Ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc khô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA VÕ CHÍ BẢO ẢNH HƢỞNG CỦA MỨC ĐỘ THỦY PHÂN ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA VÀ TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA DỊCH THỦY PHÂN PROTEIN CON RUỐC KHƠ Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HCM, tháng 01 năm 2020 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Võ Đình Lệ Tâm Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh Cán chấm nhận xét 2: PGS.TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Luận văn tốt nghiệp bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TPHCM Thời gian bảo vệ: 10/01/2020 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn bao gồm: Chủ tịch hội đồng: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn Phản biện 1: PGS.TS Hồng Kim Anh Phản biện 2: PGS.TS Tơn Nữ Minh Nguyệt Ủy viên: TS Lê Minh Hùng Ủy viên, thư ký: PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC GS TS Lê Văn Việt Mẫn ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Võ Chí Bảo MSHV: 1870358 Ngày, tháng, năm sinh: 05/06/1996 Nơi sinh: Rạch Kiến Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số : 8540101 I TÊN ĐỀ TÀI: Ảnh hƣởng mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa tính chất chức dịch thủy phân protein ruốc khô II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 1) Khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân dịch thủy phân protein ruốc khô 2) Khảo sát ảnh hưởng mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân protein ruốc khô 3) Khảo sát ảnh hưởng mức độ thủy phân đến tính chất chức dịch phân protein ruốc khô III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 19/08/2019 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/12/2019 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS Võ Đình Lệ Tâm CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) TS Võ Đình Lệ Tâm Tp HCM, ngày 30 tháng 12 năm 2019 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) GS TS Lê Văn Việt Mẫn TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài luận văn thạc sĩ nhờ hướng dẩn nhiệt tình quý Thầy Cô, động viên ủng hộ gia đình bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Cơ TS Võ Đình Lệ Tâm người hết lịng giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn q thầy phịng thí nghiệm, đặc biệt cô Nguyễn Thị Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất… suốt thời gian thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến tồn thể q thầy khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa TP HCM tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực đề tài luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn đến gia đình, q thầy bạn bè hỗ trợ tơi nhiều suốt q trình học tập, nghiên cứu thực đề tài luận văn thạc sĩ TP Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2020 Sinh viên thực Võ Chí Bảo i TĨM TẮT Nghiên cứu tập trung khảo sát ảnh hưởng mức độ thủy phân (DH) đến hoạt tính kháng oxy hóa tính chất chức dịch thủy phân protein ruốc khô Đầu tiên, ảnh hưởng thời gian thủy phân đến DH dịch thủy phân protein ruốc khơ đánh giá Sau đó, ảnh hưởng DH đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân protein theo phương pháp trung hòa gốc tự 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), phương