Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát hoạt tính liên kết đồng (Cu2+) của dịch thủy phân protein từ con ruốc khô

TÓM TATTrong nghiên cứu này, khả năng liên kết đồng Cu của các phân đoạn peptide thu nhậntừ dịch thủy phân protein của con ruốc khô được khảo sát.. Hiện nay trên thế giới, đã có ratnhiều

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

MAI TRƯỜNG CUU

KHAO SÁT HOAT TÍNH LIÊN KET ĐÔNG (Cu) CUA

DICH THUY PHAN PROTEIN TU CON RUOC KHO

(Acetes japonicus)

Chuyên ngành : Cong Nghệ Sinh Hoc

Mã số: 60420201

LUẬN VÁN THẠC SĨ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HỌC BACH KHOA —DHQG -HCMCán bộ hướng dẫn khoa học : TS VO DINH LỆ TAM

Cán bộ cham nhận xét 1 : TS LƯƠNG THỊ MỸ NGAN

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HỌC

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CONG H A XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: MAI TRƯỜNG CỬU MSHV: 7140856

Ngày, thang, năm sinh: 07/02/1992 - 55 55s <2 Nơi sinh: An Giang

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học -««- Mã số : 60420201

I TÊN DE TÀI: Khao sát hoạt tính liên kết đồng (Cu*) của dịch thủy phân protein

từ con ruôc khô (Acetes japonicus)

H NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:Nội dung 1 : Khảo sát thành phân hóa học của con ruốc khô : độ âm, hàm lượng protein,

hàm lượng béo và tro của con ruôc khô.

Nội dung 2 : Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân đến khả năng liên kết đồng

của dịch thủy phân protein từ con ruôc khô : tỉ lệ nguyên liệu : dung môi, loại enzymethủy phan, pH, nhiệt độ, tỉ lệ enzyme : co chat và thời gian thủy phân.

Nội dung 3 : Tôi ưu hóa điều kiện thủy phân nhằm thu dịch thủy phân có khả năng liên

kêt đông cao nhât.

Nội dung 4: Tách phân đoạn peptide từ dịch thủy phân và xác định khả năng liên kết

đông của chúng.

Ill NGÀY GIAO NHIEM VU : 04/09/2017IV NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 15/06/2018V CAN BO HUONG DAN: TS Võ Dinh Lệ Tâm

Tp HCM, ngày thang năm 20

CÁN BỘ HƯỚNG DAN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS Võ Đình Lệ Tâm

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CÁM ƠNTrước hết, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, bộ môn CôngNghệ Sinh Học đã hết lòng truyền dạy cho em những kiến thức quý báu trong suốt thờigian học tập và thực hiện luận văn, để em có được những kiến thức nền tảng như ngày

hồm nay.

Em xin được bay tỏ lòng biết ơn sâu sac đến cô TS Võ Dinh Lệ Tâm đã tận tình hướngdẫn và giúp đỡ em hoàn thành luận văn một cách tốt nhất

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng hỗ trợ và giúp đỡ trong suốt thời

gian học tập và thực hiện luận văn thạc sĩ.

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý thay cô và bạn bè

TP Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2018

Học viên thực hiện

Mai Trường Cửu

IV

TÓM TAT

Trong nghiên cứu này, khả năng liên kết đồng (Cu) của các phân đoạn peptide thu nhậntừ dịch thủy phân protein của con ruốc khô được khảo sát Đầu tiên, thành phần hóa họccủa con ruốc khô đã được khảo sát Kết qua cho thay độ âm khoảng 12,3+0,12%, hàm

lượng protein khoảng 72,8+0,7%, hàm lượng lipid khoảng 4,340,2% và hàm lượng tro

khoảng 16,8+0,2% (theo hàm lượng chất khô) Tiếp theo khảo sát ảnh hưởng của các yếutố: tỉ lệ nguyên liệu: dung môi (Acefes:wafer), loại enzyme, pH, nhiệt độ, tỉ lệ E/S va thờigian đến khả năng liên kết đồng của dịch thủy phân Kết quả cho thấy, khả năng liên kếtđồng cao nhất đạt 2617/04 (/gCu”/g protein) khi sử dụng chế phẩm enzymeFlavourzyme, tại pH 6.0, nhiệt độ thủy phân 60C, tỉ lệ E/S là 40U/ ø protein, thời gianthủy phân là 4 giờ, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:8 Sau đó, điều kiện thủy phân được tốiưu hóa sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng thông qua ảnh hưởng của tỉ lệ E/S và thờigian thủy phân Kết quả tối ưu hóa cho thay, dịch thủy phân có khả năng liên kết với ionCuTM* cao nhất đạt 2707,81+8.7 (ugCu’*/g protein) tăng 3% so với dịch thủy phân trướckhi tối ưu hóa khi sử dụng enzyme Flavourzyme , pH 6.0, nhiệt độ thủy phân là 60°C , ti

lệ E/S là 40,3289, thời gian thủy phân là 4,1506 giờ, ti lệ nguyên liệu:dung môi là 1:8.

Sau đó, dịch thủy phân được tách phân đoạn sử dụng thiết bị ly tâm siêu lọc với kíchthước màng lọc 30kDa, 10kDa, 3kDa và IkDa Kết quả cho thấy phân đoạn peptide <IkDa có khả năng liên kết đồng cao nhất đạt 3767,69 +15,46 (ug Cu*/g protein), thấphơn 6.5 lần so với khả năng liên kết đồng của Na;EDTA Kết quả cho thay, con ruốc khôlà nguồn nguyên liệu có tiềm năng để thu nhận các peptide có khả năng liên kết đồng

(Cu”?)

In this study, the copper chelating activity (Cu) of peptide fractions isolated from

protein hydrolysate of dried Acetes sp was investigated Firstly, the chemical composition

of dried Acetes sp was analysed including 12,3+0.12% moisture, 72,8+0.7% protein,

4.3%+0,2 lipid and 16,8%+0,2 ash (on dry weight basis) Next, the effects of hydrolysis

condition including: Acetes:water ratio, enzyme type, pH value, temperature,

enzyme/substrate ratio and hydrolysis time on the copper chelating activity of protein

hydrolysates were examined The result showed that the proteolysate reached highest

copper chelating activity 2617,04 (wgCu~*/g protein) when hydrolyzing the Acetes using

Flavourzyme at pH 6.0, temperature at 60°C, enzyme/substrate ratio of 40 U/g protein,

hydrolysis time of 4 hours, Acetes:water ratio of 1:8 After that, the hydrolysis condition

was optimized using response surface methodology via the enzyme/substrate ratio and

hydrolysis time for maxizing the copper affinity The result revealed that the proteolysate

achieved highest copper chelating activity 2707,8104 (ugCu’*/g protein), 3% higher than

before optimization Optimization condition included hydrolysis enzyme of

Flavourzyme, pH 6.0, temperature at 60°C, enzyme/substrate ratio of 40.3289 U/g

protein, hydrolysis time of 4,1506 hours and Acetes:water ratio of 1:8 Then, the

proteolysate was further fractionated using centrifugal ultrafitration devices with

molecular weight of 30kDa, 10kDa, 3kDa and IkDa to collect peptide fraction and test

their copper chelating activity The result review that the < IkDa fraction showed the

highest copper chelating activity 3767,69 +15,46 (11g Cu’*/g protein) which was 6.5 fold

lower than that of Na,EDTA This finding indicated that dried Actetes sp Could be used

as a natural protein source to produce copper-binding activity peptides or peptide which

could be applied in functional food or phamarceuticals.

