1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu phương pháp định lượng bằng HPLC và quá trình trích ly inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm thượng hoàng (Phellinus SPP.)

112 1 0
Tài liệu đã được kiểm tra trùng lặp

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề Nghiên cứu phương pháp định lượng bằng HPLC và quá trình trích ly inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm thượng hoàng (Phellinus SPP.)
Tác giả Lờ Ngọc Anh
Người hướng dẫn GS.TS Đống Thị Anh Đào
Trường học Đại học Quốc gia TP. HCM
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm
Thể loại Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản 2024
Thành phố TP. Hồ Chí Minh
Định dạng
Số trang 112
Dung lượng 1,89 MB

Cấu trúc

  • CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU (18)
  • CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN (20)
    • 2.1. Nguồn gốc và đặc tính nấm thuộc chi Phellinus (20)
      • 2.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm (20)
      • 2.1.2. Thành phần hóa học (21)
        • 2.1.2.1. Thành phần các hợp chất sơ cấp (22)
        • 2.1.2.2. Thành phần các hợp chất thứ cấp (23)
    • 2.2. Hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A (28)
      • 2.2.1. Inoscavin A (29)
        • 2.2.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lí (29)
        • 2.2.1.2. Hoạt tính sinh học (29)
      • 2.2.2. Meshimakobnol A (31)
        • 2.2.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lí (31)
        • 2.2.2.2. Hoạt tính sinh học (32)
    • 2.3. Phương pháp phân tích High performance liquid chromatography (HPLC) và ứng dụng trong phân tích nấm (33)
      • 2.3.1. Giới thiệu phương pháp phân tích HPLC-PDA (33)
      • 2.3.2. Một số báo cáo về ứng dụng HPLC phân tích các hợp chất tự nhiên trong nấm (35)
    • 2.4. Lí thuyết cơ bản về quá trình trích ly (39)
    • 2.5. Siêu âm và ứng dụng vào hỗ trợ trích ly các hoạt chất có hoạt tính sinh học (41)
      • 2.5.1 Nguyên tắc sóng siêu âm (41)
      • 2.5.2. Tác động của sóng siêu âm năng lượng cao (42)
        • 2.5.2.1. Hiện tượng xâm thực tạo nên quá trình hình thành và phá vỡ bọt khí (43)
        • 2.5.2.2. Hiện tượng xâm thực làm phá vỡ bề mặt vật liệu hỗ trợ trích ly (43)
    • 2.6. Một số nghiên cứu về ứng dụng siêu âm trong quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ nấm (44)
  • CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM (48)
    • 3.1. Nguyên liệu (48)
      • 3.1.1. Nguyên liệu nấm (48)
        • 3.1.1.1. Nguyên liệu nấm phân lập inoscavin A và meshimakobnol A (48)
        • 3.1.1.2. Nguyên liệu nấm quá trình phân tích và trích ly inoscavin A và (48)
    • 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu (48)
    • 3.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm (49)
      • 3.2.1. Dung môi (49)
      • 3.2.2. Thiết bị (50)
      • 3.2.3. Dụng cụ (52)
    • 3.3. Phân lập và xác định chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A (52)
      • 3.3.1. Quy trình phân lập inoscavin A và meshimakobnol A (52)
      • 3.3.2. Xác định chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A (54)
    • 3.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng inoscvain A và meshimakobnol (55)
    • 3.5. Định lượng đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A bằng phương pháp phân tích HPLC trên một số mẫu nấm Phellinus và Ganoderma (57)
      • 3.5.1. Phương pháp trích ly mẫu nấm Phellinus và Ganoderma (57)
      • 3.5.2. Phương pháp phân tích mẫu nấm Phellinus và Ganoderma (58)
    • 3.6. Khảo sát quá trình trích ly có sự hỗ trợ sóng siêu âm trên nấm Thượng hoàng (P.igniarius) (58)
      • 3.6.2. Bố trí thí nghiệm trích ly nấm Thượng hoàng (60)
        • 3.5.2.1. Yếu tố biên độ siêu âm (61)
        • 3.5.2.2. Yếu tố thời gian hỗ trợ siêu âm (61)
        • 3.5.2.3. Yếu tố nồng độ dung môi (62)
        • 3.5.2.4. Yếu tố nhiệt độ (62)
        • 3.5.2.5. Yếu tố thời gian trích ly (63)
  • CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN (64)
    • 4.1 Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A (64)
      • 4.1.1. Xác định cấu trúc hợp chất inoscavin A (64)
      • 4.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất meshimakobnol A (66)
      • 4.1.3. Xác định độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A (67)
    • 4.2. Phát triển phương pháp định lượng inoscavin A và meshimakobnol A bằng HPLC (69)
      • 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phân tách inoscavin A và mehsimakobnol A 52 4.2.2. Ảnh hưởng bước sóng đến phát triển phương pháp định lượng inoscavin A và meshimakobnol A (69)
    • 4.3. Thẩm định phương pháp phân tích (73)
      • 4.3.1. Độ đặc hiệu của phương pháp (74)
      • 4.3.2. Độ ổn định (75)
      • 4.3.4. Tính tuyến tính (76)
      • 4.3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) (76)
      • 4.3.6. Độ chính xác (77)
      • 4.3.7. Độ đúng (78)
    • 4.4. Phân tích mẫu thực (79)
    • 4.5. Ảnh hưởng các yếu tố công nghệ đến quá trình trích ly nấm Thượng hoàng (81)
      • 4.5.1. Kết quả khảo sát biên độ sóng ảnh hưởng đến hàm lượng inoscavin A và (81)
      • 4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A (84)
      • 4.5.4. Kết quả khảo sát nhiệt độ trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng Inoscavin A và (85)
      • 4.5.5. Kết quả khảo sát thời gian trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng inoscavin A và (86)
  • CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ (89)
    • 5.1. Kết luận (89)
    • 5.2. Kiến nghị (89)
  • TÀI LIỆU THAM KHẢO (90)
  • PHỤ LỤC (101)

Nội dung

GIỚI THIỆU

Theo Technavio Medicinal Mushrooms Market quy mô thị trường nấm ăn dự kiến đạt 72,5 tỷ USD vào 2027, trong đó thị trường nấm dược liệu ước tính tăng đến 13,88 tỷ USD vào 2022, tốc độ tăng trưởng đạt 9,54% vào năm 2023 [1] cho thấy thị trường nấm nói chung và nấm dược liệu nói riêng có quy mô lớn và mức tăng trưởng cao Số liệu này cho thấy con người ngày càng quan tâm hơn đến vấn đề sức khỏe, tìm kiếm những sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên như một biện pháp hỗ trợ hoặc thay thế trong chế độ dinh dưỡng hàng ngày Từ đó, một thách thức đặt ra đối với ngành thực phẩm là tìm kiếm giải pháp giúp nâng cao sức khỏe có nguồn gốc thiên nhiên Trong đó, nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.) thuộc họ Hymenochaetaceae là loài nấm gỗ, mọc kí sinh trên các cây thân gỗ như Dâu tằm, Dương, Liễu, Bạch dương,… thường xuất hiện trong các cánh rừng nguyên sinh nhiệt đới, cận nhiệt đới và được biết đến như một loại nấm dược liệu có tác dụng tăng cường sức khỏe do chứa nhiều hoạt chất thuộc các nhóm polysaccharide, terpenoid, steroid, polyphenol có tác dụng kháng oxi hóa, kháng viêm Bên cạnh Linh chi, nấm Thượng hoàng được biết đến là một loại dược liệu quý, được sử dụng phổ biến tại Hàn Quốc, Nhật Bản Các công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở mức độ in vivo, in vitro đối với loại nguyên liệu này bước đầu chỉ rõ các tác dụng tích cực đối với con người Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện các sản phẩm thực phẩm chức năng từ chiết xuất nấm Phellinus, sự đa dạng các sản phẩm đã đặt ra nhiều thách thức cho việc xác định nguồn gốc, chất lượng nhằm bảo vệ người tiêu dùng Vì vậy, đề tài đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu chính bao gồm:

- Thiết lập phương pháp định lượng đồng thời hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A

- Nghiên cứu điều kiện trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm để đạt hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất Đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng bằng HPLC và quá trình trích ly inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.)” thực hiện hai nội dung chính bao gồm:

- Tách chiết, tinh sạch inoscavin A và meshimakobnol A, sử dụng như chất chuẩn để phát triển quy trình phân tích đồng thời hai hợp chất này trên thiết bị HPLC nhằm xác định hàm lượng trong nguyên liệu

- Nghiên cứu về phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm nhằm thu nhận các hoạt chất có lợi từ nấm Thượng hoàng làm tiền đề cho các ứng dụng nguyên liệu tự nhiên có hoạt tính sinh học cao vào các sản phẩm thực phẩm

Phương pháp phân tích đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A có thể cung cấp cơ sở khoa học nhằm đánh giá chất lượng nấm Thượng hoàng và các sản phẩm có nguồn gốc từ nấm thuộc chi Phellinus Đồng thời, kết quả nghiên cứu trích ly có hỗ trợ sóng siêu âm hai hợp chất trên còn là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng nguồn nguyên liệu quý vào thực phẩm, tăng giá trị kinh tế cho nấm Thượng hoàng.

TỔNG QUAN

Nguồn gốc và đặc tính nấm thuộc chi Phellinus

2.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm

Chi Phellinus là một loại nấm được sử dụng từ cách đây 2000 năm và được nhắc đến nhiều trong y học cổ truyền Trung Quốc Chi Phellinus có khoảng 220 loài phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Mông Cổ, Hàn Quốc và một số nước châu Á khác cũng như Mỹ và Châu Phi Trong đó có nhiều loài nhiều được công bố có hoạt tính sinh học như: Phellinus linteus, Phellinus baumii, Phellinus igniarius, gọi chung là Sanghuang (Trung Quốc), Meshimakobu (Nhật Bản) hay còn có tên gọi khác là nấm Thượng hoàng (Việt Nam) [2] Ở Việt Nam, nấm Thượng hoàng sinh trưởng tự nhiên xung quanh khu vực rừng nguyên sinh thuộc khu bảo tồn tồn thiên nhiên Pù huống (Nghệ An), khu bảo tồn thiên nhiên Ba Bể (Bắc Cạn) hoặc Phia Oắc - Phia Đén (Cao Bằng) [3]

Vị trí và phân loại nấm học [4]:

Hình 2 1: Phellinus sinh trưởng tự nhiên [5]

A, B Quả thể non sinh trưởng tự nhiên

D Quả thể già Quả thể Phellinus thường có dạng quạt, thân gỗ cứng, mặt trên có màu vàng đến nâu đậm, mặt dưới có thể có lông mịn, màu nhạt, sống lâu năm, qua thời gian dài các sợi nấm tạo thành lớp mới chồng lên lớp cũ, các lớp này sẽ trở nên cứng và khô tạo thành quả thể cho nấm Phellinus Phellinus thường mọc ở vùng rừng sâu, núi, các khu rừng nguyên sinh, có thể chịu được các yếu tố khắc nghiệt như mưa kéo dài hay hạn hán cao, các khu rừng nguyên sinh Loài nấm này thường mọc trên các cây họ Liễu, Dương, Bạch dương và Dâu tằm [6, 7]

2.1.2.1 Thành phần các hợp chất sơ cấp

Các nghiên cứu về thành phần trong nấm cũng chỉ ra rằng các loài nấm thuộc chi Phellinus có giá trị dinh dưỡng, đóng góp thông qua các thành phần chủ yếu bao gồm protein, acid amin, chất béo và một số khoáng chất Kết quả thành phần dinh dưỡng được trình bày ở bảng 2.1, 2.2 dưới đây:

Bảng 2 1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể P igniarius và P linteus

Thành phần P igniarius P linteus Tham khảo Ẩm 16,0 ± 1,28 15,2 ± 1,20 [8]

Chất hòa tan không chứa nitơ (%)

Bảng 2 2: Thành phần khoáng chất trong quả thể nấm P igniarius và P.linteus

Thành phần P igniarius P linteus Tham khảo Dịch chiết ethanol

2.1.2.2 Thành phần các hợp chất thứ cấp

Các hợp chất thứ cấp trong nấm Phellinus bao gồm nhiều nhóm khác nhau thuộc polysaccharide, steroid, terpenoid, polyphenol

Nhóm polysaccharide cấu tạo từ nhiều đơn phân bao gồm arabinose (Ara), fructose (Fru), fucose (Fuc), galactose (Gal), galacturonic acid (GalA), glucose (Glc), glucuronic acid (GlcA), mannose (Man), rhamnose (Rha), ribose (Rib) và xylose (Xyl) khối lượng phân tử từ 1,00 × 10 3 đến 1,00 × 10 7 kDa, liên kết α-(1 → 4), α-(1

→ 3) và α-(1 → 6) phụ thuộc vào loài khác nhau, có tác dụng hạ đường huyết, chống tiểu đường, kháng viêm, kháng khối u [10, 11]

Nhiều hợp chất steroid, terpenoid được phân lập từ Phellinus có tiềm năng trong kháng viêm, hỗ trợ điều trị ung thư, viêm khớp dạng thấp, tiểu đường, thoái hóa thần kinh, chống trầm cảm [12-14] Trong đó, steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc khung chính từ 4 vòng cycloalkane xuất hiện ở nấm, thực vật bậc cao và trong cơ thể người Sterois có nguồn gốc từ Acetyl-CoA, được tổng hợp thông qua con đường Mevalonate, sản phẩm là dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) và isopentenyl pyrophosphate (IPP) phụ thuộc vào con đường chuyển hóa của từng loài Sau đó, qua quá trình chuyển hóa tạo thành steroid [15, 16] Terpenoid có cấu trúc khung cơ bản là khung 5 cacbon, hay 1 đơn vị isopren, thông qua các phản ứng đóng vòng, sắp xếp lại khung cacbon tạo thành các phân lớp terpenoid như monoterpenoid

(C10), sesquiterpenoid (C15), diterpenoid (C20), sesterpenoid (C25), triterpenoid (C30) Tương tự steroid, terpenoid có nguồn gốc từ Acetyl-CoA thông qua con đường Mevalonate hoặc Pyruvate thông qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4- phosphate (MEP) tạo thành DMAPP và IPP sau đó chuyển hóa thành các hợp chất terpenoid [13, 14, 17]

(A) (B) Hình 2 2: Cấu trúc hóa học khung chất A) Steroid; B) Terpenoid (đơn vị isopren cấu trúc khung terpenoid)

Trong thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu tiến hành xác định các hợp chất mang hoạt tính sinh học có khối lượng phân tử thấp, tập trung vào nhóm chất polyphenol, cụ thể là lớp chất styrylpyrone trên các loài nấm lớn Lớp chất này đa dạng, phổ biến và mang tính đại diện cho một số loài nấm dược liệu thuộc chi

