Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Khả năng liên kết canxi và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ da cá thát lát

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2022

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Võ Đình Lệ Tâm

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS Mai Huỳnh Cang

3 Phản biện 2: PGS.TS Phan Ngọc Hoà4 Uỷ viên: PGS.TS Võ Đình Lệ Tâm5 Thư ký: TS Nguyễn Lệ Hà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

● Xác định thành phần hoá học cơ bản của da cá thát lát.

● Khảo sát điều kiện thuỷ phân để thu dịch thuỷ phân protein có hoạt tính liên kếtcanxi cao nhất.

● Phân đoạn dịch thuỷ phân, xác định phân đoạn peptide có hoạt tính liên kết canxicao nhất.

● Xác định mức độ thủy phân và thành phần amino acid của dịch thủy phân.● Đánh giá tính chất chức năng của dịch thuỷ phân.

● Khảo sát độ ổn định hoạt tính của bột dịch thủy phân.

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 13/06/2022

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp là nhờ sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, cũng như sự động viên ủng hộ từ gia đình và bạn bè trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Cô PGS.TS Võ Đình Lệ Tâm, người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ chúng em với những chỉ dẫn quý giá trong suốt quá trình triển khai, thực hiện và hoàn thành luận văn

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô trong Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Trường Đại học Bách Khoa đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu để chúng em có được nền tảng kiến thức phục vụ cho nghiên cứu này

Cuối cùng, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã hết lòng hỗ trợ trong quá trình thực hiện luận văn

Kết quả cho thấy da cá thát lát có độ ẩm đạt 63,57 ± 1,68%, ngoài ra hàm lượng protein chiếm 25,3 ± 0,33%, chất béo chiếm 3,27 ± 1,27% và hàm lượng tro chiếm 6,99 ± 1,6% tính theo cơ bản ướt DTP thể hiện CaBC cao nhất 23,04 ± 0,34 mg Ca2+/ g protein ở bộ điều kiện thủy phân tốt nhất gồm Flavourzyme (500C, pH=7), tỉ lệ S/W 1:7 (w/v), tỉ lệ E/S 40 U/g protein và 4 giờ thủy phân DH của DTP có CaBC cao nhất là 1,39 ± 0,25% Kết quả thành phần amino acid cho thấy DTP chứa 7/9 amino acid thiết yếu, chiếm tỉ lệ 19,19% tổng lượng amino acid Độ tan của DTP vẫn giữ được trên 70% khi khảo sát trong khoảng pH 3-8 và kể cả sau khi xử lý nhiệt ở 630C trong 30 phút và 930C trong 30 giây Khả năng tạo bọt (FC) và độ bền bọt (FS) giảm dần khi tăng pH trong khoảng khảo sát từ 3-8 Khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ cho thấy xu hướng trái ngược tại pH=4 khi EAI đạt giá trị cao nhất 16,42 ± 0,25 m2/g còn ESI đạt giá trị thấp nhất 34,45 ± 1,22 phút Khả năng giữ nước (WHC) và khả năng giữ dầu (OHC) của DTP lần lượt là 1,87 ± 0,12 ml nước/g bột và 1,33 ± 0,12 ml dầu/g bột Độ ổn định CaBC của DTP giữ được trên 72,69 ± 4,17% sau khi xử lý pH 1-11 Độ ổn định CaBC theo thời gian xử lý nhiệt cho thấy CaBC của DTP vẫn giữ được 91,31 ± 3,40% khi xử lý ở 1000C trong 180 phút Trong năm phân đoạn, phân đoạn peptide <1kDa cho kết quả CaBC cao nhất với giá trị 25,53 ± 0,31 mg Ca2+/g protein thấp hơn CaBC của casein phosphopeptide 20,93 lần

ABSTRACT

This study aims to investigate the calcium-binding capacity (CaBC) and functional properties of protein hydrolysate from Clown Featherback skin using Flavourzyme preparation

Firstly, chemical composition of Clown Featherback skin was analyzed and the influence of hydrolysis conditions including the Clown Featherback skin : water ratio (S/W), enzyme:substrate ratio (E/S) and hydrolysis time was evaluated to obtain the highest CaBC protein hydrolysate Next, amino acid composition and degree of hydrolysis of highest CaBC were determined Then, solubility, foam capacity (FC), foam stability (FS), emulsifying activity index (EAI), emulsifying stability index (ESI), water holding capacity (WHC), oil holding capacity (OHC) were studied Afterward, the pH and thermal stability of CaBC were assessed Subsequently, five peptide fractions of 10-30kDa, 3-10kDa, 1-3kDa, <1kDa obtained from the protein hydrolysate using ultrafiltration were tested for their CaBC

The result showed that the chemical composition of Clown Featherback skin involved 63.57 ± 1.68% of moisture, 25.3 ± 0.33% of protein, 3.27 ± 1.27% of lipid and 6.99 ± 1.6 of ash (on wet weight basic) The proteolysate displayed the maximal CaBC of 23.04 ± 0.34 mg Ca2+/g protein when being treated with Flavourzyme (500C, pH=7), S/W ratio of 1:7, E:S ratio of 40U/g protein and hydrolysis of 4 hours The proteolysate had seven out of nine indispensable amino acids accounting for 19.19% total amino acid content The DH of proteolysate stood at 1.39 ± 0.25% The solubility remained higher than 70% at pH from 3 to 8 even after heat treatment at 630C in 30 minutes or 930C in 30 seconds FC and FS were inversely proportional to pH in range from 3-8 At pH 4 which EAI showed the highest value of 16.42 ± 0.25 m2/g meanwhile ESI was at the lowest 34.45 ± 1.22 minutes WHC and OHC of the proteolysate were 1.87 ± 0.12 ml water/g powder and 1.33 ± 0.12 ml oil/g powder, respectively CaBC maintained above 72.69 ± 4.17% after pH treatment from 1 to 11 The extension of heat treatment showed no significant effect to thermal stability of proteolysate’s CaBC, when the proteolysate retained 91.31 ± 3,40% after 180 mins at 1000C Additionally, the <1kDa peptide fraction exhibited the highest CaBC of 25.53 ± 0.31 mg Ca2+/g protein, 20.93 folds lower than that of casein phosphopeptide

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn hoàn toàn trung thực và đều thuộc sở hữu nhóm nghiên cứu Các số liệu tham khảo đã được trích dẫn và chỉ rõ nguồn gốc trong bài viết

Học viên thực hiện Luận văn

ĐOÀN TẤN HUY

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ITÓM TẮT LUẬN VĂN IIABSTRACT IIILỜI CAM ĐOAN IVMỤC LỤC VDANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VIIIDANH MỤC BẢNG IXDANH MỤC HÌNH X

1.2.2.1 Thuỷ phân sử dụng acid/kiềm 4

1.2.2.2 Thuỷ phân sử dụng chế phẩm enzyme 4

1.2.2.3 Thuỷ phân bằng phương pháp lên men 5

1.3 Khả năng liên kết canxi của DTP protein 5

1.3.1 Khả năng liên kết canxi 5

1.3.2 Cơ chế thể hiện hoạt tính 6

1.3.3 Đặc điểm của DTP có CaBC 7

1.3.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của DTP protein 7

1.4 Tính chất chức năng của DTP 9

1.4.1 Độ tan 9

1.4.2 Khả năng giữ nước và giữ dầu 10

1.4.3 Khả năng tạo gel 10

1.4.4 Khả năng tạo nhũ và bền nhũ 10

1.4.5 Khả năng tạo bọt và bền bọt 11

1.5 Tình hình nghiên cứu phụ phẩm da cá thát lát 11

1.5.1 Tình hình nghiên cứu phụ phẩm da cá thát lát trong nước 11

1.5.2 Tình hình nghiên cứu phụ phẩm da cá thát lát ngoài nước 11

1.6 Tình hình nghiên cứu DTP có tính chất chức năng 12

1.6.1 Tình hình nghiên cứu DTP protein có tính chất chức năng trên thế giới121.6.2 Tình hình nghiên cứu DTP protein có tính chất chức năng ở Việt Nam121.7 Tiềm năng ứng dụng của DTP protein 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Nguyên liệu và hoá chất 14