VỊ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Mai Trường Cửu học viên cao học ngành Công Nghệ Sinh Học, khóa 2014 đợt 2,

Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hỗ Chí Minh Tôi xin

DANH MUC CHU VIET TAT

6-hydroxy-2,5 ,7 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

Association of Official Analytical Chemists

Casein Phospho Peptide

High Performance Liquid Chromatography

Acid Trichloracetic

Low-density lipoprotein

Vill

DANH MỤC BANGBang 1.1: Phan loại khoa học của con Ruốc (Acefes "2 4Bảng 1.2: Tên sản phẩm, các ứng dụng của dịch thủy phân protein từ thủy hải sản 13Bang 2.1: Giá tri các bién thực và mã hóa của chúng - 2 5©ccs se 30Bảng 2.2: Giá trị các bién thực và mã hóa của chúng ¿ - + 5s+c+cs sec 31Bang 3.1: Thanh phan hóa học của con ruốc khô (Acetes JAPONICUS) cseseececscssesesseseesees 33Bang 3.2: Mức độ ảnh hưởng của các thông số của điều kiện thủy phân sử dung ma trận

Plackett-Burman 078 40

Bảng 3.3: Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman +5 5+ 25s+s+5s+szsze: 41Bang 3.4: Kết qua tối ưu hóa các yếu tố của quá trình thủy phân ảnh hưởng đến kha năngliên kết đồng của dịch thủy phân protein từ con ruốc khô (Acetes japonicus) 42

Bang 3.5: Ma trận thực nghiỆm - +2 S222 0n 0 re 42

Bảng 3.6: Kết quả lọc phân đoạn dịch thủy phân ở các điều kiện đã tối ưu hóa 45

DANH MỤC HÌNHHình 1.1: Sản lượng đánh bắt ruốc qua các năm (FAO Fishery Statistie) 5Hình 1.2: Sản lượng ruốc nuôi qua các năm (FAO Fishery Statistie) - 5Hình 2.1: Sơ đồ nghiên €ỨU - ¿+ ¿SE 2E9EEEE #EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrkrkrrrererred 23Hình 2.2: Quy trình sản xuất dịch thủy phân từ con ruốc khô - - 2s + 28Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: dung môi đến hiệu suất thu hồi protein 34Hình 3.2: Ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân đến khả năng liên kết đồng của dịchthủy phân protein từ con ruốc KhÔ ¿+ ¿©E+ ssesscscsesscscscsscscsessssesesesscseseeeeseeeees 35Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH thủy phân đến khả năng liên kết đồng của dịch thủy phânprotein từ con ruốc khÔ ¿+ 6+ S£+E£E9EEEEEE XEE9EEE121211212111112111 111111111111 36Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến khả năng liên kết đồng của dịch thủyphân protein từ con ruốc KhÔ ¿-¿- - 6+ SE 2E£E #EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE112121111 2311112 37Hình 3.5: Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S (U/g protein) thủy phân đến khả năng liên kết đồng củadịch thủy phân protein từ con ruốc KhôÔ -¿ - sesesesesscscsscsesessesesesscscsesesseseseesesess 38Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng liên kết đồng của dịch thủyphân protein từ con ruốc KhÔ ¿-¿- - 6+ SE 2E£E #EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE112121111 2311112 39Hình 3.7: Đồ thị bề mặt đáp ứng cho khả năng liên kết đồng của dịch thủy phân từ con"085 000008 43Hình 3.8: Các phân đoạn peptide ở điều kiện thủy phân đã tối ưu hóa - 44

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TAI LIEU 5-5 2 + E9EE£E£E£E£ESEEESESEEEEEEvkEeEeeeeererred 31.1 Giới thiệu VE con ruỐc - + E21 T1 TH HH1 gà Hà hàn già 31.1.1 Dac điểm phân bố ¿:- - + S213 E9 SE 1115115151111 11115 111111 e 31.1.2 Tình hình khai thác, chế biên và tiêu thụ ruỐc -c©cccerxcerreee 4

1.2 Dịch thủy phân pTOf€IT - - 5G 0 re 6

[.2.1 _ Giới thiệu dich thủy phân prOf€ITI (<5 S01 ng nen 6

1.2.2 _ Tính chất của dịch thủy phân protein - + 555552 s+x+cezsceererseree 6

1.2.3 Hoạt tính sinh học cua dịch thủy phân protein -« «5 «<< <s+<<<s+ 8

1.24 Cac phương pháp thủy phan pDTOf€IT\ eesneccececeeeeseneeeeeeeeeeeneees 12

1.2.5 Ung dụng của dich thủy phân thủy sản 5- 5552 552c+cccscesrsce2 13

1.3 Enzyme€ protease - Gv vớ 15

1.3.1 GiGi thiệu enzyme Protease G0 re 15

1.3.2 Phan loại enzyme DTOf€AS€ - - - G G0 re 15

1.3.3 Cơ chế xúc tác sec HT ngư 15

1.4 Tach phân đoạn peptide - <5 00.00 ke 16

LAD — GIỚI thiỆU KT nọ 16

1.4.2 Một số phương pháp thu nhận peptide -5-5 55s 2 2+s+£zescee: 16

1.5 Tinh hình nghiên cứu peptide có hoạt tính sinh học trong và ngoài nước 18

15.1 Tinh hình nghiên cứu trong NƯỚC - Ăn 1 nen 18

15.2 Tinh hình nghiên cứu ở nước ngOài ng 19

CHUONG 2: NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.[ Nguyên lIỆU - - - < S00 nọ nọ 22

JNN oi na 222.1.2 Chế phẩm enzyme - ¿2 5£ SE+ES2SE‡E9EEEE£EEEEEEEE9EE 2121112112121 1 1.1 xe 222.1.3 Hóa chất khác -++cxe th HE HH1 T1 rrrkekiio 23

2.2.1 Sơ đồ nghiên CỨU ¿+ 25692 E2E9E E393 121911212111 21111 711111111 232.2.2 Thuyết minh sơ d6 nghiên cứu - - ¿2+ 2 22+ ££+E+E£E£E+E£EzEererersrreee 24

2.3 Các phương pháp nghiÊn CỨU - - ( << 1193931010101 19 0001 ng 27

2.3.1 Quy trình thu nhận dịch thủy phân protein từ con ruốc khô sử dụng chế phẩm

CNZYME SP ŸÝỐỖỐỖÕ 27

2.3.2 Phương pháp xử lý nguyên lIỆU - - - - 5G 1 119993011 199930 11 99v ven 29

2.3.3 Phương pháp xác định thành phan hóa hoc của nguyên liệu 29

2.3.4 Phương pháp thủy phân - - << 9900 re 29

2.3.5 Phương pháp xác định mức độ thủy phân (IDH) 555552 30

2.3.6 Lọc khử khoáng - «cọ 0 nọ vớ 30

2.3.7 Phương pháp xác định khả năng liên kết đồng ¿ - 5-52 2 25s+sc5+2 302.3.8 Phương pháp sàng lọc các yếu t6 ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 302.3.9 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện thủy phân 2-2 25s cs£s+szs+2 312.3.10 Phuong pháp tách phân đoạn peptide của dịch thủy phân bang phương pháp

ly tâm SIỀU ÍỌC G0 TH Họ nọ Họ ch 31

2.3.11 Phân tích thống kê woccccecccccccscscsesescscssescscscscssssesescsssssscsescsssssssssscsssssesseseess 32CHUONG 3 KET QUA VA BAN LUẬN - 6 St 131121 E9 12121 1E Exrxrered 333.1 Khảo sát thành phan hóa học cơ bản của ruốc khÔ -c-cs+cccccceerreerreed 33Kết quả khảo sát thành phần hóa học cơ bản của con ruốc khô được trình bày ở bảng

của dịch thủy phân - - << 11+ TH 35

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH thủy phân đến khả năng liên kết đồng của dịch

THUY Phan oe eee 36

XI

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến khả năng liên kết đồng của

3.3 Kết quả sàng lọc các thông số ảnh hưởng của quá trình thủy phân đến khả năng

liên kêt đông của dịch thủy phân - - - G0 ng ke 40

3.4 Kết quả tôi ưu hóa các yếu tố của quá trình thủy phân ảnh hưởng đến khả năng liên

kết đông cua dịch thủy phân protein con Ruôc khô (Acetes JapOnICHS) 42

3.5 Kết quả khảo sát khả năng liên kết đồng của các phân đoạn peptide 44CHUONG 4 KET LUẬN VA KIÊN NGHI u eececcccccccccsccsecececescesecscscececcevevscscecsevevacscneseves 466< ec cccccecccccsscscecessssevscsceccsevevscscecseevacaceceevsvavacacecessevavacacecessacaseesavavacaeeseess 464.2 Kiến NQhi 5-5 S11 1 11 111112111111 11 0111110111010 1101 1101010101111 01701011111 y0 46TÀI LIEU THAM KHHẢO 6s E618 3 569191 98 1 9 131151 1 9E 111012111 11111211 gvọ 47

PHU LUC 9 24 54

PHU LUC A: Các phương pháp phân tích - - << 5c 1132220011 1 1 ng 54

PHU LUC B: Các bảng kết quả thí nghiệm và phân tích . 5- + 2 5555255252 68

DAT VAN DE

Con Ruốc là một loài tép nhỏ hay tôm nhỏ, thuộc chi động vật Acetes, ho Sergestidae.Ruốc chủ yếu phân bố ở vùng biến nhiệt đới va cận nhiệt đới, sản lượng khai thác vàokhoảng 160 triệu tấn/năm, san lượng khai thác ở Việt Nam khoảng 40 nghìn tan/ năm.Sản lượng ruốc không ôn định phụ thuộc vào mùa vụ trong năm Ruốc có hàm lượngprotein khá cao, chiếm từ 16,5% đến 17% khối lượng tươi Trong thành phan protein củaruốc có chứa các loại acid amin thiết yếu rất cần thiết cho con người va ham lượng acidamin này chiếm khoảng 28,8% tổng số acid amin, do đó ruốc có thể được xem là mộttrong những nguén cung cấp protein tự nhiên thiết yếu cho con người [1]

Ruốc chủ yếu được sử dụng để làm thực phẩm dưới nhiều dạng khác nhau tại Châu Á vàĐông Châu Phi Tại Việt Nam ruốc tươi được chế biến thành các món ăn như luộc, nấucanh rau, phơi khô, làm nước mam, làm mắm ruốc, một phan được phơi khô đóng góixuất khẩu dưới tên “ Ruốc khô” Do quá trình chế biến còn thô sơ nên các sản phẩm chếbiến từ ruốc còn rat hạn chế trên thị trường vi thế, cần nghiên cứu dé tận dụng tối đa giá

tri của ruôc đê tạo nên các sản phâm có gia tri gia tăng.