Hình 2 3: Cấu trúc hóa học khung chất styrylpyrone

Styrylpyrone là một phân lớp chất thuộc nhóm polyphenol thường xuất hiện ở các loài nấm dược liệu, đặc biệt là Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae, có màu vàng đặc trưng (từ vàng nhạt đến vàng cam phụ thuộc vào từng hợp chất hóa học riêng biệt) [2, 19] Ở thực vật và nấm, các hợp chất styrylpyrone là lớp chất thứ cấp có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ, chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn từ các vết thương xuất hiện trên thân hoặc quả thể [18] Ở người, stylpyrone là nhóm chất có hoạt tính sinh học cao có khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng virus, kháng ung thư, ức chế tiểu đường và an thần [2, 18, 19] Styrylpyrone được tổng hợp (thông qua con đường Shikimic) từ các tiền chất tương tự như quá trình tổng hợp chalcone (phổ biến ở các thực vật bậc cao) nhưng chỉ xảy ra hai phản ứng ngưng tụ và đóng vòng tạo thành khung styrylpyrone [19, 20] Trong đó, đơn vị styryl- có nguồn gốc từ phenylalanine thông qua con đường cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeoyl-CoA; cấu trúc vòng pyrone- có nguồn gốc từ acetate [21] Dựa vào cấu trúc hóa học, các styrylpyrone có thể được phân thành styrylpyrone đơn giản (có cấu tạo từ 1 đơn vị styryl- và 1 vòng pyrone-), styrylpyrone phức tạp (có cấu tạo từ 2 hoặc nhiều đơn vị styryl- và vòng pyrone- trở lên) Theo báo cáo của In-Kyoung Lee, nấm sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên có thể xuất hiện nhiều styrylpyrone phức tạp do sự kết hợp của styrylpyrone đơn giản với hispolon (5) hoặc 3,4-dihydroxyphenylpropanoids; trong khi đó, nấm nuôi trồng thường xuất hiện styrylpyrone đơn giản và các polymer của chúng [18, 21]

Hispidin (3), bisnoryangonin (4) là hai hợp chất điển hình, có cấu tạo hóa học đơn giản thuộc styrylpyrone Hispidin, có tên khác là 6-(3′,4′-dihydroxystyryl)-4- hydroxy-2-pyrone, định danh lần đầu bởi Edwards vào 1961 và Bu’Lock năm 1962 [22] Đến 1977, Gonindard công bố hispidin có khả năng ức chế protein kinase C, kể từ đó, hợp chất này được thương mại hóa trên thị trường và sử dụng cho các thử nghiệm ức chế protein kinase C [23] Trong khi hispidin (3) được tìm thấy ở bộ nấm

Aphyllophorales, bisnoryangonin (4) lại được tìm thấy chủ yếu ở bộ Agaricales và chỉ xuất hiện dạng vết thuộc chi Phellinus, Inonotus [18]

3,14'-bihispidinyl (6), một dipyrone sinh ra từ quá trình dimer hóa 2 hispidin được phân lập lần đầu tiên bởi Klaar năm 1977, xuất hiện trong I hispidus, P igniarius, P tuberculosus, có khả năng tiêu diệt giun tròn Caenorhabditis elegans với LD50 ≤ 25 àg/mL, khỏng oxi húa bằng phương phỏp loại bỏ gốc tự do DPPH, ABTS với IC50 lần lượt là 0,9 và 0,55 μmol/L [24-26] Hypholomine B (7) được phân lập lần dầu tiên bởi Fiasson vào năm 1977 [27] Có nhiều nghiên cứu báo cáo hoạt tính sinh học của hypholomine B như khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH, ABTS với

IC50 lần lượt là 0,31; 0,34 μmol/L; khả năng kháng virus thông qua khả năng ức chế neuraminidase trên bề mặt virus với IC50 = 0,03 μM và khả năng ức chế 3CL protease, được đánh giá có tiềm năng trong việc chống lại SARS-CoV-2 [25, 28, 29]

Theo báo cáo của Lee (2007), inoscavin A (1), một styrylpyrone được phân lập lần đầu tiên vào 1999 xuất hiện ở chi Phellinus và Inonotus, có nguồn gốc từ quá trình ngưng tụ hispidin (3) và hispolon (5) với sản phẩm trung gian là interfungins A

(8), được đánh giá có nhiều hoạt tính sinh học liên quan đến kháng oxi hóa, kháng viêm, chống lại hoạt động xâm nhập của virus vào cơ thể con người [30-33]

Hình 2 4: Quá trình sinh tổng hợp inoscavin A (1) từ hispidin (3) và hispolon (5)

Theo báo cáo của Lee (2006), meshimakobnol A (2) hay phelligridin D, được phân lập từ Inonotus xeranticus, định danh lần đầu tiên năm 2004 trên loài Phellinus igniarius có nguồn gốc từ tiền chất hispidin (3) kết hợp với 3,4-dihydroxybenzoic acid hay protocatechuic acid (9), được đánh giá có nhiều hoạt động sinh học liên quan đến loại bỏ gốc tự do, kháng tế bào ung thư [34-37]

Hình 2 5: Quá trình sinh tổng hợp meshimakobnol A (2) từ hispidin (3) và protocatechuic acid (9)

Ngoài ra, một số styrylpyrone phức tạp khác được phát hiện ở nhiều loài khác nhau thuộc chi Phellinus như phelligridimer A (10) cho thấy hoạt động ức chế quá trình oxi hóa lipid ở gan chuột với IC50 = 10,2 μM, hoạt động kháng tế bào ung thư dòng A 2780, HCT-8, Bel-7402, MCF-7, A549 với IC50 lớn hơn 50 μM [38]; squarrosidine (11) , pinillidine (12) cho thấy hoạt động ức chế enzyme xanthine oxidase liên quan đến quá trình tổng hợp acid uric với IC50 lần lượt là 8,1 và 5,8 μM [39].

Hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A

Inoscanvin A (1), meshimakobnol A (2) là hai hợp chất thuộc lớp chất styrylpyrone của polyphenol [2] Có một số nghiên cứu trước đây tiến hành trích ly, tinh sạch thành công inoscavin A [31, 32, 40, 41] và meshimakobnol A [35, 42] nhằm xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của 2 hợp chất này

Năm 1999, inoscavin A (1), một dẫn xuất của hispidin lần đầu tiên được phát hiện bởi Kim và cộng sự trong quá trình sàng lọc các hợp chất có khả năng loại bỏ gốc tự do từ Inonotus xeranticus Inoscavin A được thu nhận bằng cách trích ly nguyên liệu trong dung môi methanol, xuất hiện ở phân đoạn ethyl acetate, sắc ký cột Sephadex LH-20 và ODS, methanol 67% liên tiếp, sắc kí lỏng HPLC pha đảo, rửa giải với MeOH 60%, có bước sóng hấp thu cực đại ở 389 nm [31]

2.2.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lí

Hình 2 6: Cấu trúc hóa học của inoscavin A (1)

Inoscavin A (1) được tinh sạch từ nấm Phellinus ở dạng bột, màu vàng rơm, điểm nóng chảy 268-269 o C, gốc quay cực [𝛼]D = + 0,6 (MeOH) [41, 43], có công thức hóa học chung là C25H18O9, phổ khối lượng HRFAB-MS của inoscavin A cho thấy peak ion m/z 463,1045 [M+H] + , phổ tử ngoại UV có bước sóng hấp thụ cực đại

𝜆max ở 389 nm, phổ hồng ngoại IR cho thấy tín hiệu hấp thụ cực đại ở 3430 cm -1 đặc trưng của nhóm hydroxyl, 1700 cm -1 đặc trưng của nhóm C=O trong cacbonyl Phổ

1H-NMR có 2 hệ thống ABX (6,59; 6,75; 6,71 ppm và 7,00; 6,79; 7,08 ppm) gắn trên nhân thơm, 2 olefinic liên hợp ở 6,72 và 7,44 ppm với hằng số ghép J = 15,9Hz Phổ

13C-NMR có 25 tín hiệu cacbon bao gồm 203,1 và 160,6 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl; 167,0; 176,8; 192,9 ppm đặc trưng cho cacbon oxygenated lai hóa sp 2 ; 146,3, 147,0; 147,8; 149,5 ppm đặc trưng cho nhóm hydroxyl gắn trên vòng thơm [31]

Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (1999), ngoài xác định cấu trúc hóa học lần đầu tiên được tìm thấy ở loài Inonotus xeranticus, các tác giả còn tiến hành đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của inoscavin A Kết quả cho thấy inoscavin A có khả năng ức chế quỏ trỡnh peroxide lipid ở gan chuột IC50 = 0,3 àg/mL cao hơn so với đối chứng Vitamin E với IC50 = 1,5 àg/mL, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH cao với

Trong nghiên cứu của Seung Woong Lee và cộng sự (2014) tiến hành sàng lọc khả năng ức chế lipoxygenase của 335 mẫu nấm khác nhau cho thấy một số loài thuộc chi Phellinus thể hiện khả năng ức chế lipoxygenase, một tác nhân của quá tình sinh tổng hợp gây ra phản ứng viêm mạnh hơn so với các loài nấm khác bao gồm P gilvus,

P linteus, P baumii lần lượt 66,7%, 59,5%, 100% ở nồng độ 100 àg/ml Nghiờn cứu tiến hành phân lập inoscavin A từ cao methanol của P baumii, sau đó đánh giá khả năng ức chế lipoxygenase Kết quả cho thấy inoscavin A từ P.baumii có khả năng ức chế lipoxygenase với IC50 = 6,8 àM [32]

Năm 2020, Kai Yang và cộng sự nghiên cứu tác động chiết xuất quả thể nấm

P.baumii đến bệnh đái tháo đường Quả thể nấm được trích ly bằng ethanol 80%, sau đó tiến hành sắc kí phân đoạn liên tiếp các hợp chất trong nguyên liệu bằng dung môi petroleum ether, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) và cuối cùng là nước Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đoạn EtOAc có hoạt tính ức chế α-glucosidase với

IC50 = 49,05 àg/ml, mạnh hơn so với đối chứng acarbose (IC50 = 645,73 àg/ml) Ngoài ra, phân đoạn EtOAc cũng thể hiện khả năng làm tăng mức tiêu thụ insulin ở khoảng nồng độ 25 - 100 àg/ml, thể hiện hoạt tớnh khỏng oxi húa thụng qua phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH, ABTS, hydroxyl Bên cạnh đó, chiết xuất P.baumii được chứng minh có sự xuất hiện của hispidin, davallialactone, 2,5-bis(4,7- dihydroxy-8-methyl-2-oxo-2H-chromen-3-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione, hypholomin B và inoscavin A [44]

Trong nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống lại bệnh gout trên mô hình chuột tăng uric acid của Hongxing Li và cộng sự (2021) cho thấy dịch chiết thô từ nấm

Phellinus tự nhiên và nuôi trồng đều có khả năng làm giảm uric acid thông qua ức chế hoạt động của xanthine oxidase (XO), đồng thời kháng viêm thông qua điều chỉnh nồng độ ICAM- 1, IL-1β và IL-6, làm giảm các biểu hiện viêm cấp tính trên mô hình chuột tăng uric acid Báo cáo chỉ ra rằng, hoạt động giảm uric acid trong máu của chuột có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp alanine, leucine and isoleucine và histidine đối với nấm tự nhiên, quá trình chuyến hóa nicotin, nicotinamide và beta- alanine đối với nấm nuôi trồng Nghiên cứu xác định được sự hiện diện của phelligridimer A, hypholomine B, inoscavin A, hispidin, phelligridin I trong dịch chiết thô từ nấm Phellinus [45]

Năm 2022, Ping Qiu và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của inoscavin A đến ung thư trực tràng thông qua tín hiệu của con đường hedgehog (Hh) Inoscavin A thu nhận từ quá trình ngâm, chiết lỏng-lỏng, làm giàu bằng hệ thống sắc kí phân bố ngược dòng (HSCCC), tinh chế bằng sắc kí điều chế, xác định cấu trúc bằng sắc kí lỏng (LC), khối phổ (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Sau đó, inoscavin A được thử nghiệm trên mô hình chuột bị ung thư trực tràng HT-29 Kết quả nghiên cứu cho thấy inoscavin A biểu hiện khả năng chống tế bào ung thư trực tràng HT-29 thông qua con đường Hh nhờ việc kết hợp của inoscavin A với thụ thể Smo, ngăn chặn quá trình tăng sinh, gây chết tế bào [46]

Một nghiên cứu năm 2023 của Md Abu Sayem Khan và cộng sự sử dụng phương pháp Molecular docking để mô phỏng và sàng lọc các chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ nấm dược liệu có khả năng kháng virus SARS-CoV-2 Báo cáo chỉ ra rằng inoscavin A có tiềm năng trong việc ức chế TMPRSS2 (Transmembrane protease serine 2), một loại proteinase có vai trò giúp virus xâm nhập vào cơ thể vật chủ, đồng thời ngăn cản quá trình nhân đôi của loại virus này [33]

Một dẫn xuất mới của pyrano[4,3-c][2]benzopyran-1,6-dione lần đầu tiên được phát hiện bởi Shunyan Mo (2004) và cộng sự trong loài Phellinus igniarius tại Trung Quốc đặt tên là phelligridin D Năm 2004, Akito Nagatsu và cộng sự nghiên cứu sự khác nhau trong thành phần hóa học giữa quả thể nấm tự nhiên và nấm nuôi trồng thuộc loài Phellinus linteus tại Nhật Bản, nhóm tác giả phát hiện sự khác biệt thông qua phân tích HPLC so sánh sợi nấm, quả thể nấm nuôi cấy và quả thể nấm tự nhiên phát hiện ra một hợp chất mới đặt tên là meshimakobnol A (2) có cấu trúc tương tự phelligridin D [35, 42]

2.2.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lí

Hình 2 7: Cấu trúc hóa học của meshimakobnol A (2)

Meshimakobnol A (2) được trích ly, tinh sạch từ nấm Phellinus ở dạng bột, màu vàng cam, điểm nóng chảy lớn hơn 300 o C, có công thức hóa học chung là

C20H12O8 Phổ khối lượng EIMS của meshimakobnol A cho thấy peak ion m/z 380 [M] + Phổ tử ngoại UV có bước sóng hấp thu cực đại 𝜆max ở 417 và 255 nm Phổ hồng ngoại IR cho thấy tín hiệu hấp thu cực đại ở 3288 và 3091 cm -1 đặc trưng cho nhóm hydroxyl; 1668 cm -1 đặc trưng cho nhóm cacbonyl; 1604, 1549, 1514 cm -1 đặc trưng cho vòng thơm Phổ 1 H-NMR có 1 hệ thống ABX (6,70; 6,99; 7,07 ppm), 2 trans- olefinic liên hợp ở 6,83 và 7,65 ppm với hằng số ghép J = 15,8 Hz Phổ 13 C-NMR có