pháp lực kháng oxy hóa khử ion sắt (III) (FRAP), phương pháp trung hòa gốc tự cation 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS●+), phương pháp trung hòa gốc tự anion superoxide (O2●-) phương pháp liên kết ion Fe2+ khảo sát Cuối cùng, ảnh hưởng DH đến tính chất chức dịch thủy phân protein gồm độ tan, độ bền nhiệt, khả tạo bọt, khả tạo nhũ, khả giữ nước (WHC) khả giữ dầu (OHC) nghiên cứu Kết cho thấy giá trị DH dịch thủy phân protein ruốc khô tăng từ đến 75,8% thời gian thủy phân kéo dài từ đến 180 phút Dịch thủy phân protein ruốc khô thể hoạt tính kháng oxy hóa cao với hoạt tính trung hịa gốc DPPH giá trị FRAP cao 22,5 ± 0,3% (thấp 1,8 lần so với hoạt tính trung hịa gốc DPPH vitamin C) 74,6 ± 1,9 µM đương lượng Trolox (µM TE) (thấp 24,2 lần so với giá trị FRAP vitamin C) giá trị DH 66,7%; hoạt tính trung hịa gốc tự ABTS●+ hoạt tính trung hịa gốc tự O2●- cao với giá trị 33,5 ± 0,1% (2,4 lần thấp so với hoạt tính trung hịa gốc tự ABTS●+ vitamin C) 90,8 ± 0,8% (1,1 lần thấp so với hoạt tính trung hịa gốc O2●- vitamin C) giá trị DH 75,8%; hoạt tính liên kết ion Fe2+ cao 54,5 ± 0,3% (1,7 lần thấp so với hoạt tính liên kết ion Fe2+ dinatri ethylenediaminetetraacetate (Na2EDTA)) giá trị DH 72,1% Bột dịch thủy phân protein ruốc khô giá trị DH khảo sát có độ hịa tan 55%, kể qua xử lý nhiệt 63oC 30 phút 93oC 30 giây, khoảng pH từ đến Khả tạo bọt (FC) độ bền bọt (FS) dịch thủy phân protein ruốc khô với giá trị DH khác khoảng 5,7 – 80,0% 2,9 – 77,0%, tương ứng thấp 1,1 – 14,5 lần 1,1 – 40,3 lần so với FC FS albumin khoảng pH 3-8 Khả tạo nhũ (EAI) dịch thủy phân thấp 1,1 – 3,9 lần so với natri caseinate, độ bền nhũ (ESI) dịch thủy phân lại cao 1,4 – 9,3 lần so với natri caseinate khoảng pH 3-8 Bột dịch thủy phân thể WHC cao 9,5 ± 0,3 ml nước/g bột dịch thủy phân giá trị DH 66,7% OHC cao 3,4 ± 0,1 ml dầu/g bột dịch thủy phân giá trị DH 50,6% Qua đó, giá trị ruốc khơ nâng cao nhờ tận dụng để sản xuất dịch thủy phân protein, ứng dụng chất kháng oxy hóa phụ gia cải thiện cấu trúc cảm quan thực phẩm ii ABSTRACT This study focuses on examining the effect of degree of hydrolysis (DH) on antioxidant activity and functional properties of proteolysate from dried Acetes japonicus Firstly, effect of hydrolysis time on DH of Acetes proteolysate was investigated Subsequently, effect of DH on antioxidant activity of the Acetes proteolysate based on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging assay, ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) cation radical (ABTS●+) scavenging activity, superoxide anion radical (O2●-) scavenging activity and ferrous chelating rate was tested Finally, effect of DH on functional properties of the proteolysate including solubility, heat stability, foaming and emulsifying property, water holding capacity (WHC) and oil holding capacity (OHC) were evaluated The result indicated that DH value of the proteolysate increased from to 75.8% as prolonging hydrolysis time in range of - 180 minutes The Acetes proteolysate exerted great antioxidant activity with the highest DPPH scavenging activity and FRAP value of 22.5 ± 0.3% (1.8 times lower than that of vitamin C) and 74.6 ± 1.9 µM Trolox equipvalent (µM TE) (24.2 folds lower comparing to that of vitamin C), respectively, at DH of 66.7%; the greatest ABTS●+ O2●- scavenging activity of 33.5 ± 0.1% (2.4 folds lower than that of vitamin C) and 90.8 ± 0.8% (1.1 times lower in comparison to that of vitamin C), in order, at DH value of 75.8%; the highest ferrous chelating rate of 54.5 ± 0.3% (1.7 folds lower than that of disodium ethylenediaminetetraacetate (Na2EDTA)) at DH value of 72.1% The Acetes proteoysate powder at all tested DH range displayed solubility over 55%, even after treating at 63oC for 30 minutes or 93oC for 30 seconds, in pH range from to Foaming capacity (FC) and foaming stability (FS) of the Acetes proteolysate with various DH were in range 5.7 – 80.0% and 2.9 – 77.0%, 1.1 – 14.5 folds and 1.1 – 40.3 times lower than those of albumin, respectively, in the pH range of – Emulsifying activity indexs (EAI) of the proteolysate were 1.3 – 3.9 folds lower in comparison to that of sodium caseinate while their emulsifying stability indexs (ESI) were 1.4 – 9.3 times higher than that of sodium caseinate at all DH value in the pH range of – The proteolysate powder showed the highest WHC of 9.5 ± 0.3 ml water/g proteolysate powder at DH 66.7% and the greatest OHC of 3.4 ± 0.1 ml oil/g proteolysate powder at DH 50.6% This study contributed to enhanced value of the Acetes, being protein source to produce proteolysate which could be served as an antioxidant compound or a food additive improving food texture and sensory iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực luận văn Võ Chí Bảo iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ ix CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Con ruốc 1.2 Dịch thủy phân 1.2.1 Giới thiệu 1.2.2 Các phương pháp thuỷ phân protein 1.2.3 Hoạt tính sinh học 1.2.4 Tính chất chức 1.3 Mức độ thủy phân 13 1.4 Ứng dụng dịch thuỷ phân protein từ thủy sản 14 1.5 Tổng quan trình nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa tính chất chức dịch thủy phân protein thủy hải sản nƣớc 15 1.5.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa 15 1.5.2 Nghiên cứu tính chất chức 16 1.6 Khả hấp thu 17 1.7 Tính an tồn 18 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 2.1 Nguyên liệu 19 2.1.1 Con ruốc khô 19 2.1.2 Chế phẩm enzyme hóa chất 19 2.2 Phƣơng pháp 19 2.2.1 Phương pháp thủy phân 19 v 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ chế phẩm enzyme (Anson, 1938) 19 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan (Lowry, 1951) 20 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân 20 2.2.5 Phương pháp lọc khử khoáng dịch thủy phân 21 2.2.6 Xác định mức độ thủy phân 22 2.2.7 Xác định tính chất chức dịch thủy phân (Li cộng sự, 2012 Putra cộng sự, 2018) 22 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến DH 23 3.2 Ảnh hƣởng DH đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân protein ruốc khơ 24 3.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa theo chế cho electron 24 3.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa theo chế cho hydro 27 3.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa theo chế liên kết ion kim loại 30 3.3 Ảnh hƣởng DH đến tính chất chức dịch thủy phân protein ruốc khô 32 3.3.1 Độ tan 32 3.3.2 Độ bền nhiệt 33 3.3.3 Khả tạo bọt 36 3.3.4 Khả tạo nhũ 38 3.3.5 WHC 40 3.3.6 OHC 41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 4.1 Kết luận 43 4.