Đồng là một nguyên tổ vi lượng thiết yếu, tham gia vào hoạt động xúc tác của nhiều loạienzyme Đồng còn tham gia vào các hoạt động cầu trúc của cơ thé như tạo sắc t6 da, hỗtrợ hoạt động của hệ tuần hoàn và hệ thần kinh, gitt vai trò như chất chống oxy hóa tươngtự như nguyên tố sắt [1,2] Tuy nhiên, đồng chủ yếu được bố sung vào cơ thé thông quađường ăn uống và được hấp thu chủ yếu ở ruột non Việc thiếu đồng sẽ gây ảnh hưởngđến hoạt động của hệ tuần hoàn và hệ thần kinh [55] Hiện nay trên thế giới, đã có ratnhiều nghiên cứu về peptide có hoạt tính sinh học có nguôn gốc từ dich thủy phân proteinđộng thực vật đã được báo cáo như peptide giúp điều hòa huyết áp, điều hòa hệ miễndịch, peptide chống oxy hóa và đặc biệt là các peptide có khả năng liên kết với ion kimloại Một số nghiên cứu cho thấy rằng, các amino acid như histidine, methionine vacysteine có khả năng liên kết với đồng vi thế giúp cho quá trình hap thụ đồng hiệu quả

hơn [56] Tuy nhiên, đồng lại là chất xúc tác mạnh mẽ cho quá trình oxy hóa các proteincó tỷ trọng thấp (LDL), quá trình oxy hóa các protein này có thé là nguyên nhân gây xơvữa động mạch [56] Trong khi đó, các peptide có hoạt tính liên kết đồng có khả ngănchặn quá trình oxy hóa các protein này băng việc liên kết ion kim loại đồng Các peptidecó hoạt tính liên kết đồng đã được tìm thấy trong dịch thủy phân protein của hóa hướngdương và trong hạt đậu gà đã được báo cáo [56] Hiện nay các nghiên cứu về peptide cóhoạt tính liên kết đồng vẫn còn hạn chế.

Từ những tiền đề trên nghiên cứu “Khảo sát hoạt tính liên kết Đồng (Cu*) của dịch thủyphân protein từ con Ruốc khô (Acefes japonicus)” được thực hiện nhằm tìm ra nguồnnguyên liệu mới để thu nhận protein cũng như các peptide có khả năng liên kết đồng để

làm gia tăng giá tri sử dụng của con ruôc và làm đa dạng hóa các sản phâm từ con ruôc.

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIEU1.1 Giới thiệu về con ruốc

1.1.1 Đặc điểm phân bồ

Ruốc là động vật giáp xác mười chân sống ở vùng nước mặn hay nước lg Ruốc bao gồm53 họ, 2700 chi, gan 15000 loài Do kích thước của ruốc khá nhỏ chỉ vào khoảng 10 — 40mm tuỳ thuộc vào ruốc đực hay ruốc cái nên chúng chỉ thường được dùng để làm mắm(mam ruốc, mắm tôm hoặc mắm chua) hoặc phơi khô rồi xay vụn thành bột ruốc Ruốcchủ yếu phân bố ở các vùng biến thuộc bờ Tây An Độ sang Thái Lan, Indonesia, biển

Dong, Đài Loan, Nhat Ban [3].

Ruốc được đánh bat ở ving biển Đông Nam A chủ yếu thuộc hai loại: Acetes indicus vaAcetes japonicus Ching thuộc họ mọi biển (Sergestidae) trong bộ giáp xác mười chân(Decapoda) Loài Acetes indicus chủ yếu được tim thay ở phía tây bờ biển của An Độ đến

Thái Lan và Indonesia, còn phía tây bở biên của An Độ sang Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung

Quốc va Indonesia chủ yếu là loài Acetes japinicus Cau tạo của loài ruốc cơ bản giốngcác loại giáp xác mười chân: đầu không kéo dài, kích thước nhỏ, vỏ mềm, chân thứ 4 vàthứ 5 bị tiêu bién thành bộ phận sinh dục, có 3 chân hàm Kích thước của loại Acetesindicius vào khoảng 15 — 25 mm đối với con đực và con cái là 23 — 40 mm Trong khi đókích thước của loại Acetes japinicus lần lượt là 11 — 24 mm và 15 — 30 mm đối với conđực va con cái Loài Ruốc sống chủ yếu ở vùng nước ven biển hoặc nước lo, sống ở vùngtang nổi hoặc tang giữa [4.5.6]

Bang 1.1 Phân loại tên khoa học của ruốc (Acetes sp.) [37]

Phân loại khoa học

Giới (regnum) Động vật (Animalia)Ngành (phylum) Động vật chân khớp (Arthropoda)Phân ngành (subphylum) Động vật giáp xac (Crustacea)Lớp (class) Giáp mêm (Malacostraca)Bộ (ordo) Giáp xác mười chan (Decapoda)Phân bộ (subordo) Dendrobranchiata

Ho (familia) Moi bién (Sergestidae)Chi (genus) Ruốc (Acetes)

1.1.2 Tình hình khai thác, chế biên và tiêu thụ ruốc

Hang năm, mùa Ruốc thường bat đầu từ tháng 3 đến tháng 9 âm lich, tập trung nhiều nhấtvào tháng 5, tháng 6 Ruốc có thể xuất hiện sớm hoặc muộn hơn do ảnh hưởng thời tiết,môi trường sống và đặc trưng của mỗi địa phương Ruốc thường được đánh bắt thô sơbăng trủ (lưới) — đây là một loại lưới cước miệng rộng được gắn với thanh tre hay gỗ vàđược bang tay ngược theo con nước Ở Việt Nam, tại các tỉnh ven biển miền Trung nhưQuảng Bình, một hộ gia đình mỗi ngày có thé khai thác trung bình khoảng 500-800kg

Ruốc tươi và thu về khoảng 3-5 triệu đồng Tại các tinh ven biển phía nam như Bạc Liêu,

trung bình mỗi ngày, ngư dân có thé khai thác được 3-4 tan Ruốc tươi và ngư dân thu lãitừ 5-6 triệu đồng [38]

Theo tổ chức Nông Lương thé giới (FAO) thì sản lượng Ruốc biển khai thác trong nhữngnăm gan đây có sự giảm nhẹ so với những năm trước đó Cụ thé giai đoạn 1950-1970 sanlượng ruốc khai thác trên thé giới dao động khoảng 100 nghìn tan/ năm, từ 1970-2000 sản

năm Tuy nhiên, từ 2008 đến 2014 sản lượng khai thác ruốc có sự giảm nhẹ Hàn Quốc lànước có sản lượng khai thác lớn nhất khoảng 19398 tan [36].