2.1.1 Nguyên liệu và phụ phẩm 14

2.1.2 Chế phẩm enzyme 14

2.1.3 Hoá chất khác 14

2.2 Sơ đồ nghiên cứu 14

2.3 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 15

2.3.1 Xử lý nguyên liệu 15

2.3.2 Khảo sát thành phần hoá học 15

2.3.3 Quá trình thuỷ phân 15

2.3.4 Phương pháp xác định mức độ thuỷ phân 16

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thuỷ phân đến CaBC của DTP 16

2.3.6 Phương pháp lọc khử khoáng 17

2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein hoà tan 17

2.3.8 Phương pháp xác định CaBC 18

2.3.9 Phương pháp lọc phân đoạn DTP và khảo sát hoạt tính từng phân đoạn18

2.3.10 Phương pháp đánh giá tính chất chức năng của DTP 18

2.3.11 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính của DTP 19

3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S 21

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân 22

3.3 Kết quả đánh giá mức độ thuỷ phân DH 25

3.4 Kết quả đánh giá thành phần amino acid và tính chất chức năng của DTP 25

3.4.1 Thành phần amino acid của DTP 25

3.4.2 Tính chất chức năng của DTP 26

3.4.3 Độ ổn định CaBC 33

3.4.4 CaBC của các phân đoạn peptide 35

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ANOVA: Analysis of variance

CaBC: Calcium-binding capacity: CaBC DH: Degree of Hydrolysis: Mức độ thuỷ phân DTP: Dịch thủy phân

S/W: Substrate/Water: Da cá / nước E/S: Enzyme/Substrate: Enzyme / cơ chất

WHC: Water holding capacity: Khả năng giữ nước OHC: Oil holding capacity: Khả năng giữ dầu EAI: Emulsifying activity index: Khả năng tạo nhũ ESI: Emulsifying stability index: Độ bền nhũ

FC: Foaming capacity: Khả năng tạo bọt FS: Foaming stability: Độ bền bọt

CPP: Casein phosphopeptide

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại khoa học của cá thát lát [7] 2

Bảng 1.2 Thành phần hoá học của da cá thát lát và các phụ phẩm da khác 3

Bảng 1.3 Nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị Canxi theo độ tuổi [21] 6

Bảng 1.4 Một số hoạt tính khác của DTP protein 8

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 15

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ S/W đến CaBC của DTP protein da cá thát lát 21

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến CaBC của DTP protein da cá thát lát 22

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến CaBC của DTP protein da cá thát lát 23

Hình 3.4 So sánh CaBC của DTP có enzyme và không enzyme 24

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của DTP protein da cá thát lát 26

Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo bọt (FC) của DTP protein da cá thát lát 27

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH đến độ bền bọt (FS) của DTP protein da cá thát lát 28

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo nhũ của DTP protein da cá thát lát và Natri caseinate 30

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến độ bền nhũ (ESI) của DTP protein da cá thát lát 31

Hình 3.10 Khả năng giữ nước của bột DTP protein da cá thát lát 32

Hình 3.11 Khả năng giữ dầu của bột DTP protein da cá thát lát 33

Hình 3.12 Độ ổn định CaBC của DTP theo thời gian gia nhiệt 33

Hình 3.13 Độ ổn định CaBC của DTP theo pH 34

Hình 3.14 CaBC các phân đoạn peptide của DTP protein da cá thát lát 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong năm 2021, tổng sản lượng thuỷ sản ước đạt 77.424,9 tấn Sản lượng thuỷ sản nuôi trồng nói chung ước đạt 74.880,95 tấn với sản lượng cá Thát Lát thu hoạch được là 6.242,94 tấn Bên cạnh đó, Cá Thát Lát với phụ phẩm là phần da (chiếm từ 17-22% tổng khối lượng) Để giải quyết lượng lớn các phụ phẩm như da cá Thát Lát hiện nay xu hướng tận dụng các nguồn phụ phẩm đó để sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng đang được nghiên cứu và đẩy mạnh Da cá được biết đến như một nguồn giàu collagen và gelatin có thể tận dụng để trích ly và thu nhận cùng với hàm lượng protein cao thích hợp trong việc sản xuất DTP protein

Canxi là một nguyên tố đa lượng thiết yếu, ngoài chức năng trong hình thành xương, canxi cũng cần thiết cho các chức năng sinh lý khác như: duy trì trọng lượng cơ thể khoẻ mạnh, đông máu, co cơ, phân chia tế bào, hoạt động của enzyme và dẫn truyền xung thần kinh và tiết hormone [1] Hậu quả của việc thiếu canxi có thể dẫn đến còi xương, loãng xương, huyết áp cao, béo phì [2]

Các sản phẩm bổ sung canxi vô cơ với xu hướng tạo phức không tan với phytate mà trong cơ thể người thiếu enzyme phytase để giải phóng muối canxi hoặc phản ứng kết tủa với các gốc phosphate và oxalate trong đường ruột [1] [3] Các sản phẩm bổ sung canxi hữu cơ như canxi lactate và canxi gluconate cho thấy hiệu quả và tính sinh khả dụng thấp [4]

Peptide với khả năng liên kết canxi từ DTP protein lúc này có thể là một giải pháp thay thế thích hợp cho việc tăng tính khả dụng sinh học khi có thể giữ được dạng hoà tan của canxi khi thay đổi pH trong quá trình tiêu hoá Ngoài ra DTP protein còn có những tính chất chức năng khác có thể ứng dụng được trong thực phẩm như: khả năng tan, khả năng tạo bọt và bền bọt, khả năng tạo nhũ và bền nhũ, khả năng giữ nước và giữ dầu

Vì vậy, nghiên cứu “Khả năng liên kết canxi và tính chất chức năng của DTP protein từ da cá thát lát” với mục tiêu như tận dụng hiệu quả nguồn phụ phẩm này theo hướng tạo ra sản phẩm có giá trị gia tăng và giảm thiểu gánh nặng về vấn đề môi trường Nội dung nghiên cứu tập trung vào xác định điều kiện thuỷ phân cho DTP protein có CaBC cao nhất và các tính chất chức năng của DTP trong ứng dụng vào phụ gia trong thực phẩm

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Cá thát lát 1.1.1 Phân bố

Cá Thát Lát (danh pháp hai phần: Chitala ornata), tên tiếng Anh là Clown

Featherback hay Clown Knifefish Loài này sinh sống ở Ấn Độ và một số quốc gia Đông Nam Á khác như Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam, trong đó phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam [5] [6]

Bảng 1.1 Phân loại khoa học của cá thát lát [7]

Cá có đầu nhỏ, nhọn, dẹp bên Miệng rộng, màng da sau xương nắp mang phát triển, rạch miệng xiên kéo dài qua khỏi mắt, xương hàm trên phát triển Răng nhọn, bén mọc trên hàm dưới trên phần giữa xương trước hàm, trên xương khầu cái, trên xương lá mía và lưỡi, ngoài ra còn có đám răng nhỏ mịn trên xương bướm phụ Có một đôi râu mũi ngắn nhỏ Mắt nằm lệch về phía lưng của đầu, gần chóp mõm hơn gần điểm cuối

của xương nắp mang Phần trán gần hai mắt cong và lồi tương đương đường kính mắt [7]

1.1.3 Phụ phẩm da cá thát lát

Da cá thát lát là phụ phẩm của quá trình chế biến chả cá thát lát chiếm tỉ lệ 17-22% trên khối lượng nguyên liệu [8] Là một trong những nguồn giàu collagen, gelatin trong

số các phụ phẩm từ cá với hàm lượng protein từ 28,8 – 31,3% theo Bảng 1.2 và sản

phẩm của quá trình thuỷ phân da cá có thể chứa các peptide mang hoạt tính sinh học 20 amino acid bao gồm chống oxy hoá, chống viêm, chống tiểu đường, kháng khuẩn và chống lão hoá [9]