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 55 PHỤ LỤC B: PHƢƠNG PHÁP 61 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) ANOVA Phân tích phương sai AOAC Hiệp hội nhà hố phân tích thống DH Mức độ thủy phân DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DTT dithiothreitol FRAP Năng lực kháng oxy hóa khử ion sắt (III) Na2EDTA Dinatri ethylenediaminetetraacetate OHC Khả giữ dầu OPA o-phthaldialdehyde SDS sodium dodecyl sulfate TCA tricloroacetic acid TNBS trinitrobenzene sulfonic acid TPTZ 2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid WHC Khả giữ nước μM TE Đương lượng Trolox vii Luận văn thạc sĩ o Dung dịch Na2CO3 50mM o Dung dịch đệm acetate 1mM, pH= 7,5; T= 37oC o Dung dịch L- Tyrosine 1,1mM o Dung dịch enzyme sử dụng để kiểm tra hoạt độ: pha loãng 8000-10000 lần (tùy loại chế phẩm enzyme) dung dịch đệm acetate 1mM Quy trình thực Xây dựng đường chuẩn : thực theo bảng 1: Bảng 1: Xác định độ hấp thu mẫu chuẩn Ống nghiệm Mẫu trắng Thể tích L- Tyrosine, mL 0,05 0,1 0,2 0,4 H2O, mL 1,95 1,9 1,8 1,6 2,0 Dung dịch Na2CO3, mL 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Thuốc thử Foline, mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Ủ 30 phút 37oC Đo độ hấp thu bước sóng 660nm Đối với mẫu thử, thực theo bảng 2: Bảng 2: Xác định độ hấp thu mẫu thử Hóa chất Mẫu Mẫu trắng Dung dịch Casein 0,65%, mL 5,0 5,0 Dung dịch Enzyme phân tích, mL 1,0 Trộn đều, ủ 37oC, thời gian 10 phút Dung dịch TCA 0,11M, mL 5,0 5,0 Dung dịch Enzyme phân tích, mL 1,0 65 Luận văn thạc sĩ Trộn đều, ủ 37oC, thời gian 30 phút Lọc giấy lọc thu dịch lọc Dịch lọc 2,0 2,0 Dung dịch Na2CO3, mL 5,0 5,0 Thuốc thử Foline, mL 1,0 1,0 Đo độ hấp thu bước sóng 660nm Tính kết Hoạt tính Enzyme tính theo cơng thức sau: Hoạt tính enzyme (U/ml) = Trong đó: o x: nồng độ Tyrosine mẫu suy từ đường chuẩn, mM o V1: tổng thể tích phản ứng, 11 mL o V2: thể tích dịch lọc sử dụng để tiến hành xác định, mL o VE: thể tích enzyme sử dụng, mL o t : thời gian để phản ứng xảy ra, 10 phút Phƣơng pháp xác định khả trung hòa gốc tự DPPH (Sharma Bhat, 2009) Thiết bị, dụng cụ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Ống nghiệm, erlen o Micropipette, đầu típ Hóa chất o Dung dịch DPPH 0,06 mM o Methanol tinh khiết, 99,5% Quy trình thực 66 Luận văn thạc sĩ Cho 1mL dịch thủy phân (1mg/ml) vào ống nghiệm Thêm 2mL dung dịch DPPH 0,06mM methanol 99,5% Lắc ống nghiệm ủ tối 30 phút Sau đó, xác định độ hấp thu mẫu bước sóng 517nm Làm mẫu kiểm soát thay dung dịch DPPH methanol Làm mẫu trắng thay mẫu nước cất Dung dịch vitamin C (1mg/ml) dùng làm chất đối chứng Tính kết Khả trung hòa gốc tự dịch thủy phân xác định theo công thức: Trong đó: o Ac: Độ hấp thu mẫu kiểm sốt o As: Độ hấp thu mẫu thử o Ab: Độ hấp thu mẫu trắng Phƣơng pháp khử sắt (III) thành sắt (II) (FRAP) (Benzie Strain, 1996) Thiết bị, dụng cụ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Ống nghiệm, erlen o Micropipette, đầu típ Hóa chất o Dung dịch Trolox 500 µM ethanol (độ tinh khiết≥99,7%): Cân 0,0125g Trolox, định mức 100mL ethanol o Dung dịch FRAP: Pha đệm acetate 300 mM, pH = 3,6: trộn 3,1g CH3COONa.3H2O với khoảng 16mL dung dịch acid acetic tinh khiết → định mức 1L nước cất → dung dịch R2 Pha dung dịch HCl 40mM: 3,942 mL HCl đậm đặc định mức 1L nước cất → dung dịch R3 67 Luận văn thạc sĩ Pha dung dịch TPTZ 10mM 40mM HCl: cân 0,078 g TPTZ → định