Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu phương pháp định lượng bằng HPLC và quá trình trích ly inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm thượng hoàng (Phellinus SPP.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

LÊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC VÀ QUÁ TRÌNH TRÍCH LY INOSCAVIN A VÀ MESHIMAKOBNOL A TRONG NẤM THƯỢNG HOÀNG

(PHELLINUS SPP.)

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024

Cán bộ hướng dẫn khoa học : GS.TS Đống Thị Anh Đào Chữ kí:

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS Mai Huỳnh Cang Chữ kí:

Cán bộ chấm nhận xét 2 : PGS TS Nguyễn Thị Lan Phi Chữ kí:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 05 tháng 01 năm 2024

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 Chủ tịch: PGS.TS Kha Chấn Tuyền

2 Phản biện 1: PGS.TS Mai Huỳnh Cang 3 Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi 4 Ủy viên: GS.TS Đống Thị Anh Đào 5 Thư kí: PGS.TS Trần Thị Thu Trà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

- -

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Ngọc Anh MSHV: 2170491 Ngày, tháng, năm sinh: 02/04/1998 Nơi sinh: Đồng Tháp Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 8540101

TÊN ĐỀ TÀI:

Tên tiếng Việt: Nghiên cứu phương pháp định lượng bằng HPLC và quá trình trích ly

inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.)

Tên tiếng anh: Research on quantitative analysis by HPLC method and extraction of

Inoscavin A and Meshimakobnol A in Thuong hoang medical mushroom (Phellinus spp.)

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tổng quan về nguyên liệu nấm Thượng hoàng và 2 hoạt chất inoscavin A và meshimakobnol A

- Tổng quan phương pháp phân tích định tính và định lượng inoscavin A và meshimakobnol A bằng HPLC

- Nghiên cứu phát triển phương pháp định lượng đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A bằng HPLC, xác định thông số quá trình

- Thẩm định quá trình phân tích định lượng đã được nghiên cứu đối với inoscavin A và meshimakobnol A

- Ứng dụng phương pháp phân tích để định lượng đồng thời inoscavin A và meshimakobnol

A trong 8 loại nấm Thượng hoàng Phellinus và và 3 loại nấm Linh chi Garnoderma

- Nghiên cứu điều kiện trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm để đạt hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/12/2023 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS.TS Đống Thị Anh Đào

Tp.HCM, ngày tháng năm 2024

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến GS.TS Đống Thị Anh Đào, người cô đã hết sức tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu, tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại trường

Tiếp đến em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Ngọc Tuấn - Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, người thầy đã dìu dắt, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trên con đường nghiên cứu khoa học

Em xin gửi lời cám ơn đến Quý Thầy/Cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG HCM đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập tại trường

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cám ơn đến Quý Thầy/Cô, giảng viên phụ trách phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS Ngô Anh khoa Sinh học đại học Huế, PGS.TS Lê Xuân Thám nguyên giám đốc Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Lâm Đồng đã giúp em định danh các mẫu nấm.

Em cũng cám ơn Quý Thầy/Cô trong Hội đồng đã dành thời gian đọc, góp ý và đưa ra những lời nhận xét giúp em có thể hoàn chỉnh luận văn của mình

Trân trọng./

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01, năm 2024 Học viên thực hiện

Lê Ngọc Anh

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.) chứa nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe

con người Hiện nay, loại nấm này thường được sử dụng dưới dạng nguyên liệu thô

hoặc các chiết xuất có nguồn gốc từ nấm Phellinus Tuy nhiên, vấn đề về nguồn gốc,

phân tích thành phần và điều kiện trích ly nhằm thu được hàm lượng cao những chất có lợi từ nấm Thượng hoàng là yêu cầu cần thiết để ứng dụng nguồn nguyên liệu này Trong luận văn này, hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A thuộc phân lớp

styrylpyrone tách chiết và phân lập từ Phellinus được sử dụng làm chất chuẩn cho

phát triển và thẩm định quy trình phân tích định lượng đồng thời hai hợp chất Quá trình phân tích được thực hiện trên thiết bị HPLC-PDA Shimadzu 2030C 3D, cột VertiSep™ GES C18 (250 mm × 4,6 mm, 5,0 µm), nhiệt độ cột 30oC, bước sóng phân tích 395 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút, gradient nồng độ dung môi hỗn hợp methanol và nước chứa acid formic (pH = 2,2) Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đạt độ nhạy, độ chính xác và độ đúng cao phù hợp phân tích đối với nguyên liệu nấm Thượng hoàng Đồng thời, quy trình này được ứng dụng phân tích 11 loại nấm (8 loại

nấm thuộc chi Phellinus, 3 loại nấm thuộc chi Ganoderma)

Các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình trích ly có sự hỗ trợ sóng siêu âm bao gồm biên độ sóng, thời gian hỗ trợ, nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly cũng được khảo sát trong nghiên cứu nhằm đánh giá sự biến đổi của hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A thông qua các thí nghiệm đơn yếu tố với mục tiêu lựa chọn các điều kiện phù hợp để xây dựng quy trình trích ly hai hợp chất này với hàm lượng cao nhất Nghiên cứu chỉ rõ cả 5 yếu tố biên độ siêu âm, thời gian siêu âm, nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly Điều kiện thu nhận hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A đạt hàm lượng cao nhất là 9,577 và 37,910 mg/g tương ứng của các yêu tố nghiên cứu cụ thể như sau: biên độ sóng siêu âm 31,5 µm, thời gian siêu âm 5 phút, nồng độ dung môi ethanol 80%, nhiệt độ trích ly 40oC, thời gian trích ly 80 phút

ABSTRACT

Thuong hoang medicine mushroom (Phellinus spp.), has a lot of components

having many beneficial effects human health Recently, this medicine mushrooms are

usually used as raw materials or extracts origining Phellinus genus For application

this material in industry, the originating, analysing and extracting to obtain high components content is the necessary requirements

In this thesis, inoscavin A and meshimakobnol A belonging to styrylpyrone

class are isolation from Phellinus was used for development of RP HPLC-PDA

method for simultaneous quantitative analysis and valisation of inoscavin A and meshimakobnol A The analysis was conducted in HPLC Shimadzu 2030C 3D, VertiSep™ GES column C18 (250 mm × 4,6 mm; 5,0 µm), temperature 30oC, wavelength, 395 nm, flow rate 0,8 mL/min, gradients program elute solvent is the mixture of methanol and formic acid solutions (pH = 2,2) The validation showed that

this method had the efficiency, the truness well and suitable for Phellinus genus

