hệ thống danh pháp EC của enzyme, enzyme thuỷ phân peptide

thuộc phan lớp 3.4 Trong đó, nó được phân ra thành 3.4.11-19 là exopeptidase va3.4.21-25 là endopeptidase.

1.4.2.3 Phan loại khác

Phân loại dựa trên điều kiện pH hoạt động, Protease chia thành Protease acid(pH 2-4), Protease trung tính (pH 7-8) va Protease kiém (pH 9-11)

Phân loại dựa trên nguôn goc, Protease có thê chia thành Protease có nguôn gôcđộng vat, Protease có nguôn gôc thực vật và Protease có nguôn gôc vi sinh vật.

Bảng 1.8 Phân loại enzyme theo vị trí xúc tác

Protease EC No.

Exopeptidase 3.4.11-3.4.19

Aminopeptidase 3.4.11Carbox ypeptidase 3.4.16-3.4.18

Endopeptidase 3.4.21-3.4.25

Serine protease 3.4.21Cysteine Protease 3.4.22

Aspartic Protease 3.4.23

Threonine protease 3.4.25Metalloprotease 3.4.24

1.4.3 Cơ chế xúc tác của ProteaseXúc tác được thực hiện bang một trong hai co ché:Aspartic và metallo protease kích hoạt một phân tử nước, thực hiện tấn công tácnhân ái nhân trên mach peptide dé thuỷ phân nó [36]

Serine, threonine va cysteine protease dùng một tác nhân ái nhân để kích hoạt

phản ứng thủy phân (thường là trong một bộ ba xúc tác) Bước 1, acyl hoá: hình thành

liên kết cộng hoá trị giữa nhóm —OH của serine với nguyên tử carbon trong nhómcarboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine Bước 2,khử acyl hoá: phức hệ acyl-enzyme bị thuỷ phân bởi phân tử H,O theo chiều ngược lạicủa bước 1 Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc —OH từ serine chonhóm amine để tái sinh enzyme [36]

1.5 Chất kháng oxy hoá

1.5.1 Giới thiệu

Chất kháng oxy hoá là những hợp chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hoá,

chúng có nhiêu vai trò trong sản xuât và sức khoẻ con người.

1.5.1.1 Đối với sản xuấtTrong lĩnh vực thực phẩm, quá trình oxy hoá chất béo không bão hoa không

những làm giảm giá tri cảm quan mà còn giảm giá trị dinh dưỡng, giảm sự an toàn cua

sản phẩm trong quá trình bảo quản và tạo ra các sản phẩm thứ cấp trong quá trình chếbiến [37] Chất kháng oxy hoá được đưa vào sản phẩm với tư cách một phụ gia nhămhạn chế hoặc ngăn chặn quá trình oxy hoá diễn ra trong sản phẩm Như vậy khi sảnxuất thực phẩm, bố sung chất kháng oxy hoá sẽ góp phan làm giảm những biến đổixấu do quá trình oxy hoá trong thực phẩm gây ra và tăng thời gian bảo quản cho sảnphẩm

1.5.1.2 Đối với sức khoẻCác gốc tự do là nguyên nhân gây các bệnh ung thư, loét dạ dày, Alzheimer,viêm khóp, thiếu máu cục bộ [38] Việc tạo thành gốc tự do như gốc anionsuperoxyde, gốc hydroxyl là hệ quả không thể tránh khỏi ở sinh vật hiếu khí trong quatrình hô hấp [37] Gốc tự do không 6n định và nhanh chóng phản ứng với các nhómkhác hoặc cơ chất trong cơ thé, dẫn tới ton thương tế bào, các mô [38] Trong co thécon người, có nhiều hệ thống kháng oxy hoá khác nhau như các enzyme kháng oxy

hoá nội tại, như catalase và glutathione peroxydase, hoặc các phân tử nhỏ hơn kháng

oxy hoá như vitamin C, vitamin E Chúng có vai trò thu nhặt gốc tự do, tránh làm tonthương tế bào Tuy nhiên, khi cơ thể bị bệnh, thì việc tạo thành và loại bỏ các gốc tựdo sẽ mất cân băng [39] Vi thế việc bổ sung các chất kháng oxy hoá từ bên ngoài làcần thiết để hạn chế ảnh hưởng xấu của việc tạo thành gốc tự do trong cơ thé