Phương pháp phân tích High performance liquid chromatography (HPLC) và ứng dụng trong phân tích nấm

và ứng dụng trong phân tích nấm

2.3.1 Giới thiệu phương pháp phân tích HPLC-PDA

Phương pháp phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách, xác định các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, hóa lí, vật lí bao gồm những cân bằng động xảy ra liên tục trong cột sắc kí giữa pha tĩnh (SP) và pha động (MP) ở điều kiện nhất định Trong đó pha động là một hoặc hỗn hợp của các dung môi bao gồm nước, dung môi hữu cơ, chất đệm, chất dẫn diện, chất tạo phức, có tác dụng rửa giải các hợp chất trong quá trình phân tích sắc kí Pha tĩnh có thể ở dạng rắn hoặc lỏng (được giữ trong cột nhờ chất mang trơ) làm nhiệm vụ tách sắc kí hợp chất từ hỗn hợp mẫu ban đầu [48]

Phương pháp HPLC được xem là một công cụ phân tích hiện đại có thể sử dụng phân tích nhiều hợp chất hóa học khác nhau trong mẫu, bao gồm những hợp chất không bền với nhiệt Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, thiết bị HPLC có thể được ghép nối với nhiều loại detector khác nhau để nhận biết các hợp chất có trong mẫu Đối với các chất có khả năng hấp thụ bức xạ điện từ, detector UV-Vis thường được sử dụng như một công cụ hữu ích trong nhận diện các chất thông qua liên kết trong hợp chất hữu cơ nhờ sự thay đổi mức năng lượng so với ban đầu của hợp chất đó ở bước sóng nhất định [49] Nhu cầu phát triển các phương pháp phân tích, cùng với sự phát triển các kĩ thuật ghép nối thiết bị LC với các loại detector khác nhau giúp nâng cao hiệu quả phân tích và định lượng các hợp chất hữu cơ Trong đó photodiode array detector (PDA) hoạt động như một detector UV Tuy nhiên nguồn sáng sẽ được chiếu vào mẫu dưới dạng các tia đa sắc, trực tiếp đi qua flow cell đến cách tử nhiễu xạ, sau đó, chùm sáng được tách thành các tia đơn sắc và đi vào PDA Tại đây, các tia đơn sắc được chuyển đổi thành tín hiệu điện bởi các diode trong phạm vi bước sóng nhất định và xử lí các tín hiệu này dưới dạng độ hấp thụ [50]

Hình 2 8: Sơ đồ hoạt động của detector PDA

2.3.2 Một số báo cáo về ứng dụng HPLC phân tích các hợp chất tự nhiên trong nấm

Bảng 2 3: Một số báo cáo về ứng dụng HPLC trong phân tích hợp chất tự nhiên từ nấm

STT Loài Hoạt chất Điều kiện HPLC Kết quả TL

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Thời gian lưu: hispidin (phút 13,6), 3,14’- bihispidinyl (phút 12,6), hypolomine B (phút 15,2), 1,1- distyrylpyryleth an (phút 21,1)

- 2,5-bis(4,7- dihydroxy-8- methyl-2-oxo-2H- chromen-3- yl)cyclohexa-2,5- diene-1,4- dione

- Bước sóng phát hiện 254 nm

- Hàm lượng smudacetone (1,09%), hispidin (2,96%), davallialactone (13,72%), 2,5- bis(4,7- dihydroxy-8-

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tích tiêm: 10 àL methyl-2-oxo- 2H-chromen-3- yl)cyclohexa- 2,5-diene-1,4- dione (10,7%), hypholomine B (34,66%)

- Nước 0,1% formic acid (A), actetonitrile 1% formic acid (B)

- Tốc dộ dòng: 1 mL/phút

- Nhiệt độ: 40 o C -Thể tích tiêm: 20 àL

- Hàm lượng protocatechuic acid trong 11 loại nấm 0,1213

- 0,4121 (%) trong phân đoạn chloroform- ethyl acetate

- Thẩm định phương pháp đạt độ đúng và độ chính xác trong khoảng cho phép theo AOAC

- Pha động: Nước 0,5 % acetic acid (A) : methanol (B)

- SKD cho thấy nấm được phân loại 3 nhóm:

+ Nhóm 1 (quả thể tự nhiên): đặc trưng của meshimakobnol

A, 2 peak nhỏ hypholomine B và inoscavin A + Nhóm 2 (quả thể nuôi trồng): đặc trưng của 2 peak hypholomine B, inoscavin A; peak nhỏ của meshimakobnol

A + Nhóm 3 (sợi nấm nuôi cấy): không xuất hiện peak đặc trưng

- Bước sóng phát hiện: 395 nm -Pha tĩnh: cột C18

- Pha động: methanol (A), nước 0,2% phosphoric acid (B)

- Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút

- Thời gian lưu: hyppholomine B ở phút thứ 5,8; inoscavin A ở phút thứ 7,6 -Detector PDA và MS đều thích hợp phân tích hypholomine B và inoscavin A

- Hàm lượng inoscavin A dao động từ 0,32 -

(PDA); hàm lượng hypholomine B dao động từ 0,32

- 3,11 g/kg (PDA) Hàm lượng 2 hợp chất ảnh hưởng bởi vị trí địa lí

- Phương pháp phân tích đạt độ đúng cao

Bảng 2.3 tổng quan về ứng dụng phương pháp phân tích HPLC các thành phần hợp chất tự nhiên, cụ thể là phân lớp styrylpyrone cho thấy một số điều kiện phân tích thường sử dụng bao gồm pha tĩnh là cột pha đảo C18; pha động kết hợp nước với dung môi methanol hoặc actetonitrile, điều chỉnh pH bằng một số acid như formic acid, acetic acid, phosphoric acid, TFA Nhiệt độ cột phân tích được sử dụng khoảng

35 - 40 o C, tốc độ dòng đối với phương pháp HPLC là 1 mL/phút và chương trình phân tích sử dụng gradient nồng độ dung môi theo thời gian Ngoài ra, bảng 2.3, nghiên cứu số 4 của Kojima (2008) còn cho thấy inosacvin A và meshimakobol A là hai hợp chất có tiềm năng trong phân biệt nấm Phellinus theo nguồn gốc và điều kiện sinh trưởng Tuy nhiên, chỉ có nghiên cứu của tác giả Kojima dùng phương pháp HPLC để định tính inoscavin A, meshimakobnol A trong nấm P.linteus dựa trên thời gian lưu so với chất chuẩn, chưa nêu được nhiệt độ cột và bước sóng hấp thu của hai hợp chất trên, đồng thời chưa có nghiên cứu nào phát triển và thẩm định phương pháp HPLC phân tích đồng thời hai hợp chất này trong nấm thuộc chi Phellinus và Ganoderma Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đồng thời hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A bằng phương pháp HPLC-PDA là tiền đề cho các nghiên cứu xác định hàm lượng hai hợp chất này trong các loài nấm dược liệu, đặc biệt là Phellinus.

Lí thuyết cơ bản về quá trình trích ly

Trích ly là quá trình chuyển một hoặc nhiều cấu tử từ pha này sang pha khác nhằm tách toàn bộ hoặc các cấu tử mục tiêu từ nguyên liệu thô Dựa trên nguyên lí, có nhiều phương pháp trích ly khác nhau bao gồm trích ly sử dụng dung môi, chưng cất, ép, thăng hoa [54]

Hình 2 9: Mô tả quá trình trích ly các phân tử hữu cơ nhỏ trong nguyên liệu [55] Thông thường, phương pháp trích ly sử dụng dung môi được sử dụng rộng rãi trong trích ly các hợp chất tự nhiên từ nguyên liệu thô, bao gồm 5 giai đoạn [55]:

- Giai đoạn 1: Dung môi tiếp xúc bề mặt pha rắn

- Giai đoạn 2: Các cấu tử dung môi bắt đầu đi vào pha rắn theo nguyên tắc thẩm thấu và khuếch tán

- Giai đoạn 3: Dung môi tương tác với pha rắn, các chất tan được giải phóng khỏi nền mẫu

- Giai đoạn 4: Các chất tan trong pha rắn bắt đầu đi vào dung môi tạo thành dung dịch

- Giai đoạn 5: Dựa vào sự chênh lệch nồng độ, dung dịch chứa chất tan trong pha rắn di chuyển ra pha lỏng

Các giai đoạn trên xảy ra liên tục khi dung môi tiếp xúc tiếp xúc pha rắn, quá trình trích ly dừng lại khi nồng độ các chất trong hai pha đạt trạng thái cân bằng được mô tả như hình 2.10

Hình 2 10: Biểu đồ mô tả hiệu quả quá trình trích ly [56]

Quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên có thể được chia thành ba giai đoạn riêng biệt bao gồm [55]:

- Giai đoạn 1: trích ly với tốc độ không đổi, trong giai đoạn này các chất tan dễ dàng theo dung môi di chuyển ra môi trường dung dịch, cơ chế chính của quá trình chuyển khối là sự đối lưu của dung dịch giữa hai pha rắn-lỏng

- Giai đoạn 2: tốc độ trích ly giảm, trong giai đoạn này quá trình truyền khối giảm, tốc độ trích ly giảm, cơ chế chính của quá trình này là sự khuếch tán chất tan ra môi trường dung dịch

- Giai đoạn 3: khuếch tán kiểm soát, trong giai đoạn này dung môi gặp khó khăn trong quá trình tiếp xúc và đưa chất tan từ pha rắn ra môi trường chất lỏng, quá trình trích ly diễn ra chậm dần

Trạng thái cân bằng của quá trình trích ly có thể thay đổi khi có các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển khối, khuếch tán tạo ra sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha Quá trình trích ly tiếp tục diễn ra đến khi đạt trạng thái cân bằng nồng độ mới trong dung dịch.

Siêu âm và ứng dụng vào hỗ trợ trích ly các hoạt chất có hoạt tính sinh học

Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (20 kHz) Dựa vào cường độ hay năng lượng, sóng siêu âm ứng dụng trong công nghệ thực phẩm được chia thành 2 loại [57]:

- Siêu âm năng lượng thấp (công suất thấp, cường độ thấp): có tần số cao hơn

100 kHz, cường độ dưới 1 W/cm 2 , được khai thác bởi khả năng cảm biến của siêu âm Nhờ khả năng di chuyển trong nhiều môi trường khác nhau, bước sóng ngắn và đặc tính không phá hủy vật liệu, sóng siêu âm có khả năng phân biệt nhiều loại môi trường dựa trên sự khác biệt về vật liệu cấu tạo, đặc tính đàn hồi Do đó khi có sự thay đổi về cấu trúc môi trường dẫn đến sự thay đổi về khả năng lan truyền sóng Việc xác định các thay đổi về khả năng lan truyền sóng giúp xác định tính chất môi trường, từ đó ứng dụng kiểm soát chất lượng thực phẩm trước và sau thu hoạch, hoặc quá trình chế biến dầu, các sản phẩm thực phẩm chứa hàm lượng béo cao, thực phẩm nhũ hóa,…đánh giá trạng thái, kích thước hạt vật chất giúp phát hiện mật ong giả

- Siêu âm năng lượng cao (công suất cao, cường độ cao): có tần số trong khoảng 20-500 kHz, cường độ trên 1 W/cm 2 tạo ra sự biến đổi vật lí, cơ học, hóa sinh của thực phẩm Trong đó, một số nghiên cứu báo cáo rằng với sóng siêu âm ở cường độ cao (lớn hơn 10 W/cm 2 ), tần số thấp (20-40 kHz) tạo ra lực cơ học mạnh có khả năng phá hủy vật liệu [58] Đồng thời nhờ lực cơ học mạnh, sóng siêu âm có năng lượng cao được ứng dụng trong nhiều quá trình chế biến nhằm tăng cường chiết xuất, nhũ hóa, kết tinh, thay đổi cấu trúc nguyên liệu hoặc tham gia vào quá trình khử trùng thực phẩm

2.5.2 Tác động của sóng siêu âm năng lượng cao

Hiện nay, quá trình khai thác ứng dụng sóng siêu âm năng lượng cao trong thực phẩm chủ yếu dựa trên tính chất phi tuyến tính gắn liền với biên độ cao của sóng siêu âm Tính chất phi tuyến tính của sóng siêu âm cường độ cao được thể hiện qua độ biến dạng sóng (wave distortion), độ bão hòa âm thanh (acoustic saturation), áp xuất bức xạ âm thanh (radiation pressure), hiện tượng xâm thực (cavitation) trong chất lỏng và thay đổi chuyển động trong chất rắn [57] Trong trường hợp khi sóng siêu âm di chuyển trong môi trường nước, hiện tượng xâm thực có vai trò quan trọng trong tạo nên các tính chất chức năng cho việc ứng dụng sóng siêu âm cải thiện các quá trình công nghệ thực phẩm

2.5.2.1 Hiện tượng xâm thực tạo nên quá trình hình thành và phá vỡ bọt khí

Khi sóng siêu âm lan truyền trong môi trường chất lỏng, các chu trình co dãn liên tục nhờ áp suất bức xạ âm thanh tạo thành các vi bọt khí

Hình 2 11: Hiệu ứng xâm thực của sóng siêu âm [59]

Dựa vào quá trình hoạt động của vi bọt khí, quá trình xâm thực được chia thành

- Xâm thực ổn định hay xâm thực không phá vỡ (stable cavitation): quá trình này thường xảy ra ở áp xuất bức xạ âm thanh thấp Các vi bọt khí chưa đạt đến kích thước tới hạn làm vỡ các bọt khí

- Xâm thực không ổn định hay xâm thực phá vỡ (transient cavitation): khi áp xuất bức xạ âm thanh đủ lớn tạo ra các vi bóng khí vượt qua kích thước tới hạn, các bóng khí có xu hướng vỡ ra Sự phá vỡ này tạo ra một năng lượng lớn dạng cục bộ, nhiệt độ có thể đạt 5000 K, áp xuất có thể lên đến 100 Mpa [61]

2.5.2.2 Hiện tượng xâm thực làm phá vỡ bề mặt vật liệu hỗ trợ trích ly

Sự phá vỡ các bóng khí khi hiện tượng xâm thực diễn ra làm cho nhiệt độ và áp xuất tăng lên ở quy mô cục bộ Quá trình này xảy ra ngay trên bề mặt vật liệu tạo ra một lực cơ học làm phá vỡ bề mặt vật liệu giúp các chất nội bào được giải phóng ra môi trường bên ngoài Nếu môi trường có ái lực phù hợp với các chất nội bào, quá trình hòa tan các chất mục tiêu diễn ra hiệu quả hơn [62]