Beside that, this method was used for analysing 11 medicine mushroom including 8

Phellinus genus and 3 Ganoderma genus

This study also investigates the technological factors affecting the assisted extraction process including amplitude, ultrasound-assisted time, solvent concentration, temperature and time extraction for evaluating the change of inoscavin A and meshimakobnol A through the single factor experiment to choose the factors suitable for extracting both of them This study show that the high contents of inoscavin A and meshimakobnol A is 9,577 and 37,910 mg/g, respectively found were: amplitude 31,5 µm, ultrasound - assisted time 5 minutes, solvent concentration 80%, extraction temperature 40oC and extraction time 80 minutes

ultrasound-LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Đống Thị Anh Đào Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào trước đây Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đều đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được nêu rõ nguồn gốc

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2024 Học viên thực hiện

Lê Ngọc Anh

DANH MỤC SƠ ĐỒ xii

DANH MỤC VIẾT TẮT xiii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

2.3.1 Giới thiệu phương pháp phân tích HPLC-PDA 16

2.3.2 Một số báo cáo về ứng dụng HPLC phân tích các hợp chất tự nhiên trong nấm 18

2.4 Lí thuyết cơ bản về quá trình trích ly 22

2.5 Siêu âm và ứng dụng vào hỗ trợ trích ly các hoạt chất có hoạt tính sinh học 24

2.5.1 Nguyên tắc sóng siêu âm 24

2.5.2 Tác động của sóng siêu âm năng lượng cao 25

2.5.2.1 Hiện tượng xâm thực tạo nên quá trình hình thành và phá vỡ bọt khí 26

2.5.2.2 Hiện tượng xâm thực làm phá vỡ bề mặt vật liệu hỗ trợ trích ly 26

2.6 Một số nghiên cứu về ứng dụng siêu âm trong quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ nấm 27

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 31

3.1 Nguyên liệu 31

3.1.1 Nguyên liệu nấm 31

3.1.1.1 Nguyên liệu nấm phân lập inoscavin A và meshimakobnol A 31

3.1.1.2 Nguyên liệu nấm quá trình phân tích và trích ly inoscavin A và meshimakobnol A 31

3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 31

3.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 32

3.2.1 Dung môi 32

3.2.2 Thiết bị 33

3.2.3 Dụng cụ 35

3.3 Phân lập và xác định chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A 35

3.3.1 Quy trình phân lập inoscavin A và meshimakobnol A 35

3.3.2 Xác định chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A 37

3.4 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng inoscvain A và meshimakobnol A 38

3.5 Định lượng đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A bằng phương pháp phân tích HPLC trên một số mẫu nấm Phellinus và Ganoderma 40

3.5.1 Phương pháp trích ly mẫu nấm Phellinus và Ganoderma 40

3.5.2 Phương pháp phân tích mẫu nấm Phellinus và Ganoderma 41

3.6 Khảo sát quá trình trích ly có sự hỗ trợ sóng siêu âm trên nấm Thượng hoàng (P.igniarius) 41

3.6.1 Sơ đồ trích ly thu nhận inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng

hoàng 41

3.6.2 Bố trí thí nghiệm trích ly nấm Thượng hoàng 43

3.5.2.1 Yếu tố biên độ siêu âm 44

3.5.2.2 Yếu tố thời gian hỗ trợ siêu âm 44

3.5.2.3 Yếu tố nồng độ dung môi 45

3.5.2.4 Yếu tố nhiệt độ 45

3.5.2.5 Yếu tố thời gian trích ly 46

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47

4.1 Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A 47

4.1.1 Xác định cấu trúc hợp chất inoscavin A 47

4.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất meshimakobnol A 49

4.1.3 Xác định độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A 50

4.2 Phát triển phương pháp định lượng inoscavin A và meshimakobnol A bằng HPLC 52

4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phân tách inoscavin A và mehsimakobnol A 52 4.2.2 Ảnh hưởng bước sóng đến phát triển phương pháp định lượng inoscavin A và meshimakobnol A 54

4.5 Ảnh hưởng các yếu tố công nghệ đến quá trình trích ly nấm Thượng hoàng 64

4.5.1 Kết quả khảo sát biên độ sóng ảnh hưởng đến hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A 64

4.5.2 Kết qua khảo sát thời gian hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng inoscavin A và

Phụ lục 3: Đường chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A 90

Phụ lục 4: Số liệu đo hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A trong các mẫu nấm 91

Phụ lục 5: Kết quả hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A quá trình khảo sát trích ly 93

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1: Phellinus sinh trưởng tự nhiên 4

Hình 2 2: Cấu trúc hóa học khung chất A) Steroid; B) Terpenoid (đơn vị isopren cấu trúc khung terpenoid) 7

Hình 2 3: Cấu trúc hóa học khung chất styrylpyrone 7

Hình 2 4: Quá trình sinh tổng hợp inoscavin A (1) từ hispidin (3) và hispolon (5) 10 Hình 2 5: Quá trình sinh tổng hợp meshimakobnol A (2) từ hispidin (3) và protocatechuic acid (9) 10

Hình 2 6: Cấu trúc hóa học của inoscavin A (1) 12

Hình 2 7: Cấu trúc hóa học của meshimakobnol A (2) 15

Hình 2 8: Sơ đồ hoạt động của detector PDA 17

Hình 2 9: Mô tả quá trình trích ly các phân tử hữu cơ nhỏ trong nguyên liệu 23

Hình 2 10: Biểu đồ mô tả hiệu quả quá trình trích ly 24

Hình 2 11: Hiệu ứng xâm thực của sóng siêu âm 26

Hình 2 12: Cơ chế của hiện tượng xâm thực tác động đến bề mặt nguyên liệu 27

Hình 2 13: Hiệu ứng xâm thực tạo nên hiện tượng vi dòng 27

Hình 3 1: Thiết bị siêu âm dạng thanh 33

Hình 3 2: Thiết bị siêu âm dạng bể 33

Hình 3 3: Thiết bị cô quay chân không 33

Hình 3 4: Thiết bị đông khô 34

Hình 3 5: Thiết bị HPLC và cột sử dụng phân tích sắc kí lỏng 34

Hình 3 6: Thiết bị sắc kí điều chế Agilent 1260 Infinity MWD VL (G1365D) 34

Hình 3 7: Thiết bị đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 35

Hình 4 1: Công thức hóa học của inoscavin A (1) 48

Hình 4 2: Cấu trúc hóa học của meshimakobnol A (2) 50

Hình 4 3: Sắc kí đồ thể hiện độ tinh khiết chất chuẩn (A) inoscavin A (B) meshimakobnol A 51

Hình 4 4: Sắc kí đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến peak inoscavin A và meshimakobnol A 30oC (xanh lá); 35oC (nâu); 40oC (xanh dương) 54

