TÓM TẮTTrong nghiên cứu này, hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein của con ruốc khô được khảo sát.. Tiếp theo, ảnh hưởng của loại enzyme, p
TONG QUAN 1.1 Giới thiệu về con ruốc
Ruốc theo định nghĩa sinh học là một loài tôm nhỏ (hay rõ hơn là một loài tép nhỏ) thuộc chi động vật Acetes, ho Sergestidae Chi Acetes, theo phân loại của FAO, có đến 14 loài, trong đó chỉ những loài tại châu Á là có những giá tri kinh tế, được dùng làm thực phẩm và là nguồn cung cấp chất đạm quan trọng cho dân địa phương.
Ruốc sống ở vùng nước Io hay mặn ven biến, do kích thước của con ruốc quá nhỏ nên chúng thường chỉ được dùng dé làm mam Ruốc hay phơi khô rồi xay vụn thành bột ruốc Ruốc phân bố chủ yếu trải dài từ bờ tây Ấn Độ sang Thái Lan, Indonesia, biển Đông và ngược lên Đài loan, Nhật Bản [2].
Acetes có một số đặc tính chung là không có những đôi chân thứ 4 và thứ 5 nơi phan bụng Chúng có cau tạo cơ bản giống các loài giáp xác 10 chân, đầu không kéo dài, kích thước nhỏ, vỏ mềm, thân trong, nhưng có đôi mắt to, và có những đốm sắc tố đỏ nơi phan đuôi Acetes đẻ trứng màu xanh lục, và trứng phình to gấp đôi trong thời gian tăng trưởng Chu kì sống chỉ khoảng 3 — 10 tháng, kéo dai trong cùng một năm từ khi trứng nở, chuyển sang ấu trùng, trưởng thành và phát dục Acetes thường di chuyển từ tầng đáy lên bề mặt vào ban đêm và trở xuống vào ban ngày, chúng tập trung thành bay, dày đặc noi mặt biển Chúng được xem là một nguồn cung cấp thực phẩm tương đối lớn cho sinh vật biến.
H nh 1.1 Ruốc Acetes japonicas [3] ang 1.1 Phân loại tên khoa học của con ruốc [4]
Giới (regnum) Dong vat (Animalia) Ngành (phylum) Dong vat chan khop (Arthropoda)
Phan nganh (suphylum) Dong vat giap xac (Crustacean)
Lop (class) Ciáp mềm (Malacostraca)
Bộ (ordo) Giáp xác mười chiân (Decapoda)
Ho (familia) Moi bién (Sergestidae) Chi (genus) Ruốc (Acetes)
1.1.2 Tinh hình thu hoạch, chế biến và xuất khẩu ruốc
Tại Việt Nam ruốc thông thường được gọi là tép nhỏ, còn được gọi dưới những cái tên địa phương như khuyết (miền Trung, Huế), moi (Hà Tĩnh) và ruốc vịt (Gành Hào, Bạc Liêu) Ruốc thường di chuyển vào gan bờ tại Việt Nam vào khoảng thang 3 đến tháng 9 (âm lịch) Tùy vào con nước mà ruốc xuất hiện nhiều hay ít, những hôm biển sạch, nước trong ruốc nỗi lềnh bénh trên mặt biển thành một vùng rộng lớn màu hông, trôi dân vào bờ.
Tại Quang Bình, trung bình mỗi ngày, một hộ gia đình thu về từ 3-5 triệu đồng,nhưng sau sự cô môi trường biến vừa qua, ruốc biến hiện nay gia rất rẻ và rất khó tiêu thụ, nhiều gia đình phải đưa ruốc về muối hoặc làm thức ăn cho gia súc [5| Tại BạcLiêu, ruốc xuất hiện nhiều hơn, mỗi chuyên ra khơi ngư dân thu lãi bình quân từ 5 -6 triệu đồng, trung bình mỗi ngày, ngư dân khai thác được từ 3 — 4 tan ruốc tươi Chính vì thế, lượng ruốc luôn có sẵn dé cung cấp cho các thị trường tiêu thụ Tuy nhiên, một van dé chính là con ruốc ở Bạc Liêu thường chỉ sản xuất thô là chính, dẫn đến khó chủ động vẻ thị trường tiêu thụ và lại bị các thương lái ép giá Việc thu mua ruốc tươi cũng hạn chế bởi có rât ít doanh nghiệp trên địa bàn tỉnh thu mua, còn lại hầu hết các doanh nghiệp ngoài tỉnh chỉ mua ruốc khô [6].