Hình 2 12: Cơ chế của hiện tượng xâm thực tác động đến bề mặt nguyên liệu [63]

Ngoài ra, quá trình lan truyền sóng âm trong dung dịch chất lỏng tạo ra hiện tượng vi dòng dẫn đến chất lỏng được khuấy trộn Từ đó, làm tăng quá trình truyền khối và truyền nhiệt trong dung dịch, kết hợp với hiệu ứng xâm thực dẫn đến tăng tốc độ phá vỡ bề mặt mặt liệu đẩy nhanh quá trình giải phóng các chất nội bào [64]

Hình 2 13: Hiệu ứng xâm thực tạo nên hiện tượng vi dòng [65]

(A) Vi bọt khí đối lưu ở xâm thực ổn định

(B) Vi bọt khí bị phá vỡ tạo ra hiện tượng vi dòng ở xâm thực không ổn định

Một số nghiên cứu về ứng dụng siêu âm trong quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ nấm

Có nhiều nghiên cứu báo cáo về ứng dụng siêu âm trong trích ly các hợp chất tự nhiên từ nấm Nguyên nhân chủ yếu là ứng dụng các ưu điểm từ hiệu ứng xâm thực và khả năng tạo vi xoáy từ sóng siêu âm làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dung môi với mẫu, tăng tính thấm của vách tế bào, giảm thời gian, nhiệt độ của qúa trình trích ly, nâng cao hiệu quả và hiệu suất, tiết kiệm dung môi [66]

Bảng 2 4: Ứng dụng siêu âm trong trích ly các hợp chất tự nhiên từ nấm

Thiết bị Điều kiện Hiệu quả Tham khảo

Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/25 - 1/35 g/mL Công suất: 80 - 120 W Nhiệt độ: 30 - 50 o C Thời gian: 30 - 50 phút

Hàm lượng polysaccharide đạt 7,47% trong điều kiện: nước (30,6 mL/g); công suất (109,8 W); nhiệt độ (40,2 o C), thời gian (42,2 o C)

Bể ổn nhiệt, có cánh khuấy (HWE)

Nhiệt độ: 90 o C Tốc độ cánh khuấy:

Hàm lượng polysaccharide đạt 8,21% trong điều kiện: trích ly CCPUE, nhiệt độ

60 o C, thời gian 40 phút, tỉ lệ 16/1 (v/w)

Nhiệt độ: 20 - 90 o C Tần số: 20 kHz

Nhiệt độ (20 - 90 o C) Tần số 20 kHz Chu kì siêu âm: 4 giây Thanh siêu âm (CCPUE)

Nhiệt độ (20 - 90 o C) Tần số 20 kHz Chu kì siêu âm: 2 giây

W Điều kiện thu được hàm lượng triterpenoid tối ưu: công suất 564,7 W,

Thời gian hỗ trợ siêu âm: 1 - 10 phút

Khoảng cách đầu siêu âm và mẫu: 4,5 - 11,5 cm Nhiệt độ: 50 - 90 o C Nồng độ ethanol: 60 - 95% (v/v)

Tỉ lệ: 1/20 - 1/50 g/mL thời gian hỗ trợ siêu âm 5,4 phút, khoảng cách 8,2 cm, nhiệt độ 60 o C, nồng độ ethanol 95% (v/v), thời gian 60 phút, tỉ lệ 1/50 g/mL

Nhiệt độ: 30 - 55 o C Thời gian hỗ trợ siêu âm: 8 - 20 phút

Tỉ lệ: 1/20 - 1/50 (w/v) Điều kiện thu được hàm lượng polyphenol, flavonoid, kháng oxi hóa DPPH, FRAP: nhiệt độ

44 o C, thời gian hỗ trợ trích ly 13 phút, tỉ lệ 1/20 (w/v)

Biờn độ: 20 - 100 àm Thời gian hỗ trợ siêu âm: 0 - 15 phút

Hàm lượng polysaccharide cao nhất đạt 4,17% trong điều kiện: biờn độ 100 àm, thời gian hỗ trợ 15 phút, thời gian trích ly 1 giờ, nồng độ ethanol 80% (v/v)

Thời gian: 5 - 25 phút Nhiệt độ: 30 - 70 o C

Hàm lượng triterpenoid tối đa thu được là 13,30 mg/g ở điều kiện: ethanol 80%, thời gian

Tỉ lệ: 1/10 - 1/30 (w/v) 20 phút, nhiệt độ 60 o C, tỉ lệ 1/20 (w/v)

Các nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy siêu âm thích hợp ứng dụng trong trích ly nấm do những tác động tích cực mà loại sóng cơ học này mang lại làm tăng hiệu quả và hiệu suất thu hồi các hợp chất tự nhiên có trong nguyên liệu Tổng quan về một số nghiên cứu ứng dụng siêu âm trong quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ nấm chỉ ra rằng hai phương pháp hỗ trợ sóng siêu âm được ứng dụng phổ biến hiện nay là siêu âm dạng thanh và siêu âm dạng bể đều được sử dụng trích ly nấm Các thông số được quan tâm trong khảo sát quá trình trích ly bao gồm phương pháp siêu âm (siêu âm theo chu kì hoặc siêu âm liên tục), biên độ hoặc công suất siêu âm, thời gian hỗ trợ siêu âm, nồng độ dung môi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly Qua tổng quan về sóng siêu âm cho thấy hỗ trợ siêu âm có khả năng làm tăng hoạt chất mục tiêu trong nguyên liệu Tuy nhiên, rất ít nghiên cứu ứng dụng siêu âm vào quá trình trích ly styrylpyrone trong nấm Thượng hoàng, đặc biệt là hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A Vì vậy, đề tài tiến hành ứng dụng siêu âm vào quá trình trích ly inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Phellinus igniarius ở Việt Nam Kết quả đề tài này là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng sản phẩm sau trích ly của nấm Thượng hoàng nhằm nâng cao khả năng tận dụng các hợp chất mang hoạt tính sinh học có lợi vào thực phẩm.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Nguyên liệu

3.1.1.1 Nguyên liệu nấm phân lập inoscavin A và meshimakobnol A

Nguyên liệu nấm được sử dụng cho quá trình phân lập và tách chiết inoscavin

A và meshimakobnol A thuộc loài Phellinus igniarius được thu hoạch tại khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống (Nghệ An) năm 2019, được định danh bởi PGS.TS Ngô Anh, khoa Sinh học, đại học Huế Sau thu hái, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ thường, vận chuyển về thành phố Hồ Chí Minh trong 7 ngày, nghiền nhỏ, sàng qua rây có kích thước lỗ 60 mesh, hàm ẩm ban đầu của bột nấm từ 13 - 15%, tiến hành trích ly, tinh sạch inoscavin A và meshimakobnol A Mẫu được lưu trữ tại viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh

3.1.1.2 Nguyên liệu nấm quá trình phân tích và trích ly inoscavin A và meshimakobnol A

Nguyên liệu nấm trong nghiên cứu trích bao gồm 11 loại, trong đó 1 mẫu nấm thương mại Phellinus igniarius (PS7) mua tại Công ty Linh Chi Vina (394/1, Hà Huy Giáp, phường Thạnh Lộc, quận 12, Tp Hồ Chí Minh) và 10 mẫu nấm Phellinus nilgheriensis (PS1), Phellinus baumii (PS2), Phellinus linteus (PS3), Phellinus linteus (PS4), Phellinus pomaceus (PS5), Phellinus pini (PS6), Phellinus igniarius

(PS8), Ganoderma applanatum (GS1), Ganoderma australe (GS2), Ganoderma brownii (GS3) thu hái tại khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống (Nghệ An) năm 2022 được sử dụng cho nghiên cứu phân tích hàm lượng inoscavin A, meshimakobol A Các loài nấm trong nghiên cứu định danh bởi PGS.TS Lê Xuân Thám, nguyên giám đốc Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Lâm Đồng Mẫu Phellinus igniarius (PS8) được sử dụng cho các nghiên cứu quá trình trích ly Hình ảnh mẫu được trình bày như phụ lục

1 Quả thể nấm được nghiền nhỏ, sàng qua rây có kích thước lỗ 60 mesh, hàm ẩm ban đầu của bột nấm từ 13 - 15%, sau đó, bột quả thể nấm được hút chân không, bảo quản ở -20 o C đến khi trích ly và phân tích.

Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm, trường đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

- Từ 2019-2022: tiến hành trích ly, tinh sạch và xác định công thức cấu tạo hai marker inoscavin A và meshimakobnol A từ Phellinus igniarius

- Từ 2022-2023: tiến hành phát triển phương pháp phân tích HPLC đồng thời inoscavin A, meshimakobnol A và nghiên cứu quá trình trích ly có hỗ trợ siêu âm hai hợp chất này trong nguyên liệu nấm Phellinus igniarius.

Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

Bảng 3 1: Dung môi sử dụng cho nghiên cứu

STT Hóa chất Kí hiệu hóa học Trạng thái Xuất xứ

1 Nước cất H2O Lỏng Việt Nam

2 Cồn thực phẩm C2H5OH Lỏng Việt Nam

3 Nước (đạt chuẩn phân tích HPLC)

4 Methanol (đạt chuẩn phân tích

5 Acid formic (đạt chuẩn phân tích

Thiết bị siêu âm dạng thanh Vibra-Cell VCX-500, Sonics®, USA như hình 3.1

Hình 3 1: Thiết bị siêu âm dạng thanh Thiết bị bể siêu âm Sonica 2200 EP, Soltec®, Italy như hình 3.2

Hình 3 2: Thiết bị siêu âm dạng bể Thiết bị cô quay chân không IKA® RV 10, Germany như hình 3.3

Hình 3 3: Thiết bị cô quay chân không Thiết bị đông khô ScanVac Coolsafe 9L, Labogene, Denmark như hình 3.4

Hình 3 4: Thiết bị đông khô

Thiết bị phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-2030C 3D ghép nối detector PDA (hình 3.5) Sử dụng cột VertiSep™ GES C18 HPLC column (250 mm ì 4,6 mm, 5,0 àm) cho phõn tớch HPLC (hỡnh 3.6)

Hình 3 5: Thiết bị HPLC và cột sử dụng phân tích sắc kí lỏng

Hình 3 6: Thiết bị sắc kí điều chế Agilent 1260 Infinity MWD VL (G1365D) Thiết bị đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Bucker 500 MHz như hình 3,7

Hình 3 7: Thiết bị đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Một số dụng cụ khác bao gồm becker, erlen, ống đong, đũa thủy tinh, bình định mức,… được sử dụng cho các thí nghiệm.

Phân lập và xác định chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A

3.3.1 Quy trình phân lập inoscavin A và meshimakobnol A

Nguyên liệu Phellinus igniarius thu hái tại khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống (Nghệ An), tiến hành trích ly, phân lập 2 hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A theo phương pháp công bố ở tài liệu tham khảo [3, 43]

Sơ đồ 3 1: Sơ đồ tách chiết và tinh sạch thu được chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A

Quả thể nấm P.igniarius (11kg) sau khi thu hái, tiến hành xay nhỏ thành dạng bột Sau đó, nguyên liệu được trích ly với ethanol 98% (20L) trong 7 ngày, sau đó tiến hành lọc lấy dịch, cô quay chân không thu hồi cao chiết EtOH bảo quản ở -4 o C Quá trình được lập lại 3 lần Tất cả cao chiết EtOH thu được (700g), thực hiện chiết lỏng-lỏng 3 lần với nước và các dung môi độ phân cực tăng dần (hexan, ethyl acetate) Thu gom dịch chiết phân đoạn EtOAc, loại dung môi bằng thiết bị cô quay chân không thu được phân đoạn cao EtOAc (56g) Tiến hành sắc kí cột phân đoạn cao EtOAc với pha tĩnh là silicagel, nhiệt độ phòng (30 - 32 o C), hệ dung môi rửa giải chloroform:methanol (C:M) gradient độ phân cực tăng dần theo thứ tự 100:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 4:1 thu được 5 phân đoạn chính

PBE 1 PBE 2 PBE 3 PBE 4 PBE 5

- Phân đoạn PBE 3 tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi rửa giải C:M = 30:1 thu được PIE-01 (120 mg), sau đó tiếp tục quá trình tinh chế sắc kí bằng thiết bị LC với cột

Luna C18, rửa giải với pha động methanol:nước M:W = 20:1, tốc độ dòng 2,0 mL/phút thu được inoscavin A (45 mg) sử dụng như chất chuẩn phân tích

- Phân đoạn PBE 5 tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi rửa giải C:M = 10:1 thu được PBE-02 (20 mg), sau đó tiếp tục quá trình tinh chế sắc kí bằng thiết bị LC với cột

Luna C18, rửa giải với pha động methanol:nước M:W = 4:1, tốc độ dòng 2,0 mL/phút thu được thu được meshimakobnol A (5 mg) sử dụng như chất chuẩn phân tích

3.3.2 Xác định chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A

Theo Dược điển Việt Nam V “Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học, vật lí và sinh học” Chất chuẩn hay chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng, thông thường từ 95% tổng thành phần trở lên [73, 74] Sau khi thực hiện tách chất bằng các kĩ thuật sắc kí, kiểm tra độ tinh khiết sơ bộ bằng kĩ thuật Thin-layer chromatography (TLC) Nếu trên bản mỏng chỉ có 1 vệt chất duy nhất trong 3 hệ dung môi: phân cực, trung bình, không phân cực thì tiến hành kiểm tra lại độ tinh khiết và xác định cấu trúc của mẫu inoscavin A và meshimakobnol A bằng dữ liệu phổ NMR, so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo về phân lập hai hai hợp chất inoscavin A [31, 43] và meshimakobnol A [35] trước đó để so sánh và xác định cấu trúc hóa học Kết hợp với sắc kí đồ HPLC để kiểm tra độ tinh khiết và thu nhận mẫu inoscavin A và meshimakobnol A được sử dụng như chất chuẩn cơ sở Điều kiện ghi phổ: Đối với inoscavin A: sử dụng dung môi Acetone D6, đo phổ 1 H-NMR tần số 500MHz, phổ 13 C-NMR tần số 125 MHz Đối với meshimakobnol A: sử dụng dung môi DMSO D6, đo phổ 1 H-NMR tần số 500MHz, phổ 13 C-NMR tần số 125 MHz