Hình 4 5: Sắc kí đồ ảnh hưởng bước sóng đến peak inoscavin A và

meshimakobnol A 250 nm (đen); 295 nm (xanh dương); 330 nm (xanh lá); 395 nm

(đỏ) 55

Hình 4 6: Sắc kí đồ thể hiện độ đặc hiệu của phương pháp phân tích A) mẫu trắng B) chất chuẩn 58

Hình 4 7: Sắc kí đồ thể hiện giá trị LOD của inoscavin A và meshimakobnol A 60

Hình 4 8: Sắc kí đồ thể hiện độ đúng của phương pháp phân tích 62

Hình 4 9: Ảnh hưởng biên độ siêu âm 64

Hình 4 10: Ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ siêu âm 66

Hình 4 11: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi 67

Hình 4 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ 69

Hình 4 13: Ảnh hưởng của thời gian trích ly 70

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể P igniarius và P linteus 5

Bảng 2 2: Thành phần khoáng chất trong quả thể nấm P igniarius và P.linteus 5

Bảng 2 3: Một số báo cáo về ứng dụng HPLC trong phân tích hợp chất tự nhiên từ nấm 18

Bảng 2 4: Ứng dụng siêu âm trong trích ly các hợp chất tự nhiên từ nấm 28

Bảng 3 1: Dung môi sử dụng cho nghiên cứu 32

Bảng 3 2: Các yếu tố khảo sát quá trình trích ly 43

Bảng 3 3: Khảo sát sự ảnh hưởng biên độ siêu âm 44

Bảng 3 4: Khảo sát sự ảnh hưởng thời gian hỗ trợ siêu âm 44

Bảng 3 5: Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ dung môi 45

Bảng 3 6: Khảo sát sự ảnh hưởng nhiệt độ trích ly 46

Bảng 3 7: Khảo sát sự ảnh hưởng thời gian trích ly 46

Bảng 4 1: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của inoscavin A và so sánh với công bố [43] 47

Bảng 4 2: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của meshimakobnol A và so sánh với công bố số [35] 49

Bảng 4 3: Dữ liệu xác định độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A 52

Bảng 4 4: Độ bất đối (Asys) của peak inoscavin A và meshimakonol A 53

Bảng 4 5: Dữ liệu xác định bước sóng cho inoscavin A và meshimakobnol A 55

Bảng 4 6: Điều kiện HPLC phân tích đồng thời inoscavin A và mehsimakobnol A 56

Bảng 4 7: Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 57

Bảng 4 8: Kết quả xác định giá trị LOD của inoscavin A và meshimakobnol A 59

Bảng 4 9: Kết quả xác định độ chính xác của inoscavin A và meshimakobnol A 60 Bảng 4 10: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp phân tích 61

Bảng 4 11: Kết quà hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A ở các mẫu nấm 62

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3 1: Sơ đồ tách chiết và tinh sạch thu được chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A 36 Sơ đồ 3 2: Sơ đồ trích ly thu nhận bột nấm chứa inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng hoàng 42

DANH MỤC VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà khoa học Phân tích Hoa Kỳ

GCMS Gas chromatography – mass spectrometry

Sắc kí khí ghép khối phổ

HPLC High performance liquid chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

HRFAB - MS High resolution fast atom bombardment mass spectrum

Khối phổ bắn phá nguyên tử nhanh có độ phân giải cao HSCCC High - speed countercurrent

chromatography

Sắc kí ngược dòng tốc độ cao

ICH International Council for Harmonisation of Technical Requirements for

Pharmaceuticals for Human Use

Hội đồng quốc tế về hài hòa các thủ tục đăng kí dược phẩm sử dụng cho con người

IR Infrared radiation Bức xạ hồng ngoại LC Liquid chromatography Sắc kí lỏng

LCMS Liquid chromatography -mass spectrometry

Sắc kí lỏng ghép khối phổ

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit if quantity Giới hạn định lượng

NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PDA Photo diode array Dãy diode quang

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TLC Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng

UPLC Ultra-performance liquid chromatography

Sắc kí lỏng siêu cao áp

UV/Vis Ultraviolet - Visible Tia tử ngoại - Khả kiến

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

Theo Technavio Medicinal Mushrooms Market quy mô thị trường nấm ăn dự kiến đạt 72,5 tỷ USD vào 2027, trong đó thị trường nấm dược liệu ước tính tăng đến 13,88 tỷ USD vào 2022, tốc độ tăng trưởng đạt 9,54% vào năm 2023 [1] cho thấy thị trường nấm nói chung và nấm dược liệu nói riêng có quy mô lớn và mức tăng trưởng cao Số liệu này cho thấy con người ngày càng quan tâm hơn đến vấn đề sức khỏe, tìm kiếm những sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên như một biện pháp hỗ trợ hoặc thay thế trong chế độ dinh dưỡng hàng ngày Từ đó, một thách thức đặt ra đối với ngành thực phẩm là tìm kiếm giải pháp giúp nâng cao sức khỏe có nguồn gốc thiên

nhiên Trong đó, nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.) thuộc họ Hymenochaetaceae là

loài nấm gỗ, mọc kí sinh trên các cây thân gỗ như Dâu tằm, Dương, Liễu, Bạch dương,… thường xuất hiện trong các cánh rừng nguyên sinh nhiệt đới, cận nhiệt đới và được biết đến như một loại nấm dược liệu có tác dụng tăng cường sức khỏe do chứa nhiều hoạt chất thuộc các nhóm polysaccharide, terpenoid, steroid, polyphenol có tác dụng kháng oxi hóa, kháng viêm Bên cạnh Linh chi, nấm Thượng hoàng được biết đến là một loại dược liệu quý, được sử dụng phổ biến tại Hàn Quốc, Nhật Bản Các công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở mức độ in vivo, in vitro đối với loại nguyên liệu này bước đầu chỉ rõ các tác dụng tích cực đối với con người Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện các sản phẩm thực phẩm chức năng từ chiết

xuất nấm Phellinus, sự đa dạng các sản phẩm đã đặt ra nhiều thách thức cho việc xác

định nguồn gốc, chất lượng nhằm bảo vệ người tiêu dùng Vì vậy, đề tài đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu chính bao gồm:

- Thiết lập phương pháp định lượng đồng thời hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A

- Nghiên cứu điều kiện trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm để đạt hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất

Đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng bằng HPLC và quá trình trích ly

inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.)” thực

hiện hai nội dung chính bao gồm:

- Tách chiết, tinh sạch inoscavin A và meshimakobnol A, sử dụng như chất chuẩn để phát triển quy trình phân tích đồng thời hai hợp chất này trên thiết bị HPLC nhằm xác định hàm lượng trong nguyên liệu

- Nghiên cứu về phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm nhằm thu nhận các hoạt chất có lợi từ nấm Thượng hoàng làm tiền đề cho các ứng dụng nguyên liệu tự nhiên có hoạt tính sinh học cao vào các sản phẩm thực phẩm