Nhu câu xuất khẩu ruốc sang 3 thị trường chính là Hàn Quốc, Mỹ và Trung Quốc, trong đó xuất khâu sang Hàn Quốc là nhiều nhât ruốc xuất khẩu được qua SƠ chế, ngoài ra còn ruốc khô dé làm thực phẩm ở các quán ăn do bảo quản được lâu [7],
1.2 Dịch thủy phan protein 1.2.1 Khái niệm
Dịch thuỷ phân từ protein là sản phẩm của quá trình thuỷ phân sử enzyme tạo thành các peptide hay các amino acid có phân tử lượng nhỏ hơn, được gọi chung là peptidhydrogenlase, có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được phân biệt với nhau bởi tính đặc hiệu khác nhau với liên kết peptide [9] Một số dịch thuỷ phân từ protein là hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng cao; hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng trung bình; peptone; hỗn hợp các peptide mạch ngăn, hỗn hợp các amino acid và các peptide phân tử lượng thấp hoặc hỗn hợp các amino acid tự do [10].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy sự tương quan giữa mức độ thủy phân và khả năng nhũ hóa của dịch thủy phân Các nghiên cứu đã tìm ra rằng tính chất nhũ hóa của dịch thủy phân được cải thiện khi kiểm soát mức độ thủy phân Dịch thủy phân chứa từ 20 gốc amino axit hoặc hơn cho thay khả năng nhũ hóa cao hơn Nhiều dịch thủy phân từ protein có giới han khả năng nhũ hóa trong khoảng khối lượng phân tử từ 2,4 - 2,5 kDa Nhiều bằng chứng cho thấy tính kị nước cũng như tính đặc hiệu của enzyme thủy phân có ảnh hưởng lớn đến khả năng nhũ hóa của dịch thủy phân Những dịch thủy phân với mức độ thủy phân cao có khả năng nhũ hóa thấp, do đó một giải pháp đã được đề ra là trộn lẫn chúng vào dẫn xuất của các loại tinh bột khác nhau Hỗn hợp này không chi tạo ra hệ nhũ tương 6n định, nó còn cho thay sự bên nhiệt trong quá trình tiệt trùng, lạnh đông hoăc bảo quản nhiều giờ ở nhiệt độ phòng [11].
1.2.2.2 Tính tan và sự bền nhiệt
Tính tan và sự bên nhiệt là một trong những tính chất quan trọng của dịch thủy phân protein Độ tan của dịch thủy phân năm trong một khoảng rộng pH, nhiệt độ, nông độ chất khô và nồng độ muối Dịch thủy phân với mức độ thủy phân thấp vẫn có thé tan ở pH 4-5 vì nó không chỉ chứa các peptide có phân tử lượng nhỏ hơn mà còn có sự ion hóa mạnh hon của các nhóm amino va carboxyl với sự gia tăng tương ung tính ưa nước tính chất này của dịch thủy phân đặc biệt quan trọng trong công nghiệp sản xuât thực phâm, đô uông như nước ép trái cây, nước udng cho trẻ em.
Dich thủy phân có kha năng bên nhiệt hơn đối với protein nguyên liệu Tính chất này quan trọng trong việc sản xuất dịch thủy phân có sử dụng quá trình tiệt trùng Tính bên nhiệt của dịch thủy phân ở mức độ thủy phân thấp ( khoảng 3-10%) với sự có mặt của ion kim loại hóa trị II như CaCl, ở 100 - 130°C nằm trong khoảng pH từ 3 - 11
1.2.2.3 Su tham thau Đây là tính chat hóa lý quan trong đặc trưng cho chat lượng sản phẩm dành cho trẻ em và thức uống cho người già Sản phẩm có độ thấm thấu cao làm gia tăng chất lượng chất lỏng trong ruột non, gây rối loạn đường ruột và mất nước đường ruột, rối loạn cân băng điện giải, buồn nôn, ói mira, và tác dụng phụ khác Sự tham thấu của dịch thủy phân protein tăng đáng kế với sự gia tăng mức độ tạo thành hỗn hợp peptide và các amino axit Dé điều chỉnh độ thâm thấu của sản phẩm có chứa dich thủy phân từ protein, các chất khác nhau chang hạn như tinh bột việc này không chỉ làm giảm khả năng thắm thấu mà còn đảm bao sự 6n định của sản phẩm khi chế biến [1 1].
Vi dang được coi là van dé can trở quan trong nhat trong việc su dụng dich thủy phân protein thương mai trong công nghiệp thực phẩm Các peptide có trọng lượng phân tử thấp tạo nên vị đăng của dịch thủy phân Những peptide này được biết có chứa các axít amin ky nước như leucine, proline, phenylalanine, và tyrosine Các axít amin ky nước có vị đăng nhiều khi chúng ở bên trong chuỗi peptit chứ không phải là N- hoặc C-cuối cùng của peptide [12].
1.2.3 Hoạt tính sinh học của dịch thúy phân
Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân bao gồm sự cộng hưởng hoạt tính của các protein tan, các đoạn peptide, các amino axit, các vitamin Vi peptide chiếm phan lớn trong dịch thủy phân nên nó đóng vai trò quan trọng nhất peptide có hoạt tính sinh hoc hau như bi vô hoạt khi năm trong trình tự của protein [13] Tuy nhiên, khi giải phóng các peptide này ra khỏi protein thì nó sẽ thể hiện các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, liên kết canxi, hạ huyết áp, chống đông máu [13], [14], [15].
1.2.4 Các phương pháp thúy phân protein
Day là phương pháp thủy phan protein dưới xúc tác của acid mạnh (HCI, H;SO,) hay kiềm mạnh (NaOH) ở nhiệt độ cao để cắt đứt các liên kết peptide.
Phương pháp này sử dụng HCI ở nồng độ 6 — ION, nhiệt độ (100 — 180°C), thời gian thủy phân từ 24 — 48 giờ Sau quá trình thủy phân, dung dich được trung hòa đến pH về 6,5 — 7 Do sử dụng acid nồng độ cao và nhiệt độ thủy phân cao nên một số acid amine bị phá hủy Tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, các acid amine như serine và threonine bị phá hủy một phan Asparagine, glutamine bị chuyền thành dạng acid, hau hết các vitamin bị phá hủy [16]
Sử dụng NaOH nông độ từ 4 — 8N, nhiệt độ 100 — 110°C, thời gian 24 — 48 giờ. Đối với phương pháp nay, tryptophan được bảo toàn nhưng xảy ra hiện tượng racemic hóa làm giảm giá trị dinh dưỡng, tạo lysineolanine làm giảm lysine trong thành phan nên phương pháp này it sử dung trong công nghiệp [16].
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Con ruốc khô trong nghiên cứu này được mua tại một công ty ở Bình Thuận.
Ruốc đã được yêu cầu sấy khô đến độ âm 12% và được bảo quản trong các túi PA hút chân không, khối lượng 0,5 kg/túi.
Chế phẩm enzyme Alcalase® 2.5 L (EC No: 3.4.21.62) từ Bacillus licheniformis với hoạt độ công bố 2,5 AU-A/g Điều kiện nhiệt độ va pH tối ưu tương ứng là 30 -
Chế phẩm enzyme Corolase” 7089 (EC No: 3.4.22) tir Bacillus subtilis với hoạt độ công bố 840 UHb/g Điều kiện nhiệt độ va pH tối ưu tương ứng là 40 - 65°C và 6 —
Chế phẩm enzyme Flavourzyme” 500 MG (EC No: 34.11.1) từ Aspergillus oryzae với hoạt độ công bố 500 LAPU/g Điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là
Chế phẩm enzyme Neutrase” 08 L (EC No: 34.22) từ Bacillus amyloliquefacien với hoạt độ công bố 0.8 AU/ g Điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 40 - 50°C và 5,5 — 8 [51].
Chế phẩm enzyme Protamex® (EC No: 3.4.24.28) từ Bacillus licheniformis và Bacillus amyloliquefaciens với hoạt độ công bố 1,5 AU/ g Điều kiện nhiệt độ va pH tối ưu tương ứng là 35 - 60°C và 5,5 — 7,5 [55].
Các hoá chất khác được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm DPPH, Albumin được mua tại công ty Sigma - Aldrich (Mỹ), methanol 99,7%, ethanol 99%, vitamin C được mua ở công ty Hoá Nam (Việt Nam), acetic acid, CH3;3COONa.3H20, FeCl,.6H,O, TPTZ, Folin, Tyrosin được mua ở công ty Merck Schuchardt (Đúc).
Khảo sát thành phan hoa học cua con rudc khô (Protein tông, béo, tro, âm)
TA, IA ` LẠ Hoạt tính kháng oxy hóa của
Nhiệt độ Ham mục tiêu dịch thủy phân (DPPH, FRAP)
Khảo sát điều kiện thủy phân Tỉ lệ E/S
Tối ưu hóa điều Hoạt tính nhốt gốc tự do _ A Ham muc tiéu DPPH cua dich thuy phan cao kién thuy phan h nhât
Hoạt tính kháng oxy hóa của Tách phân đoạn Hàm mục tiêu từng phân đoạn peptide
Xác định phân đoạn peptide có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhâ và so sánh voi vitamin C
H nh 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
2.2.2.1 Khảo sát thành phần hóa học của nguyên liệu Con ruốc khô được xác định các thành phần hóa học cơ bản sau:
- Hàm lượng protein thô (phương pháp kjeldahl với hệ số chuyển đổi Nito
- Hàm lượng tro tông (AOAC, 2000)
2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp DPPH, FRAP
- Thông số cô định: e Tỉ lệ E/S: 30 U/g protein e Thời gian: 4 gio
- Thong sỐ thay đổi: 5 loại chế phẩm enzyme được đem ra khảo sát lần lượt là Alcalase, Corolase, Flavourzyme, Neutrase và Protamex ở điều kiện pH nhiệt độ tối ưu (bảng 2.1).
Bang 2.1 Nhiệt độ va pH tối ưu cua từng loại chế phẩm enzyme
Loại enzyme pH Nhiệt độ (“C) TLTK Alcalase 75 55 [49]
Hàm mục tiêu: hoạt tính kháng oxy hóa của dich thủy phân cao nhất.
— Chọn được loại chế phẩm enzyme thủy phân cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất cho nghiên cứu tiếp theo.
2.3 Khảo sát ảnh hướng của pH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp DPPH, FRAP
- Thông số có định: e Enzyme: đã chọn e Nhiệt độ tối ưu của loại enzyme đã chọn (bang 2.1)
Thông số thay đối: pH: khảo sát các giá trị pH nằm trong vùng hoạt động tối ưu của enzyme với bước nhảy là 0,5.
Hàm mục tiêu: hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân cao nhất
—> Chọn giá trị pH cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất.
2.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thúy phân theo phương pháp DPPH, FRAP
Enzyme: đã chọn pH: đã chọn E/S: 30 U/g protein
Nhiệt độ: khảo sát các giá trị nhiệt độ năm trong vùng hoạt động tối ưu của enzyme với bước nhảy là 5°C.
Hàm mục tiêu: hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân cao nhất
— Chọn giá tri nhiệt độ thủy phân cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất.
2.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thúy phân theo phương pháp DPPH, FRAP
Enzyme: đã chọn pH: đã chọn Nhiệt độ: đã chọn
Thông số thay đổi: Tỉ lệ E/S: tỉ lệ E/S thay đối trong khảo sát 30 — 70 U/g protein, bước nhảy là 10 U/g protein.
- Hàm mục tiêu: hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân cao nhất
— Chọn tỉ lệ E/S cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất.
2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa cua dịch thủy phan theo phương pháp DPPH, FRAP
- Thông số có định: e Enzyme: đã chọn e pH: đã chọn e Nhiệt độ: đã chọn e Tỉ lệ E/S: đã chọn
- Thông số thay đổi: e Thời gian thủy phân: thay đổi thời gian thủy phân trong khoảng 2 - 6 giờ, bước nháy là | giờ.
- Hàm mục tiêu: hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân cao nhất
— Chọn thời gian thủy phân cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất.
2.3.1.4 Sang loc các yếu tổ anh hưởng điều kiện thủy phân Để xác định các yếu tố va mức anh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH, 4 yếu tố được chọn là pH, nhiệt độ tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân Thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Plackett Burman với 4 yếu tô trong 11 thí nghiệm (3 thí nghiệm tại tâm) dé sàng lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp nhốt gốc tự do
2.3.1.5 Tối ưu hoá điều kiện thuỷ phân
Quá trình tối ưu hoá với 2 yếu tô ảnh hưởng chính đến hoạt tính kháng oxy hoá của dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Phương pháp này sử dụng kỹ thuật phân tích hồi quy đa thức nhằm xác định tất cả các hệ số bậc 1 (Xị, X2), hệ số bậc hai (X¡ˆ, X.°) và hệ số tương quan (X¡X;) và sử dụng thiết kế hỗn hợp có tâm (CCC) để thiết kế ma trận thí nghiệm tối ưu.
2.3.1.6 Lọc phần đoạn dịch thúy phân.
Sau khi khảo sát các điều kiện thủy phân, ta tiến hành thủy phân mẫu ruốc ở các điều kiện đã chọn Dịch thủy phân sẽ được mang đi lọc cột ly tâm với các kích thước mang là 30kDa, 10kDa, 3kDa, IkDa Cac phan đoạn protein thu được bao gom
>30kDa, 10-30kDa, 10-3kDa, 3-1 kDa, 1kDa.
2.3.1.7 Khao sát hoạt tính kháng oxy hóa cua các phan đoạn peptide thu được theo DPPH và FRAP.
Các phân đoạn peptide sau khi thu nhận sẽ được xác định hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH và FRAP để xác định xem phân đoạn peptide nào có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất.
2.3.1.8 Khao sát hoạt tính kháng oxy hóa của Vitamin C
Dùng vitamin C là mẫu đối chứng Do hoạt tính kháng oxy hóa của vitamin C tương tự như các phân đoạn peptide để so sánh.
2.4 Các quy trình nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu
Con ruốc khô sau khi mua về sẽ được xay nhuyễn, sau đó chứa trong các túi PA hút chân không, khối lượng 0,5 kg/túi và bảo quản ở nhiệt độ 4°C sử dụng trong suốt quá trình thí nghiệm.
2.4.2 Quy trình san xuất dịch thủy phân từ ruốc khô sử dụng các chế phẩm enzyme
Con ruốc khô được hòa trộn với nước tỉ lệ 1:8 (w/v) Sau đó sẽ được gia nhiệt tới 90°C trong vòng 30 phút dé vô hoạt enzyme nỘI tại Tiếp đến, hỗn hợp sẽ được chỉnh pH bang acid/base và thêm đệm với pH tương ứng để tạo điều kiện cho chế phẩm enzyme hoạt động Sau đó, chế phẩm enzyme được cho vào theo tỉ lệ E/S phù hợp với thí nghiệm và tiến hành thuỷ phân trong bể điều nhiệt tại nhiệt độ và thời gian phù hợp Sau quá trình thuỷ phân, dịch thuỷ phân được gia nhiệt ở 90°C trong 15 phút để vô hoạt chế phẩm enzyme thêm vào Dịch thuỷ phân được ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 20 phút dé tách riêng phan lỏng và phan ran Phan ran sẽ được loại bỏ sau khi
20 quá thiết bị lọc chân không sử dụng giấy lọc Whatman, còn phần lỏng được thu nhận và tiếp tục lọc để có được dịch thuỷ phân trong.
Nước (tỉ lệ 1:8 w/v) Hòa trộn
Vô hoạt enzyme nội tại
Acid/base + đệm Điều chỉnh pH
Chế phẩm enzyme Thủy phân it
H nh 2.2 Quy trình sản xuất dịch thủy phân từ Ruốc khô.
2.4.3 Phương pháp xác định thành phan hóa học của nguyên liệu 2.4.3.1 Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Kjeldahl
- Nguyên lý: Vô cơ hóa mau bang H;SO¿ đậm đặc va chat xúc tác, sau đó dùng kiểm mạnh (NaOH hay KOH) dé đây NH; từ muối (NH¿)zSO¿ hình thành ra thé tự do Định lượng NH3 bằng H;SO¿ 0,1N.
- Cách tiễn hành: được trình bày ở phần phụ lục.
2.4.3.2 Xác định hàm lượng béo bằng phương pháp soxhlet
- Nguyên lý: Dựa vào tính tan hoàn toàn của chất béo vào dung moi hữu cơ Dung dung môi hữu co trích ly chất béo có trong sản phẩm thực phẩm Sau đó làm bay hơi hết dung môi, chất béo còn lại đem cân, tính ra hàm lượng chất béo có trong sản phẩm thực phẩm.
- Cách tiễn hành: được trình bày ở phần phụ lục.
- Nguyên tắc: sây nguyên liệu đến khối lượng không đổi, từ đó xác định được hàm âm của nguyên liệu (AOAC, 2000).
- Cách tiễn hành: được trình bày ở phan phục lục.
2.4.3.4 Xác định hàm lượng tro
- Nguyên tac: nung mẫu ở nhiệt độ khoảng 500°C dé đốt cháy hết các hợp chất hữu cơ rồi đem cân phan tro còn lại (AOAC, 2000).
- Cách tiễn hành: được trình bày ở phan phục lục.
2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
2.4.4.1 Hoạt tính nhốt gốc tự do DPPH
- Nguyên tắc: sốc tự do DPPH có màu tím sẽ bị khử thành hợp chất có màu vàng khi có mặt của chất chống oxy hóa Do độ giảm độ hap thu ở bước sóng 517nm để xác định hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu.
- Cách tiễn hành: được trình bày ở phan phục lục.
2.4.4.2 Phương pháp khử sắt FRAP
- Nguyên tắc: Mẫu thử sẽ khử ion Fe”” trong phân tử kali ferricyanid (K3[Fe(CN).]) thành ion Fe”? trong phan tử kali ferrocyanid (K„[Fe(CN)s]) có màu xanh dương đậm.
- Cách tiễn hành: được trình bày ở phan phục lục.
2.4.5 Phương pháp sang lọc các yếu tố ảnh hướng đến quá trình thủy phân
Tiến hành thí nghiệm sàng lọc theo ma trận Plackett Burman với các thông SỐ tại tâm của từng yếu tố ứng với điều kiện thủy phân đã được chọn Mỗi điểm thí nghiệm sẽ được khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH Số liệu sàng lọc được xử lý bằng phần mềm Modde 5.0. ảng 2.1 Giá trị các biên thực và mức mã hóa của chúng
Biến thực Biến mã hóa Các mức mã hóa
Nhiệt độ (°C) Xa 50 55 60 Tỉ lệ E/S (U/g protein) X3 50 60 70
Số thí nghiệm khảo sát: 11 (3 thí nghiệm tại tâm).
2.4.6 Phương pháp tối ưu hoá điều kiện thuỷ phân
Tiến hành thí nghiệm tối ưu với các thông số tại tâm của từng yếu tố ứng với điều kiện thuỷ phân đã được chọn Mỗi điểm thí nghiệm sẽ được khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá theo phương pháp DPPH Số liệu tối ưu được xử lý băng phần mềm Modde 5.0 Sau khi có được phương trình hồi quy, tiễn hành thí nghiệm kiểm tra độ tin cậy của phương trình.
23 ảng 2.2 Giá trị các biên thực và mức mã hóa của chúng
Tên yêu to hó ea -d -ẽ 0 | aL
Số thí nghiệm được tính theo công thức:
- k: Số yếu tố thí nghiệm (k = 2) - no: Số thí nghiệm tai tâm (nọ = 5)
2.4.7 Phương pháp tách phân đoạn peptide cua dịch thuỷ phân
KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát thành phan hóa học của con ruốc khô
ang 3.1 Thành phan hóa học của con ruốc khô
Tên chỉ tiêu Kết quả (%) Độ âm 123 +0,12 Hàm lượng tro tổng trên chất khô 168+02 Hàm lượng protein tổng trên chất khô 723+0/7 Hàm lượng béo tổng trên chất khô 4.3 +02
Kết quả phân tích cho thay con ruốc khô có độ âm 12,3%, ham lượng tro 16,8 +
0,2%, hàm lượng protein 72,8 + 0,7%, hàm lượng béo 4,3 + 0,2% (tính theo ham lượng chất khô) Nghiên cứu của AOAC (2000) về chủng Acetes sp cho thấy trong thành phân hóa học cua con ruôc có chứa 86,8% âm, hàm lượng protein, béo và tro tính theo khối lượng khô là 61,5 %; 11,67 và 19,09%, tương ứng.
Từ đó cho thay con ruôc khô là nguôn nguyên liệu giàu protein có tiêm năng dé thu nhận dịch thủy phân hay các phân đoạn peptide có hoạt tính kháng oxy hóa, cũng như các hoạt tính sinh học khác.
3.2 Kết quả khảo sát ánh hưởng của loại enzyme đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH và phương pháp khứ sắt FRAP
= lệ || || Ỉ Ỉ 1 Alcalase Corolase Flavouzyme Neutrase Protamex
H nh 3.1 Khao sát ảnh hướng của loại enzyme đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH a b bc lọ
Alcalase Corolase Flavouzyme Neutrase Protamex
Gia tri FRAP (uM Trolox) \)© ©œ |
H nh 3.2 Khao sát ảnh hướng của loại enzyme đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp khử sắt FRAP
Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch thủy phân sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme cho hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất đạt 46,4% theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH và 112,1 „M Trolox theo phương pháp khử sat FRAP Chế phẩm enzyme Protamex cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa thấp nhất, hoạt tính nhốt gốc tự do DPPH chỉ đạt 33.94% và hoạt tính khử sat FRAP đạt 75,94 „M Trolox.
3 chế phẩm enzyme Alcalase, Corolase va Neutrase cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa trung bình, hoạt tính nhốt gốc tự do DPPH là 36,27; 36,38 và 39,5%, tương ứng và hoạt tính khử sat FRAP là 94; 93 và 101 ;M Trolox, tương ứng Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân không chỉ liên quan đến mức độ thủy phân DH mà còn liên quan đến các yếu tố khác, như sự tăng hoặc giảm mức độ ki nước, thành phan và cau trúc các acid amine thơm, có tính acid, hoặc trung tinh [55] Trong nghiên cứu của Guang-Rong Huang va cộng sự (2011) khảo sát hoạt tính khang oxy hóa của dịch thủy phân từ phụ phẩm tôm, kết quả cho thay dịch thủy phân sử dụng chế phẩm enzyme Alcalase cho hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH cao nhất khoảng 32,5% [55] Điều đó cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân phụ thuộc vào loại nguyên liệu, loại chế phẩm enzyme sử dụng, trình tự, thành phan của các peptide
Ngoài ra, chế phẩm enzyme Flavourzyme cho dich thủy phân không có vị dang so với dịch thủy phân thu được từ các chế phẩm enzyme khác [56] Do đó, thích hợp để nghiên cứu ứng dụng vào thực phẩm.
Vì vậy, chế phẩm enzyme Flavourzyme được chọn làm chế phẩm enzyme thủy phân cho các thí nghiệm sau.
3.3 Kết qua khảo sát anh hưởng của pH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH và phương pháp khử sắt FRAP
H nh 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH a b b b
Gia tri FRAP (uM Trolox) LÒ a So oS cm”)
H nh 3.4 Khao sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp khử sắt FRAP
Khi pH tăng từ 5 đến 7, hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân tăng dan từ 33,53% đến 44,38% theo phương phỏp nhốt gốc tự do DPPH và từ 61 đến 106 ằM Trolox theo phương pháp khử sắt FRAP Điều này có thể được giải thích là pH có ảnh hưởng đến khả năng ion hóa cơ chất, enzyme, peptide, amino acid từ đó làm tăng tốc độ phản ứng thủy phân dẫn đến làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân.
Trong nghiên cứu của Jarnathanan Gunasekaran và cộng sự (2014), cho thấy dịch thủy phân từ phụ phẩm đầu tôm (Metapenaeus dobsoni) có hoạt tinh kháng oxy hóa cao nhất khi sử dụng chế phẩm enzyme Alcalase ở pH = 8.2 [63] Từ đó có thé thay mỗi loại chế phẩm enzyme khác nhau sẽ cho dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa khác nhau ở mỗi pH khác nhau.
Vì vậy, pH = 7 được chọn làm pH thủy phân cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4 Kết qua khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH và phương pháp khứ sắt FRAP
H nh 3.5 Khao sát ảnh hướng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH a b lọ c d
Gia trị FRAP (uM Trolox) ơ
H nh 3.6 Khao sát ảnh hướng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp khứ sắt FRAP
Khi tăng nhiệt độ thủy phân từ 40 đến 55C, hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân tăng dan và dat giá trị cực đại 51% theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH và 168.47 „M Trolox theo phương pháp khử sắt FRAP tại 55 C Khi nhiệt độ tăng sẽ làm protein duỗi mạch, các gốc amino acid kị nước và cho proton sẽ lộ ra ngoài, tạo thuận lợi cho sự phân cắt của phân tử protein, và đóng góp vào hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân [59] Trong nghiên cứu của LiJun You và cộng sự (2010) sử dụng chế phẩm enzyme Papain để thủy phân gelatin cá cũng cho thấy hoạt tính kháng oxy hoá đạt cao nhất ở nhiệt độ thủy phan 52°C [64].