Xác định độ tinh khiết của chất chuẩn bằng cách kết hợp dữ liệu phổ NMR và sắc kí đồ thu được từ phương pháp phân tích sắc kí lỏng HPLC Độ tinh khiết của chất chuẩn được tính dựa trên diện tích peak của chất chuẩn so với tổng diện tích của các peak xuất hiện trên sắc kí đồ thu được theo công thức sau: Độ tinh khiết = 𝑥 1

Trong đó: x1: diện tích peak chất chuẩn (inoscavin A và meshimakobnol A) x0: tổng diện tích các peak của sắc kí đồ

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng inoscvain A và meshimakobnol

Tổng quan tài liệu tham khảo, kết hợp sắc kí đồ phân tích HPLC, tiến hành phát triển phương pháp phân tích 2 chất chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A Khảo sát một số điều kiện phân tích ảnh hưởng đến quá trình phân tách peak trên sắc kí đồ Chọn ra điều kiện phù hợp cho quá trình phân tích đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A

Thẩm định phương pháp phân tích là quá trình đánh giá, kiểm tra lại phương pháp phân tích đảm bảo rằng kết quả phân tích của quy trình có tính phù hợp Thông thường, khi phát triển hoặc sửa đổi một phương pháp phân tích, quá trình thẩm định là yêu cầu cần thiết nhằm đảm bảo các kết quả phân tích có độ chính xác trong một khoảng chấp nhận và phụ thuộc vào mức độ sửa đổi hoặc tính mới của phương pháp Quy trình thẩm định một phương pháp phân tích thường tuân theo một bộ các thử nghiệm đươc tiêu chuẩn hóa Một số hướng dẫn về quy trình thẩm định phương pháp phân tích thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm như quy định của AOAC, ICH, Eurachem,…[75]

Sau khi xác định inoscavin A và meshimakobnol A thu được đạt yêu cầu của một chất tinh khiết sử dụng làm chất chuẩn, tiến hành phát triển phương pháp phân tích định lượng đồng thời 2 hợp chất này bằng phương pháp HPLC-PDA Để phát triển phương pháp định lượng, tiến hành khảo sát các điều kiện thích hợp về hệ dung môi rửa giải của pha động, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện phù hợp đối với chất phân tích Dựa trên kết quả thu được từ sắc kí đồ, tiến hành định tính inoscavin A và meshimakobnol A dựa trên thời gian lưu của mẫu so với chất chuẩn, định lượng theo phương pháp ngoại chuẩn Để đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của Eurachem (2014) [76] dựa trên các tiêu chí sau đây:

- Tính đặc hiệu (hay độ chọn lọc): xác định khả năng xuất hiện peak của mẫu so với chất chuẩn và mẫu trắng dựa trên thời gian lưu của chất chuẩn

- Tính chính xác (độ chọn lọc/độ lập lại): là tiêu chí cơ bản và quan trọng trong thẩm định một phương pháp phân tích Phép thử xác định khả năng xuất hiện peak của cùng một mẫu hoặc chuẩn ở cùng 1 thời gian lưu của nhiều lần thí nghiệm khác nhau Tính chính xác được xác định bằng cách chạy lập lại dung dịch chất phân tích

6 lần trên cùng 1 điều kiện phân tích và đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn (%RSD) giữa các lần chạy của thời gian lưu và diện tích peak Độ lệch chuẩn (%RSD) của phép thử thỏa mãn %RSD ≤ 2

- Tính tuyến tính: là khoảng giá trị nồng độ của chất phân tích mà ở đó có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị đo y (chiều cao hoặc diện tích peak) so với nồng độ chất cần xác định Phương trình hồi quy tuyến tính (Y = aX + b) của chất cần phân tích được thiết lập thông qua phương pháp bình phương tối thiểu để xác định các giá trị tự do của phương trình Phương trình hồi quy được đánh giá thông qua hệ số xác định R 2 , thông thường đối với phép định lượng R 2 ≥ 0,98 Phương trình hồi quy tuyến tính và giá trị R 2 ,r được tính toán bởi phần mềm Labsolution

- Giới hạn phát hiện (Limit of detection/LOD) và giới hạn định lượng (Litmit of/ quantitation/LOQ):

+ Giới hạn phát hiện là nồng độ nhỏ nhất mà ở đó peak của chất phân tích được xác định đáng tin cậy sau khi loại nhiễu của nền Để xác định LOD, tiến hành phân tích mẫu (mẫu, mẫu chuẩn, hoặc mẫu thêm chuẩn) ở nồng độ thấp nhất mà peak của chất phân tích còn xuất hiện và tín hiệu peak lớn gấp 2-3 lần tín hiệu nhiễu của nền (S/N, trong đó S là chiều cao peak của chất phân tích, N là tín hiệu nhiễu của nền)

+Giới hạn định lượng (LOQ) là giới hạn nồng độ nhỏ nhất có khả năng định lượng của phương pháp phân tích, thông thường giới hạn định lượng có thể được xác định thông qua giới hạn phát hiện theo công thức:

- Độ lập lại là thông số đánh giá sai số ngẫu nhiên của phương pháp phân tích Trong đó, các kết quả thử nghiệm của phương pháp phân tích được thực hiện trong cùng điều kiện của phòng thí nghiệm, thiết bị, người thực hiện, trong thời gian ngắn và các mẫu phân tích phải đảm bảo giống nhau Kết quả của độ lập lại thường được thể hiện và đánh giá thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) [77]

- Độ đúng của một phép phân tích là đại lượng đặc trưng của phương pháp phân tích thể hiện mức độ gần đúng của kết quả phân tích khi so sánh với giá trị thực Thông thường có 3 cách để xác định độ đúng của một phương pháp phân tích [78]: + Sử dụng chất chuẩn đối chiếu (Certified reference materials/CRMs) tiến hành phân tích và xác định sự khác nhau của giá trị phân tích và giá trị thực của chất chuẩn đối chiếu Sự khác biệt của 2 giá trị này được tính bằng chỉ số Z-score ≤ 2

+ Sử dụng phương pháp thêm chuẩn (Spiking method): tiến hành thêm chất chuẩn vào mẫu thực ở các nồng độ khác nhau Độ đúng được đánh giá thông qua độ thu hồi (tính theo tỉ lệ phần trăm) của mẫu thêm chuẩn so với mẫu thực Độ thu hồi của phương pháp phân tích được xem là phù hợp khi nằm trong khoảng giá trị xác định của AOAC Độ thu hồi (Recovery, Re) được tính theo công thức:

Trong đó: xo: nồng độ chất chuẩn thờm vào mẫu (àg/mL) x1: nồng độ ban đầu của mẫu (àg/mL) x2: nồng độ mẫu thờm chuẩn (àg/mL)

+ So sánh phương pháp đang phân tích với một phương pháp tiêu chuẩn

Trong phạm vi luận văn tiến hành xác định độ đúng theo phương pháp thêm chuẩn để xác định độ đúng của quá trình thẩm định phương pháp phân tích.

Định lượng đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A bằng phương pháp phân tích HPLC trên một số mẫu nấm Phellinus và Ganoderma

3.5.1 Phương pháp trích ly mẫu nấm Phellinus và Ganoderma

Quả thể nấm được xây thành dạng bột (kích thước khoảng 60 mesh), sau đó tiến hành trích ly theo phương pháp của Dokhaharani (2021) và Vượng (2021) với một số thay đổi phù hợp điều kiện thí nghiệm [79, 80] Các mẫu nấm được cân khối lượng 10 ± 0,0001 g phá mẫu trong điều kiện siêu âm (Vibra-Cell VCX-500, Sonics®, USA) tần số 20 kHz, biờn độ 31,5àm, ethanol 80%, nhiệt độ phũng 30-32 o C, thể tớch

200 mL Thêm ethanol 80% cho vừa đủ 300 mL, tiến hành trích ly trong bể siêu âm (Sonica 2200 EP, Soltec®, Italy) điều kiện nhiệt độ 60 o C, thời gian 280 phút Sau khi trích ly, lọc (giấy lọc Whatman®, số 4) chân không thu dịch Sau đó cô quay chân không (IKA® RV 10, Germany) ở nhiệt độ 40 o C và đông khô (ScanVac Coolsafe 9L, Labogene, Denmark) thành bột Sản phẩm sau đông khô được bảo quản ở tủ lạnh -

20 o C đến khi thí nghiệm và phân tích Hàm lượng chất phân tích được xác định thông qua giá trị trung bình của 3 lần lập lại

3.5.2 Phương pháp phân tích mẫu nấm Phellinus và Ganoderma

Cân bột nấm sau đông khô (0,0100 ± 0,0001 g), chuyển vào bình định mức 10 ml, định mức bằng hỗn hợp methanol và nước điều chỉnh pH bằng acid formic pH 2,2 với tỉ lệ 1 : 1 (v/v), đặt vào bể siêu âm trong 10 phút Sau đó, lọc loại bỏ cặn trong dung dịch bằng giấy lọc Whatmanđ số 4 Tiờm mẫu 20 àL bằng autosampler, tiến hành phân tích HPLC.

Khảo sát quá trình trích ly có sự hỗ trợ sóng siêu âm trên nấm Thượng hoàng (P.igniarius)

3.6.1 Sơ đồ trích ly thu nhận inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng hoàng

Sơ đồ 3 2: Sơ đồ trích ly thu nhận bột nấm chứa inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng hoàng

- Nguyên liệu: nấm Thượng hoàng (P igniarius) được nghiền nhỏ, sàng qua rây có kích thước lỗ 60 mesh, xác định hàm ẩm ban đầu của bột nấm Tiến hành hút chân không và bảo quản bột nấm ở nhiệt độ -20 o C đến khi trích ly và phân tích

- Cân 10 ± 0,0001g bột nấm, cho 60 mL nước cất (đối với thí nghiệm nồng độ ethanol từ 60, 70, 80, 90% v/v , lượng nước sử dụng là 120, 90, 60, 30 mL tương ứng) vào becker 250 mL, tiến hành đun cách thủy ở nhiệt độ 85 o C trong 55 - 65 giây, sau đó cho 100 mL cồn thực phẩm vào becker (tổng thể tích là 160 mL), làm lạnh ở 0 o C trong 20 phút

- Sau khi làm lạnh, mẫu được xử lí bằng thanh siêu âm ở tần số và thời gian như bố trí thí nghiệm mục 3.6.2, đầu thanh siêu âm được cố định ở giữa, cách đáy becker 0,5 cm

- Thời gian hỗ trợ siêu âm

Xác định hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A

- Sau khi phá mẫu bằng thanh siêu âm (Vibra-Cell VCX-500, Sonics®, USA), thêm cồn thực phẩm vào becker vừa đủ 300 mL (nồng độ ethanol 80%, v/v) Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình trích ly bằng bể siêu âm (Sonica 2200 EP, Soltec® , Italy), như sơ đồ trích ly và bố trí thí nghiệm mục 3.6.2

- Sau khi trích ly, tiến hành cô quay chân không ở 40 o C, loại dung môi thu hồi dịch chiết nấm Thượng hoàng

- Lấy dịch chiết nấm sau khi cô quay đông khô (48 giờ) thu nhận bột nấm Thượng hoàng và xác định hàm lượng inoscavin A, meshimakobnol A

3.6.2 Bố trí thí nghiệm trích ly nấm Thượng hoàng

Nội dung: Xác định ảnh hưởng các yếu tố công nghệ quá trình trích ly đến hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A Nghiên cứu tiến hành khảo sát 5 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bao gồm biên độ siêu âm, thời gian hỗ trợ siêu âm, hàm lượng ethanol, nhiệt độ và thời gian trích ly Sau khi tổng quan và tham khảo một số nghiên cứu trước về trích ly nấm, chọn vùng khảo sát được thể hiện như trong bảng 3.2

Bảng 3 2: Các yếu tố khảo sát quá trình trích ly

Thí nghiệm Yếu tố khảo sát

Thời gian siêu âm (phút)

Thời gian trích ly (phút)

3.5.2.1 Yếu tố biên độ siêu âm

Thí nghiệm 1 : ảnh hưởng biên độ siêu âm như sơ đồ 3.2 với khoảng khảo sát từ 0 - 50,4 àm, thời gian hỗ trợ siờu õm cố định 5 phỳt, hàm lượng ethanol 80%, nhiệt độ 40 o C, thời gian trích ly 80 phút Giá trị biên độ siêu âm thu được inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất được chọn tiến hành thí nghiệm tiếp theo Bảng 3.3 thể hiện kí hiệu khảo sát ảnh hưởng biên độ siêu âm

Bảng 3 3: Khảo sát sự ảnh hưởng biên độ siêu âm

Biờn độ (àm) Kớ hiệu mẫu

Thời gian siêu âm (phút)

Thời gian trích ly (phút)

3.5.2.2 Yếu tố thời gian hỗ trợ siêu âm

Thí nghiệm 2: ảnh hưởng thời gian hỗ trợ siêu âm như sơ đồ 3.2 với khoảng khảo sát từ 1 - 7 phút như bảng 3.4, biên độ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 1, cố định hàm lượng ethanol 80%, nhiệt độ 40 o C, thời gian trích ly 80 phút Giá trị thời gian hỗ trợ siêu âm tương ứng với hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất được chọn cho thí nghiệm tiếp theo

Bảng 3 4: Khảo sát sự ảnh hưởng thời gian hỗ trợ siêu âm

Thời gian hỗ trợ siêu âm (phút)

Thời gian trích ly (phút)

1 C1 Biên độ phù hợp được

3.5.2.3 Yếu tố nồng độ dung môi

Thí nghiệm 3 : ảnh hưởng hàm lượng ethanol như sơ đồ 3.2, trong khoảng khảo sát từ 60 - 80% được khảo sát như bảng 3.5, biên độ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 1, thời gian hỗ trợ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 2, nhiệt độ 40 o C, thời gian trích ly 80 phút Giá trị nồng độ dung môi tương ứng có inoscavin A và mehsimakobnol A cao nhất được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 3 5: Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ dung môi

Thời gian hỗ trợ siêu âm (phút)

Thời gian trích ly (phút)

60 E1 Biên độ phù hợp được chọn từ thí nghiệm 1

Thời gian hỗ trợ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 2

Thí nghiệm 4 : ảnh hưởng nhiệt độ như sơ đồ 3.2 trong khoảng khảo sát từ 30

- 40 o C được khảo sát như bảng 3.6, biên độ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 1, thời gian hỗ trợ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 2, hàm lượng ethanol được chọn từ thí nghiệm 3, thời gian trích ly 80 phút Giá trị nhiệt độ tương ứng có hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 3 6: Khảo sát sự ảnh hưởng nhiệt độ trích ly

Thời gian hỗ trợ siêu âm (phút)

Thời gian trích ly (phút)