1.5.1.3 Phân loạiCác chất kháng oxy hoá thường được phân loại theo nguồn gốc [40].- Chat kháng oxy hoá tự nhiên: flavonoid, phenolic acid, carotenoid, tocopherol,

ascorbic acid,

- Chat kháng oxy hoá tổng hop: BHT, BHA, propyl gallte, 1.5.2 Một số phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá

1.5.2.1 Hoat tinh bắt gốc tự do DPPHGốc tự do DPPH? là một gốc tự do bên, có màu tía và có độ hấp thu cực đại ởbước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành DPPH°H, cómàu vàng (hình 1.3) Do độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm để xác định khảnăng khử gốc DPPH của chat chống oxy hóa [41]

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng của gốc tự do DPPH và chất kháng oxy hoá

1.5.2.2 Hoạt lực khứ RP (Reducing Power)

Phương pháp nay dựa trên nguyên tắc làm gia tăng độ hap thu của hỗn hop phanứng Sự gia tăng độ hấp thu cho thấy hoạt tính kháng oxy hoá tăng Trong phươngpháp nay, chất kháng oxy hoá tạo phức chất màu với potassium ferricyanide, trichloreacetic acid va ferric chloride Độ hap thu của hỗn hop được đo ở bước sóng 700 nm

[41].

1.5.2.3 Phương pháp khử sắt (IID thành sat (ID FRAPỞ pH thấp phức chat ferric tripyridyltriazine (Fe -TPTZ) bị khử thành dạngferrous (Fe”), màu xanh đậm với độ hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm (hình 1.4)

[41].

SS %

“Ty CI ey LI

NN Sy we NN

Fe”-TPTZ + reducing antioxidant » Fe’-TPTZ (intense blue at 595 nm)

Hình 1.5 So đồ phan ứng của phương pháp FRAP1.5.2.4 Phương pháp bắt gốc tự do ABTS°”

Cation ABTS°” là một gốc tự do bên Đây là một chất phát quang mau xanh,hấp thu cực đại ở bước sóng 734 nm Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứaABTS", các chất chống oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS Do độ giảm độ hap thucủa dung dịch ở bước sóng 734 nm để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóatrong sự so sánh với chất chuẩn Trolox (hình 1.5) Trong môi trường kali persulfate,gốc ABTS®” có thé bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh sáng [41]

Hình 1.6 So đồ phản ứng của phương pháp ABTS1.5.2.5 Phương pháp ức chế quá trình peroxyde hoá lipid

Nguyên tắc của phương pháp nảy là phản ứng của một phân tử malonaldehydevới hai phân tử thiobarbituric acid (TBA) dé tạo thành phức chất malonaldehyde màuđỏ, được định lượng băng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 532 nm [41]

1.5.2.6 Phương pháp tay màu j-caroteneTrong phương pháp nay, hoạt tính kháng oxy hoá được xác định bang việc so

sánh hai phan ứng hoá học cạnh tranh nhau Hệ nhũ ÿ-carotene/ linoleic acid trong

nước với gốc peroxyl (LOO») được tạo thành là thành phần chính của môi trườngphản ứng Những thay đổi của nồng độ B-carotene trong mẫu trang và mẫu có chứachất kháng oxy hoá được kiểm tra trong thí nghiệm nay B-carotene phản ứng với gốcperoxyl trong mẫu chỉ sau khi không còn chất kháng oxy hoá được nghiên cứu Sự tốnthất B-carotene được đo ở bước sóng 470 nm Trong thí nghiệm này, hoạt tính khángoxy hoá thường được thể hiện băng % ức chế so với mẫu trắng (không có chất kháng

oxy hoa) [41].