Phương pháp phân tích đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A có thể cung cấp cơ sở khoa học nhằm đánh giá chất lượng nấm Thượng hoàng và các sản phẩm

có nguồn gốc từ nấm thuộc chi Phellinus Đồng thời, kết quả nghiên cứu trích ly có

hỗ trợ sóng siêu âm hai hợp chất trên còn là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng

nguồn nguyên liệu quý vào thực phẩm, tăng giá trị kinh tế cho nấm Thượng hoàng

Vị trí và phân loại nấm học [4]:

Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomycete Bộ: Hymenochaetales Họ: Hymenochaetaceae Chi: Phellinus

A B

Hình 2 1: Phellinus sinh trưởng tự nhiên [5]

A, B Quả thể non sinh trưởng tự nhiên C Quả thể trên 10 năm

D Quả thể già

Quả thể Phellinus thường có dạng quạt, thân gỗ cứng, mặt trên có màu vàng

đến nâu đậm, mặt dưới có thể có lông mịn, màu nhạt, sống lâu năm, qua thời gian dài các sợi nấm tạo thành lớp mới chồng lên lớp cũ, các lớp này sẽ trở nên cứng và khô

tạo thành quả thể cho nấm Phellinus Phellinus thường mọc ở vùng rừng sâu, núi, các

khu rừng nguyên sinh, có thể chịu được các yếu tố khắc nghiệt như mưa kéo dài hay hạn hán cao, các khu rừng nguyên sinh Loài nấm này thường mọc trên các cây họ Liễu, Dương, Bạch dương và Dâu tằm [6, 7]

2.1.2 Thành phần hóa học

2.1.2.1 Thành phần các hợp chất sơ cấp

Các nghiên cứu về thành phần trong nấm cũng chỉ ra rằng các loài nấm thuộc

chi Phellinus có giá trị dinh dưỡng, đóng góp thông qua các thành phần chủ yếu bao

gồm protein, acid amin, chất béo và một số khoáng chất Kết quả thành phần dinh dưỡng được trình bày ở bảng 2.1, 2.2 dưới đây:

Bảng 2 1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể P igniarius và P linteus

Bảng 2 2: Thành phần khoáng chất trong quả thể nấm P igniarius và P.linteus

khảo Dịch chiết

ethanol

Dịch chiết nước

Các hợp chất thứ cấp trong nấm Phellinus bao gồm nhiều nhóm khác nhau

thuộc polysaccharide, steroid, terpenoid, polyphenol

Nhóm polysaccharide cấu tạo từ nhiều đơn phân bao gồm arabinose (Ara), fructose (Fru), fucose (Fuc), galactose (Gal), galacturonic acid (GalA), glucose (Glc), glucuronic acid (GlcA), mannose (Man), rhamnose (Rha), ribose (Rib) và xylose (Xyl) khối lượng phân tử từ 1,00 × 103 đến 1,00 × 107 kDa, liên kết α-(1 → 4), α-(1 → 3) và α-(1 → 6) phụ thuộc vào loài khác nhau, có tác dụng hạ đường huyết, chống tiểu đường, kháng viêm, kháng khối u [10, 11]

Nhiều hợp chất steroid, terpenoid được phân lập từ Phellinus có tiềm năng

trong kháng viêm, hỗ trợ điều trị ung thư, viêm khớp dạng thấp, tiểu đường, thoái hóa thần kinh, chống trầm cảm [12-14] Trong đó, steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc khung chính từ 4 vòng cycloalkane xuất hiện ở nấm, thực vật bậc cao và trong cơ thể người Sterois có nguồn gốc từ Acetyl-CoA, được tổng hợp thông qua con đường Mevalonate, sản phẩm là dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) và isopentenyl pyrophosphate (IPP) phụ thuộc vào con đường chuyển hóa của từng loài Sau đó, qua quá trình chuyển hóa tạo thành steroid [15, 16] Terpenoid có cấu trúc khung cơ bản là khung 5 cacbon, hay 1 đơn vị isopren, thông qua các phản ứng đóng vòng, sắp xếp lại khung cacbon tạo thành các phân lớp terpenoid như monoterpenoid (C10), sesquiterpenoid (C15), diterpenoid (C20), sesterpenoid (C25), triterpenoid (C30) Tương tự steroid, terpenoid có nguồn gốc từ Acetyl-CoA thông qua con đường Mevalonate hoặc Pyruvate thông qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) tạo thành DMAPP và IPP sau đó chuyển hóa thành các hợp chất terpenoid [13, 14, 17]

Phellinus và Inonotus [18]

Hình 2 3: Cấu trúc hóa học khung chất styrylpyrone

Styrylpyrone là một phân lớp chất thuộc nhóm polyphenol thường xuất hiện ở

các loài nấm dược liệu, đặc biệt là Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae, có màu

vàng đặc trưng (từ vàng nhạt đến vàng cam phụ thuộc vào từng hợp chất hóa học riêng biệt) [2, 19] Ở thực vật và nấm, các hợp chất styrylpyrone là lớp chất thứ cấp có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ, chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn từ các vết thương xuất hiện trên thân hoặc quả thể [18] Ở người, stylpyrone là nhóm chất có hoạt tính sinh học cao có khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng virus, kháng ung thư, ức chế tiểu đường và an thần [2, 18, 19] Styrylpyrone được tổng hợp (thông qua con đường Shikimic) từ các tiền chất tương tự như quá trình tổng hợp chalcone (phổ biến ở các thực vật bậc cao) nhưng chỉ xảy ra hai phản ứng ngưng tụ và đóng vòng tạo thành khung styrylpyrone [19, 20] Trong đó, đơn vị styryl- có nguồn gốc từ phenylalanine thông qua con đường cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeoyl-CoA; cấu trúc vòng pyrone- có nguồn gốc từ acetate [21] Dựa vào cấu trúc hóa học,

các styrylpyrone có thể được phân thành styrylpyrone đơn giản (có cấu tạo từ 1 đơn vị styryl- và 1 vòng pyrone-), styrylpyrone phức tạp (có cấu tạo từ 2 hoặc nhiều đơn vị styryl- và vòng pyrone- trở lên) Theo báo cáo của In-Kyoung Lee, nấm sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên có thể xuất hiện nhiều styrylpyrone phức tạp do sự kết hợp

của styrylpyrone đơn giản với hispolon (5) hoặc 3,4-dihydroxyphenylpropanoids;

trong khi đó, nấm nuôi trồng thường xuất hiện styrylpyrone đơn giản và các polymer của chúng [18, 21]