60 TE1 Biên độ phù hợp được chọn từ thí nghiệm 1

Thời gian hỗ trợ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 2

Nồng độ dung môi được chọn từ thí nghiệm 3

3.5.2.5 Yếu tố thời gian trích ly

Thí nghiệm 5 : ảnh hưởng thời gian trích ly như sơ dồ 3.2, trong khoảng khảo sát từ 0 - 120 phút được khảo sát như bảng 3.7, biên độ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 1, thời gian hỗ trợ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 2, hàm lượng ethanol được chọn từ thí nghiệm 3, nhiệt độ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 4 Giá trị thời gian tương ứng có hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất được chọn làm điều kiện trích ly tốt nhất trong phạm vi thí nghiệm

Bảng 3 7: Khảo sát sự ảnh hưởng thời gian trích ly

Thời gian hỗ trợ siêu âm (phút)

0 TI1 Biên độ phù hợp được chọn từ thí nghiệm 1

Thời gian hỗ trợ siêu âm được chọn từ thí nghiệm 2

Nồng độ dung môi được chọn từ thí nghiệm 3

Nhiệt độ được chọn từ thí nghiệm 4

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A

Trong phạm vi luận văn, inoscavin A và meshimakobnol A được xem là hai hợp chất mục tiêu phân lập từ quả thể nấm Thượng hoàng (P igniarius), quá trình phân lập được trình bày cụ thể ở phần thực nghiệm 3.1 Kết quả của quá trình trích ly, tinh sạch cao ethanol thu được 2 hợp chất inoscavin A (45 mg), meshimakobnol

A (5 mg) Tiến hành đo, phân tích phổ bằng phương pháp NMR xác định cấu trúc đặc trưng của 2 hợp chất và so sánh kết quả với các nghiên cứu đã công bố trước đây để định danh 2 hợp chất trên

4.1.1 Xác định cấu trúc hợp chất inoscavin A

Kết quả đo phổ NMR và cấu trúc hóa học của hợp chất PBE-01 được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1

Phổ 1 H-NMR xuất hiện các tín hiệu proton nhân thơm 7,09 ppm (dd; 2,0; 8,3; H-13); 7,20 ppm (d; 2,0; H-9); 6,89 ppm (d; 8,3; H-12); 6,66 ppm (dd; 2,3; 8,4; H- 11’); 6,82 ppm (d; 2,3; H-7’); 6,84 ppm (d; 8,4; H-10’) đặc trưng cho hệ thống ABX của vòng benzen tại vị trí 2, 5, 6; tín hiệu của hai nhóm methyl liên kết đôi dạng trans ở 7,42 ppm (d; 16,0; C-7); 6,82 ppm (d; 16,0; H-6)

Phổ 13 C-NMR của hợp chất PBE-01 xuất hiện 25 tín hiệu carbon, một tín hiệu nhóm cacbonyl ở 200,4 ppm (C-3’) và 190,2 ppm (C-3’), ba cacbon gắn oxy 158,3 ppm (C-1), 175,2 ppm (C-3), 166,0 ppm (C-5), bốn carbon nhân thơm gắn nhóm hydroxyl 148,6 ppm (C-11), 147,7 ppm (C-9’), 146,4 ppm (C-10), 145,7 ppm (C-8’) Bảng 4 1: Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của inoscavin A và so sánh với công bố [43]

“ * ”: dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR theo công bố số [43]

Từ dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR (phụ lục 2) và so sánh với công bố số [43] có thể kết luận hợp chất PBE-01 là hợp chất inoscavin A

Hình 4 1: Công thức hóa học của inoscavin A (1)

4.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất meshimakobnol A

Kết quả đo phổ NMR và cấu trúc hóa học của hợp chất PBE-02 được thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.2

Phổ 1 H-NMR xuất hiện các tín hiệu proton nhân thơm 7,00 ppm (dd; 2,0; 8,0; H-8’); 6,79 ppm (d; 8,0; H-7’); 7,08 (d; 2,0; H-4’) đặc trưng cho hệ thống ABX của vòng benzen tại vị trí 2, 5, 6; hai tín hiệu proton methyl liên kết đôi dạng trans tại vị trí 1’, 2’có δ H tương ứng 6,79 ppm (d; 16,0; H-1’); 7,29 ppm (d; 16,0; H-2’); ba tín hiệu proton thuộc vùng thơm 6,73 ppm (s; H-4), 7,52 ppm (s; H-7), 8,35 ppm (s; H- 10)

Phổ 13 C-NMR xuất hiện 20 tín hiệu carbon, trong đó bao gồm bốn carbon trên nhân thơm gắn nhóm hydroxyl 145,6 (C-5’); 146,9 ppm (C-8); 147,8 (C-6’); 153,6 ppm (C-9); bốn carbon gắn oxy 158,4ppm (C-3); 158,7 ppm (C-6); 159,5 ppm (C-1); 160,8 ppm (C-4a)

Bảng 4 2: Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của meshimakobnol A và so sánh với công bố số [35]

Vị trí cacbon δ 1 H (J, Hz) δ 1 H * (J, Hz) δ 13 C δ 13 C *

“ * ”: dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR theo công bố số [35]

Từ dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR (phụ lục 2) so sánh với dữ liệu phổ công bố số [35] có thể kết luận hợp chất PBE-02 là hợp chất meshimakobnol A

Hình 4 2: Cấu trúc hóa học của meshimakobnol A (2)

4.1.3 Xác định độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A

Sử dụng phương pháp HPLC để phân tích từng chất chuẩn inoscavin A, meshimakobnol A Dựa trên sắc kí đồ thu được, tiến hành xác định peak chất chính, Việc xác định độ tinh khiết của chất chuẩn được áp dụng phương pháp tổng diện tích

(B) Hình 4 3: Sắc kí đồ thể hiện độ tinh khiết chất chuẩn (A) inoscavin A (B) meshimakobnol A

Sắc kí đồ hình 4.3 và bảng 4.3 thu được cho thấy inoscavin A tinh sạch có thời gian lưu ở phút 27,0, nhiễu nền thấp, xuất hiện peak tạp chất ở phút 29,8, không trùng lắp và tách hoàn toàn với peak chuẩn, dựa trên tổng diện tích peak của sắc kí đồ, độ tinh khiết inoscavin A là 95,01%, phù hợp sử dụng làm chất chuẩn phân tích

Sắc kí đồ meshimakobnol A tinh sạch có thời gian lưu ở phút thứ 34,4, peak tạp xuất hiện ở phút thứ 35,5, không trùng lắp và tách hoàn toàn với peak chuẩn, dựa

Datafile Name:MeshA.388.lcd Sample Name:MeshA.388 Sample ID:MeshA.388

395nm,4nm trên tổng diện tích peak của sắc kí đồ, độ tinh khiết của meshimakobnol A đạt 97,93%, phù hợp sử dụng làm chất chuẩn phân tích

Bảng 4 3: Dữ liệu xác định độ tinh khiết của inoscavin A và meshimakobnol A

Peak chính Tạp chất Peak chính Tạp chất

Diện tích peak 539590 28327 238543 4941 Độ tinh khiết 95,01% 97,93%

Phát triển phương pháp định lượng inoscavin A và meshimakobnol A bằng HPLC

Trong phạm vi luận văn, sử dụng phương pháp HPLC-PDA phân tích đồng thời 2 hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A Hai yếu tố bao gồm nhiệt độ và bước sóng hấp thụ được chọn để khảo sát cho quá trình phân tích sắc kí

4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phân tách inoscavin A và mehsimakobnol A

Trong phân tích HPLC, nhiệt độ là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng phân tách các chất Nhiệt độ cao có thể đẩy nhanh quá trình rửa giải các chất ra khỏi cột [53], các peak được tách có độ phân giải (Rs) cao [81] Tuy nhiên, khả năng tách các chất còn được đánh giá thông qua sự cân đối của các peak trên sắc kí đồ Hệ số bất đối cao cho thấy độ rộng nửa sau của peak lớn, hình thành các đuôi peak, ảnh hưởng khả năng tách của peak cần xác định với peak liền kề Phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình di chuyển các chất trong cột sắc kí, dẫn đến độ phân giải và khả năng tách các chất khác nhau [82] Trong phần khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng phân tách, cố định các điều kiện về cột sắc kí, chương trình rửa giải, tốc độ pha động (bảng 4.6), thay đổi nhiệt độ từ 30 - 40 o C Kết quả phân tách các peak được đánh giá thông qua hình dáng peak trên sắc kí đồ và độ bất đối (Asys) được thể hiện ở bảng 4.4 và sắc kí đồ hình 4.4

Bảng 4 4: Độ bất đối (Asys) của peak inoscavin A và meshimakonol A

W: độ rộng chõn peak ở độ cao 10% so với chiều cao peak; W a : độ rộng ẵ peak đầu; A sys : độ bất đối của peak

Theo phân phối Gauss, một peak có hình dạng cân đối, độ bất đối dao động trong khoảng 1 ≤ Asys ≤ 2,76 Khi độ bất đối càng lớn, hiện tưởng kéo vệt tăng, dẫn đến khả năng tách peak kém [83] Kết quả độ bất đối ở bảng cho thấy đối với inoscavin A, độ bất đối tăng dần theo thứ tự 40 < 30 < 35 o C, trong khi Asys tăng dần theo thứ tự 30 < 35 < 40 0 C đối với meshimakobnol A Độ bất đối của meshimakobnol

A ở 40 o C là 5,105 dẫn đến peak kéo vệt, tách peak kém, khả năng xác định hàm lượng chất trong mẫu giảm do các peak chồng lên nhau Trong khi độ bất đối của inoscavin

A và meshimakobnol A ở 35 o C cao hơn 30 o C cho thấy khả năng tách peak ở 30 o C tốt hơn 35 o C (hình 4.4) Vì vậy, chọn nhiệt độ 30 o C cho quá trình phân tích đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A

Nhiệt độ: 30 o C (xanh lá); 35 o C (nâu); 40 o C (xanh dương)

Hình 4 4: Sắc kí đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến peak inoscavin A và meshimakobnol

4.2.2 Ảnh hưởng bước sóng đến phát triển phương pháp định lượng inoscavin

A và meshimakobnol A Đối với phát triển phương pháp phân tích sử dụng detector PDA, việc tìm được bước sóng phù hợp nhằm thu được sắc kí đồ có peak (diện tích, chiều cao) đủ lớn để có thể định tính và định lượng đồng thời nhiều hợp chất hữu cơ là cần thiết Inoscavin

A và meshimakobnol A là hai hợp chất thuộc phân lớp styrylpyrone có bước sóng hấp thụ UV đặc trưng ở 380 - 420 và 245 - 255 nm Để xác định bước sóng phù hợp cho phân tích đồng thời 2 hợp chất này, tiến hành tiêm mẫu hỗn hợp chứa chuẩn inoscavin A và meshimakobnol A, sử dụng detector PDA và phần mềm Labsolution quan sát sự hấp thu của hai chất này ở các bước sóng 250, 295, 330, 395 nm [31, 35, 42] Sắc kí đồ kết quả bước sóng ảnh hưởng đến khả năng hấp thu inoscavin A và meshimakobnol A được thể hiện ở bảng 4.5

Bảng 4 5: Dữ liệu xác định bước sóng cho inoscavin A và meshimakobnol A

Inoscavin A Meshimakobnol A Chiều cao Diện tích peak Chiều cao Diện tích peak

Quan sát sắc kí đồ hình 4.5 và bảng 4.5, bước sóng hấp thu cho thấy cả hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A đều có khả năng hấp thu cực đại ở bước sóng 395 nm trong vùng UV Kết quả trên tương tự với nghiên cứu của DanShou (2016) về phân tích đồng thời 2 hợp chất inoscavin A và hypholomine B (thuộc lớp chất styrylpyrone) sử dụng bước sóng 395 nm cho quá trình phân tích [53]

Bước sóng: 250 nm (đen); 295 nm (xanh dương); 330 nm (xanh lá); 395 nm (đỏ)

Hình 4 5: Sắc kí đồ ảnh hưởng bước sóng đến peak inoscavin A và meshimakobnol A

Sau khi xác định điều kiện phân tích bao gồm nhiệt độ, bước sóng hấp thụ và điều chỉnh hệ thống sắc kí lỏng HPLC-PDA, kết quả thu được quy trình phân tích đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A được trình bày ở bảng 4.6

Bảng 4 6: Điều kiện HPLC phân tích đồng thời inoscavin A và mehsimakobnol A

Cột (pha tĩnh) VertiSep™ GES C18 HPLC (250 mm ×

Tốc độ dòng 0,8 mL/phút

Bước sóng hấp thu 395 nm

Pha động Methanol (A) và formic acid solution pH = 2,2 (B) Chương trình rửa giải 0 - 3 phút, 25% (A), 3 - 10 phút, 25 -

Thẩm định phương pháp phân tích

Khi nghiên cứu phát triển một phương pháp phân tích nói chung và phân tích sắc kí bằng HPLC-PDA nói riêng, thẩm định để đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích là một nội dung quan trọng cần thực hiện để xác định năng lực định tính, định lượng của phương pháp trước khi áp dụng để phân tích mẫu thực tế Quy trình thẩm định phương pháp phân tích được trình bày ở mục 3.4 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích được thể hiện ở bảng 4.7

Bảng 4 7: Kết quả thẩm định phương pháp phân tích

Phương trình hồi quy Y = aX + b a = 59621,6 b = -694,057

LOQ (mg/L) 0,04 0,17 Độ lập lại, RSD% (n=9);

0,8182 0,7577 Độ chính xác trung gian,

Diện tích peak, RSD% 28695 (0,4704) 260388 (0,2941) Thời gian lưu, phút,

26,7828 (0,0395) 34,4285 (0,0456) Độ đúng (độ thu hồi)

4.3.1 Độ đặc hiệu của phương pháp Độ đặc hiệu của phương pháp được xác định thông qua phân tích và so sánh thời gian lưu của sắc kí đồ mẫu trắng (hình 4.6 (A)) với sắc kí đồ hỗn hợp chất chuẩn Kết quả cho thấy peak chuẩn inoscavin A có thời gian lưu tr = 26,546; peak chuẩn meshimakobnol A có thời gian lưu tr = 34,046 (hình 4.6 (B)) Tương ứng với thời gian lưu của 2 chất chuẩn, không xuất hiện peak ở sắc kí đồ mẫu trắng chứa dung môi Kết quả cho thấy phương pháp phân tích có độ đặc hiệu cao đối với inoscavin

(B) Hình 4 6: Sắc kí đồ thể hiện độ đặc hiệu của phương pháp phân tích A) mẫu trắng