1.5.2.7 Phương pháp bắt gốc oxy tự do (ORAC)

Phương pháp nay đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa cua fluorescein khi có sự

hiện diện của gốc peroxy Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứngtrong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫuchứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính Khi fluorescein bị oxy hóa, cường độphát huỳnh quang sẽ giảm đi Tién hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tụctrong 35 phút sau khi thêm chất oxy hóa vào Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phânrã fluorescein sẽ chậm hơn Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảmphát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán Kết quả

tính toán là mmol Trolox/g mẫu [41]

1.5.3 Dịch thuỷ phân và peptide kháng oxy hoá.

Bảng 1.9 Hoạt tính kháng oxy hoá của một số dịch thuỷ phân proteinNguồn Phương pháp thủy ˆ Hoạt tính kháng oxy hoá cúa Tài liệu

phân dịch thuỷ phân tham khảo

Đầu và nội Alcalase 2.4 L, Ở 300ug/ml, khả năng bắt gốc |42I

tạng cá tự do DPPH của dịch thuỷ phân

Enzyme thô trích ly từsadinelle từ nội tạng cá với enzyme thô

nội tạng cá sadinelle

cao nhat.

Nguồn Phương pháp thủy ˆ Hoạt tính kháng oxy hoá cúa Tài liệu

phan dich thuy phan tham khao

Ca rô phi Alcalase, pronase E, Dich thuy phan boi alcalase [43]

trypsin, pepsin cho thay giá tri ICs) của DPPH

(600ug/mL) va hydroxyl

(263ug/mL) tốt nhấtCá chim Papain, pepsin and Ở nông độ 1,5mg/mL hoạt tính [44]

trypsin bat gốc tự do DPPH là 40,1%;

hoạt tính bắt sốc tự do

hydroxyl là 44,6%

Da cá bò Trypsin, neutrase, Hoạt tinh bắt gốc tự do DPPH [45]

papain, alcalase, va hydroxyl cua dich thuy phanpepsin và từ Alcalase là cao nhất với giáflavourzyme trị ICso lần lượt là 5,22mg/mL

và 1,04 mg/mL

Gan cáNgừ Alcalase, Ở nồng độ 5mg/mL hoạt tính [46]van Flavourzyme, bat gốc DPPH trên 80%, hoạt

Neutrase, Protamex tính bat ion sắt (II) trên 80% Ở

nông độ 2mg/mL, hoạt tính batgốc H202¢ trên 80%, bắt gốc

OHe trên 50%

Cá Nuc tròn Alcalase, Hoat tinh khang oxy hoa cua [47]

Flavourzyme dịch thuỷ phân ở mức độ thuỷ

phân 60% là cao nhất

1.6 Thu nhận peptide

Peptide có hoạt tính sinh học dang dan được ứng dụng pho bién trong thực phẩmvà dược phẩm Các peptide này có thể được thu nhận bằng nhiều phương pháp khácnhau, mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm riêng và phù hợp cho từng loại

điện di miền dịch.

_=—-“ >) làBiên tính protem

Thời gtzn

Sơ dé điện di SDS-PAGE

Hình 1.7 Sơ dé điện di SDS - PAGE

Phương pháp điện di SDS — PAGE được sử dụng khá pho biến Khi protein đượcchạy trong điện trường không đổi, phức hệ protein — SDS sẽ di chuyển xuyên qua cáclỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc vào hình dáng, kích thước phân tử Khi

đó protein sẽ được phân tách thành các băng, vạch khác nhau Gel thường được sử

dụng với nông độ từ 5% + 15% và có thé được chạy theo chiều năm ngang hoặc chiềuthăng đứng

e Phương pháp siêu lọc (UF)

Phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ rất nhỏ Màng lọc sẽ giữ các protein

và peptide có kích thước lớn ở trên và cho những peptide và protein có kích thước phù

hợp đi qua Phương pháp này có thé dùng dé làm tăng nông độ dung dịch protein vapeptide, khó có thé dùng dé tách cụ thé một protein hoặc peptide nào đó [49]

e Sắc ký pha lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC (High Performance Liquid Chromatogrphy) là một phương pháp chia tach

trong đó pha động là chat lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chat rắn đã được phânchia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang răn, hay một chấtmang đã được biến băng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phạm vi ứngdụng của phương pháp HPLC rất rong, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu,thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm,môi trường [50] Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC,

người ta chia HPLC thành 4 loại:

- Sac ký hap phụ hay sắc ký lỏng ran (adsorption/liquid chromatography).- _ Sắc ký phân bồ (partition chromatography)

- _ Sắc ký ion (ion chromatography).- Sac ký ray phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).1.7 Tổng quan tình hình nghiên cứu hoạt tinh kháng oxy hoá cúa dich thủyphan protein từ cá và các phần đoạn peptide

Trong nghiên cứu về dịch thủy phân thịt đen cá ngừ của Kuo Chiang Hsu (2010),tác giả sử dụng hai loại chế phâm enzyme thương mại orientase va protease XXIII déthủy phân nguyên liệu trong vòng 6 tiếng và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của

dịch thủy phân Sau đó, dịch thủy phân được đem lọc phân đoạn bằng Sephadex G-25và được tinh sạch bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) Hai peptide được

tinh sạch là Leu-Pro-Thr-Ser-Glu— Ala—Ala—Lys—Tyr (978 Da) và d Pro-Met-Asp—Tyr—Met—Val—Thr (756 Da) cho hoạt tính bắt sốc tự do DPPH với giá tri lần lượt à79.6% pvà 85,2% Nghiên cứu cho thay dịch thủy phân phụ phẩm thịt đen cá ngừ cókhả năng ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [51]

Năm 2011, Centenaro và cộng sự đã khảo sat dịch thuỷ phân cá du Argentine

(Umbrina canosai) bằng các chế phẩm protease khác nhau (Flavourzyme, Chymotrypsin và Trypsin) để thu nhận dịch peptide có hoạt tính kháng oxy hóa Cácdịch thủy phân cho thay mức độ khác nhau của quá trình thủy phân và hoạt tính kháng

a-oxy hoá Hoạt tính kháng a-oxy hóa của dịch thủy phần được đánh giá thông qua sự ức

chế của peroxy acid linoleic, bắt gốc hydroxyl, bắt gốc tự do DPPH, ABTS và hoạtlực khử Dich thủy phân sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme cho hoạt tính ức chếlipid peroxy cao (77,3 và 61.6%, tương ứng) và kha năng bắt gốc tự do DPPH,

ABTS+ mức trung bình Dịch thuỷ phân thu được sau khi khảo sát hoạt tính khángoxy hoá sẽ được đem lọc phân đoạn (phân đoạn I: >6 kDa, phân đoạn II: 3-6 kDa,

phân đoạn III: 1-3 kDa và phân đoạn IV: <1 kDa) va đã xác định thành phan chính

trong dịch thuỷ phân là <3 kDa va <1 kDa và xác định hoạt tính kháng oxy hoá cao

nhất ở phân đoạn <3 kDa [52]Trong nghiên cứu của Abraham T Girgih và cộng sự (2013), protein thịt cá Hồi