2-Ngoài ra DTP từ nguyên liệu cá có những tính chất chức năng khác như khả năng tan tốt, tạo bọt và gel, khả năng tạo nhũ và giữ nước có thể đóng vai trò làm phụ gia cải thiện cấu trúc của thực phẩm [10]

Vì những lý do trên, hiện nay trên thế giới nói chung cũng như Việt Nam nói riêng, phụ phẩm chế biến từ cá đã và đang đc nghiên cứu để tận dụng vào các ngành công nghiệp như thực phẩm, dược phẩm,… Điều này góp phần vào việc tái sử dụng các phụ phẩm này để giảm gánh nặng về chi phí xử lý môi trường, tạo ra sản phẩm có giá trị gia tăng góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế

Da cá hồi vân 41,6 ± 0,06 41,12 ± 0,01 13,12 ± 0.20 5,45 ± 0,10 [14]

Từ Bảng 1.2 trên ta thấy hàm lượng protein trong các nghiên cứu về da cá thát lát trước

đó cho thấy hàm lượng protein cao (>25%) khi so sánh với hàm lượng protein với các phụ phẩm da cá khác chứng minh da cá thát lát là một nguồn giàu protein cho việc sản xuất DTP protein

1.2 DTP protein

1.2.1 Giới thiệu DTP

DTP protein được định nghĩa là những sản phẩm thu được từ quá trình thuỷ phân protein bởi enzyme, acid, kiềm và phương pháp lên men Định nghĩa này được mở rộng cho cả khoáng, lipid, carbohydrate nếu chúng ở trong nguyên liệu, enzyme cùng với protein DTP được đánh giá bởi mức độ thuỷ phân (DH) ứng với số liên kết peptide bị cắt trên cho tổng liên kết peptide [10]

DTP thường là hỗn hợp của các polypeptides, oligopeptides và amino acids do quá trình thuỷ phân một phần [15]

1.2.2 Phương pháp thu nhận

1.2.2.1 Thuỷ phân sử dụng acid/kiềm

Quá trình thuỷ phân sử dụng acid với tác nhân acid thường là acid sulfuric (H2SO4) hoặc acid hydrochloric (HCl) ở điều kiện nhiệt độ cao (>1210C) và áp suất cao (>220,6kPa) Phương pháp này với ưu điểm là chi phí thấp tuy nhiên tryptophan bị phân huỷ hoàn toàn trong quá trình này, methionine bị phân huỷ 1 phần và sự chuyển hoá của glutamine thành glutamate và aspargine thành aspartate Đi kèm với đó là yêu cầu về thiết bị phải chịu nhiệt, áp lực và sự ăn mòn của acid nên ứng dụng của phương pháp này trong công nghiệp thực phẩm thường cho chất tạo vị

Quá trình thuỷ phân sử dụng kiềm với tác nhân kiềm thường Ca(OH)2, KOH, NaOH ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn 27-550C với thời gian thuỷ phân từ 4-8 giờ trong nền công nghiệp thực phẩm Với phương pháp này hàm lượng tryptophan được bảo tồn nhưng một số amino acid khác như serin, threonine bị phá huỷ trong quá trình thuỷ phân này và phản ứng racemic hoá Ứng dụng chính của phương pháp này là trong sản xuất các tác nhân tạo bọt [15] [16] [17]

1.2.2.2 Thuỷ phân sử dụng chế phẩm enzyme

Phương pháp thuỷ phân sử dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất DTP với ưu điểm là điều kiện phản ứng ôn hoà hơn khi so sánh với phương pháp thuỷ phân bằng acid/kiềm (pH 6÷8, nhiệt độ 30÷600C) ít gây biến đổi amino acid cùng với đó tính đặc

hiệu phản ứng của enzyme giúp kiểm soát mức độ thuỷ phân và hạn chế các phản ứng phụ [17]

Các chế phẩm enzyme sử dụng trong phương pháp này là protease từ các nguồn chủ yếu từ động vật (pancreatin, pepsin), thực vật (papain, ficin, bromelain) hoặc vi sinh vật (alcalase, flavourzyme) [15]

Cơ chế phản ứng của các protease trong quá trình thuỷ phân được chia thành 2 loại Endoprotease và Exoprotease Endoprotease có thể cắt các liên kết peptide trong protein còn Exoprotease có thể cắt các liên kết peptide ở đầu tận cùng C và N Tuỳ theo sản phẩm sau cùng mà có thể chọn enzyme có cơ chế phản ứng phù hợp [18]

Chế phẩm enzyme protease được chọn trong nghiên cứu này là Flavourzyme® 500

MG là enzyme được thu nhận từ quá trình lên men của nấm mốc Aspergillus oryzae

trong điều kiện pH trung tính hoặc acid yếu Chế phẩm này là hỗn hợp chứa 8 loại enzyme khác nhau bao gồm: 3 endopeptidase (neutral protease 1, neutral protease 2 và alkaline protease 1), 2 leucyl aminopeptidase (leucine aminopeptidase A và leucine amino peptidase 2), 2 dipeptidyl peptidase (dipeptidyl peptidase 4 và dipeptidyl peptidase 5), 1 amylase (α–amylase A type 3) [19]

1.2.2.3 Thuỷ phân bằng phương pháp lên men

Đây là quá trình thủy phân protein nhờ xúc tác enzyme từ vi sinh vật Các enzyme này có thể được tạo ra từ việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường riêng sau đó được đưa vào nguyên liệu giàu đạm như trong sản xuất nước tương hoặc tận dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệu ban đầu như sản xuất nước mắm Thành phần thu được trong dung dịch bao gồm cả protein, pepton, peptide và amino acid

1.3 Khả năng liên kết canxi của DTP protein 1.3.1 Khả năng liên kết canxi

Canxi là một trong những khoáng chất đa lượng chiếm nhiều nhất trong cơ thể người (1,5 – 2,2% tổng khối lượng cơ thể người) [20] với 99% nằm trong xương và 1% nằm trong dịch ngoại bào và nội bào [3] Ngoài chức năng trong hình thành xương, canxi cũng cần thiết cho các chức năng sinh lý khác như: duy trì trọng lượng cơ thể khoẻ mạnh, đông máu, co cơ, phân chia tế bào, hoạt động của enzyme và dẫn truyền xung thần kinh và tiết hormone [1] Hậu quả của việc thiếu canxi có thể dẫn đến còi xương, loãng xương, huyết áp cao, béo phì [2] và có thể ngăn ngừa bằng việc sử dụng các sản phẩm bổ sung canxi

Nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị với canxi (RDA) the độ tuổi được thể hiện trong

500 800 1300

>50

1000 1200 Mang thai hoặc

cho con bú

<19 19-50

1300 1000

Tuy nhiên việc hấp thu đủ lượng canxi không chỉ phụ thuộc vào lượng hấp thụ mà còn dựa trên khả năng hấp thụ của cơ thể Một trong các lý do ảnh hưởng tới khả năng hấp thụ canxi của cơ thể với sản phẩm bổ sung canxi vô cơ là do xu hướng tạo phức không tan với phytate mà trong cơ thể người thiếu enzyme phytase để giải phóng muối canxi hoặc phản ứng kết tủa với các gốc phosphate và oxalate trong đường ruột [1] [3] Một vài ý kiến cho rằng canxi hữu cơ sẽ tốt hơn muối canxi vô cơ vì có hai vấn đề chính nhau sau: ở nồng độ thấp thì tính khả dụng sinh học của canxi vô cơ sẽ kém và ở nồng độ cao thì dấy lên quan ngại về vấn đề độc tính sinh học [22] Tuy nhiên một số sản phẩm canxi hữu cơ như canxi lactate và canxi gluconate cho thấy hiệu quả thấp vì tính sinh khả dụng thấp và hàm lượng canxi thấp [4]

Peptide với khả năng liên kết canxi lúc này có thể là một giải pháp thay thế thích hợp cho việc tăng tính khả dụng sinh học khi có thể giữ được dạng hoà tan của canxi khi thay đổi pH trong quá trình tiêu hoá Việc tiêu thụ các peptide có nhiều lợi thế khi sử dụng ít năng lượng để vận chuyển qua màng từ đó tăng khả năng hấp thu [2]