mức 25mL dung dịch R3 → dung dịch R4 Pha dung dịch FeCl3 20mM: cân 5,406g FeCl3.6H2O định mức 1L nước cất → dung dịch R5 Chuẩn bị dung dịch FRAP cho lần phân tích, pha hỗn hợp theo tỷ lệ R2: R4: R5 = 10:1:1 (50mL: 5mL: 5mL) → dung dịch R6 giữ 37oC Quy trình thực o Xây dựng đường chuẩn Bước 1: Pha dung dịch chuẩn Trolox giá trị nồng độ: 0; 100;150; 200; 250; 300 µM theo bảng 3: Bảng 3: Chuẩn bị dung dịch Trolox chuẩn Nồng độ Trolox (µM) 100 150 200 250 300 Dung dịch Trolox 500 µM (µL) 30 Ethanol (µL) 45 60 75 90 150 120 105 90 75 60 Bước 2: Thêm 2850 µL dd FRAP, để 30 phút, nhiệt độ phòng Bước 3: Đo độ hấp thu bước sóng 593 nm Bước 4: Vẽ đường chuẩn thể nồng độ Trolox theo độ hấp thu o Xác định giá trị FRAP mẫu Bước 1: Pha loãng mẫu nước cất cho hiệu số độ hấp thu mẫu thử với mẫu trắng nằm khoảng độ hấp thu dung dịch chuẩn Trolox với nồng độ khác Bước 2: Thực tương tự thay 150 µL dd chuẩn mẫu pha loãng Bước 3: Đo độ hấp thu nước sóng 593 nm Tính kết Dựa vào đường chuẩn để tính giá trị FRAP mẫu theo đương lượng µM Trolox Dung dịch vitamin C (1mg/ml) dùng làm chất đối chứng 68 Luận văn thạc sĩ Phƣơng pháp trung hòa gốc tự ABTS●+ (Stephanié Dudonné cộng sự, 2009) Thiết bị, dụng cụ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Ống nghiệm, erlen o Micropipette, đầu típ Hóa chất o Dung dịch ABTS●+ có độ hấp thu bước sóng 734nm 0,7±0,02: ủ tối dung dịch chứa 7mM ABTS 2,45 mM kali persulfate 12-16 trước thêm nước cất vào để đạt độ hấp thu mong muốn Quy trình thực Trộn 100µl dịch thủy phân (1mg/ml) với 3ml dung dịch ABTS●+ có độ hấp thu bước sóng 734nm 0,7±0,02, ủ 10 phút 30oC trước đo độ hấp thu bước sóng 734nm Mẫu trắng thực tương tự thay dịch thủy phân nước cất Dung dịch vitamin C (1mg/ml) dùng làm chất đối chứng Tính kết Hoạt tính trung hịa gốc tự ABTS●+ dịch thủy phân tính theo cơng thức sau: Trong đó: AB AS độ hấp thu mẫu trắng mẫu chứa dịch thủy phân bước sóng 734nm Phƣơng pháp trung hịa gốc tự O2●- (Haiping Jiang cộng sự, 2014) Thiết bị, dụng cụ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Ống nghiệm, erlen o Micropipette, đầu típ Hóa chất 69 Luận văn thạc sĩ o Đệm 50mM Tris-HCl-(1mM) EDTA, pH 8,2 o Dung dịch pyrogallol 5mM Quy trình thực Ủ 5,7 mM dung dịch đệm 50mM Tris-HCl-(1mM) EDTA, pH 8,2 25oC 20 phút trước thêm vào theo thứ tự 0,2 ml dịch thủy phân protein (1mg/ml) 0,1 ml dung dịch pyrogallol 5mM Độ hấp thu bước sóng 320nm ghi lại sau 30 giây phút kể từ thêm pyrogallol Mẫu trắng thực tương tự thay dịch thủy phân nước cất Dung dịch vitamin C (1mg/ml) dùng làm chất đối chứng Tính kết Hoạt tính trung hịa gốc tự O2●- tính theo cơng thức sau: ● ⁄ ⁄ ⁄ Trong đó: ⁄ ⁄ độ thay đổi độ hấp thu theo thời gian mẫu trắng mẫu chứa dịch thủy phân protein 10 Hoạt tính liên kết ion Fe2+ (Assaâd Sila cộng sự, 2014) Thiết bị, dụng cụ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Ống nghiệm, erlen o Micropipette, đầu típ Hóa chất o Dung dịch sắt (II) sulfate 2mM o Dung dịch ferrozine 5mM Quy trình thực Trộn 0,5 ml dịch thủy phân protein (1 mg/ml) với 1,6 ml nước cất 0,05 ml dung dịch sắt (II) sulfate 2mM Sau 15 phút, thêm 0,1 ml dung dịch ferrozine 5mM ủ hỗn hợp nhiệt độ phòng 10 phút trước đo độ hấp thu bước sóng 562nm Mẫu 70 Luận văn thạc sĩ trắng thực tương tự thay dịch thủy phân protein nước cất Dung dịch Na2EDTA (1mg/ml) dùng làm chất đối chứng Tính kết Hoạt tính liên kết ion Fe2+ tính theo cơng thức sau: Trong độ hấp thu mẫu trắng mẫu chứa dịch thủy phân protein 11 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein hòa tan (Lowry cộng sự, 1951) Thiết bị, dụng cụ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Ống nghiệm, erlen o Micropipette, đầu típ Hố chất o Dung dịch albumin chuẩn 0,1% (w/v) o Dung dịch A: dung dịch Na2CO3 2% (w/v), natri-kali tartrate 0,54% (w/v) dung dịch NaOH 0,1N o Dung dịch B: dung dịch CuSO4 1% (w/v) o Dung dịch C: trộn dung dịch A dung dịch B với tỷ lệ A:B 100:1 (v/v) o Thuốc thử Folin Ciocalteau (2N): pha với nước cất tỉ lệ 1:1 Quy trình thực Cho vào ống nghiệm mL dung dịch mẫu, thêm vào ống nghiệm mL dung dịch C, lắc đều, để yên 10 phút nhiệt độ phịng Sau thêm 0,5 mL thuốc thử Folin, lắc để yên 30 phút trước đo độ hấp thu bước sóng 660nm Thực tương tự với mẫu trắng cách thay 1mL mẫu 1mL nước cất Lập đồ thị chuẩn: chuẩn bị dung dịch protein chuẩn với hàm lượng khác bảng 7, thực tương tự quy trình để xác định độ hấp thu bước sóng 660nm 71 Luận văn thạc sĩ Bảng 7: Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn Mẫu chuẩn Dung dịch albumin chuẩn (mL) 0,0 Nước cất (mL) 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Tính kết Hiệu độ hấp thu mẫu đến trừ độ hấp thu mẫu độ hấp thu thật dung dịch protein chuẩn Dựng đồ thị với trục hoành độ hấp thu dung dịch protein chuẩn trục tung nồng độ protein Tương tự, độ hấp thu thật mẫu hiệu độ hấp thu mẫu mẫu trắng Hàm lượng protein mẫu tính tốn nhờ vào đường chuẩn 12 Phƣơng pháp lọc khử khoáng Thiết bị, dụng cụ o Thiết bị khử khoáng: cột nhồi với hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri, Acros (cột nhồi) o Giấy quỳ tím Hóa chất o Dung dịch NaOH 1M o Dung dịch HCl 1M o Ethanol o Dung dịch NaHCO3 0,1M Quy trình thực Tinh chế hạt nhựa trao đổi ion Mục đích: Loại bỏ tạp chất Rửa thể tích hạt nhựa (khoảng 50g) với 50ml dung dịch HCl 1M, khuấy 30 phút Lặp lại dung dịch HCl sau rửa không đục, gạn bỏ dung dịch HCl rửa hạt nhựa lại với nước cất đến pH đạt gần giá trị pH trung tính (quỳ tím khơng đổi màu) Lắc hạt nhựa với 50ml ethanol 15 phút Gạn bỏ ethanol 72 Luận văn thạc sĩ Thêm 50ml dung dịch NaOH 1M, khuấy 30 phút Gạn bỏ NaOH rửa hạt nhựa lại 2- lần 50ml nước cất Khuấy với 30ml HCl 1M 30 phút Rửa hạt nhựa lại nước cất pH đạt giá trị trung tính Gạn khỏi hạt nhựa sấy hạt nhựa đến khô 50 oC (các hạt nhựa tách rời nhau) Lọc khử khoáng dịch thủy phân Bước 1: lắc hạt nhựa trao đổi ion tinh chế với nước cất 15–20 phút Lắp cột nhồi vào giá đỡ, sau cho bơng gòn vào cột nhồi để tránh hạt nhựa làm nghẹt đầu cột Cho hạt nhựa lắc với nước vào cột cho đạt chiều cao hạt nhựa khoảng 12 – 15cm Luôn cho nước ngập hạt nhựa khoảng 1cm Chú ý cố định hạt nhựa cột nhồi Bước 2: cho 15ml dung dịch NaOH 1M chảy qua cột nhồi với tốc độ dòng chảy 1mL/phút Cho nước cất chảy qua cột đến nước khỏi cột khơng làm đổi màu quỳ tím Bước 3: cho dịch thủy phân (thể tích tối đa 50ml) chạy qua cột nhồi với tốc độ dòng chảy khoảng 1mL/phút Sau đó, rửa cột nước cất pH đạt giá trị trung tính Bước 4: cho 15mL dung dịch NaHCO3 0,1M chảy qua cột với tốc độ dòng chảy 1mL/phút, rửa lại với nước cất đến pH trung tính Cho 15 mL dung dịch HCl 1M qua cột với tốc độ 1mL/phút, rửa lại nước cất pH đạt giá trị trung tính 13 Phƣơng pháp xác định mức độ thủy phân (Nielsen cộng sự, 2001) Thiết bị, dụng cụ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Ống nghiệm, erlen o Micropipette, đầu típ Hóa chất o Cân 50,8g natri borate 1,333g SDS, hòa tan vào nước cất định mức lên 1L → dung dịch D1 73 Luận văn thạc sĩ o Hòa tan 80mg OPA 88 mg DTT vào 2ml ethanol tinh khiết, định mức lên 100mL dung dịch D1 → dung dịch D2 o Dung dịch chuẩn L – serine có nồng độ 0.9516 mili đương lượng/L Quy trình thực Cho 0,4mL dịch thủy phân vào 3mL dung dịch D2, lắc 5s để yên phút Sau đó, đo độ hấp thu bước sóng 340 nm (As) Xác định độ hấp thu mẫu chuẩn: thay dịch thủy phân dung dịch chuẩn L – serine: chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu đo độ hấp thu trước đo độ hấp thu mẫu dịch thủy phân mẫu trắng mẫu đo độ hấp thu sau xác định hết độ hấp thu mẫu dịch thủy phân mẫu trắng Độ hấp thu mẫu chuẩn (A std) giá trị trung bình độ hấp thu mẫu chuẩn Xác định độ hấp thu mẫu trắng (Ab): thực tương tự thay dịch thủy phân 0,4 ml nước cất Tính kết Trong đó: h: đương lượng thủy phân, nồng độ nhóm α-amino tạo thành q trình thủy phân, tính theo đơn vị mili đương lượng / g protein h ( Serine  NH )    Serine-NH2: mili đương lượng nhóm α-amino tạo thành, tính theo serine 1g protein As: độ hấp thu mẫu Ab: độ hấp thu mẫu trắng Astd: độ hấp thu mẫu chuẩn 0.9516: nồng độ đương lượng gam L-serine sử dụng 74 Luận văn thạc sĩ P hàm lượng protein tính theo phương pháp Lowry, mg/ml α, β: số Đối với cá: α= 1.00; β= 0.4 htot: đương lượng thủy phân điểm thủy phân hoàn toàn protein thành acid amin Đối với cá: htot = 8.6 14 Phƣơng pháp xác định độ hòa tan (Li cộng sự, 2012) Thiết bị, dụng cụ o Máy ly tâm o Máy đo pH o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet Hóa chất o Dung dịch NaOH 1M o Dung dịch HCl 1M o Hóa chất sử dụng cho phương pháp Lowry (mục 10) Quy trình thực 100mg bột dịch thủy phân hịa tan 10ml nước khử ion pH điều chỉnh đến giá trị 3, 4, 5, 6, dung dịch HCl 1M dung dịch NaOH 1M Hỗn hợp sau khuấy nhiệt độ phòng 30 phút trước ly tâm Hàm lượng protein tổng mẫu đánh giá sau hòa tan mẫu dung dịch NaOH 0,5M Hàm lượng protein xác định phương pháp Lowry (mục 12) Tính kết Độ hịa tan tính theo cơng thức: Độ tan (%) = Hàm lượng protein dịch lỏng * 100 / Tổng hàm lượng protein mẫu 15 Phƣơng pháp xác định độ bền nhiệt (Li cộng sự, 2012) Thiết bị, dụng cụ o Máy ly tâm o Máy đo pH 75 Luận văn thạc sĩ o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet o Bếp điện, bể điều nhiệt Hóa chất o Dung dịch NaOH 1M o Dung dịch HCl 1M o Hóa chất sử dụng cho phương pháp Lowry (mục 10) Quy trình thực 100mg bột dịch thủy phân hòa tan 10ml nước khử ion pH điều chỉnh đến giá trị 3, 4, 5, 6, dung dịch HCl 1M dung dịch NaOH 1M Sau xử lý nhiệt 63oC 30 phút 93oC 30 giây, hỗn hợp giữ nước đá 10 phút trước ly tâm Độ bền nhiệt thể thông qua độ tan sau xử lý nhiệt 16 Phƣơng pháp xác định khả tạo bọt độ bền bọt (Li cộng sự, 2012) Thiết bị, dụng cụ o Máy đồng hóa o Ống đong 50ml o Máy đo pH Hóa chất o Dung dịch NaOH 1M o Dung dịch HCl 1M o Dung dịch chất đối chứng: dung dịch albumin (10mg/ml) Quy trình thực Xác định khả tạo bọt 20 ml dịch thủy phân (10mg/ml) với pH chỉnh giá trị 3, 4, 5, 6, dung dịch NaOH 1M dung dịch HCl 1M đồng hóa phút Mẫu đồng hóa chuyển vào ống đong 50ml thể tích ghi lại sau 30 giây Giá trị FC xác định theo công thức sau: Khả tạo bọt (%) = [(A – B)/B]*100 76 Luận văn thạc sĩ Trong o A thể tích dịch thủy phân sau đồng hóa (ml) o B thể tích dịch thủy phân trước đồng hóa (ml) Xác định độ bền bọt Mẫu sau đồng hóa giữ 20oC phút thể tích ghi nhận Tính kết Giá trị FS xác định theo công thức sau: Độ bền bọt (%) = [(At – B)/B]*100 Trong o At thể tích dịch thủy phân sau giữ 20oC phút (ml) o B thể tích dịch thủy phân trước đồng hóa (ml) 17 Phƣơng pháp xác định khả tạo nhũ độ bền nhũ (Li cộng sự, 2012) Thiết bị, dụng cụ o Máy đồng hóa o Ống đong 50ml o Máy đo pH o Máy đo quang phổ UV-VIS, cuvet Hóa chất o Dung dịch NaOH 0.1M o Dung dịch HCl 0.1M o Dầu thực vật o Dung dịch sodium dodecyl sulfate, 1mg/ml o Dung dịch chất đối chứng: dung dịch natri caseinate (10mg/ml) Quy trình thực 5ml dầu thực vật trộn với 15ml dịch thủy phân pH điều chỉnh giá trị 3, 4, 5, 6, dung dịch HCl 0,1M dung dịch NaOH 0,1M Sau đó, hỗn hợp đồng hóa phút Tiếp theo, 50 µL dịch bề mặt đáy hệ nhũ tương lấy thời điểm sau đồng hóa sau đồng hóa 10 phút 4,95 ml dung dịch 77 Luận văn thạc sĩ sodium dodecyl sulfate có nồng độ 1mg/ml trộn vào tiến hành đo độ hấp thu 500nm Tính kết Khả tạo nhũ độ bền nhũ tính theo cơng thức sau: ⁄ Trong o ∆A = A0 – A10 o A0 độ hấp thu mẫu đo thời điểm sau đồng hóa; o A10 độ hấp thu mẫu đo thời điểm 10 phút sau đồng hóa; o ∆t = 10 phút; o mprotein khối lượng protein xác định phương pháp Lowry, (g) o 2*2.303*A0/1 diện tích bề mặt phân pha o 2.303*A0/1 độ đục mẫu o chiều dài khe hẹp (khoảng cách bước sóng truyền qua) cuvet (cm) o 0.25 tỷ lệ pha phân tán (dầu) hỗn hợp 18 Phƣơng pháp xác định WHC (Putra cộng sự, 2018) Thiết bị, dụng cụ o Máy ly tâm o Ống đong 50ml o Giấy lọc o Máy Vortex Quy trình thực 0,5g bột dịch thủy phân trộn với 20ml nước cất ống ly tâm 50ml, sau tiến hành phân tán máy trộn vortex 30 giây Tiếp theo, hỗn hợp để yên nhiệt độ phòng trước ly tâm Phần dịch ghi lại thể tích (V1) sau 78 Luận văn thạc sĩ lọc qua giấy lọc Whatman số Thể tích nước bám vào ống ly tâm (V2) xác định cách thực tương tự bột dịch thủy phân Tính kết Khả giữ nước bột dịch thủy phân tính theo công thức sau: ⁄ 19 Phƣơng pháp xác định OHC (Putra cộng sự, 2018) Thiết bị, dụng cụ o Máy ly tâm o Ống đong 50ml o Máy lắc Hóa chất o Dầu thực vật Quy trình tiến hành 0,5g bột dịch thủy phân trộn với 10ml dầu thực vật ống ly tâm 50ml Sau đó, hỗn hợp giữ nhiệt độ phòng (25±1oC) 30 phút (cứ 10 phút khuấy 30 giây) Tiếp theo, hỗn hợp ly tâm thể tích phần dịch (V1) ghi lại Lượng dầu bám thành ống ly tâm (V2) xác định cách tiến hành tương tự quy trình khơng sử dụng mẫu bột dịch thủy phân OHC thể theo thể tích dầu (ml) hấp thu 1g bột dịch thủy phân Tính kết Khả giữ dầu bột dịch thủy phân tính theo cơng thức sau: ⁄ 79 ... dịch thủy phân protein ruốc khô 2) Khảo sát ảnh hưởng mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân protein ruốc khô 3) Khảo sát ảnh hưởng mức độ thủy phân đến tính chất chức dịch phân. .. sát ảnh hưởng mức độ thủy phân (DH) đến hoạt tính kháng oxy hóa tính chất chức dịch thủy phân protein ruốc khô Đầu tiên, ảnh hưởng thời gian thủy phân đến DH dịch thủy phân protein ruốc khô đánh... Ảnh hƣởng mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa tính chất chức dịch thủy phân protein ruốc khô II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 1) Khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân dịch