4.3.2 Độ ổn định Độ ổn định của phương pháp được thực hiện bằng 6 lần phân tích độc lập dung dịch chuẩn hỗn hợp inoscavin A và meshimakobnol A Độ ổn định hệ thống được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) diện tích peak và thời gian lưu của sắc kí đồ thu được Kết quả giá trị %RSD về thời gian lưu, diện tích peak đối với inoscavin A và meshimakobnol A được thể hiện ở bảng 4.7 đều bé hơn 2% , cho thấy phương pháp có độ lập lại tốt, ổn định khi phân tích đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A

Datafile Name:0.8m L.30C.2.lcd Sam ple Name:0.8m L Sam ple ID:0.8mL

Phương trình tuyến tính (phụ lục 3) được xây dựng bằng cách phân tích HPLC- PDA đối với các dung dịch chuẩn chứa đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A với các nồng độ 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5; 5 ppm đối với inoscavin A và 1,5; 3,75; 7,5; 15; 37,5; 75 ppm đối với meshimakobnol A như điều kiện được mô tả ở bảng 4.7 Diện tích peak của mỗi chất được ghi nhận, áp dụng phương pháp bình phương tối thiểu tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak (y) và nồng độ các chất (x) Kết quả được thể hiện ở bảng 4.7 cho thấy trong khoảng nồng độ 0,1 - 5 ppm (inoscavin A), 1,5 - 75 ppm (meshimakobnol A) có sự tương quan tuyến tính tốt với hệ số xác định R 2 = 0,9999 (inoscavin A), R 2 = 0,9996 (mehsimakobnol A)

4.3.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Để xác định giá trị LOD và LOQ của phương pháp phân tích, tiến hành phân tích mẫu chứa dung dịch hỗn hợp chuẩn đến nồng độ thấp nhất có thể xuất hiện peak của chất phân tích Kết quả xác định giá trị LOD được thể hiện ở bảng 4.8 và sắc kí đồ hình 4.7, giá trị LOQ của inoscavin A và meshimakobnol A tương ứng được tính toán theo công thức 3.2

Bảng 4 8: Kết quả xác định giá trị LOD của inoscavin A và meshimakobnol A

Tỉ lệ S/N 3/1,2 2/1 Đối với inoscavin A, giá trị LOD xác định được là 0,012 mg/L tương ứng với LOQ là 0,04 mg/L Đối với meshimakobnol A, giá trị LOD xác định được là 0,05 mg/L tương ứng với giá trị LOQ là 0,17 mg/L

Hình 4 7: Sắc kí đồ thể hiện giá trị LOD của inoscavin A và meshimakobnol A

4.3.6 Độ chính xác Độ chính xác được đánh giá bằng giá trị RSD% thông qua độ lập lại (repeatability) và độ chính xác trung gian (intermediate precision) Trong đó, độ lập lại được xác định bằng cách phân tích 3 mẫu chứa hỗn hợp chất chuẩn với 3 lần tiêm độc lập với cùng điều kiện phân tích được mô tả như bảng trong cùng ngày Độ chính xác trung gian được xác định bằng cách phân tích 3 mẫu chứa hỗn hợp chất chuẩn với 3 lần tiêm độc lập với cùng điều kiện phân tích được mô tả như bảng, không cùng ngày, người thực hiện phân tích khác Kết quả độ chính xác được thể hiện ở bảng 4.9 ,giá trị RSD% của độ lập lại và độ chính xác trung gian dao động từ 0,8182 - 1,4236% (đều bé hơn 2%) cho thấy phương pháp phân tích có độ chính xác cao

Bảng 4 9: Kết quả xác định độ chính xác của inoscavin A và meshimakobnol A Độ lập lại

Diện tích peak Độ chính xác trung gian

4.3.7 Độ đúng Độ đúng được kiểm tra thông qua độ thu hồi của phương pháp phân tích Để kiểm tra độ thu hồi, tiến hành thêm chuẩn vào mẫu thực tế ở 3 mức nồng độ khác nhau (50, 100, 150%), sau đó dựa trên kết quả thu được, tiến hành tính toán độ thu hồi trung bình ở cả 3 mức nồng độ Kết quả ở bảng 4.10 và sắc kí đồ hình 4.8 cho thấy phương pháp phân tích đạt độ thu hồi cao 99,690% đối với inoscavin A và 99,4763% đối với meshimakobnol A, thỏa mãn yêu cầu của AOAC về độ đúng của một phương pháp phân tích [78]

Bảng 4 10: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp phân tích

Hợp chất Độ thu hồi (%)

Sắc kí đồ: mẫu phân tích (đỏ), mẫu thêm 50% chuẩn (xanh lá), mẫu thêm 100% chuẩn (xanh dương), mẫu thêm 150% chuẩn (đen)

Hình 4 8: Sắc kí đồ thể hiện độ đúng của phương pháp phân tích

Phân tích mẫu thực

Quả thể nấm được chuẩn bị như phương pháp được trình bày ở mục 3.5.1 Phương pháp HPLC xác định hàm lượng chất cần phân tích được trình bày ở bảng 4.6 Kết quả hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A được trình bày ở bảng 4.11 dưới đây:

Bảng 4 11: Kết quà hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A ở các mẫu nấm

SD (n=3) RSD (%) PS1 0,1832 a 0,0021 1,1553 0,3083 a 0,0010 0,3266 PS2 9,0940 g 0,1368 1,5047 6,6267 c 0,1773 2,6762 PS3 6,1547 d 0,0753 1,2230 4,4273 b 0,0586 1,3235 PS4 6,9578 e 0,3088 4,4388 11,8811 d 0,5117 4,3069

“-“: không phát hiện trong phạm vi phân tích

Các giá trị được kí hiệu với những chữ cái khác nhau trong cùng 1 cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05

Hàm lượng dao động từ 0,0810 - 9,5233 mg/g đối với inoscavin A và 0,3083

- 46,4300 mg/g đối với meshimakobnol A trong các mẫu nấm phân tích Trong đó, mẫu PS2, PS3, PS4, PS 5, PS6, PS8 thuộc chi Phellinus có hàm lượng inoscavin A cao hơn Phellinus igniarius theo báo cáo của DanShou (2016) có nguồn gốc từ Trung Quốc [53] Những khác biệt này phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, nguồn gốc, vị trí địa lí, môi trường sống và điều kiện nuôi trồng [84] Hàm lượng meshimakobnol A trong mẫu PS4 cao hơn PS3 Mặc khác PS3 và PS4 đều được xác định là P linteus, quan sát hình dạng quả thể nấm ở bảng 4.11 có thể thấy PS4 có có tuổi thọ lâu năm hơn PS3 cho thấy meshimakobnol có thể là thành phần giúp xác định được tuổi thọ của nấm P linteus

Inoscavin A xuất hiện trong hầu hết các mẫu nấm chi Phellinus và Ganoderma, không xuất hiện trong mẫu nấm P igniarius thương mại (PS7) Trong khi đó PS8 cũng được xác định là loài P igniarius nhưng hàm lượng inoscavin A cao Kết quả này tương tự công bố của Kojima (2008) báo cáo rằng inoscavin A là một trong những thành phần tạo nên đặc trưng về thành phần hóa học giữa nấm nuôi trồng và nấm tự nhiên trong một số mẫu nấm P linteus được nghiên cứu có nguồn gốc từ Hàn Quốc và Trung Quốc Kết quả trên cho thấy inoscvain A có thể là một thành phần tiềm năng trong xác định nguồn gốc nấm (tự nhiên hoặc nuôi trồng)

Bên cạnh nấm Thượng hoàng, nghiên cứu còn tiến hành phân tích hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A của nấm Linh chi thuộc loài Ganoderma Kết quả cho thấy hàm lượng inoscavin A trong nấm Linh chi thấp hơn nấm Thượng hoàng Ngoài ra, trong nấm Linh chi cũng không xuất hiện meshimakobnol A, trong khi thành phần này xuất hiện ở nhiều loài Thượng hoàng và được đánh giá là một trong những thành phần chính của quả thể Phellinus linteus trong tự nhiên Kết quả này cho thấy meshimakobnol A có thể là cơ sở để phân biệt Phellinus với một số loài nấm khác, đặc biệt là Ganoderma.

Ảnh hưởng các yếu tố công nghệ đến quá trình trích ly nấm Thượng hoàng

Trong thí nghiệm này, nguyên liệu trích ly với biên độ siêu âm được khảo sát từ 25,2 - 50,4 àm và mẫu đối chứng (A0) trớch ly khụng qua tiền xử lớ siờu õm, cỏc điều kiện trích ly có hỗ trợ siêu âm (mẫu A1 - A5) khác được cố định để khảo sát ảnh hưởng của biên độ siêu âm đến khả năng trích ly inoscavin A và meshimakobnol A Hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A được xác định bằng phương pháp HPLC tương tự như mục 4.2 Kết quả hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A được trình bày như hình 4.9 dưới đây

Biờn độ: A0 (khụng siờu õm), A1 (25,2 àm), A2 (31,5 àm), A3 (37,8 àm), A4 (44,1 àm), A5 (50,5 àm)

Hình 4 9: Ảnh hưởng biên độ siêu âm Khi thay đổi biên độ siêu âm, hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A trớch ly cú sự thay đổi Cụ thể, khi tăng biờn độ siờu õm từ 25,2 - 50,4 àm Hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A đạt cao nhất tương ứng là 8,847 và 32,090 mg/g ở biờn độ 31,5 àm (mẫu A2) Sau đú, hàm lượng cả 2 hợp chất cú xu hướng giảm dần khi tăng biờn độ siờu õm đến 50,4 àm và cao hơn mẫu đối chứng trớch ly theo phương

Inoscavin A Meshimakobnol A pháp trích ly không xử lí siêu âm Từ kết quả trên cho thấy, siêu âm có khả năng làm tăng hiệu quả trích ly so với phương pháp không xử lí siêu âm, kết quả trên tương tự với các báo cáo trước đây về ứng dụng siêu âm trong trích ly có thể làm tăng khả năng thu hồi các hợp chất tự nhiên từ nấm [85, 86] Nguyên nhân có thể được giải thích là do biên độ (amplitude) và cường độ siêu âm (intensity) có mối tương quan, biên độ tăng có thể dẫn đến cường độ siêu âm tăng, hiệu ứng xâm thực diễn ra mạnh hơn làm tăng khả năng phá vỡ do các bóng khí, từ đó tăng hiệu quả trích ly Tuy nhiên, khi cường độ siêu âm cao, dẫn đến hiệu ứng xâm thực giảm, thay vào đó là khả năng khuấy trộn chất lỏng do sóng siêu âm tạo nên Siêu âm di chuyển qua môi trường chất lỏng kém, làm giảm hiệu quả trích ly [87, 88]

4.5.2 Kết qua khảo sát thời gian hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A

Bên cạnh các thông số vật lí như tần số, biên độ siêu âm thường được báo cáo có ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly do có liên quan đến tính chất cơ học của sóng, thời gian hỗ trợ siêu âm cũng là một yếu tố quan trọng khi ứng dụng vào hỗ trợ trích ly nhằm làm tăng hiệu quả thu hồi các hoạt chất mong muốn từ nguyên liệu Do thời gian hỗ trợ siêu âm có ảnh hưởng đến năng lượng mà khối chất lỏng bao gồm nguyên liệu nhận được và thời gian hiệu ứng xâm thực diễn ra Năng lượng từ sóng siêu âm và sự phá vỡ các bóng khí hình thành từ hiệu ứng xâm thực ngoài làm tăng hiệu quả thu hồi các hợp chất, có thể làm thay đổi một số tính chất hóa lí bên trong khối chất lỏng làm ảnh hưởng đến quá trình trích ly [89] Do đó, trong thí nghiệm này, khảo sát thời gian hỗ trợ siêu âm từ 1 - 7 phút, biên độ sóng và các yếu tố khác không thay đổi Kết quả hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A được trình bày như hình 4.10 bên dưới

Thời gian siêu âm: C1 (1 phút), C2 (3 phút), C3 (5 phút), C4 (7 phút)

Hình 4 10: Ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ siêu âm

Khi thay đổi thời gian hỗ trợ siêu âm từ 1 - 7 phút, hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A tăng theo thời gian và cao nhất đạt 8,727 mg/g và 33,543 mg/g tương ứng ở thời gian 5 phút (mẫu C3) Sóng siêu âm năng lượng cao tạo ra từ thanh siêu âm cung cấp năng lượng cho khối chất lỏng, đồng thời hiện tượng xâm thực và vi xoáy diễn ra làm cho dung môi dễ dàng khuyếch tán vào nguyên liệu, các hoạt chất hòa tan và theo dung môi ra môi trường chất lỏng bên ngoài làm tăng hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A thu được Tuy nhiên, thời gian hỗ trợ siêu âm kéo dài có thể dẫn đến giảm hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A Tương tự như kết quả nghiên cứu của Qinghong You và cộng sự (2014) khi sử dụng siêu âm và mô hình Boxh-Behnken nhằm tối ưu hóa điều kiện trích ly polysaccharide từ Tricholoma matsutake, tăng thời gian hỗ trợ siêu âm từ 130 - 170 giây, hàm lượng chất mục tiêu tăng Hàm lượng polysaccharide tăng 7,97% khi trích ly với điều kiện 160 giây, công suất 345 W [90] Một nghiên cứu khác của Shen và cộng sự (2019) về ứng dụng sóng siêu âm năng lượng cao vào trích ly triterpenoid từ Ganoderma lucidum tiến hành khảo sát thời gian hỗ trợ siêu âm từ 0 - 30 phút cho thấy khi tăng thời gian từ 0 - 5 phút, hàm lượng triterpenoid tăng, tuy nhiên kéo dài thời gian, hàm lượng chất mục tiêu có xu hướng giảm [69] Nguyên nhân của hiện tượng này có thể do năng lượng trong quá trình siêu âm kết hợp với hiệu ứng xâm thực kéo dài ngoài làm tăng nhiệt

Inoscavin A Meshimakobnol A độ khối chất lỏng dẫn đến các liên kết trong phân tử kém bền với nhiệt, còn tạo ra các gốc hydroxyl tự do (•H, •OH, OOH•, O•) dẫn đến quá trình phân hủy các chất diễn ra nhanh hơn và các bóng khí của hiệu ứng xâm thực tăng cường hòa tan O2, làm các chất bị oxi hóa nên chất mục tiêu trong dung dịch trở nên kém bền và dễ phân hủy nếu kéo dài thời gian hỗ trợ siêu âm [89]

4.5.3 Kết quả khảo sát nồng độ dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng inoscavin

Dung môi là một yếu tố quan trọng trong hầu hết các nghiên cứu về quá trình trích ly, vì yếu tố này ảnh hưởng đến khả năng hòa tan thông qua sự tương quan về độ phân cực của dung môi và các hợp chất mục tiêu Thông thường, với các sản phẩm được sử dụng làm thực phẩm, nước và ethanol là hai loại dung môi được ưu tiên sử dụng vì độ an toàn của chúng Vì vậy, nghiên cứu này tiến hành khảo sát dung môi trích ly là ethanol với các nồng độ khác nhau nhằm chọn ra nồng độ phù hợp để trích ly inoscavin A và meshimakobnol A Kết quả được trình bày như hình 4.11 dưới đây