Hispidin (3), bisnoryangonin (4) là hai hợp chất điển hình, có cấu tạo hóa học

đơn giản thuộc styrylpyrone Hispidin, có tên khác là hydroxy-2-pyrone, định danh lần đầu bởi Edwards vào 1961 và Bu’Lock năm 1962 [22] Đến 1977, Gonindard công bố hispidin có khả năng ức chế protein kinase C, kể từ đó, hợp chất này được thương mại hóa trên thị trường và sử dụng cho các thử

6-(3′,4′-dihydroxystyryl)-4-nghiệm ức chế protein kinase C [23] Trong khi hispidin (3) được tìm thấy ở bộ nấm

Aphyllophorales, bisnoryangonin (4) lại được tìm thấy chủ yếu ở bộ Agaricales và

chỉ xuất hiện dạng vết thuộc chi Phellinus, Inonotus [18]

(5)

3,14'-bihispidinyl (6), một dipyrone sinh ra từ quá trình dimer hóa 2 hispidin

được phân lập lần đầu tiên bởi Klaar năm 1977, xuất hiện trong I hispidus, P

igniarius, P tuberculosus, có khả năng tiêu diệt giun tròn Caenorhabditis elegans

với LD50 ≤ 25 µg/mL, kháng oxi hóa bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH, ABTS với IC50 lần lượt là 0,9 và 0,55 μmol/L [24-26] Hypholomine B (7) được phân

lập lần dầu tiên bởi Fiasson vào năm 1977 [27] Có nhiều nghiên cứu báo cáo hoạt tính sinh học của hypholomine B như khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH, ABTS với IC50 lần lượt là 0,31; 0,34 μmol/L; khả năng kháng virus thông qua khả năng ức chế neuraminidase trên bề mặt virus với IC50 = 0,03 μM và khả năng ức chế 3CL protease, được đánh giá có tiềm năng trong việc chống lại SARS-CoV-2 [25, 28, 29]

Theo báo cáo của Lee (2007), inoscavin A (1), một styrylpyrone được phân

lập lần đầu tiên vào 1999 xuất hiện ở chi Phellinus và Inonotus, có nguồn gốc từ quá

trình ngưng tụ hispidin (3) và hispolon (5) với sản phẩm trung gian là interfungins A (8), được đánh giá có nhiều hoạt tính sinh học liên quan đến kháng oxi hóa, kháng

viêm, chống lại hoạt động xâm nhập của virus vào cơ thể con người [30-33]

Hình 2 4: Quá trình sinh tổng hợp inoscavin A (1) từ hispidin (3) và hispolon (5) Theo báo cáo của Lee (2006), meshimakobnol A (2) hay phelligridin D, được

phân lập từ Inonotus xeranticus, định danh lần đầu tiên năm 2004 trên loài Phellinus

igniarius có nguồn gốc từ tiền chất hispidin (3) kết hợp với 3,4-dihydroxybenzoic

acid hay protocatechuic acid (9), được đánh giá có nhiều hoạt động sinh học liên quan

đến loại bỏ gốc tự do, kháng tế bào ung thư [34-37]

Hình 2 5: Quá trình sinh tổng hợp meshimakobnol A (2) từ hispidin (3) và protocatechuic acid (9)

(10)

(11)

(12)

Ngoài ra, một số styrylpyrone phức tạp khác được phát hiện ở nhiều loài khác

nhau thuộc chi Phellinus như phelligridimer A (10) cho thấy hoạt động ức chế quá

trình oxi hóa lipid ở gan chuột với IC50 = 10,2 μM, hoạt động kháng tế bào ung thư dòng A 2780, HCT-8, Bel-7402, MCF-7, A549 với IC50 lớn hơn 50 μM [38];

squarrosidine (11) , pinillidine (12) cho thấy hoạt động ức chế enzyme xanthine

oxidase liên quan đến quá trình tổng hợp acid uric với IC50 lần lượt là 8,1 và 5,8 μM [39]

2.2 Hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A

Inoscanvin A (1), meshimakobnol A (2) là hai hợp chất thuộc lớp chất

styrylpyrone của polyphenol [2] Có một số nghiên cứu trước đây tiến hành trích ly, tinh sạch thành công inoscavin A [31, 32, 40, 41] và meshimakobnol A [35, 42] nhằm xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của 2 hợp chất này

2.2.1 Inoscavin A

Năm 1999, inoscavin A (1), một dẫn xuất của hispidin lần đầu tiên được phát

hiện bởi Kim và cộng sự trong quá trình sàng lọc các hợp chất có khả năng loại bỏ

gốc tự do từ Inonotus xeranticus Inoscavin A được thu nhận bằng cách trích ly

nguyên liệu trong dung môi methanol, xuất hiện ở phân đoạn ethyl acetate, sắc ký cột Sephadex LH-20 và ODS, methanol 67% liên tiếp, sắc kí lỏng HPLC pha đảo, rửa giải với MeOH 60%, có bước sóng hấp thu cực đại ở 389 nm [31]

2.2.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lí

Hình 2 6: Cấu trúc hóa học của inoscavin A (1)

Inoscavin A (1) được tinh sạch từ nấm Phellinus ở dạng bột, màu vàng rơm,

điểm nóng chảy 268-269oC, gốc quay cực [𝛼]D = + 0,6 (MeOH) [41, 43], có công thức hóa học chung là C25H18O9, phổ khối lượng HRFAB-MS của inoscavin A cho thấy peak ion m/z 463,1045 [M+H]+, phổ tử ngoại UV có bước sóng hấp thụ cực đại 𝜆max ở 389 nm, phổ hồng ngoại IR cho thấy tín hiệu hấp thụ cực đại ở 3430 cm-1 đặc trưng của nhóm hydroxyl, 1700 cm-1 đặc trưng của nhóm C=O trong cacbonyl Phổ

1H-NMR có 2 hệ thống ABX (6,59; 6,75; 6,71 ppm và 7,00; 6,79; 7,08 ppm) gắn trên nhân thơm, 2 olefinic liên hợp ở 6,72 và 7,44 ppm với hằng số ghép J = 15,9Hz Phổ

13C-NMR có 25 tín hiệu cacbon bao gồm 203,1 và 160,6 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl; 167,0; 176,8; 192,9 ppm đặc trưng cho cacbon oxygenated lai hóa sp2; 146,3, 147,0; 147,8; 149,5 ppm đặc trưng cho nhóm hydroxyl gắn trên vòng thơm

[31]

2.2.1.2 Hoạt tính sinh học

Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (1999), ngoài xác định cấu trúc hóa học

lần đầu tiên được tìm thấy ở loài Inonotus xeranticus, các tác giả còn tiến hành đánh

giá hoạt tính kháng oxi hóa của inoscavin A Kết quả cho thấy inoscavin A có khả năng ức chế quá trình peroxide lipid ở gan chuột IC50 = 0,3 µg/mL cao hơn so với đối

chứng Vitamin E với IC50 = 1,5 µg/mL, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH cao với IC50 = 0,1 µg/mL [31]