1.3.2 Cơ chế thể hiện hoạt tính

Các peptide và amino acid nằm trong DTP có khả năng liên kết với các ion kim loại dựa trên sự liên kết phối trí giữa nhóm tạo điện tử trong bề mặt phối tử (peptide) và ion kim loại (chất nhận điện tử), hình thành của cấu trúc ổn định về mặt hóa học Phối

tử có thể được coi là base Lewis, có thể chia sẻ một cặp electron với kim loại, được coi là acid Lewis Do đó, hợp chất phối trí được hình thành do tương tác giữa acid Lewis và bazơ Lewis [23]

Cơ chế trên thể hiện ở 2 nhóm phosphate và carboxyl là hai nhóm thường được thấy trong các báo cáo liên quan tới khả năng liên kết canxi với peptide [24]

Nhóm phosphate liên kết canxi với đại diện là casein phosphopeptide và phosvitin phosphopeptide Nhiều nghiên cứu chỉ ra được mối quan hệ giữa nhóm phosphate với khả năng liên kết canxi có mối quan hệ với sự có mặt của nhóm phosphate của phosphoserine và cho thấy tỉ lệ nhóm phosphate trong phân tử casein tăng cường khả năng hấp thụ canxi bởi ruột non Cùng với đó peptides bị loại nhóm phosphoryl hoá không cho thấy khả năng liên kết canxi mà dạng phosphoryl hoá của αs1 và β-casein cho hoạt tính canxi cao hơn [24]

Nhóm carboxyl liên kết canxi theo Bao và cộng sự (2008) thì lượng canxi liên kết tăng tuyến tính theo sự tăng của nhóm carboxyl thường thấy ở nhóm carboxyl của Asp và Glu [24]

1.3.3 Đặc điểm của DTP có CaBC

Khả năng liên kết canxi của peptide trong DTP protein phụ thuộc nhiều vào thành phần amino acid của peptide

Thành phần amino acid và trình tự peptide là những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến khả năng liên kết kim loại của peptide Ngoài 2 amino acid Asp, Glu với khả năng liên kết với canxi qua nhóm carboxyl, nhóm N- imidazole của His và N-amide của Lys, vòng thơm của Phe, Tyr được biết đến như nguồn giàu electron có thể hỗ trợ khả năng liên kết canxi và các amino acid kị nước như (Ile, Leu, Val, Phe, Ala và Pro) có thể ngăn chặn sự tấn công của phân tử nước làm ổn định liên kết với canxi theo Vo và cộng sự (2018) [2] Ngoài ra Ser, Thr và Tyr đóng 1 vai trò quan trọng trong khả năng liên kết canxi thông qua nhóm -OH của chúng có thể liên kết với canxi theo Jung và cộng sự (2006) [25]

Như các peptide có hoạt tính sinh học khác thường là một chuỗi peptide từ 3-20 amino acid Khối lượng phân tử của các peptide có CaBC theo Feng-Ru Liu và cộng sự (2013) là những phân đoạn peptide <2 kDa [26]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của DTP protein

Bảng 1.4 Một số hoạt tính khác của DTP protein

Chống tiểu đường

Kì giông khổng lồ Trung Quốc

CSSV YSFR SAAP PGGP LGGGN

[27]

Ức chế ACE

Hạt bạch quả

TNLDWY RADFY RVFDGAV

[28]

Hạt nhãn

ETSGMKPTEL ISSMGILVCL

[29]

Liên kết khoáng

Phosphoprotein trong lòng đỏ

[32]

Chống oxy hoá

Đậu nành

VVFVDRL VIYVVDLR

IYVVDLR IYVFVR

[33]

Bánh gạo lên men

WLSYPMNPATGH PRPPKPDAPR

[34]

1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu CaBC của DTP protein trên thế giới

Phôi lúa mì là phụ phẩm của quá trình sản xuất bột mì vốn được biết đến là nguồn giàu amino acid đặc biệt là lysine, methionine và threonine DTP của phôi lúa mì theo các nghiên cứu trước báo có khả năng liên kết kẽm và canxi đã được Wang và cộng sự (2018) tận dụng và phân lập được chuỗi trình tự peptide FVDVT( Phe-Val-Asp-Val-Thr) với CaBC đạt 89,94 ± 0,75 % (w/w) khi thuỷ phân phôi lúa mì với enzyme Alcalase 2.4L tăng hơn 86,73% so với DTP [35]

DTP protein của đậu đen cho hoạt tính 77,54 ± 1,61 μg Ca2+/mg protein bằng enzyme ficin trong điều kiện nhiệt độ 700C, pH=6,2, tỉ lệ E/S 1,61% và thời gian thuỷ phân là 3h theo Wang và cộng sự (2020) [36]

Trình tự peptide VLGYIQIR có CaBC với khối lượng phân từ 960,58 Da được thu

nhận từ phụ phẩm là xương sống Cá Minh Thái Trong thử nghiệm in vitro liên kết canxi

có thể hoà tan cùng một lượng canxi khi so sánh với CPP theo Jung và cộng sự [37] 1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu CaBC của DTP protein ở Việt Nam

Đạm cá phân lập (FPI) từ phụ phẩm cá tra Pangasius hypophthalmus sử dụng

phương pháp thuỷ phân với xúc tác enzyme sử dụng là Alcalase 2.4L đã được nghiên cứu khả năng cố định canxi Kết quả thực nghiệm cho thấy CaBC của FPI cao nhất đạt 26,85 mg Ca2+/g FPI với điều kiện thuỷ phân pH=7, tỉ lệ E/S 0,15% (w/v), nhiệt độ thuỷ phân 550C, thời gian thuỷ phân 120 phút [38]

Phụ phẩm cá Tra Pangasius hypophthalmus gồm đầu xương sống, vây, đuôi sử

dụng phương pháp thuỷ phân enzyme Trypsin và tối ưu hoá quá trình thuỷ phân thu nhận peptide có CaBC Kết quả với điều kiện thuỷ phân tối ưu tỉ lệ enzyme 11,8 U/g, nhiệt độ 41,80C, thời gian thuỷ phân 108,26 phút ở pH = 8 có CaBC cao nhất là 18,69 mg Ca2+/g protein [39]

Có thể thấy hầu hết các liên kết canxi hiện tại ở Việt Nam còn ít và chỉ tập trung vào phụ phẩm cá tra Tuy nhiên điều này cũng cho thấy đây là hướng đi chung khi có thể tận dụng được nguồn phụ phẩm từ công nghiệp chế biến thuỷ sản và đặt nền móng cho các nghiên cứu về CaBC trên phụ phẩm của ngành công nghiệp này trong tương lai

Hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có công bố nào về DTP protein có CaBC từ da cá thát lát

1.4 Tính chất chức năng của DTP 1.4.1 Độ tan

Độ hòa tan là một tính chất quan trọng của DTP đại diện cho khả năng hòa tan của chúng trong một khoảng pH, nhiệt độ, nồng độ chất khô và lượng muối trong dung dịch

DTP với mức độ thuỷ phân bất kì đều thể hiện khả năng tan tốt hơn so với protein ban đầu Điều này được giải thích trong quá trình thuỷ phân protein bị phân cắt thành các peptide từ đó xuất hiện nhiều nhóm amino và carboxyl hơn tạo điều kiện cho các phản ứng giữa protein-nước [40]

Một tính năng quan trọng bổ sung của dịch thủy phân protein là độ bền nhiệt, điều này đặc biệt quan trọng trong khâu tiệt trùng đối với các sản phẩm có chứa dịch thủy phân Dịch thủy phân có được sự ổn định nhiệt ở mức độ thuỷ phân thấp (3 – 10%) khi có mặt của các kim loại, chẳng hạn như CaCl2, ở 100-130°C với pH 3÷11 [41]