Hình 4 11: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi

Khi tăng nồng độ ethanol từ 60 - 90%, hàm lượng meshimakobnol A tăng dần, đạt nồng độ tối đa là 32,527 mg/g (mẫu E3) ở ethanol 80% và thay đổi không có ý nghĩa thống kê khi nồng độ ethanol tăng đến 90% Đối với inoscanvin A, hàm lượng tăng dần theo sự gia tăng nồng độ dung môi và đạt 9,030 mg/g ở ethanol 80% (mẫu

E3), sau đó có xu hướng giảm khi tăng nồng độ đến 90% Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tương đồng với một số báo cáo trước đây, khi nồng độ dung môi ethanol thấp, sự suất hiện của nước trong dung dịch cao làm tăng độ phân cực của dung dịch do nước có hằng số điện thẩm (dielectric constant) cao [91] Ngoài ra, lượng nước trong dung môi còn góp phần làm trương nở tế bào nguyên liệu, dẫn đến tăng khả năng thẩm thấu dung môi và hòa tan của các hợp chất vào dung dịch [92] Thêm vào đó, sự suất hiện các nhóm hydroxyl trong cấu trúc phân tử góp phần làm tăng mức độ ưa nước của hai hợp chất vì vậy khi tăng nồng độ dung môi hơn 80%, lượng nước của dung dịch giảm, hàm lượng inoscavin A giảm do độ phân cực của dung môi giảm dần, trong khi đó, meshimakobnol A có suy giảm nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hàm lượng ở hai nồng độ ethanol là 80% và 90% Tuy nhiên, hàm mục tiêu của nghiên cứu là thu nhận cả 2 hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A

Vì vậy chọn nồng độ ethanol 80% cho các thí nghiệm đơn yếu tố tiếp theo

4.5.4 Kết quả khảo sát nhiệt độ trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng Inoscavin A và Meshimakobnol A

Nhiệt độ là một yếu tố được quan tâm trong các nghiên cứu về trích ly Thông thường khi tăng nhiệt độ, độ nhớt của dung môi giảm, giúp dung môi dễ khuếch tán vào mẫu, hòa tan các hợp chất vào dung dịch Ngoài ra, nhiệt độ còn liên quan đến quá trình truyền khối của chất trong dung dịch và năng lượng khối chất lỏng nhận được tác động đến màng tế bào nguyên liệu hỗ trợ tăng hiệu quả trích ly Tuy nhiên sự gia tăng quá mức nhiệt độ đối với những chất mục tiêu cụ thể có thể làm giảm hàm lượng của chất đó trong quá trình trích ly vì nhiệt độ có thể làm phân hủy chất, hoặc xúc tác các phản ứng bên trong dung dịch làm suy giảm nồng độ các chất, đặc biệt là các chất nhạy nhiệt [93] Nghiên cứu tiến hành khảo sát nhiệt độ trong khoảng 30 -

60 o C, hàm mục tiêu là 2 hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A Kết quả được trình bày như hình 4.12

Nhiệt độ siêu âm: TE1 (30 o C), TE2 (40 o C), TE3 (50 o C), TE4 (60 o C)

Hình 4 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ

Khi thay đổi nhiệt độ từ 30 - 60 o C, hàm lượng inoscavin A tăng đến 9,340 mg/g ở 40 o C, sau đó giảm khi nhiệt độ tăng đến 50 o C và giữ nguyên hàm lượng inoscavin A thu được ở 60 o C Trong khi đó, meshimakobnol A có xu hướng tăng và đạt nồng độ cao nhất là 34,530 mg/g ở 40 0 C sau đó giảm dần đến 60 o C Kết quả của tăng nhiệt độ có thể hàm giảm hàm lượng các chất tương tự như báo cáo của Yim (2011) về tối ưu hóa thời gian, nhiệt độ khi sử dụng bể siêu trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính chống oxi hóa trong nấm Schizophyllum commune Kết quả nghiên cứu cho thấy trong khoảng nhiệt độ 30,1 - 54,9 o C, hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa có xu hướng tăng khi nhiệt độ tăng, sau đó giảm khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ tối ưu Hàm mục tiêu TPC và khả năng kháng oxi hóa đạt giá trị cao nhất ở điều kiện 40,3 o C đối với TPC; 35,7 o C đối với phương pháp DPPH; 41,7 o C đối với phương pháp ABTS; 42,4 o C đối với phương pháp FRAP [94] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng khoảng nhiệt độ phân hủy của polyophenol nằm trong khoảng 50 - 60 o C, khi nhiệt độ sử dụng vượt quá

70 o C, quá trình phân hủy diễn ra nhanh chóng [93]

4.5.5 Kết quả khảo sát thời gian trích ly ảnh hưởng đến hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A

Bên cạnh các thông số xử lí tiền siêu âm, nồng độ dung môi và nhiệt độ trích ly Thời gian trích ly là một yếu tố công nghệ liên quan đến hiệu quả thu hồi các hợp chất mục tiêu Trong quá trình trích ly, các chất tan tiếp xúc với dung môi, thời gian ảnh hưởng đến quá trình chuyển khối, hòa tan của các hợp chất này giữa hai pha rắn lỏng Vì vậy, nghiên cứu tiến hành khảo sát thời gian trích ly từ 0 - 120 phút, kết quả được trình bày như hình 4.13 bên dưới

Thời gian trích ly: TI1 (không trích ly), TI2 (40 phút), TI3 (80 phút), TI4 (120 phút)

Hình 4 13: Ảnh hưởng của thời gian trích ly Khi tăng thời gian trích ly từ 0 - 120 phút, hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A thu được có xu hướng tăng dần và không thay đổi sau 80 phút Lúc này, hàm lượng chất mục tiêu gần như đạt trạng thái cân bằng nồng độ giữa trong tế bào nấm và dung dịch trích ly Tốc độ trích ly giảm, nồng độ inoscavin A và meshimakobol A gần như không đổi sau 80 phút trích ly Nếu tiếp tục tăng thời gian trích ly, nồng độ các chất mục tiêu trong dung dịch có khả năng giảm tương tự như báo cáo của Zeng và cộng sự (2014) ứng dụng sóng siêu âm tối ưu trích ly polysacchaaride trong nấm Trametes orientails Hàm lượng polysaccharide được nhóm tác giả xác định đạt cao nhất ở 40 phút, sau đó giảm khi tăng thời gian chiết tăng đến 50 phút [67] Hay một nghiên cứu khác của Chengshan Cai và cộng sự (2019) sử dụng siêu âm trích ly triterpenoid trong nấm Sanghuang cho thấy sau 20 phút, hàm lượng triterpenoid trong nấm gần như đạt trạng thái cân bằng Nhóm tác

Inoscavin A Meshimakobnol A giả đánh giá trong điều kiện siêu âm, nếu tiếp tục kéo dài thời gian trích ly, ngoài vấn đề các chất có khả năng bị phân hủy do chịu tác động cơ học của sóng, một số chất khác trong nguyên liệu có khả năng hòa tan trong trong cồn sẽ theo dung môi khuếch tán vào dung dịch dẫn đến giảm hiệu quả chiết và gây khó khăn cho quá trình tinh chế và làm sạch sản phẩm chiết [72] Thêm vào đó, nếu tiếp tục tăng thời gian trích ly khi hàm lượng chất mục tiêu đạt trạng thái cân bằng dẫn đến lãng phí thời gian và năng lượng Vì vậy, chọn thời gian 80 phút là thời gian trích ly hiệu quả cao nhất đối với inoscavin A và meshimakobnol A trong phạm vi nghiên cứu

Khảo sát thành công phương pháp trích ly nấm P igniarius với sự hỗ trợ sóng siờu õm bao gồm cỏc yếu tố cho thấy với điều kiện biờn độ 31,5 àm, thời gian hỗ trợ siêu âm 5 phút, nồng độ ethnaol 80%, nhiệt độ 40 o C, thời gian trích ly 80 phút cho hàm lượng inoscavin A mà meshimakobnol A cao nhất trong điều kiện thí nghiệm

Và phương pháp siêu âm phù hợp để trích ly 2 hợp chất này trong nấm Thượng hoàng.

Ngày đăng: 30/07/2024, 16:56

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
[1] Technavio, "Medicinal Mushrooms Market by Usage, Product and Geography - Forecast and Analysis 2023-2027," 2023, Available:https://www.technavio.com/report/medicinal-mushrooms-market-industry-analysis#:~:text=The%20medicinal%20mushrooms%20market%20size,%2C%20APAC%2C%20and%20EMEA (accessed on 15 December 2023) Sách, tạp chí
Tiêu đề: Medicinal Mushrooms Market by Usage, Product and Geography - Forecast and Analysis 2023-2027
[2] P. He, Y. Zhang, and N. Li, "The phytochemistry and pharmacology of medicinal fungi of the genus Phellinus: A review," Food &amp; Function, vol. 12, no. 5, pp.1856-1881, 2021 Sách, tạp chí
Tiêu đề: The phytochemistry and pharmacology of medicinal fungi of the genus Phellinus: A review
[3] N. T. Thanh et al., "Chemical constituents from the fruiting bodies of Phellinus igniarius," Natural product research, vol. 32, no. 20, pp. 2392-2397, 2018 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Chemical constituents from the fruiting bodies of Phellinus igniarius
[5] E. Zapora, M. Wolkowycki, S. Bakier, and J. K. Zjawiony, "Phellinus igniarius: A pharmacologically active polypore mushroom," Natural product communications, vol. 11, no. 7, p. 1934578X1601100741, 2016 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Phellinus igniarius: A pharmacologically active polypore mushroom
[6] G. Kawashte, H. Sonawane, S. Mittal, and M. Borde, "Medicinal fungi: a natural source of pharmacologically important metabolites," Recent Developments in Microbial Technologies, Singapore: Springer, 2021, pp. 379-394 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Medicinal fungi: a natural source of pharmacologically important metabolites
[7] J. Huo et al., "Whole-genome sequence of Phellinus gilvus (mulberry Sanghuang) reveals its unique medicinal values," Journal of Advanced Research, vol. 24, pp. 325-335, 2020 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Whole-genome sequence of Phellinus gilvus (mulberry Sanghuang) reveals its unique medicinal values
[8] N.-C. Yang, C.-C. Wu, R. H. Liu, Y.-C. Chai, and C. Y. Tseng, "Comparing the functional components, SOD-like activities, antimutagenicity, and nutrient compositions of Phellinus igniarius and Phellinus linteus mushrooms," Journal of food and drug analysis, vol. 24, no. 2, pp. 343-349, 2016 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Comparing the functional components, SOD-like activities, antimutagenicity, and nutrient compositions of Phellinus igniarius and Phellinus linteus mushrooms
[9] J.-K. Lee, J.-H. Song, and J.-S. Lee, "Optimal extraction conditions of anti- obesity lipase inhibitor from Phellinus linteus and nutritional characteristics of the extracts," Mycobiology, vol. 38, no. 1, pp. 58-61, 2010 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Optimal extraction conditions of anti-obesity lipase inhibitor from Phellinus linteus and nutritional characteristics of the extracts
[10] E. Deveci, F. Çayan, G. Tel‐Çayan, and M. E. Duru, "Structural characterization and determination of biological activities for different polysaccharides extracted from tree mushroom species," Journal of food biochemistry, vol. 43, no. 9, p. e12965, 2019 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Structural characterization and determination of biological activities for different polysaccharides extracted from tree mushroom species
[11] H. Zhang, F. Jiang, L. Li, X. Liu, and J.-K. Yan, "Recent advances in the bioactive polysaccharides and other key components from Phellinus spp. and their pharmacological effects: A review," International Journal of Biological Macromolecules, vol. 222, part B, pp. 3108-3128, 2022 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Recent advances in the bioactive polysaccharides and other key components from Phellinus spp. and their pharmacological effects: A review
[12] M. V. Donova, "Steroid bioconversions," Microbial Steroids: Methods and Protocols, vol. 1645, New York: Humana Press, 2017, pp. 1-13 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Steroid bioconversions
[13] P. K. Ajikumar, K. Tyo, S. Carlsen, O. Mucha, T. H. Phon, and G. Stephanopoulos, "Terpenoids: opportunities for biosynthesis of natural product drugs using engineered microorganisms," Molecular pharmaceutics, vol. 5, no.2, pp. 167-190, 2008 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Terpenoids: opportunities for biosynthesis of natural product drugs using engineered microorganisms
[14] D. Cox-Georgian, N. Ramadoss, C. Dona, and C. Basu, "Therapeutic and medicinal uses of terpenes," Medicinal plants: from farm to pharmacy, 2019, pp.333-359 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Therapeutic and medicinal uses of terpenes
[15] P. J. Mullen, R. Yu, J. Longo, M. C. Archer, and L. Z. Penn, "The interplay between cell signalling and the mevalonate pathway in cancer," Nature Reviews Cancer, vol. 16, no. 11, pp. 718-731, 2016 Sách, tạp chí
Tiêu đề: The interplay between cell signalling and the mevalonate pathway in cancer
[16] A. K. Singh, H. K. Rana, and A. K. Pandey, "Fungal-derived natural product: Synthesis, function, and applications," Recent Advancement in White Biotechnology Through Fungi, vol. 2, Springer, 2019, pp. 229-248 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Fungal-derived natural product: Synthesis, function, and applications
[17] D. W. Christianson, "Structural biology and chemistry of the terpenoid cyclases," Chemical reviews, vol. 106, no. 8, pp. 3412-3442, 2006 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Structural biology and chemistry of the terpenoid cyclases
[18] I.-K. Lee and B.-S. Yun, "Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp., and their medicinal importance," The Journal of antibiotics, vol. 64, no. 5, pp. 349-359, 2011 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp., and their medicinal importance
[20] J. Schroder, "The chalcone/stibene synthase-type family of condensing enzymes," in Comprehensive natural products chemistry. Polyketides and other secondary matabolites including fatty acids and their derivative, vol. 1, 1999, pp.749-771 Sách, tạp chí
Tiêu đề: The chalcone/stibene synthase-type family of condensing enzymes
[21] G. Gribble, Progress in the chemistry of organic natural products. Springer Science &amp; Business Media, 2012 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Progress in the chemistry of organic natural products
[22] M. Gill and W. Steglich, Progress in the chemistry of organic natural products. Springer Science &amp; Business Media, 2012 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Progress in the chemistry of organic natural products

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN