TỔNG QUAN
Tổng quan về cacao
Cacao (Theobroma cacao L) có nguồn gốc từ các vùng rừng nhiệt đới của Châu
Mỹ nhiệt đới từ Peru đến Mexico [3] Cacao được trồng rộng rãi trên thế giới đặc biệt là ở các nước đang phát triển [4] Cacao là một trong những sản phẩm thực vật được sử dụng nhiều nhất trong sô cô la, đồ ăn nhẹ và đồ uống Sản lượng cacao hàng năm đạt khoảng 4,72 triệu tấn vào năm 2020, với giá trị bán ra dự kiến khoảng 20 tỷ USD vào năm 2021 [5] Mỗi loại cacao có đặc tính và hương vị khác nhau
Bảng 2.1: Đặc tính hương vị của hạt cacao từ các nguồn gốc khác nhau [6]
Nguồn gốc Giống Hương vị đặc trưng
Côte d’Ivoire Forastero Hương cacao tốt, ít đắng, acid thấp, hương trái cây, mùi thơm
Ghana Hạt lai Forastero Hương chocolate mạnh
Nigeria Hạt lai Forastero Hương cacao trung bình,
Principe Forastero Hương cacao tốt, đắng, hơi cay, hương trái cây và màu ánh đỏ
Madagascar Criollo Mùi rượu, thối và vị chanh
Hương cacao dịu, hơi đắng, hương trái cây
Brazil Forastero Hương cacao, đắng, acid cao, chát và đôi khi có hương trái cây
Criollo Hương trái cây, đắng và vị cacao Peru Forastero Hơi đắng và có hương trái cây
Chocolate thấp, hương hoa, hương trái cây, mùi cỏ khô và mùi đất
Chocolate thấp, acid cao, hương trái cây nhẹ
Panama Forastero Chocolate trung bình, vị chua, hương trái cây và tinh dầu
Jamaica Forastero Hương trái cây
Hạt lai Criollo/Forastero Cacao thấp, không thơm, đắng Cộng hòa Dominica
Mùi rượu, mùi đất và có thể có mùi thuốc lá Costa Rica Forastero Hương trái cây, hương cacao
Trinidad & Tobago Trinitario Cacao cao, mùi đậu, mùi rượu và thơm
Grenada Trinitario Chocolate, hương trái cây, hương hoa, mùi cỏ khô và mùi gỗ
Criollo/Forastero Chocolate thấp, chua và có vị trái cây
Criollo/Forastero Cacao thấp, đắng, hơi chua và có vị chát
Cacao thấp, hương dịu, acid và có màu nhạt
Papua New Guinea Hạt lai Criollo thuần/Forastero
Acid biến đổi mạnh, hương hoa, dịu và có mùi đậu
Malaysia Hạt lai Foratero Cacao từ thấp đến trung bình, độ chua từ trung bình đến cao, chát
Có khoảng 20 loại cacao (T Cacao) trong đó có 3 loại phổ biến (Criollo, Forastero và Trinitario) và 3 loại này chiếm sản lượng 95% trong tổng số sản lượng cacao trên thế giới [4] Gần đây, ngoài 3 giống cacao được trồng phổ biến trên thì có thêm một giống khác được trồng ở Ecuado, được gọi là Nacional
Các giống chính của cây cacao gồm:
- Forastero có nguồn gốc ở lưu vực sông Amazon [7]
- Criollo hiếm khi được trồng vì cây dễ nhiễm bệnh, cho sản lượng thấp
- Trinitario là cây lai giữa 2 giống Forastero và Criollo, với ưu điểm là năng suất cao và kháng bệnh tốt
- Nacional với sản lượng ít nhất nhưng lại đem đến hương vị hảo hạng, được trồng nhiều ở Ecuador
Các giống cây Forastero có sản lượng lớn nhất trên thế giới Sản lượng hạt cacao hàng năm trên thế giới khoảng 4,25 triệu tấn với các nhà sản xuất chính là Ghana, Indonesia, Brazil, Ecuador…
Hình 2.1: Các giống chính của cây cacao [8]
Forastero có nguồn gốc từ cao nguyên Amazon và phần lớn được trồng ở Tây Phi và Đông Nam Á Nó chiếm khoảng 70% sản lượng cacao trên thế giới và được sử dụng nhiều nhất do năng suất cao hơn so với giống Criollo [9] Giống này được trồng chủ yếu ở Tây Phi, đặc biệt ở Bờ Biển Ngà, Ghana, Nigeria và Cameroon Hạt có màu tím (đỏ) đặc trưng, do sự biểu hiện của anthocyanin [10], có vị vị hơi đắng nhưng có hương vị mạnh nhất [11]