Global Capture Production for species (tonnes)Source: FAO FishStat

[ral Acetles japonicus

Hình 1.1 Sản lượng đánh bat Ruốc qua các năm (FAO Fishery Statistic) [36]Sản lượng Ruốc nuôi từ các vùng nuôi có biến động rất lớn, khoảng cuối nhữngnăm 80 đến cuỗi những năm 90 sản lượng nuôi trồng tăng rõ rệt (1992: 3735 tan).Tuy nhiên từ 1994 đến nay sản lượng nuôi trồng giảm đi rõ rệt cụ thể đến năm2008 tong sản lượng nuôi Ruốc biến chỉ còn khoảng 100 nghìn tan [36]

Global Aquaculture Production for species (tonnes)

Tại Việt Nam và một sô nước khác trong khu vực, Ruôc được sử dụng như là nguon thực

phâm cung câp đạm, có thê được chê biên thành các món ăn khác nhau như: luộc, nầu

canh rau, làm nước mam, làm mam ruôc, Thị trường ruôc xuât khâu của nước ta chủ yêu

ở 3 nước là Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản [36].Tại Nhật Ban: Akiami paste là sản phẩm làm từ acetes, được FAO phi nhận là chứa 16.2% chất đạm và 1.3 % chất béo Tại Ấn Độ: Ruốc tươi (acetes) được chế biến với ớt bột,nghệ và me ăn kèm với bánh mì hay cơm Món “bhajeeya” là ruốc tươi giã nhuyễn trộnvới hành và bột rỗi chiên thành bánh Ruốc có thé phơi khô thành 'sookat' dé nau ca ri.Tại Thái Lan: Mam Gafi được chế biến từ ruốc Acetes Ty lệ muối sử dụng là 3-5:1 Thờigian lên men để tạo mắm kéo dài đến 2 tháng Kapi chứa độ âm 36-49%, độ muối 19-24%, khoảng trên 24 % chat đạm

1.2 Dịch thủy phân protein

1.2.1 Giới thiệu dịch thủy phân protein

Dịch thủy phân protein là sản phẩm của quá trình thủy phân protein bởi enzyme, chuyếnprotein thành các peptide nhỏ hơn, mỗi peptide chứa từ 2-20 amino acids Một số dichthủy phân protein là hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng trung bình, peptone,hỗn hợp các peptide ngăn, hỗn hợp các amino acid và các peptide phân tử lượng thấphoặc hỗn hợp các amino acid tự do [9] Dịch thủy phân protein dần được sử dụng như

nguôn protein săn có với các đặc tính tôt cho người và động vật [7].

1.2.2 Tính chất của dịch thủy phân protein

1.2.2.1 Tính tan và sự bền nhiệtTính tan và sự bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng của dịch thủy phân Độtan của dịch thủy phan nằm trong khoảng rộng của pH, nhiệt độ, nồng độ chất khô nông

các nhóm amino va carboxyl với sự gia tăng tương ứng về tính ưa nước Tính chat naycủa dịch thủy phân đặc biệt quan trọng trong sản xuất thực phẩm, nước ép trái cây, thức

uông cho trẻ em vì cho phép kiêm soát độ thâm thâu của sản phâm.

Dịch thủy phân protein thì bên nhiệt hơn so với protein nguyên liệu ban đầu Tính chatnày quan trọng trong sản xuất sản phẩm dịch thủy phân có sử dụng quá trình tiệt trùng.Tính tan và sự bên nhiệt của dịch thủy phân có thé được gia tăng bằng cách tạo thànhphức chất với polysaccharide như galacturonic acid [7 8]

1.2.2.2 Tính nhũ hóa

Tính chất nay đặc biệt quan trọng trong sản xuất thực phẩm kế cả trẻ em và người lớn.Nhiều nghiên cứu đã cho thấy sự phụ thuộc của khả năng nhũ hóa và mức độ thủy phâncủa dịch thủy phân Các nghiên cứu đã tìm ra tính chất nhũ hóa của dịch thủy phân đượccải thiện khi kiểm soát mức độ thủy phân Chang hạn, khả năng nhũ hóa gia tăng đáng kể

ở mức độ thủy phân 5-7% Dịch thủy phân có các peptide chứa từ 20 amino acid hoặc

nhiều hơn cho thấy mức độ nhũ hóa mạnh hơn Nhiều bằng chứng cho thấy răng tính kynước là một yếu tố quyết định quan trọng đến khả năng nhũ hóa của dịch thủy phân Tính

đặc hiệu của enzyme thủy phân có ảnh hưởng tới khả năng nhũ hóa của dịch thủy phân

[8].

1.2.2.3 Su thấm thấuSự thấm thấu là một tính chất hoá lý đặc trưng cho chất lượng các sản phẩm thựcphẩm dành cho trẻ em và chế độ ăn uống cho người lớn Thâm thấu là sự dịch chuyển tựphát của các phân tử dung môi đến một khu vực có nông độ cao hơn của chất tan, theokhuynh hướng cân bằng nông độ chất tan ở hai bên Sản phẩm có độ thâm thấu cao sẽlàm gia tăng lượng chat lỏng trong ruột non, gây rối loạn đường ruột và mat nước củaruột, rồi loạn cân băng điện giải, gây buôn nôn, ói mira va các tác dụng phụ khác Dé điềuchỉnh độ thấm thấu của sản phẩm có chứa dịch thuỷ phân từ protein có thé sử dụng các

chất khác nhau chang han như tinh bột được bổ sung vào để làm giảm độ thầm thấu vàđảm bảo sự 6n định của sản phẩm khi chế bién [8].

1.2.2.4 Vị đắngDịch thủy phân được biết là có mùi đặc biệt và có thể được sử dụng để tạo hương Tuynhiên, các sản phẩm được thủy phân từ casein, lactalbumin và các protein khác có vi dangvà không thé bố sung trực tiếp va sản phẩm thực phẩm Các nghiên cứu gan đây cho thấy,vị đăng có thể được tạo ra do peptide, ở mức độ thủy phân cao có thể làm giảm vị đăng[9] Các peptide có trọng lượng phân tử thấp tạo nên vị đăng của dịch thủy phân Nhữngpeptide này được biết có chứa các axít amin ky nước như leucine, proline, phenylalanine,và tyrosine Các axit amin ky nước có vị đắng nhiều khi chúng ở bên trong chuỗi peptitchứ không phải là N- hoặc C-cuối cùng của peptide [10]

1.2.3 Hoạt tính sinh học của dịch thủy phần protein1.2.3.1 Hoat tính kháng oxy hóa

Chất chống oxy hóa là những hợp chất hoặc hệ thống làm chậm hoặc ức chế quá trình oxyhóa bang cách ức chế sự hình thành các gốc tự do hoặc làm gián đoạn sự lan truyền củacác gốc tự do bằng nhiều cơ chế hoặc thu nhặt các hợp chất chứa oxy hoặc liên kết với ionkim loại [11][12] Các peptide kháng oxy hóa từ thực phẩm được xem là an toan đối vớisức khỏe với phân tử lượng thấp, chi phí thấp, hoạt tính cao, dé hấp thu [7] Tuy nhiên, cochế chính xác của sự kháng oxy hóa của các peptide vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng ngườita quan sát thay rang các amino acid thơm va histidine đóng vai trò quan trọng trong hoạtđộng này Hoạt tính này giúp bảo vệ cơ thể chống lại nhiều loại bệnh tật và trong bảoquản thực phẩm chúng giúp làm chậm quá trình oxy hóa [13] Hơn nữa, các peptide còncó khả năng kích ứng các đoạn gene đặc biệt mã hóa cho các thành phần kháng oxy hóaphi enzyme trong tế bảo và hệ thống enzyme trong mô hình nuôi cay tế bào [14]

1.2.3.2 Hoạt tính kháng khuẩnVới sự xuất hiện của các tác nhân gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh ngày cảng tăngtrong bảo quản thực phẩm Việc phát hiện ra các peptide kháng khuẩn an toàn và hiệu quảvới một cơ chế hoạt động khác với kháng sinh truyền thống là vẫn đề đang được quan tâmhiện nay [15] Các peptide kháng khuẩn phát hiện lần đầu tiên từ loài bướm đêm bởiSteiner et al 1981 và ngày càng nhiều các peptide kháng khuẩn được cô lập và tinh chế từnhiều loài côn trùng, thực vật và động vật được báo cáo [15| Hoạt tính các peptide khángvi sinh vật thé hiện băng sự phân huỷ màng tế bao, theo đó, lớp lipid kép của màng tế bảolà mục tiêu chính Sự tương tác giữa peptide kháng vi sinh vật và màng tế bào là một yêucầu quan trọng của hoạt tính kháng vi sinh vật Đa số các peptide kháng vi sinh vật chứacau trúc vòng xoăn a là ationic và amphiphathic[16] CgPep33 là một loại peptide khángkhuẩn mới có nguồn gốc từ dịch thủy phân Hau với enzyme alcalase và bromelin (Liu etal 2008) hay lactofeerrin và lysozyme trứng gà có thé sử dụng để sản xuất peptide mớivới tính chất kháng khuẩn mạnh hơn các protein nguyên ven (Meisel 1997; Mine et al.2004) [15] Do đó, thủy phân protein dé tao ra các peptide kháng khuẩn có thé có tiềm

năng sản xuât các kháng sinh mới ở quy mô lớn.