Trong nghiên cứu của Seung Woong Lee và cộng sự (2014) tiến hành sàng lọc khả năng ức chế lipoxygenase của 335 mẫu nấm khác nhau cho thấy một số loài thuộc

chi Phellinus thể hiện khả năng ức chế lipoxygenase, một tác nhân của quá tình sinh tổng hợp gây ra phản ứng viêm mạnh hơn so với các loài nấm khác bao gồm P gilvus,

P linteus, P baumii lần lượt 66,7%, 59,5%, 100% ở nồng độ 100 µg/ml Nghiên cứu

tiến hành phân lập inoscavin A từ cao methanol của P baumii, sau đó đánh giá khả năng ức chế lipoxygenase Kết quả cho thấy inoscavin A từ P.baumii có khả năng ức

chế lipoxygenase với IC50 = 6,8 µM [32]

Năm 2020, Kai Yang và cộng sự nghiên cứu tác động chiết xuất quả thể nấm

P.baumii đến bệnh đái tháo đường Quả thể nấm được trích ly bằng ethanol 80%, sau

đó tiến hành sắc kí phân đoạn liên tiếp các hợp chất trong nguyên liệu bằng dung môi petroleum ether, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) và cuối cùng là nước Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đoạn EtOAc có hoạt tính ức chế α-glucosidase với IC50 = 49,05 µg/ml, mạnh hơn so với đối chứng acarbose (IC50 = 645,73 µg/ml) Ngoài ra, phân đoạn EtOAc cũng thể hiện khả năng làm tăng mức tiêu thụ insulin ở khoảng nồng độ 25 - 100 µg/ml, thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa thông qua phương

pháp loại bỏ gốc tự do DPPH, ABTS, hydroxyl Bên cạnh đó, chiết xuất P.baumii

được chứng minh có sự xuất hiện của hispidin, davallialactone, dihydroxy-8-methyl-2-oxo-2H-chromen-3-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione,

2,5-bis(4,7-hypholomin B và inoscavin A [44]

Trong nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống lại bệnh gout trên mô hình chuột tăng uric acid của Hongxing Li và cộng sự (2021) cho thấy dịch chiết thô từ nấm

Phellinus tự nhiên và nuôi trồng đều có khả năng làm giảm uric acid thông qua ức

chế hoạt động của xanthine oxidase (XO), đồng thời kháng viêm thông qua điều chỉnh nồng độ ICAM- 1, IL-1β và IL-6, làm giảm các biểu hiện viêm cấp tính trên mô hình chuột tăng uric acid Báo cáo chỉ ra rằng, hoạt động giảm uric acid trong máu của chuột có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp alanine, leucine and isoleucine và histidine đối với nấm tự nhiên, quá trình chuyến hóa nicotin, nicotinamide và beta-

alanine đối với nấm nuôi trồng Nghiên cứu xác định được sự hiện diện của phelligridimer A, hypholomine B, inoscavin A, hispidin, phelligridin I trong dịch

chiết thô từ nấm Phellinus [45]

Năm 2022, Ping Qiu và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của inoscavin A đến ung thư trực tràng thông qua tín hiệu của con đường hedgehog (Hh) Inoscavin A thu nhận từ quá trình ngâm, chiết lỏng-lỏng, làm giàu bằng hệ thống sắc kí phân bố ngược dòng (HSCCC), tinh chế bằng sắc kí điều chế, xác định cấu trúc bằng sắc kí lỏng (LC), khối phổ (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Sau đó, inoscavin A được thử nghiệm trên mô hình chuột bị ung thư trực tràng HT-29 Kết quả nghiên cứu cho thấy inoscavin A biểu hiện khả năng chống tế bào ung thư trực tràng HT-29 thông qua con đường Hh nhờ việc kết hợp của inoscavin A với thụ thể Smo, ngăn chặn quá trình tăng sinh, gây chết tế bào [46]

Một nghiên cứu năm 2023 của Md Abu Sayem Khan và cộng sự sử dụng phương pháp Molecular docking để mô phỏng và sàng lọc các chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ nấm dược liệu có khả năng kháng virus SARS-CoV-2 Báo cáo chỉ ra rằng inoscavin A có tiềm năng trong việc ức chế TMPRSS2 (Transmembrane protease serine 2), một loại proteinase có vai trò giúp virus xâm nhập vào cơ thể vật chủ, đồng thời ngăn cản quá trình nhân đôi của loại virus này [33]

2.2.2 Meshimakobnol A

Một dẫn xuất mới của pyrano[4,3-c][2]benzopyran-1,6-dione lần đầu tiên

được phát hiện bởi Shunyan Mo (2004) và cộng sự trong loài Phellinus igniarius tại

Trung Quốc đặt tên là phelligridin D Năm 2004, Akito Nagatsu và cộng sự nghiên cứu sự khác nhau trong thành phần hóa học giữa quả thể nấm tự nhiên và nấm nuôi

trồng thuộc loài Phellinus linteus tại Nhật Bản, nhóm tác giả phát hiện sự khác biệt

thông qua phân tích HPLC so sánh sợi nấm, quả thể nấm nuôi cấy và quả thể nấm tự

nhiên phát hiện ra một hợp chất mới đặt tên là meshimakobnol A (2) có cấu trúc tương

tự phelligridin D [35, 42]

2.2.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lí

Hình 2 7: Cấu trúc hóa học của meshimakobnol A (2)

Meshimakobnol A (2) được trích ly, tinh sạch từ nấm Phellinus ở dạng bột,

màu vàng cam, điểm nóng chảy lớn hơn 300oC, có công thức hóa học chung là C20H12O8 Phổ khối lượng EIMS của meshimakobnol A cho thấy peak ion m/z 380 [M]+ Phổ tử ngoại UV có bước sóng hấp thu cực đại 𝜆max ở 417 và 255 nm Phổ hồng ngoại IR cho thấy tín hiệu hấp thu cực đại ở 3288 và 3091 cm-1 đặc trưng cho nhóm hydroxyl; 1668 cm-1 đặc trưng cho nhóm cacbonyl; 1604, 1549, 1514 cm-1 đặc trưng cho vòng thơm Phổ 1H-NMR có 1 hệ thống ABX (6,70; 6,99; 7,07 ppm), 2 trans-olefinic liên hợp ở 6,83 và 7,65 ppm với hằng số ghép J = 15,8 Hz Phổ 13C-NMR có 20 tín hiệu cacbon [35, 42]