1.4.2 Khả năng giữ nước và giữ dầu

Khả năng giữ nước đề cập đến khả năng của protein trong việc hấp thụ và giữ nước chống lại lực hấp dẫn trong protein nền Gel với khả năng giữ nước thấp thường có kết cấu lỏng lẻo nên khả năng giữ nước của protein có nhiều ứng dụng trong cải thiện kết cấu trong thực phẩm [42]

Khả năng giữ dầu, tính chất chức năng quan trọng được sử dụng trong các sản phẩm thịt và bánh kẹo Sự có mặt của các amino acid có tính kị nước trong protein cao làm tăng khả năng liên kết với các chuỗi hydrocarbon đại diện cho sự tăng lên của khả năng giữ dầu [42]

1.4.3 Khả năng tạo gel

Khả năng tạo gel là một trong số những tính chất chức năng có tầm ảnh hưởng quan trọng trong thực phẩm đặc biệt là các sản phẩm dạng thạch, pudding và thịt Khả năng tạo gel phụ thuộc vào sự duỗi mạch của protein dẫn tới sự tăng các amino acid kị nước Sau đó các amino acid kị nước này sắp xếp lại và liên kết lại bởi các liên kết disulfua (S-S), liên kết hydro, liên kết kị nước, có thể có tương tác Van der Wall Nếu hàm lượng protein đủ cao thì một mạng không gian ba chiều sẽ được tạo thành Khả năng tạo gel của protein phụ thuộc nhiều vào khối lượng phân tử protein, pH, nhiệt độ và lực ion, tỉ lệ E/S và bản chất nguyên liệu [42]

1.4.4 Khả năng tạo nhũ và bền nhũ

Khả năng nhũ hoá được đánh giá dựa trên 2 tiêu chí là khả năng tạo nhũ (EAI) và khả năng bền nhũ (ESI) EAI đại diện cho lượng dầu có thể được nhũ hoá trên cho một đơn vị protein còn ESI đại diện cho độ bền của hệ nhũ tương đó trong thời gian nhất định

Tỉ lệ nhóm kị nước/ưa nước và khả năng duỗi gấp mạch của protein đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện hệ nhũ tương Sự hấp phụ của protein tại bề mặt liên

quan đến sự sắp xếp và tiếp xúc của các amino acid kị nước đến pha dầu còn amino ưa nước đến pha nước làm giảm sức căng bề mặt Tương tác giữa protein-protein ở bề mặt tạo nên màng nhớt đàn hồi mạnh có khả năng ngăn cản sự kết tụ [42]

1.5 Tình hình nghiên cứu phụ phẩm da cá thát lát

1.5.1 Tình hình nghiên cứu phụ phẩm da cá thát lát trong nước

Ở Việt Nam, nghiên cứu về phụ phẩm da của cá còn ít chủ yếu tập trung vào trích ly collagen, gelatin từ da cá Một nghiên cứu của Lê Thị Minh Thủy, Trương Thị Mộng Thu về nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp xử lý đến chất lượng và hiệu suất thu hồi collagen từ da cá thát lát cho thấy khi khử protein phi collagen và lipid trong NaOH 0,1M trong giờ và CH3COOH 0,5M trong 60 phút (loại được 13,9% protein phi collagen và 64,5% lipid) thì mẫu đc chiết rút với CH3COOH 0,5M trong 3 ngày ở 4 ± 10C và kết tủa collagen với NaCL 2,5M Sau đó kết tủa đc lọc và hoà tan lại trong CH3COOH 0,5M và thẩm tách trong CH3COOH 0,1M và nước cất Mẫu được sấy đông khô trong 48 giờ cho hiệu suất thu hồi là 13,8% với độ ẩm 11,7% có độ hoà tan cực đại ở pH = 2 và NaCl 0,2M cho thấy tiềm năng làm nguồn nguyên liệu sản xuất collagen của da cá thát lát [43]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu phụ phẩm da cá thát lát ngoài nước

Với đặc điểm là nguồn giàu collagen, gelatin của da cá, nghiên cứu về phụ phẩm da cá thát lát trên thế giới cũng tập trung vào việc trích ly collagen và tối ưu hoá quá trình này

Kittiphattanabawon và cộng sự (2015) đã trích ly và định danh 2 loại collagen có trong da cá thát lát là collagen tan trong acid (ASC) và collagen tan trong pepsin (PSC) chiếm 27,64 và 44,63 % (khô) với hiệu suất thu hồi collagen tổng là 82,08% [8] Để tối ưu hoá quá trình trích ly collagen từ da cá thát lát Karnjanapratum và cộng sự (2020) đã khảo sát ảnh hưởng của siêu âm tới quá trình trích ly với đầu dò phát sóng gián đoạn (20-80%) và thời gian từ 10-30 phút Với sự tăng về hiệu suất trích ly và không ảnh hưởng tới cấu trúc phân tử collagen nhóm tác giả đã chọn chế độ đầu dò phát sóng gián đoạn 80% trong thời gian là 10 phút [44]

Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học của collagen thuỷ phân từ da cá thát lác trên thế giới Chodnakarin và cộng sự (2018) đã khảo sát khả năng ức chế angiotensin I-converting enzyme (ACE) và khả năng chống oxy hoá của collagen thuỷ phân bằng 3 loại enzyme lần lượt là trypsin, pepsin, alcalase trong 0,2,4,6,8 giờ Kết quả cho thấy quá trình thuỷ phân sử dụng alcalase trong 8h cho khả năng ức chế ACE và khả năng chống oxy hoá DPPH và FRAP cao nhất [45]

1.6 Tình hình nghiên cứu DTP có tính chất chức năng

1.6.1 Tình hình nghiên cứu DTP protein có tính chất chức năng trên thế giới Theo Klompong và cộng sự (2007), khi đánh giá các tính chất chức năng của DTP từ thịt cá chỉ vàng xay nhuyễn với enzyme Alcalase 2.4 L và Flavourzyme 500L đã cho thấy hiệu quả của phương pháp thuỷ phân bởi 2 enzyme khi làm tăng độ tan lên 85% trong khoảng pH từ 2-12 Ngoài ra trong nghiên cứu này chỉ ra được mối tương quan giữa các tính chất chức năng khác như khả năng tạo nhũ, bền nhũ, tạo bọt, bền bọt với mức độ thuỷ phân (DH) của DTP từ thịt cá chỉ vàng, khi DH tăng thì các tính chất chức năng trên sẽ bị suy giảm

Cá mè lúi là một loại cá có nguồn gốc từ Indonesia vốn có giá trị kinh tế thấp hơn khi so với cá tra và cá rô phi Một trong số các hướng đi để tạo giá trị gia tăng cho cá mè lúi là tận dụng protein từ DTP của cá mè lúi Theo Junianto và cộng sự (2020), khi đánh giá các tính chất chức năng của DTP protein cá mè lúi bao gồm: khả năng giữ nước, khả năng giữ dầu, khả năng tạo nhũ và khả năng tan trong nước lần lượt là 3,1 ml/g, 1,94 ml/g, 23,60 % và 78,2 % [46]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu DTP protein có tính chất chức năng ở Việt Nam

Đạm cá phân lập (FPI) từ phụ phẩm chế biến cá tra Pangasius Hypophthalmus sử

dụng phương pháp thuỷ phân bằng enzyme bởi Alcalase 2,4 L được nghiên cứu tính chất tạo nhũ Kết quả thu được khả năng tạo nhũ cao nhất đạt 31,8% ứng với điều kiện thuỷ phân tối ưu như sau pH=7,4, tỉ lệ E/S 0,19% (w/v), nhiệt độ thuỷ phân 620C, thời gian thuỷ phân là 80 phút [47]

Phụ phẩm từ cá tra Pangasius Hypophthalmus sử dụng phương pháp thuỷ phân

bằng enzyme bởi Alcalase 2,4 L được tối ưu hoá điều kiện thuỷ phân để thu được đạm cá phân lập có khả năng tạo bọt Kết quả thu được ở điều kiện thuỷ phân tối ưu bao gồm

tỉ lệ S/W 1:2, tỉ lệ E/S 0,2% (w/v), nhiệt độ 640C, thời gian thuỷ phân 92 phút thu được khả năng tạo bọt tối đa là 94,92% [48]