đã tách xương được thuỷ phân sử dụng 3 enzyme protease (Pepsin, Trypsin và

Chymotrypsin) và dịch thuỷ phân được đưa sang hệ thống lọc dòng tiếp tuyến có kíchthước < 1 kDa; phan qua màng được thu hồi là dịch thuỷ phân protein cá hồi (SPH).SPH được tách bởi sắc ký pha đảo RP — HPLC thành 4 phân đoạn peptide (SFI — SF4)và được khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá băng các phương pháp khác nhau Kết quảcho thay phần lớn các phân đoạn peptide (SF2 — SF4) thé hiện giá trị hoạt tính kháng

oxy hoá theo phương pháp ORAC cao hơn (1.315—1.541uM Trolox/g) so với dich

thuỷ phân protein cá Héi Đồng thời, các phân đoạn peptide cũng thé hiện hoạt tínhkháng oxy hoá cao hon theo phương pháp bắt gốc DPPH’ và phương pháp bắt gốc tựdo peroxide khi so sánh với dịch thuỷ phân chưa tách phân đoạn Tổng kết, hoạt tính

bắt gốc tự do của peptide tăng cùng với tính ky nước, ngoại trừ gốc tự do hydroxyl

[50]

Trong nghiên cứu của Haiping Jiang va cộng su (2013), protein cơ cá Nuc

(Decapterus maruadsi) được thuỷ phân bang 5 loại chế phẩm enzyme protease

Alcalase, Neutral protease, Papain, Pepsin và Trypsin Dịch thuỷ phân cá Nục sử dụng

chế phẩm enzyme Alcalase thể hiện hoạt tính kháng oxy hoá cao nhất Sau khi siêulọc, phân đoạn RSH III (MW < 5kDa) thể hiện hoạt tính mạnh nhất Sau đó, phânđoạn này được tinh sạch băng sắc ký lọc gel (Sephadex G-15) và được tách thành 4phân đoạn nhỏ khác (A, B, C và D), trong đó, phan đoạn B thể hiện hoạt tính khángoxy hod cao nhất và tiếp tục được tinh sạch hai lần băng phương phắp sac ký pha đảo

(RP — HPLC) Peptide được tinh sạch được định danh His-Asp-His-Pro-Val-Cys

(706.8 Da) và His- Glu-Lys-Val-Cys (614/7 Da) bang ma trận hỗ trợ giải hap thu ion

hoá [53].

Trong nghiên cứu cua Pedro J Garcfa-Moreno va cộng sự (2014), nhóm tác giả

đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của dịch thuỷ phân protein phụ phẩm cá ĐịaTrung Hải (cá Moi, cá Thu ngựa, cá Trap, cá Bogue và cá Nhám mèo) Kết qua chothay DH của dịch thuỷ phân từ các loài cá này là khoảng từ 13,2 đến 21%, hàm lượngprotein khoảng từ 60,7 đến 89,5%, hàm lượng béo khoảng từ 4,6 đến 25,3% Hoạt tínhbat gốc DPPH’ tinh theo ICsp cao nhất được tìm thấy ở dịch thuỷ phân từ protein củacá Moi và cá Thu ngựa lần lượt là 0,91 và 1,78 mg protein/mL Dịch thuỷ phân từprotein cua cá moi va cá catshark có hoạt tính tao phức với sat (II) tính theo ICs caonhất ở nông độ là 0,32 mg protein/mL Ngoài ra, dịch thuỷ phân từ protein của cá Mồivà cá Bogue có hoạt lực khử sat (IIT) cao nhất Tóm lại, dịch thuỷ phân từ protein từcác loại cá Địa Trung Hải này đều cho thấy là chất kháng oxy hoá tự nhiên tiềm năng

[54].Nghiên cứu của Xin Pang và cộng sự (2016) đã định danh các đoạn peptide thu

được sau khi tinh sạch từ phân đoạn < 1 kDa của dịch thủy phân sụn cá đuối (Rajaporosa) bang hỗn hop enzyme trysin và alcalase Các phân đoạn peptide gồm Phe-lle-

Met-Gly-Pro-Tyr (726,90 Da), Gly- Pro-Ala-Gly-Asp-Tyr (578,58 Da) và

Ile-Val-Ala-Gly-Pro-GIn (583,69 Da) cho hoạt tinh bat dốc tự do DPPH (ICao 3,5768; 6,0147