1.2.3.3 Khả năng liên kết với ion kim loại

1.2.3.3.1 Kha năng liên kết canxi (Ca””)Canxi có vai trò quan trọng như làm cho xương cứng, hoạt động như một chất truyền tinthứ cấp trong việc điều hoà các hoạt động của nội bào, Nhờ vào sự chênh lệch nông độqua màng lớn [17] Dưới nhiều điều kiện, lượng Canxi trong khẩu phân ăn không còn khảnăng hap thu do sự hình thành các hop chất không hòa tan và nếu lượng canxi trong khâuphân ăn không đủ sẽ dẫn đến một số bệnh lý thông thường và mãn tính như: loãng xương,viêm xương khớp, tim mach (cao huyết áp, đột quy) và có thé dẫn đến ung thư Sữa vacác sản phẩm từ sữa là nguồn cung cấp canxi phô biến Casein phosphopeptide (CPP) từquá trình tiêu hóa trong ruột non của casein có khả năng bắt canxi, làm gia tăng lượng

canxi hòa tan hap thu vào cơ thê Tuy nhiên, nhiêu người không thê sử dụng canxi từ sữa

hay các sản phẩm từ sữa do không thé hap thu lactose hoặc bị dị ứng Vi thé, việc nghiêncứu các nguồn cung cấp canxi khác nhau đã được thực hiện nham để khắc phục tinh trangtrên, các nguồn đó có thể là: protein từ bột cá, từ đậu nành, fructo- oligosaccharides Hiện

nay, các peptide từ dịch thủy phân các loai protein khác nhau đã được nghiên cứu va cho

thay rằng các peptide này có khả năng gan kết với canxi làm tăng cường kha năng sinhhọc của canxi Mặt khác, các peptide này còn có khả năng gan với thụ thé trên bẻ mặt tếbao osteoclasts và làm giảm số lượng tế bao osteoclasts, các tế bào này có liên quan trongquá trình chuyên hóa canxi trong cơ thé, vi thé các peptide này có thé được sử dung trongviệc điều trị bệnh loãng xương hay bệnh đau xương khop (Paget) [18]

1.2.3.3.2 Kha năng liên kết đồng (Cu*)Cũng như các kim loại khác, đồng cũng có vai trò quan trọng trong cau trúc của cơ thénhư: tạo sac tố da, tóc, giữ cho xương và răng chắc khỏe, hỗ trợ hoạt động của tim, bảo vệtế bào tránh các tác nhân hóa hoc, chống oxy hóa Đồng giúp quá trình xử lý sắt tham giavào quá trình tạo hồng cầu trong cơ thể Đồng còn giúp bảo vệ lớp myellin bao quanh cácdây thần kinh và hỗ trợ hoạt động của hệ thần kinh Thiếu hụt đồng dẫn đến bệnh thiếumáu và các triệu trứng khác Thiếu đồng lâu dài sẽ gây tôn hại đến phối, xuất huyết vàlàm tốn thương các mô liên kết [2] Bên cạnh đó, đồng còn có thé tạo ra các phân tử oxy

phan ứng khác nhau làm phá vỡ các sợ DNA và các base trong các nucleotide [57].

Hiện nay vẫn chưa có những nghiên cứu về hoạt tính liên đồng của dịch thủy phân proteintừ con ruốc Cac peptide có khả năng liên kết đồng được báo cáo có nguén gốc từ dịch

thủy phân protein hoa hướng dương và đậu gà Các peptide này thường có trọng lượng

phân tử thấp và có Histidine trong thành phan cau trúc của chuỗi amino acid [57] Nhữngpeptide này có khả năng liên kết với đồng giúp giữ lại đồng cho cơ thé hoặc ức chế hoạtđộng xúc tác quá mức của đồng làm giảm sự tác động của các quá trình oxy hóa đối vớicơ thé [56, 57]

1.2.3.3.3 Khả năng liên kết kẽm (Zn”*)

Trong cơ thể người, kẽm chỉ được sử dụng một lượng rất nhỏ nhưng đóng vai trò rất quantrọng Kẽm tham gia vào quá trình tái tạo tế bào, đặc biệt trong quá trình mang thai Thamgia vào quá trình tong hợp DNA va RNA trong cơ thé, duy trì hoạt động của hệ miễndịch Tham gia vào quá trình phân giải carbonhydrate, chất béo, protein

Có nhiều nguyên nhân gây nên sự thiếu hụt kẽm trong cở thể Một trong những nguyênnhân có thé là do chế độ ăn uống không phù hợp nên lượng kẽm không đủ dé cung cấpcho cơ thé Hai là do giảm khả năng hap thu kẽm trong đường ruột hoặc do nhu cầu hapthu kẽm ở người bệnh đang trong quá trình hồi phục [39] Sự hiện diện của các chất ứcchế hấp thụ kẽm như phatates và chất xơ trong quá trình tiêu hóa thức ăn sẽ làm giảm khanăng hấp thu kẽm của cơ thể Kẽm chủ yếu được hấp thu ở tá tràng do đó việc nghiên cứukẽm liên kết với phức hợp như protein hoặc polysaccharide đang được tiễn hành giúp làmtăng khả năng hấp thu kẽm [40]

1.2.3.4 Hoạt tính ức chế men chuyền đối Angiotensin IHuyết áp cao được xem là một yếu tô nguy co gây nên bệnh tim mạch (xơ cứng động

mạch, đột quy và nhồi máu cơ tim) và bệnh thận giai đoạn cuối Enzyme chuyển đôi

Angiotensin I (ACE, dipeptidyl carboxpeptidase, EC: 3.4.15.1), có ở nhiều mô và trongcác dịch sinh học, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa huyết áp và cân bằng điện giảibăng cách chuyển Angiotensin I và bradykinin ở dạng không hoạt động thànhAngiotensin II hoạt động như chất làm giãn mạch và hạ huyết áp [19] Nhiều nghiên cứucũng cho thấy răng, dịch thủy phân protein từ tôm có chứa các peptide có khả năng ức chếmen chuyên đổi Angiotensin I (ACE) Trong nghiên cứu của Zhang Yu-Zhong va cộng sự(2006), phân tích các peptide có khả năng ức chế ACE trong dịch thủy phân protein từtôm băng enzyme protease cho thấy rang dịch thủy phân có khả năng chống oxy hóa vaức ché men chuyên đôi Angiotensin I có giá trị cao IC50= 0,97mg/ml [20]

II

1.2.4 Các phương pháp thủy phan protein

Bản chất của quá trình thủy phân protein là quá trình phá vỡ các liên kết peptide khi cómặt của nước Do liên kết peptide là liên kết bền nên quá trình thủy phân cần có mặt chấtxúc tác Phương pháp thủy phân băng tác nhân hóa học (acid hoặc base) và tác nhân sinhhọc (enzyme) là 2 phương pháp sử dụng phô biến trong công nghiệp

1.2.4.1 Thủy phân protein bằng tác nhân hóa học (acid hoặc base)Thủy phân bang acid: một số peptide như Tryptophan, Serine và Threonine sẽ bị pháhủy, một số peptide như Asparagine, Glutamine chuyển thành dạng acid và hầu hết cácvitamine sẽ bị phá hủy Nguyên nhân chính là do thủy phân bằng acid xảy ra ở điều kiệnnông độ acid cao (6N-10N), nhiệt độ 100-180°C [22]

Thủy phân bang kiềm: thì hiện tượng racemin hóa xảy ra là giảm giá trị dinh dưỡng,giảm lượng Lysine nhưng vẫn bảo toàn lượng Tryptophan Do đó, phương pháp thủyphân băng kiềm hạn chế sử dụng trong công nghiệp [23]

1.2.4.2 Thủy phân protein bằng phương pháp sinh hoc (Enzyme hoặc vi sinh vật)

Phương pháp vi sinh vật: protein được thủy phan nhờ enzyme ngoại bào do vi sinh vật

tiết ra trong quá trình nuôi cay Các enzyme này có thé được tạo ra trong môi trường nuôicấy riêng biệt, sau đó được đưa vào nguyên liệu giàu đạm như trong sản xuất nước tươnghoặc tận dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệu ban đầu như sản xuất nước mắm.Thành phân thu được trong dung dịch bao gồm cả protein, pepton, peptide và acid amine

[24].

Phương pháp xúc tác bởi enzyme: phương pháp nay sử dung các chế phẩm enzymethương mại, có thể kết hợp nhiều loại enzyme lại với nhau để nâng cao hiệu suất quá trình

thủy phân Các acid amine thu được trong phương pháp này có giá trị dinh dưỡng cao, an

toàn khi sử dụng Đặc biệt, phương pháp sử dụng enzyme thủy phân protein cho hiệu suấtthu hồi sản phẩm cao vì nhờ tính đặc hiệu của enzyme thủy phân Chang hạn, Papain cắt

liên kết peptide trong chuỗi gần Arginine, Lysine va Phenylalanine hay Pepsine cat chuỗicó liên kết với Phenylalanine hoặc leucine tham gia liên kết trong chuỗi [23].

1.2.5 Ứng dụng của dịch thủy phân thủy sản

Dịch thủy phân protein từ thủy hải sản có thể cung cấp các dưỡng chất cần thiết, đặc biệtchúng còn có các hoạt tính sinh học các hợp chất giúp cải thiện sức khỏe, giúp cơ thểchống lại một số tác nhân gây bệnh Hiện nay, dịch thủy phân thủy sản ứng dụng nhiềutrong các lĩnh vực như thực phẩm, y tế, dược phẩm, mỹ phẩm

Bảng 1.2 Tên sản phẩm, các ứng dụng của dịch thủy phân protein từ thủy hải sản [7]Tên sản phẩm Nguồn gốc Ứng dụng Xuất xứ

Seacure” Được điều chế từ| Bồ sung vào thực | US và Canada

protein cá Trang Đại | phâm chứ năngdương vùng nước | giúp hỗ trợ các têsâu bào trong đường

tiêu hóa và điêuti chức năngđường ruột

Amizate” Được sản xuât từ |Thục phâm dinh | Bac Mỹ

protein cá hồi Dai | dưỡng trong thé thaodương bang quá | (hỗ trợ phục hỏi traotrình tự phần đối chất)

Stabilium” 200 Được điều chế từ | Hỗ trợ cơ thé giảm | UK

Molva dypterygia | căng thang, cải thiệnbăng quá trình tự | trí nhớ và chức năngphân thần kinh

Protizen” Được sản xuat từ | Được sử dụng bô | UK

quá trình thủy phân | sung vào thực phẩmcá Trắng để giảm stress và

một số van đề về hệ

13

thân kinh (mất ngủ,mất tập trung, căngthang, mệt mỏi)

_®

VasotensinPeptace”

enzyme ACE

US va Nhat Ban

Nutripeptin” Được sản xuất băng

thuỷ phân bởi

enzyme của protein

ca Tuyét

Giúp 6n định đườnghuyết và kiếm soát

cân nặng.

UK va USA

LIQUAMEN® Được điêu chế từ

quá trình tự phân cáMolva molva

Bồ sung vào thựcphẩm giúp giảm sự

oxy hóa do căng

Đại Tây Dương

băng thủy phân bằng

enzyme

Thực phâm bồ sunggiúp cân bằngcholesterol, kiểmsoát căng thăng và

cải thiện sức khỏe

tim mạch

UK

SEAGEST®Được điêu chê từ ca

Trăng biên sâu

1.3 Enzyme protease

1.3.1 Giới thiệu enzyme protease

Protease là tên dùng chung cho một nhóm các enzyme thủy phân, chúng có khả năng cắtđứt các liên kết peptide của protein Các enzyme protease được tìm thấy ở động vật, thựcvật, nam, vi sinh vat Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật là nguồn enzyme quan trọng

được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi và thương mại hóa.

1.3.2 Phan loại enzyme protease

Phân loại theo kiêu xúc tac enzyme protease được chia thành 5 nhóm:- Serine protease - trung tâm hoạt động là serine

- Threonine protease — trung tâm hoạt động là threonine

- Cysteine protease — trung tâm hoạt động là cysteine

- Aspatic protease — trung tâm hoạt động là cacboxylic acid

- Metalloprotease — trung tâm hoạt động là kim loại

Dựa theo vi trí phản ứng, Protease được chia thành endopeptidase và exopeptidase Theo

hệ thống danh pháp EC của enzyme thì enzyme thủy phân peptide thuộc phân lớp 3.4

Trong đó, nó được phân thành 3.4.11-19 là exopeptidase và 3.4.21-25 là endopeptidase.

Phân loại theo tinh chất và nguồn gốc:

Protease còn được phân loại dựa trên pH hoạt động như acid protease pH từ 2-4, protease

trung tính pH từ 7-8 hoặc protease kiềm pH từ 9-11

Phân loại dựa trên nguồn sốc, protease có nguồn gốc từ động vật, thực vật, vi sinh vật.1.3.3 Cơ chế xúc tác

Xúc tác được thực hiện băng một trong hai cơ chế [25]:- Aspartic và Metallo protease kích hoạt một phân tử nước, thực hiện tan công ái

nhân trên mạch peptide để thủy phân nó Serine, Threonine và cysteine protease

dùng một tác nhân ái nhân (thường là một bộ 3 xúc tác):

15

- Bude 1: Acyl hóa hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm —OH của serine vớinguyên tử cacbon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của

nhóm imidazole từ histidine.

- - Bước 2: khử acyl hóa: phức hệ acyl-emzyme bị thủy phân bởi phân tử HO theo

chiều ngược lại của bước 1 Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc —OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh enzyme

1.4 Tach phân đoạn peptide

1.4.1 Giới thiệu

Ngày nay, peptide có hoạt tính sinh học được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực nhấtlà trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm Có nhiều phương pháp thu nhận peptide cóhoạt tính sinh học khác nhau đã được thực hiện Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểmriêng và phù hợp cho từng loại peptide Vì vậy, cần chọn phương pháp tối ưu để có thểthu nhận được peptide có hoạt tính sinh học mong muốn

1.4.2 Một số phương pháp thu nhận peptide1.4.2.1 Điện di

Nguyên tắc: là sự dịch chuyển của các thành phần mang điện trong điện trường Sự dịchchuyển của các thành phan này phụ thuộc vào kích thước, độ tích điện, hình dạng của mỗithành phan mà chúng sẽ được tách ra ở các khu riêng biệt và hiển thị dưới dạng hình anhđịnh tính [28] Có nhiều phương pháp điện di protein khác nhau:

= Điện di miễn dịch

m- Diện di hội tụ

= Điện di hai chiều

» Điện di mao quản

= Điện di gel

= Dién di qua mang cellulose acetate

= Điện di trong lòng dịch và điện di giấy

Trong đó, phương pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate — Polyacrylamide

Gel Electrophoresis) được sử dụng khá phổ biến dé tách protein dựa vào trong lượng phân

tử của nó Trong phương pháp điện di này, các phan tử protein được chạy qua một điện

trường không đối, tốc độ di chuyên phụ thuộc vào kích thước, hình dạng của các phân tửprotein Các phân tử protein sẽ được phân tách thành các bang khác nhau Nông độ gelacrylamide sử dụng với nông độ 5%- 5%

1.4.2.2 Phương pháp siêu lọc (UF)

Phương pháp này sử dụng màng lọc có lỗ với kích thước nhỏ Màng lọc sẽ giữ các protein

và peptide có kích thước lớn ở trên và cho những peptide có kích thước phù hợp đi qua.

Phương pháp này còn được dùng dé làm tăng nông độ dung dich protein va peptide Tuynhiên, phương pháp này lại khó tách một loại protein hoặc một loại peptide cụ thể nào

[29].

1.4.2.3 Phuong pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performance LiquidChromatography) dùng dé nhận biết, tách, định lượng thành phân hỗn hợp HPLC gồm có2 pha: Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất răn được phân chia dưới

dạng tiêu phân hoặc một chất lỏng phủ lên bề mặt chất rắn hoặc một chất mang đã được

cho liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này có độ nhạy cao, địnhlượng chính xác, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy bởi nhiệt

[28].