1.7 Tiềm năng ứng dụng của DTP protein

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu và hoá chất

tin cụ thể của chế phẩm được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông tin về chế phẩm enzyme sử dụng

Flavourzyme® 500 MG

Nguồn thu nhận Aspergillus oryzae

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.3 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 2.3.1 Xử lý nguyên liệu

Da cá thát lát được rửa sạch với nước lạnh để loại bỏ các tạp chất và máu còn sót lại sau đó để ráo, cắt nhỏ, xay nhuyễn và trữ đông trong các túi polyamide (PA) tại – 20℃ cho đến khi phân tích

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.3 Quá trình thuỷ phân

Nguyên liệu da cá thát lát đã xay nhuyễn được rã đông trước khi tiến hành thủy phân protein

Quy trình chuẩn bị dịch thủy phân protein được tiến hành dựa theo phương pháp của Bhaskar và Mahendrakar (2008) [53] với một vài thay đổi Nước cất được thêm vào

với một tỉ lệ (S/W) nhất định Sau đó hỗn hợp được gia nhiệt ở 95℃ trong 15 phút để diệt enzyme nội Hỗn hợp sau diệt enzyme nội được làm nguội và chỉnh pH về giá trị mong muốn bằng các dung dịch NaOH 1M hoặc HCl 1M Tiếp theo enzyme được cho vào hỗn hợp với tỉ lệ E/S thích hợp và tiến hành thủy phân theo thời gian xác định

Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, ngừng phản ứng bằng cách đun hỗn hợp thu được ở 95℃ trong 15 phút để tiêu diệt enzyme Hỗn hợp sau đó được ly tâm để lắng cặn và tách béo Phần dịch thu được được lọc qua giấy lọc để loại bỏ các hạt huyền phù còn sót lại, sau đó được sử dụng để tiến hành thí nghiệm

2.3.4 Phương pháp xác định mức độ thuỷ phân

Nguyên tắc: Trong quá trình thuỷ phân protein cứ một liên kết peptide bị cắt đứt giải phóng một nhóm amino (-NH2) và 1 nhóm carboxyl Dựa vào lượng NaOH dùng để chuẩn độ lượng H+ được tạo thành khi cho Formol (HCHO) phản ứng với nhóm amino của acid amin theo phương pháp chuẩn độ formol xác định mức độ thuỷ phân của Noman và cộng sự (2018) [54]

Cách tiến hành được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thuỷ phân đến CaBC của DTP

Vo và cộng sự (2020) giải trình tự phân đoạn peptide có CaBC cao nhất (<1kDa) được thu nhận từ quá trình thuỷ phân con ruốc với Flavourzyme có CaBC cao nhất với chuỗi trình tự peptide YEIPAEDL [55]

Chen và cộng sự (2019) đã giải trình tự một trình tự phân đoạn peptide mới từ việc thuỷ phân cơ cá ngừ bằng hỗn hợp Papain và Flavourzyme với CaBC 76,8 ± 4,5 mg Ca2+/g protein được xác định là EPAH [56]

Lee và cộng sự (2009) khi giải trình tự của phân đoạn có khả năng liên kết canxi peptide của DTP từ huyết tương lợn bằng Flavourzyme đã thu nhận được chuỗi trình tự Val-Ser-Gly-Val-Glu-Asp-Val-Asn [57]

Từ những nghiên cứu trên kết quả nghiên cứu trên, ta có thể thấy trong mỗi phân đoạn peptide được giải trình tự trên đều có chứa Glutamic (E), Aspartic acid (D) những amino acid có khả năng liên kết với canxi qua nhóm carboxyl của chúng [24] Vì những kết quả và lí do trên nghiên cứu này sẽ sử dụng enzyme Flavourzyme để nghiên cứu CaBC cho phụ phẩm da cá Thát lát

Nhiệt độ hoạt động của Flavourzyme từ 40-600C với khoảng pH hoạt động trong khoảng 5 đến 7 Trong thí nghiệm này chúng tôi cố định điều kiện pH và nhiệt độ hoạt

động tối ưu của Flavourzyme lần lượt là 7 và 500C theo như Huang và cộng sự (2011) và Kang cùng cộng sự (2013) [58] [59]

2.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ S/W tới CaBC của DTP

Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu là DTP có CaBC cao nhất Mẫu DTP được thuỷ phân ở điều kiện cố định pH = 7, nhiệt độ 500C, thời gian thủy phân 4 giờ Trong thí nghiệm này, tỉ lệ S/W (w/v) dao động trong khoảng 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10

2.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ E/S tới CaBC của DTP

Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu là DTP có CaBC cao nhất Mẫu DTP được thủy phân ở pH = 7, nhiệt độ 500C, thời gian thủy phân 4 giờ cùng với tỉ lệ S/W có CaBC cao nhất được chọn ở mục 2.3.5.1 Trong thí nghiệm này, tỉ lệ E/S dao động trong khoảng 10, 20, 30, 40, 50 U/g protein

2.3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân tới CaBC của DTP Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu là DTP có CaBC cao nhất Mẫu DTP được thủy phân ở pH =7, nhiệt độ 500C, thời gian thủy phân 4 giờ cùng với tỉ lệ S/W và tỉ lệ E/S có CaBC cao nhất được chọn ở mục 2.3.5.1, 2.3.5.2 Trong thí nghiệm này, thời gian thuỷ phân dao động trong khoảng 2, 3, 4, 5, 6 giờ

2.3.6 Phương pháp lọc khử khoáng

Sau khi chuẩn bị dịch thủy phân, quá trình lọc khử khoáng sẽ được tiến hành để loại bỏ các ion kim loại nặng trong dịch như Ca2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, bằng phương pháp trao đổi ion - sử dụng hạt nhựa Amberlite® IRC-748

Quá trình khử khoáng gồm 3 bước: hoạt hóa hạt resin, khử khoáng và tái sinh hạt resin

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein hoà tan

Hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân da cá được xác định dựa theo phương pháp Lowry (1951) [60]

Về cơ bản, phản ứng bao gồm hai giai đoạn Giai đoạn đầu là phản ứng Biuret, khi các liên kết peptide phản ứng với ion Cu2+ trong môi trường kiềm tạo thành các Cu+ Sản phẩm sau đó phản ứng với thuốc thử Folin Ciocalteau ở giai đoạn tiếp theo Kết quả là phức có màu xanh đặc trưng được tạo thành, cường độ màu của dung dịch được ghi

lại đồng thời dựa trên đường chuẩn được xây dựng bởi albumin để xác định hàm lượng protein hòa tan

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.8 Phương pháp xác định CaBC

Phương pháp này dựa trên sự hình thành phức chất màu tím của ion canxi với cresolphthalein complexone (o-CPC) trong môi trường kiềm cho độ hấp thu cực đại ở bước sóng 570nm Thí nghiệm đánh giá CaBC được thực hiện theo phương pháp của Jung và cộng sự (2006) [37]

o-Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.9 Phương pháp lọc phân đoạn DTP và khảo sát hoạt tính từng phân đoạn DTP protein da cá được lọc phân đoạn bằng thiết bị ly tâm siêu lọc (Thermo–Fisher Scientific, Pall, Mỹ) với kích thước màng lọc 30 kDa, 10 kDa, 3 kDa và 1 kDa Các phân đoạn > 30 kDa, 10 – 30 kDa, 3 – 10 kDa, 1 – 3 kDa và <1 kDa, được xác định CaBC ở mục 2.3.8

2.3.10 Phương pháp đánh giá tính chất chức năng của DTP 2.3.10.1 Đánh giá độ tan của DTP

Bột DTP được pha loãng với nước cất và được điều chỉnh pH trong khoảng 3, 4, 5, 6, 7, 8 Sau đó khảo sát độ tan các mẫu xử lý pH này bằng phương pháp xác định độ tan theo Li và cộng sự (2012)

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.10.2 Đánh giá độ bền nhiệt của DTP