2.2.2.2 Hoạt tính sinh học

Trong nghiên cứu của Mo và cộng sự (2004), ngoài xác định cấu trúc hóa học

của meshimakobnol A được tìm thấy ở loài Phellinus igniaius, các tác giả còn tiến

hành đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của meshimakobnol A Kết quả cho thấy meshimakobnol A có khả năng kháng tế bào ung thư A549, MCF7, Bel7402, Ketr3, HCT-8 với IC50 lần lượt là 0,016; 0,037; 0,008; 0,090; 0,099 µM [35]

Năm 2008, Jeong và cộng sự tiến hành tách và xác định hoạt tính loại bỏ gốc peroxynitrite (ONOO-) của các chất được tách ra từ phân đoạn ethyl acetate (EtOAc)

của nấm P linteus Kết quả báo cáo cho thấy phân đoạn EtOAc có khả năng loại bỏ

gốc ONOO- cao IC50 = 8,64 ± 0,05 µg/mL Meshimakobnol A là một trong 17 chất được tách và xác định công thức từ phân đoạn EtOAc có hoạt tính loại bỏ gốc ONOO-

với IC50 = 2,06 ± 0,1 µg/mL [36]

Nghiên cứu của Jung-Ran Noh và công sự (2011) tiến hành chiết tách và phân

đoạn cao EtOAc từ P baumii nhằm xác định khả năng chống xơ vữa động mạch trên chuột Quả thể nấm P baumii được trích ly bằng phương pháp ngâm chiết với ethanol,

sau đó tiến hành phân đoạn bằng các dung môi nước, hexan và cuối cùng là ethyl acetate Phân đoạn EtOAc được sấy khô và tiến hành các thí nghiệm in vivo trên chuột Kết quả cho thấy, nhóm chuột được cho cho ăn và điều trị bằng quả thể nấm

P baumii giảm tổn thương mạch máu, chống xơ vữa động mạch do liên quan đến sự

biểu hiện của các phân tử liên kết tế bào mạch máu (VCAM)-1, phân tử liên kết giữa các tế bào (ICAM)-1, TNF-, IL-6, IL-1 và cytokine Dựa trên các nhiên cứu trước ở cấp độ phân tử, nhóm tác giả đánh giá khả năng chống xơ vữa động mạch của phân đoạn EtOAc có liên quan đến các chất được tách ra từ phân đoạn này bao gồm: interfungin A, baumin, davallialactone, hispidin, hypholomine B, inoscavin A, phelligridin D [47]

Ohyoshi và cộng sự (2019) thiết lập con đường tổng hợp cho phelligidin A, C, D, đồng thời tiến hành đánh giá khả năng kháng tế bào ung thư cổ tử cung ở người Hela S3 Kết quả cho thấy phelligridin D có khả năng kháng dòng tế bào ung thư Hela S3 với giá trị IC50 = 2,1 µM [37]

Qua tổng quan về thành phần các hoạt chất thứ cấp xuất hiện cho thấy nấm Thượng hoàng chứa nhiều các hoạt chất có lợi cho sức khỏe con người, trong đó

styrylpyrone là lớp chất xuất hiện phổ biến trong nguyên liệu nấm Phellinus

Inoscavin A và meshimakonnol A là hai hợp chất thuộc lớp chất styrylpyrone được chứng minh mang nhiều hoạt tính sinh học quy mô in vivo, in vitro; đặc trưng bởi khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, chống lại tế bào ung thư Do đó, đề tài tiến hành trích ly, tinh sạch hợp chất này, sử dụng như chất chuẩn cho quá trình phát triển phương pháp phân tích đồng thời inoscavin A, meshimakobnol A bằng HPLC, là tiền đề cho nghiên cứu trích ly trong nguyên liệu nấm Thượng hoàng

2.3 Phương pháp phân tích High performance liquid chromatography (HPLC) và ứng dụng trong phân tích nấm

2.3.1 Giới thiệu phương pháp phân tích HPLC-PDA

Phương pháp phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách, xác định các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, hóa lí, vật lí bao gồm những cân bằng động xảy ra liên tục trong cột sắc kí giữa pha tĩnh (SP) và pha động (MP) ở điều kiện nhất định Trong đó pha động là một hoặc hỗn hợp của

các dung môi bao gồm nước, dung môi hữu cơ, chất đệm, chất dẫn diện, chất tạo phức, có tác dụng rửa giải các hợp chất trong quá trình phân tích sắc kí Pha tĩnh có thể ở dạng rắn hoặc lỏng (được giữ trong cột nhờ chất mang trơ) làm nhiệm vụ tách sắc kí hợp chất từ hỗn hợp mẫu ban đầu [48]

Phương pháp HPLC được xem là một công cụ phân tích hiện đại có thể sử dụng phân tích nhiều hợp chất hóa học khác nhau trong mẫu, bao gồm những hợp chất không bền với nhiệt Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, thiết bị HPLC có thể được ghép nối với nhiều loại detector khác nhau để nhận biết các hợp chất có trong mẫu Đối với các chất có khả năng hấp thụ bức xạ điện từ, detector UV-Vis thường được sử dụng như một công cụ hữu ích trong nhận diện các chất thông qua liên kết trong hợp chất hữu cơ nhờ sự thay đổi mức năng lượng so với ban đầu của hợp chất đó ở bước sóng nhất định [49] Nhu cầu phát triển các phương pháp phân tích, cùng với sự phát triển các kĩ thuật ghép nối thiết bị LC với các loại detector khác nhau giúp nâng cao hiệu quả phân tích và định lượng các hợp chất hữu cơ Trong đó photodiode array detector (PDA) hoạt động như một detector UV Tuy nhiên nguồn sáng sẽ được chiếu vào mẫu dưới dạng các tia đa sắc, trực tiếp đi qua flow cell đến cách tử nhiễu xạ, sau đó, chùm sáng được tách thành các tia đơn sắc và đi vào PDA Tại đây, các tia đơn sắc được chuyển đổi thành tín hiệu điện bởi các diode trong phạm vi bước sóng nhất định và xử lí các tín hiệu này dưới dạng độ hấp thụ [50]

Hình 2 8: Sơ đồ hoạt động của detector PDA

2.3.2 Một số báo cáo về ứng dụng HPLC phân tích các hợp chất tự nhiên trong

distyrylpyrylethan

- Detector PDA - Cột C18 (4,6 × 150 mm)

- Pha động TFA 0,04% (A) : methanol (B) - Gradient: 0 - 5 phút, 30% (B); 5 - 23 phút, 30 - 90 (B); 23 - 23 phút, 90% (B); 23 - 27 phút, 90 - 30% (B) - Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Thời gian lưu: hispidin (phút 13,6), 3,14’-bihispidinyl (phút 12,6), hypolomine B (phút 15,2), 1,1-distyrylpyrylethan (phút 21,1)

[25]