Khi nhiệt độ tiếp tục tăng từ 55 lên 60°C thì hoạt tính kháng oxy lại giảm xuống
(hình 3.5 và hình 3.6) Theo nghiên cứu của Janarthanan Gunasekaran và cộng sự
(2014) cũng cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân đầu tôm (Metapenaeus dobsoni) sử dung ché phẩm enzyme Alcalase giảm khi nâng nhiệt độ thủy phân đến 65°C [57] Từ đó có thé thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân.
Mỗi loại enzyme khác nhau sẽ có nhiệt độ tôi ưu khác nhau.
Vì vậy, 55°C được chọn làm nhiệt độ thủy phân cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5 Kết quả khảo sát anh hưởng của tỉ lệ E/S đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH và phương pháp khử sắt FRAP.
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH (%) =
H nh 3.7 Khao sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hoạt tính kháng oxy hóa của dich thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH
Gia trị FRAP (uM Trolox) Nn©
H nh 3.8 Khao sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hoạt tính kháng oxy hóa của dich thủy phân theo phương pháp khứ sắt FRAP
Khi tăng tỉ lệ E/S từ 30 đến 60 U/g protein, dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa tăng dan và dat giá trị cao nhất 58,07% theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH và 242 uM Trolox theo hoạt tính khử sắt FRAP tại 60 U/g protein Khi tăng tỉ lệ E/S, khả năng tiếp xúc giữa enzyme va cơ chất tang, tạo điều kiện cho phản ứng thủy phân xảy ra dễ dàng hơn và tăng khả năng tạo ra nhiều hợp chất kháng oxy hóa trong dịch thủy phân Khi tiếp tục tăng tỉ lệ E/S đến 70 U/g protein, hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân giảm xuống Nếu ta tiếp tục tăng tỉ lệ E/S, các peptide có khả năng kháng oxy hóa tiếp tục bị phân giải từ đó làm giảm khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân Theo nghiên cứu của Janarthanan Gunasekaran và cộng sự (2014) cho thay hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân đầu Tôm (Metapenaeus dobsoni) su dụng ché pham enzyme Alcalase đạt cực dai khi tang tỉ lệ E/S từ 0,65% đến 2,1% Khi tiếp tục tang tỉ lệ E/S thì hoạt tính kháng oxy hóa lại giảm [63].
Vi vậy, tỉ lệ E/S 60 U/g protein được chọn làm tỉ lệ E/S cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.6 Kết qua khảo sát ảnh hướng của thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH và phương pháp khử sat FRAP.
Hoạt tính nhốt gốc tự do DPPH (%)
H nh 3.9 Khao sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp nhốt gốc tự do DPPH
Gia tri FRAP (uM Trolox) NO=©CC thlam L ©œ |
H nh 3.10 Khao sát ảnh hướng của thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân theo phương pháp khử sat FRAP
KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 4.1 Kết luận
Nghiên cứu này đã đạt được các kết quả sau:
Xác định được thành phân hóa học của con ruốc khô (âm, protein, lipid, và tro).
Xác định được và tối ưu điều kiện thủy phân dé thu dịch thủy phân protein từ con ruốc khô cho hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất đạt 68,01 + 1,45% Cụ thé là: chế phẩm enzyme Flavourzyme, pH 7, nhiệt độ thủy phan 55°C, tỉ lệ E/S 59,39 U/g protein va thời gian thủy phân 3,05 giờ.
Xác định được phân đoạn peptide < 1 kDa có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất với giá tri lCso đạt 1107,7 + 16,6 pg/mL cao hơn giá tri [Cso của vitamin C 150 lần và gid tri FRAP đạt 150.9 + 2,8 „M thấp hon giá trị FRAP của vitamin C 454 lần.
Nghiên cứu này đã hoàn thành được mục tiêu đã đề ra.
Tinh sạch phan đoạn peptide cho hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất, xác định cau trúc và giải trình tự phần đoạn peptide này.
Khảo sát các hoạt tính sinh học khác của các phần đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein của ruốc khô.
Sản xuất bột peptide có hoạt tính kháng oxy hóa từ ruốc khô ứng dụng vào công nghiệp thực phẩm, dược phẩm.