Bột DTP được pha loãng với nước cất và được điều chỉnh pH trong khoảng 3,4,5,6,7,8 Sau đó khảo sát độ bền nhiệt các mẫu xử lý pH này ở 2 mức nhiệt độ là 630C và 930C bằng phương pháp độ bền nhiệt theo Li và cộng sự (2012) [61]

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.10.3 Đánh giá khả năng tạo bọt và độ bền bọt của DTP

Mẫu DTP được điều chỉnh pH trong khoảng 3,4,5,6,7,8 Sau đó xác định khả năng tạo bọt và bền bọt theo phương pháp của Li và cộng sự (2012) [61]

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.10.4 Đánh giá khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của DTP

Mẫu DTP được điều chỉnh pH trong khoảng 3,4,5,6,7,8 Sau đó xác định khả năng tạo nhũ và bền nhũ theo phương pháp của Li và cộng sự (2012) [61]

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.10.5 Đánh giá khả năng giữ nước của DTP

Mẫu bột sấy đông khô được pha với nước cất và được xác định khả năng giữ nước theo phương pháp của Putra và cộng sự (2018) [62]

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.10.6 Đánh giá khả năng giữ dầu của DTP

Mẫu bột sấy đông khô được trộn với dầu thực vật và được xác định khả năng giữ dầu theo phương pháp của Putra và cộng sự (2018) [62]

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.11 Phương pháp đánh giá độ ổn định hoạt tính của DTP 2.3.11.1 Phương pháp đánh giá độ ổn định CaBC theo pH

Mẫu DTP được khảo sát độ ổn định CaBC sau khi đã được điều chỉnh pH từ 1 đến 11 theo phương pháp của Sripokar và cộng sự (2019) [63]

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.11.2 Phương pháp đánh giá độ ổn định CaBC theo nhiệt độ

Mẫu DTP được khảo sát độ ổn định CaBC sau khi đã xử lý ở 1000C từ 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 phút theo phương pháp của Sripokar và cộng sự (2019) [63]

Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày cụ thể trong PHỤ LỤC A

2.3.12 Phương pháp xử lý thống kê

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ít nhất 3 lần Tất cả dữ liệu được phân tích phương sai (ANOVA), ý nghĩa khác biệt và độ lệch chuẩn sử dụng phần mềm Statgraphics và Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Sự chênh lệch về hàm lượng protein (tính theo căn bản ướt) so với 2 mẫu da cá thát lát

ở Bảng 1.2 có thể giải thích bởi sự khác biệt về mặt địa lý, môi trường sinh sống và chế

độ nuôi cùng với các yếu tố khác như độ tuổi, giới tính cân nặng Tuy nhiên với hàm lượng protein 25,3% gần bằng da cá minh thái (25%) và da cá tuyết (24,5%) đã được tận dụng để thu nhận DTP có hoạt tính chống oxy hoá [64] [65] da cá thát lát có thể được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho DTP có hoạt tính sinh học

Ngoài ra, hàm lượng lipid thấp sẽ hạn chế được sự cản trở trong quá trình thủy phân và các chất béo có thể được loại bỏ dễ dàng quá trình ly tâm và lọc trong mục 2.3.3 Hàm lượng tro cũng không có những tác động quá lớn đến hoạt tính của sản phẩm vì sẽ được xử lý ở quá trình lọc khử khoáng

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thuỷ phân đến hoạt tính sinh học của DTP

3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ S/W

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ S/W đến CaBC của DTP protein da cá thát lát

CaBC của DTP protein da cá Thát lát tăng từ 7,33 ± 0,33 mg Ca2+/g protein đến 19,38 ± 0,40 mg Ca2+/g protein khi tỉ lệ S/W tăng từ 1:2 đến 1:7 (w/v) và đạt giá trị cao nhất tại tỉ lệ S/W 1:7 Ở giai đoạn đầu, khi tăng dung môi khi lượng dung môi tăng sẽ giúp tăng lượng protein và peptide hoà tan được trích ly ra Ở đây trong nghiên cứu tại tỉ lệ S/W tăng từ 1:7 đến 1:10 (w/v) CaBC giảm từ 19,38 ± 0,40 xuống 17,45 ± 0,91 mg Ca2+/g protein Tuy nhiên khi hàm lượng dung môi lên quá cao khiến dung dịch bị pha loãng dẫn tới sự tiếp xúc kém hiệu quả của enzyme và nguyên liệu làm hiệu quả của quá trình thuỷ phân giảm Kết quả của việc này là hàm lượng các protein, peptide với khối lượng phân tử lớn trong DTP cao dẫn tới CaBC thấp Xu hướng tương tự khi tỉ lệ S/W tăng dẫn tới xu hướng giảm hoạt tính được ghi nhận bởi Ogonda và cộng sự [66]

Tỉ lệ S/W phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất nguyên liệu và loại enzyme sử dụng Tỉ lệ S/W 1:8 (w/v) được chọn bởi Vo và cộng sự (2020) để thuỷ phân con ruốc [55] Tỉ lệ S/W 1:20 (w/v) được chọn bởi Huang và cộng sự (2015) trong thu nhận peptide có CaBC từ DTP whey protein [67]

Dựa vào kết quả thí nghiệm từ Hình 3.1 tỉ lệ S/W 1:7 (w/v) được lựa chọn để tiếp

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến CaBC của DTP protein da cá thát lát

CaBC của DTP protein da cá Thát lát tăng từ 15,78 ± 0,17 mg Ca2+/g protein đến 23,36 ± 0,34 17 mg Ca2+/g protein khi tỉ lệ E/S tăng từ 10 đến 40 U/g và đạt giá trị cao nhất tại 40U/g protein Lý giải cho sự tăng hoạt tính của DTP protein da cá thát lát này khi tỉ lệ S/W cố định việc tăng tỉ lệ E/S đồng nghĩa với tăng lượng enzyme tham gia vào quá trình thuỷ phân dẫn tới tốc độ phân cắt các liên kết peptide của protein giúp thu được nhiều peptide có CaBC hơn trong cùng 1 thời gian thuỷ phân xác định Tuy nhiên ở tốc độ thuỷ phân ổn định, khi tất cả cơ chất đã chuyển đổi thành sản phẩm thì việc tăng tỉ lệ E/S không làm tăng CaBC của DTP theo Kang và cộng sự 2018 [68] Khi tiếp tục tăng tỉ lệ E/S lên 50U/g thì hoạt tính canxi của DTP giảm xuống còn 19,46 ± 0,09 mg Ca2+/g protein Theo Chen và cộng sự (2014) [4] , khi tốc độ phản ứng thuỷ phân tăng nhanh do tăng tỉ lệ E/S lượng peptide mạch ngắn sinh ra nhiều hơn trong cùng 1 thời gian thuỷ phân xác định Những peptide mạch ngắn này lại tiếp tục bị cắt tạo thành các peptide với khối lượng phân tử nhỏ hơn và thành phần amino acid trong chuỗi trình tự peptide này bị thay đổi điều này làm CaBC của DTP bị giảm xuống Xu hướng tăng giảm tương tự cũng được ghi nhận bởi Vo và cộng sự khi CaBC tăng dần từ 10-60 U/g và đạt giá trị cao nhất là tại 60 U/g sau đó giảm dần trong khoảng 60-70 U/g [55]

Dựa vào kết quả thí nghiệm từ Hình 3.2 tỉ lệ E/S 40U/g được lựa chọn để tiếp tục

E/S ratio (U/g protein)

Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)…

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến CaBC của DTP protein da cá thát lát

Thời gian thuỷ phân cùng với tỉ lệ S/W và tỉ lệ E/S là một trong số những điều kiện thuỷ phân quan trọng quyết định hoạt tính của sản phẩm DTP sau cùng Quá trình thuỷ phân đảm bảo cho enzyme phản ứng nguyên liệu đủ lâu để tạo ra DTP có hoạt tính tốt nhất