- Hispidin

- Davallialactone - 2,5-bis(4,7-dihydroxy-8-methyl-2-oxo-2H-chromen-3-

diene-1,4- dione

yl)cyclohexa-2,5 Detector MS, UV

- Bước sóng phát hiện 254 nm - Cột C18 (5 μm, 4,6 × 150 mm) - Pha động: nước (A), acetonitrile

- Hàm lượng smudacetone (1,09%), hispidin (2,96%), davallialactone (13,72%), 2,5-bis(4,7-

dihydroxy-8-[44]

- Hypholomine B - Inoscavin A

0,1% formic acid (B)

- Gradient: 0 - 20 phút, 5 - 20% (B); 20 - 60 phút, 20 - 50% (B); 60 - 95 phút, 50 - 100% (B)

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tích tiêm: 10 µL

2H-chromen-3-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4- dione (10,7%), hypholomine B (34,66%)

acid

- Detector UV-Vis (200 - 400 nm) - Cột C18 (4,6 x 150 mm, 5µm) - Nước 0,1% formic acid (A), actetonitrile 1% formic acid (B) - Tốc dộ dòng: 1 mL/phút

- Nhiệt độ: 40oC -Thể tích tiêm: 20 µL

- Thời gian lưu: phút 7,9

- Hàm lượng protocatechuic acid trong 11 loại nấm 0,1213 - 0,4121 (%) trong phân đoạn chloroform-ethyl acetate - Thẩm định phương pháp đạt độ đúng và độ chính xác trong khoảng cho phép theo AOAC

[51]

4 P linteus - Meshimakbnol A

- Meshimakobnol B

- Hypholomine B - Inoscavin A

- Detector: PDA - Pha động: Nước 0,5 % acetic acid (A) : methanol (B) - Gradient: 0 - 20 phút, 20 - 100% (B); 20 - 25 phút, 100% (B)

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

- Cột RP (4,6 x 150 mm, 5µm)

- Hàm lượng meshimakbnol A từ 0,021 - 0,14 % (theo diện tích peak)

- SKD cho thấy nấm được phân loại 3 nhóm: + Nhóm 1 (quả thể tự nhiên): đặc trưng của meshimakobnol A, 2 peak nhỏ hypholomine B và inoscavin A + Nhóm 2 (quả thể nuôi trồng): đặc trưng của 2 peak

hypholomine B, inoscavin A; peak nhỏ của meshimakobnol A

+ Nhóm 3 (sợi nấm nuôi cấy): không xuất hiện peak đặc trưng

[52]

5 Phellinus igniarius

- Inoscavin A - Hypholomine B

- Thiết bị: UPLC - Detector PDA và MS

- Bước sóng phát hiện: 395 nm -Pha tĩnh: cột C18 - Pha động: methanol (A),

phosphoric acid (B)

- Gradient: 0 - 8 phút: 20-30% (A); 8-10 phút: đẳng dòng 30% (A) - Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút

- Nhiệt độ cột: 35oC

- Thể tích tiêm: 1 µL

- Thời gian lưu: hyppholomine B ở phút thứ 5,8; inoscavin A ở phút thứ 7,6 -Detector PDA và MS đều thích hợp phân tích hypholomine B và inoscavin A - Hàm lượng inoscavin A dao động từ 0,32 -

(PDA); hàm lượng

hypholomine B dao động từ 0,32 - 3,11 g/kg (PDA) Hàm lượng 2 hợp chất ảnh hưởng bởi vị trí địa lí

- Phương pháp phân tích đạt độ đúng cao

[53]

Bảng 2.3 tổng quan về ứng dụng phương pháp phân tích HPLC các thành phần hợp chất tự nhiên, cụ thể là phân lớp styrylpyrone cho thấy một số điều kiện phân tích thường sử dụng bao gồm pha tĩnh là cột pha đảo C18; pha động kết hợp nước với

dung môi methanol hoặc actetonitrile, điều chỉnh pH bằng một số acid như formic acid, acetic acid, phosphoric acid, TFA Nhiệt độ cột phân tích được sử dụng khoảng 35 - 40oC, tốc độ dòng đối với phương pháp HPLC là 1 mL/phút và chương trình phân tích sử dụng gradient nồng độ dung môi theo thời gian Ngoài ra, bảng 2.3, nghiên cứu số 4 của Kojima (2008) còn cho thấy inosacvin A và meshimakobol A là

hai hợp chất có tiềm năng trong phân biệt nấm Phellinus theo nguồn gốc và điều kiện

sinh trưởng Tuy nhiên, chỉ có nghiên cứu của tác giả Kojima dùng phương pháp

HPLC để định tính inoscavin A, meshimakobnol A trong nấm P.linteus dựa trên thời

gian lưu so với chất chuẩn, chưa nêu được nhiệt độ cột và bước sóng hấp thu của hai hợp chất trên, đồng thời chưa có nghiên cứu nào phát triển và thẩm định phương pháp

HPLC phân tích đồng thời hai hợp chất này trong nấm thuộc chi Phellinus và

Ganoderma Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích

đồng thời hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A bằng phương pháp PDA là tiền đề cho các nghiên cứu xác định hàm lượng hai hợp chất này trong các

HPLC-loài nấm dược liệu, đặc biệt là Phellinus

2.4 Lí thuyết cơ bản về quá trình trích ly

Trích ly là quá trình chuyển một hoặc nhiều cấu tử từ pha này sang pha khác nhằm tách toàn bộ hoặc các cấu tử mục tiêu từ nguyên liệu thô Dựa trên nguyên lí, có nhiều phương pháp trích ly khác nhau bao gồm trích ly sử dụng dung môi, chưng cất, ép, thăng hoa [54]

Hình 2 9: Mô tả quá trình trích ly các phân tử hữu cơ nhỏ trong nguyên liệu [55] Thông thường, phương pháp trích ly sử dụng dung môi được sử dụng rộng rãi trong trích ly các hợp chất tự nhiên từ nguyên liệu thô, bao gồm 5 giai đoạn [55]: - Giai đoạn 1: Dung môi tiếp xúc bề mặt pha rắn

- Giai đoạn 2: Các cấu tử dung môi bắt đầu đi vào pha rắn theo nguyên tắc thẩm thấu và khuếch tán

- Giai đoạn 3: Dung môi tương tác với pha rắn, các chất tan được giải phóng khỏi nền mẫu

- Giai đoạn 4: Các chất tan trong pha rắn bắt đầu đi vào dung môi tạo thành dung dịch - Giai đoạn 5: Dựa vào sự chênh lệch nồng độ, dung dịch chứa chất tan trong pha rắn di chuyển ra pha lỏng

Các giai đoạn trên xảy ra liên tục khi dung môi tiếp xúc tiếp xúc pha rắn, quá trình trích ly dừng lại khi nồng độ các chất trong hai pha đạt trạng thái cân bằng được mô tả như hình 2.10