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tach chiét người ta chia HPLC thành 4 loại:= Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng ran (adsorption/liquid chromatography)= Sắc ký phân bố (partition chromatography)

= Sắc ký ion (ion chromatography)= Sắc ky ray phân tử (size exclusion/ gel permeation chromatography)

17

1.5 Tình hình nghiên cứu peptide có hoạt tinh sinh học trong vàngoài nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu của Nguyễn Lệ Hà (2011), nhóm tác giả nghiên cứu tách chiết và ứng dụngenzyme protease từ tôm st (Penaeus monodo) trong chế biến thủy sản Kết quả nghiêncứu đã xác định protease trong tôm st thuộc nhóm enzyme protease serine, thành phanbao gồm ít nhất có 5 loại protease ở gan tụy tôm và bảy loại ở đầu tôm, trong đó có 3 loạiđóng vai trò chủ đạo với phân tử lượng từ 20.200kDa đến 25.000kDa và đã được xác địnhcác tính chất co bản và động học của protease tách chiết từ đầu và gan tụy tom Proteasetừ nội tạng tôm sú bền nhiệt và hoạt động tốt ở 62°C đây là lợi thế cho việc ứng dụngprotease này vào quá trình chế biến thực phẩm vì ức chế được nhiều sinh vật gây thối.Hoạt tính protease thể hiện tốt nhất ở pH 7,5, hoạt tính protease giảm khi có mặt của mộtsố ion kim loại đặc biệt là Hg2+, ion Mn2+ làm tăng hoạt tính protease [30]

Năm 1995, Nguyễn Van Thoa va cs đã tiến hành nghiên cứu quy trình công nghệ san xuấtmam ruốc ăn liền Nước mắm có hàm lượng nitơ toàn phan là 30 — 40g/kg, ham lượng

muối la 14— 18 %, ham lượng nước là 25 — 30%, hợp vệ sinh an toàn thực phẩm

Trần Bích Lam va cs đã nghiên cứu sử dụng protein con ruốc vào sản xuất mì sợi với tý lệpha trộn là 10% bột protein, 40% bột săn và 50% bột mì, hay 8% bột protein concentrat,23% bột san và 60% bột mì Chất lượng của các sản phẩm này tương đương các sản phẩmcùng loại sử dụng các nguồn protein cao cấp như: thịt, trứng và có hàm lượng protein cao

(13%).

Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeusvannamei) băng enzyme Alcalase theo phương pháp RSM của Ngô Dang Nghĩa và cs(2013) Nhóm tác giả tiễn hành tối ưu 3 nhân tối tỉ lệ Alcalase (0,1-0,5%), nhiệt độ thủy

phân (50-700C), thời gian thủy phân (2-8 giò), với 2 hàm mục tiêu là hàm lượng protein

Alcalase là 0,382%, nhiệt độ thủy phân là 620C, thời gian thủy phân là 2 giờ Hàm lượng

protein hòa tan 2401,4+0,75mh/130mL, khả năng khử gốc tự do 45,7+3,09 pM/mg

protein hòa tan [31].

1.5.2 Tình hình nghiên cứu 6 nước ngoài

Nghiên cứu của Venkateshwarlu Gudipati và cộng sự (2015), tối ưu hóa điều kiện thủyphân đầu tôm để thu hồi dịch thủy phân có hoạt tính oxy hóa tối đa băng phương phápRSM Kết quả nghiên cứu cho thấy rang điều kiện thủy phân tối ưu ở pH=8.2, nhiệt độ45,40C, tỉ lệ E/S=1,8% Trong đó hoạt tính kháng oxy hóa được đo bằng phương phápDPPH và FRAP Kết quả dự đoán theo phương pháp RSM cho mức độ thủy phân (DH),DPPH, FRAP lần lượt là 42.44%, 39.64% va 8,3 uM Fe (ID/g Việc thu nhận dịch thủyphân theo điều kiện tối ưu có nguồn gốc từ mô hình nay cho thay giá tri DH, DPPH vaFRAP lần lượt là 40.31%, 38.93% và 8.21 uM Fe (II) / g mẫu, điều này cho thấy thích

hợp với dự đoán của mô hình [32].

Nghiên cứu khảo sát đặc điểm của peptide có hoạt tính liên kết ion sắt từ dịch thủy phânphụ phẩm tôm (Zhang-yan Ren va cs 2011) 6 enzyme nhóm protease (Trypsin, Pepsin,

Protmex, Flavourzyme, Neutrase va Alcalase) được su dụng trong nghiên cứu nay, trong

đó dich thủy phân từ enzyme Trypsin cho hoạt tinh liên kết ion sắt cao nhất Kết quả chothay rang pH, nông độ Trypsin, thời gian thủy phân có ảnh hưởng đáng ké đến hoạt tínhliên kết ion của dịch thủy phân Kế đến, nhóm tác giả tiến hành tối ưu điều kiện thủy phâncủa enzyme Trypsin bang phương pháp đáp ứng bé mat (RSM) Kết quả cho thấypH=8.18, nông độ enzyme 500U/ml và thời gian thủy phân là 120 phút được xác định làđiều kiện tối ưu để dịch thủy phân có hoạt tính liên kết ion sắt cao nhất (6.75 ng-

như: alcalase, protamex, flavourzyme, papain, và trypsin để thủy phân Kết quả nghiêncứu cho thấy rang, dịch thủy phân protein từ enzyme Protamex cho hoạt tinh ức chế ACEcao nhất ở IC50= 0.08+0.00 mg/mL Dịch thủy phân từ enzyme Protamex được phânđoạn 2 lần bằng phương pháp siêu lọc với cột lọc kích thước 3kDa và 10kDa (dưới 3kDa,giữa 3 và 10kDa, trên 10kDa), thành phần acid amin tong số, hoạt tinh kháng oxy hóa,hoạt tính ức chế ACE được đánh giá ở 3 phân đoạn này Kết quả, ở phân đoạn lọc <3kDa

và 3kDa-10kDa cho hoạt tính khang oxy hóa cao hơn ở phân đoạn >10kDa Phan đoạn

3-10kDa và >3-10kDa cho hoạt tính ức chế ACE cao nhất [ 34]

Nghiên cứu cua Mingyong Zeng và cộng sự (2012), trong nghiên cứu này nhóm tác gia

tiến hành thủy phân protein từ con Sò để khảo sát hoạt tính liên kết Zn””, dịch thủy phân

được cho qua cột trao đổi ion kim loại Các peptide liên kết kẽm (Zn) được xác định

băng sắc ký lỏng cao áp (RP-HPLC) và được giải mã băng phương pháp sắc ký lỏng(LC/LTQ) khối phố (chuỗi từ đầu N đến C) có trọng lượng phân tử là 1882.0 Da Khảnăng liên kết kẽm của peptide (HLRQEEKEEVTVGSLK) là 6.56 g/ mg Băng phươngpháp đo quang phố UV-vis và FTIR người ta đã chứng minh được rang các nguyên tửNito và oxy thuộc nhóm carboxylate là các vị trí gắn của Zn”” Kết qua đã cung cấp mộtcách tiếp cận khả thi dé cô lập các peptide liên kết kẽm va góp phan làm rõ cơ chế liên kết

giữa kẽm va peptide [45].

Trong nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện thủy phân (tỉ lệ E/S và thời gian thủy phân) proteintừ con ruốc (Acetes indicus) sử dụng enzyme Alcalase của Vignaesh Dhanabalan và cộngsự (2017) đến hoạt tính ACE, liên kết kim loại và chống oxy hóa Tỉ lệ E/S (1,57; 1.69;

1,60; 1,56 và 1,50) và thời gian (97,18 phút; 96,5 phút; 98,15 phút; 102,48 và 88,44 phút)

dùng để tiến hành tối ưu Kết quả cho thấy: hoạt tính nhốt gốc tự do DPPH cao nhất là

7,04 (uM Trolox/g) với tỉ lệ E/S=1,6 mL/100g, thời gian thủy phân 98,15 phút Hoạt tính

liên kết ion kim loại cao nhất là 77.24% với tỉ lệ E/S=1,5 mL/100g, thời gian thủy phân là88.44 phút Hoạt tinh ức chế ACE cao nhất đạt 87, 95 với E/S=1,56 mL/100g và thời gian

Nghiên cứu tối ưu hóa hoạt tính kháng khuẩn của dịch thủy phân cá cơm biển của

Dongfeng Wang và cộng sự (2011), trong nghiên cứu nay tác giả sử dụng 6 loại enzyme

(papain, pepsin, trypsin, alkaline protease, acidic protease, và flavoring protease) dé tiễnhành thủy phân Kết qua cho thay rang dich thủy phân protein từ enzyme pepsin cho hoạttính kháng khuẩn cao hơn dịch thủy phân từ các enzyme khác Tác giả tiễn hành tôi ưuhóa các điều kiện thủy phân bang phương pháp đáp ứng bề mặt RSM Kết qua cho thayrang tỉ lệ E/S=1,1 U/g, pH=2, thời gian phản ứng 2.4 giờ, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi(v/w) = 4:1 là điều kiện tối ưu cho dịch thủy phân cá cơm có hoạt tính kháng khuẩn caonhất Dịch thủy phân có khả năng ức chế sự phát triển của Escherichia coli CGMCC

1.1100; Pseudomonas fluorescens CICC 20225; Proteus vulgaris CICC 20049; Bacillus

megaterium CICC 10324 voi nông độ ức chế tối thiểu ICso trong khoảng 28.38 đến 56.75

ug/ml {15}.

21

CHUONG 2: NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

2.1 Nguyén liéu

2.1.1 Ruốc khôCon ruốc khô trong nghiên cứu này được mua tại Bình Thuận, có độ âm # 12% và được

bảo quản trong các túi PA hút chân không, nhiệt độ phòng.

2.1.2 Chế phẩm enzyme

Trong nghiên cứu này, 5 loại enzyme đã được sử dụng được mua từ hãng MERCK củaĐức, bao gôm:

- Chế phẩm enzyme Alcalase” 2.5 L (EC No: 3.4.21.62) từ Bacillus licheniformis

với hoạt độ công bố 2,4 AUA/g Điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 55

-70°C va 6.5 — 8.5.

- Chế pham enzyme Protamex® (EC No: 34.24.28) từ Bacillus licheniformis vaBacillus amyloliquefaciens với hoạt độ công bố 1,5 AU/g Điều kiện nhiệt độ vapH tối ưu tương ứng là 35 - 60°C và 5,5 — 7,5

- Chế phẩm enzyme Flavourzyme” 500 MG (EC No: 34.11.1) từ Aspergillusoryzae với hoạt độ công bố 500 LAPU/g Điều kiện nhiệt độ va pH tối ưu tương

2.1.3 Hóa chất khácCác hóa chất được sử dụng: Pyrocatechol Violet (PV) mua từ công ty Sigma-Aldrich (Mỹ), đồng sulphate (CuSO,), Pyridine, EDTA disodum salt

(CyoH | 4N2.Na,Og) mua từ công ty Hóa Nam (Việt Nam), Folin, Albummin,

Tyrosin, 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) mua từ công ty Merck

Schuchardt (Duc).

2.2 Phuong pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Con ruôc khô

Ỳ

Khảo sát thành phan hóa hoc của

con ruôc khô

Hàm mục tiêu: kha năng liên kết đồng (Cu)

_— Tối ưu hóa điều kiện thủy phân —> Thu dịch thủy phân có khả năng liên

kết đồng cao nhất

L

Xác định khả năng liên kết đồng của

từng phân đoạn Tách phân đoạn

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

23

2.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu

2.2.2.1 Khao sát thành phan hóa học của nguyên liệu (con ruốc khô)Con ruốc khô được xác định thành phan hóa hoc cơ bản sau:

Hàm lượng âm (AOAC, 2000)- Ham lượng protein thô (phương pháp Kjeldahl với hệ số chuyển đổi Nito là 6,25

AOAC, 2000)

- Ham lượng béo (AOAC, 2000)

- Ham lượng tro (AOAC, 2000)

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi đến hiệu suất thu hồi

protein.

Mau ruốc được thủy phân với các thông số cô định là loại enzyme, ti lệ E/S, thời gianthủy phân, nhiệt độ, pH tương thích với enzyme được chọn thủy phân Thay đổi tỉ lệnguyên liệu:dung môi (Acetes:water) trong khoảng từ 1:3 đến 1:10 Chon tỉ lệ nguyênliệu:dung môi cho hiệu suất thu hồi protein cao nhất

Cách tiễn hành được trình bày trong bày trong phan phụ lục A.2, trang [54, 55, 56]2.2.2.3 Khảo sát anh hưởng của loại enzyme thủy phân lên khả năng liên kết đồng

cúa dịch thủy phân.

Mau ruốc được thủy phân với các thông số cô định là tỉ lệ nguyên liệu: dung môi, tỉ lệE/S, thời gian thủy phân Thay déi enzyme khảo sát với pH, nhiệt độ tương thích từng loạienzyme Chọn loại enzyme cho dịch thủy phân với khả năng liên kết đồng cao nhất

Thông số cô định:

- _ Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (1:8)

- Tilé E/S: 30 U/g protein

- Thời gian thủy phân 4 giờ.

Thông số thay đối:- Enzyme Flavourzyme; pH: 7, nhiệt độ 50°C- Enzyme Alcalase; pH: 7.5, nhiệt độ 55°C

- Enzyme Corolase; pH: 7, nhiệt độ 55°C- Enzyme Neutrase; pH: 8, nhiệt độ 50°C- Enzyme Protamex; pH: 6.5, nhiệt độ 55°C2.2.2.4 Khao sát ảnh hưởng của pH đến kha năng liên kết đồng của dịch thủy phan.Mẫu ruốc được thủy phân với các thông số cố định: tỉ lệ nguyên liệu:dung môi, loạienzyme, nhiệt độ, tỉ lệ E/S, thời gian thủy phân Thay đôi pH khảo sát và chọn pH tối ưucho dịch thủy phân có khả năng liên kết đồng cao nhất.

e Thông số cô định:

- Tilé nguyên liệu:dung môi: 1:8

- - Loại enzyme: đã chọn

- _ Nhiệt độ: 50°C

- Tilé E/S: 30U/g protein

- Thời gian thủy phân: 4 giờ

e Thông số thay đổi:

- Khao sát pH trong khoảng 5-7, bước nhảy là 0,5

2.2.2.5 Khảo sát anh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến khả năng liên kết đồng của

dịch thủy phan

Mẫu ruốc được thủy phân với các thông số cô định là: tỉ lệ nguyên liệu: dung môi,enzyme, pH, tỉ lệ E/S, thời gian thủy phân Thay đối nhiệt độ khảo sát và chọn nhiệt độ tốiưu sao cho dịch thủy phân có khả năng liên kết đồng cao nhất

e Thông số cô định:

- _ Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi: 1:8

- - Loại enzyme: đã chọn

- pH: đã chọn

- Tilé E/S: 30U/g protein

- Thời gian thủy phân: 4 giờ

e Thông số thay đổi:

25

- Nhiét độ khảo sát trong khoảng 40-60°C, bước nhảy là 5°C2.2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S lên khả năng liên kết đồng của dịch thủy

phân

Mẫu ruốc được thủy phân với thông số cô định: tỉ lệ nguyên liệu:dung môi, loại enzyme.pH, nhiệt độ, thời gian thủy phân Thay đổi tỉ lệ E/S sao cho dịch thủy phân có khả năngliện kết đồng cao nhất

- Thời gian thủy phân: 4 giờ

e Thông số thay đổi:

- Khao sát tỉ lệ E/S trong khoảng 30-70U/g protein, bước nhảy là 10U/g

- _ Thời gian thủy phân khảo sát trong khoảng 1-5 giờ, bước nhảy là 1 giờ.

2.2.2.8 Sang lọc các yếu tố ảnh hướng đến điều kiện thủy phânĐể xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng liên kết đồng của dịch thủy phân, 4 yếutố được chon là: pH, nhiệt độ, tỉ lệ E/S, thời gian thủy phân Thí nghiệm được thiết kếtheo ma trận Plackett Burman để sàng lọc các yếu tố quan trong ảnh hưởng đến kha năngliên kết đồng của dịch thủy phân

2.2.2.9 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân:Quá trình tối ưu hóa với (số yếu tố) ảnh hưởng chính đến khả năng liên kết đồng của dịchthủy phân theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Phương pháp này sử dụng thuật toánphân tích hồi quy đa thức nhằm xác định tat cả các hệ số bậc 1 (X¡, Xa), hệ số bậc 2 (XJ”.Xz') và hệ số tương quan (X,X>) và sử dụng thiết kế hỗn hợp có tâm (CCC) dé thiết kế matrận thí nghiệm tối ưu

2.2.2.10 Lọc phân đoạn dịch thủy phân

Dịch thủy phân thu được từ các điều kiện thủy phân tối ưu ở trên được lọc qua cột lọc lytâm ở các kích thước màng lần lượt là: 30kDa, 10kDa, 3kDa, 1kDa Các phân đoạn

protein thu được bao gồm: >30kDa, 10-30kDa, 3-10kDa, 3-IkDa, 1kDa Sau đó, 5 phan

đoạn peptide này đem xác định khả năng liên kết đồng dé chọn ra phân đoạn có khả năngliên kết đồng cao nhất

2.2.2.11 So sánh hoạt tính liên kết của phân đoạn peptide với ÑNa;EDTANaEDTA được khảo sát kha năng liên kết đồng dé so sánh với kha năng liên kết đồng

của các phan đoạn peptide cua dịch thủy phân.

2.3 Các phương pháp nghiên cứu2.3.1 Quy trình thu nhận dịch thủy phân protein từ con ruốc khô sir dụng chế phẩm

enzyme

Con ruốc khô được xay nhuyễn và được hòa trộn với nước theo tỉ lệ 1:8 (w/v), sau đóđược gia nhiệt tới 95°C trong 20 phút để vô hoạt enzyme noi tại Sau đó mẫu được chỉnhpH thích hợp cho chế phẩm enzyme hoạt động Cho chế phẩm enzyme vào theo tỉ lệ E/S

27