CaBC của DTP protein da cá Thát lát tăng từ 12,61 ± 0,37 mg Ca2+/g protein đến 23,04 ± 0,34 mg Ca2+/g protein khi thời gian thuỷ phân tăng từ 2 đến 4 giờ Thuỷ phân protein trong thời gian dài sẽ phân cắt liên kết peptide tạo ra nhiều peptide có khả năng liên kết với canxi Theo Chen và cộng sự (2014) quá trình thuỷ phân kéo dài khiến các gốc ưa nước như –OH, –COOH và –NH2 có khả năng liên kết canxi lộ ra dẫn tới sự tăng này [69]

Khi thời gian thuỷ phân tăng từ 5 đến 6 giờ CaBC giảm xuống còn 18,47 ± 0,29 mg Ca2+/g protein Lí do cho việc này khi các peptide có khả năng liên kết canxi tiếp tục bị phân cắt thành các peptide có phân tử lượng nhỏ hơn và thành phần amino acid bị thay đổi dẫn đến CaBC của DTP bị giảm

Xu hướng tương tự được ghi nhận bởi Chen và cộng sự (2014) khi thuỷ phân vảy cá rô phi với 3 loại enzyme pepsin, trypsin, flavourzyme với thời gian tối ưu lần lượt là 4,5, 3,5 và 3 giờ [4] Thời gian thuỷ phân đạt được CaBC cao nhất tương tự với mẫu DTP và xu hướng giảm hoạt tính từ 48,26 ± 0,53 xuống 42,77 ± 0,82% tại 5 giờ cũng

Thời gian thuỷ phân (h)

Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

được ghi nhận bởi Li Wang và cộng sự (2018) khi thuỷ phân phôi lúa mì với enzyme Alcalase 2.4L [35]

Dựa vào kết quả thí nghiệm từ Hình 3.3 thời gian thuỷ phân 4 giờ với hoạt tính

liên canxi cao nhất 23,04 ± 0,34 mg Ca2+/g protein được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu Khả năng liên kết canxi của DTP ở điều kiện thuỷ phân tốt nhất (pH=7, nhiệt độ 500C, tỉ lệ S/W 1:7, tỉ lệ E/S 40U/g, thời gian thuỷ phân 4 giờ), được đánh giá thông qua việc so sánh hoạt tính với CPP và mẫu DTP không sử dụng enzyme

Hình 3.4 So sánh CaBC của DTP có enzyme và không enzyme

CaBC của DTP không enzyme là 1,07 ± 0.27 mg Ca2+/g protein thấp hơn 21,5 lần khi so với hoạt tính của DTP ở điều kiện thuỷ phân tốt nhất cho thấy hiệu quả của quá trình thuỷ phân enzyme nói chung và sử dụng enzyme Flavourzyme nói riêng

Tuy nhiên kết quả khi so sánh với CaBC của CPP 482,40 ± 3,67 mg Ca2+/g protein cho thấy CaBC của mẫu DTP ở điều kiện tốt nhất thấp hơn 20,93 lần

Ngoài ra khi so sánh với một số nghiên cứu về khả năng liên kết canxi của một số DTP protein khác thì hoạt tính của DTP protein da cá thát lát lần lượt thấp hơn 2,28 lần, 11,35 lần và 2,9 lần so với CaBC của DTP protein isolate cơ cá rô phi (65 mg Ca2+/g protein) theo Narin và cộng sự (2013), DTP protein từ ruốc (261.61 ± 3.89 mg Ca2+/g protein) theo Vo và cộng sự (2020), DTP protein từ đậu nành(66,9 mg Ca2+/g protein) của Bao và cộng sự (2007) [55] [70] [71]

0510152025

3.3 Kết quả đánh giá mức độ thuỷ phân DH

Mức độ thuỷ phân DH ở điều kiện thuỷ phân tốt nhất với tỉ lệ S/W 1:7, tỉ lệ E/S 40U/g và thời gian thuỷ phân 4 giờ là 1,39 ± 0,25% Mức độ thuỷ phân được định nghĩa bởi tỉ lệ của số lượng liên kết peptide bị phân cắt trên cho tổng liên kết peptide ban đầu của protein Theo Li và cộng sự (2013) mức độ thuỷ phân có thể ảnh hưởng tới một số tính chất chức năng của DTP [72]

3.4 Kết quả đánh giá thành phần amino acid và tính chất chức năng của DTP 3.4.1 Thành phần amino acid của DTP

Bảng 3.2 Thành phần amino acid của DTP protein da cá thát lát có CaBC cao nhất

Với hàm lượng Glu cao thứ 2 trong bảng thành phần cùng với hàm lượng Asp cao 114,44 mg/100ml vốn là hai amino acid đại diện cho khả năng liên kết canxi của peptide thông qua nhóm carboxyl (-COOH) khi có khả năng liên kết với với canxi thông qua việc nhường electron ở O-carboxyl của chúng Ngoài ra sự có mặt với hàm lượng >50mg/100ml của Lys là nguồn giàu electron cho liên kết canxi và các amino acid kị nước (Leu,Val, Alo, Pro) ngăn chặn sự tác động của phân tử nước làm ổn định liên kết Canxi.Thêm vào đó Thr và Ser với khả năng liên kết với canxi qua nhóm hydroxyl(-OH) cũng có mặt trong DTP với hàm lượng lần lượt là 52,78 và 68,60 mg/100ml Về mặt dinh dưỡng, DTP cá thát lát cung cấp 1 lượng lớn và đa dạng các amino acid đặc biệt là sự có mặt của 7/9 amino acid thiết yếu như His, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Val có thể cân nhắc hướng đi làm thực phẩm chức năng bổ sung dinh dưỡng

3.4.2 Tính chất chức năng của DTP 3.4.2.1 Độ tan của DTP

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của DTP protein da cá thát lát

Từ Hình 3.5 giá trị độ tan (%) thấp nhất tại pH=5 với 83,19 ± 2,61 % theo sau đó

là giá trị độ tan tại pH = 4 và pH = 6 lần lượt là 92,80 ± 1,87 và 91,62 ± 0,88 % Giải thích cho điều này vì khoảng pH từ 4 đến 6 là khoảng pH đẳng điện của hầu hết DTP protein [42] Tại pH đẳng điện protein trung hoà về điện tích nên lúc này lực đẩy tĩnh

da

điện giữa những phân tử peptide là nhỏ nhất dẫn đến xu hướng hình thành các tương tác giữa protein-protein khiến chúng kết tụ và kết tủa lại làm giảm độ tan của DTP [73]

Giá trị độ tan tăng khi ở ngoài điểm pH đẳng điện lúc này phân tử protein có khả năng tích điện âm hoặc dương dẫn tới lực đẩy tĩnh điện giữa các protein tăng và lúc này liên kết giữa nước-protein chiếm đa số dẫn đến sự tăng của độ tan [73] Giá trị độ tan (%) đạt giá trị cao nhất tại pH = 8 với 95.95 ± 1,36 %

Xử lý nhiệt là một quá trình công nghệ quan trọng trong thực phẩm có thể ảnh hưởng đến tính chất chức năng của thực phẩm [74] Hai chế độ nhiệt được khảo sát trong thí nghiệm là 630C trong 30 phút và 930C trong 30s được khảo sát trong thí nghiệm cho thấy giá trị độ tan vẫn giữ được trên 70% khi mà giá trị độ tan thấp nhất ở cả hai chế độ xử lý nhiệt là 70,2 ± 3,24% tại pH = 3 ở chế độ xử lý nhiệt 930C trong 30 giây Quá trình gia nhiệt làm giảm độ tan của protein do hiện tượng đông tụ và kết tủa nên xu hướng độ tan (%) của DTP giảm ghi nhận được là hợp lý

3.4.2.2 Khả năng tạo bọt và bền bọt của DTP

Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo bọt (FC) của DTP protein da cá thát lát

Từ kết quả trên Hình 3.6 ta có thể nhận thấy được sự khác biệt xu hướng giữa chất

chuẩn albumin và DTP Khả năng tạo bọt của DTP da cá thát lát đạt cực đại tại pH = 3 với FC (%) 26,83 ± 1,04 % thấp hơn 3,01 lần so với giá trị cực đại của albumin ở pH =

ab