Cây cacao, giống Forastero có khả năng kháng sâu bệnh hại ở mức khá [10] Mặc dù sản lượng cao hơn, khả năng sinh trưởng tốt hơn nhưng chất lượng lại kém hơn loại Criollo (vị đắng hơn) Forastero khi chín có vỏ cứng, màu vàng và có dạng tròn như quả dưa Bên trong chứa khoảng 30 hạt hoặc nhiều hơn Chocolate được sản xuất từ hạt cacao này sẽ có hương vị rất phong phú [11] Forastero có nhiều phân loài: Amelonado, Cundeamor và Calabacillo, trong đó, Amelonado được trồng phổ biến nhất [6]
Criollo có nguồn gốc ở Châu Mỹ [12] Được khám phá bởi Christopher Columbus vào năm 1502 trên đảo Guanaja Là loại cây nhỏ, có chất lượng cao nhưng cây này có sức sống kém, dễ nhiễm bệnh và sự tấn công của côn trùng Sản lượng thu hoạch thấp nhưng giá lại đắt nên ít được trồng trên thế giới (chỉ khoảng 5 – 10% sản lượng cacao trên thế giới) Loại này hiện nay rất hiếm và chỉ có ở các đồn điền cũ ở Venezuela, Trung Mỹ, Madagascar, Sri Lanka và Samoa [11]
Hạt có màu trắng, trắng ngà hoặc có màu tím nhạt là do có gen gây ức chế hoạt động của anthocyanin [12] Hạt cacao của nó có chất lượng cao nhất, nó ít đắng hơn nhưng lại thơm hơn Đây cũng là lý do giá thành của nó cao hơn các loại khác [11] Hạt cacao giống này có chứa hàm lượng lớn pyrazine và pH thấp rất dễ ảnh hưởng đến hương vị [6]
Năng suất của Criollo thấp hơn so với các loại giống khác mặc dù cùng quy mô [11] Criollo cũng mẫn cảm với sâu bệnh hại Ngày nay, giống này chỉ được trồng giới hạn ở Trung Mỹ và một số vùng ở Châu Á [13] Quả của Criollo thường có vỏ mỏng mềm, màu đỏ và bên trong chứa từ 20 – 30 hạt Khi quả chín, quả dài, vỏ có màu vàng hoặc đỏ, có rãnh sâu và mụn cóc lớn [11]
Trinitario có nguồn gốc từ Trinidad do đó tên của nó được đặt dựa theo tên của địa phương này, đây là sản phẩm lai tạo tự nhiên và tái tổ hợp giữa các quần thể Criollo và Forastero [14]
Giống này có chất lượng cao hơn so với Criollo và năng suất cao hơn, kháng bệnh tốt hơn Forastero trước đây [15] Giống cây này chiếm khoảng 10 – 15% sản lượng cacao trên thế giới Trinitario có vỏ cứng, màu sắc của vỏ có thể thay đổi Chúng có thể dài hoặc tròn Bên trong chứa từ 30 hạt hoặc nhiều hơn [11] Hạt cacao trinitario có màu trắng và mức chống chịu sâu bệnh hại ở mức trung bình giữa Criollo và Forastero [10]
2.1.2 Cấu tạo, thành phần quả cacao
Quả cacao có cấu tạo như sau:
Lớp vỏ cứng bên ngoài (Pod shell/Husk):
Vỏ cacao bao ở bên ngoài cứng và dày Vỏ cacao chiếm tỷ lệ 67-76% so với tổng khối lượng quả cacao và được cấu tạo bởi 3 lớp: Epicarp – Lớp ngoài cùng; Mesocarp
– Lớp trong; Endocarp – Lớp trong cùng Endocarp là một mô mềm màu trắng có chức năng bảo vệ các hạt ở bên trong Mesocarp có cấu trúc cứng, có khả năng giữ các hạt bên trong ngay ngắn dưới các tác động bên ngoài Và lớp ngoài cùng Epicarp tương đối mềm có màu vàng hoặc đỏ tím khi chín (tùy thuộc từng loại giống), chịu tác động trực tiếp của mặt trời, môi trường xung quanh [2]
Bảng 2.2: Thành phần của vỏ cứng cacao theo nhiều tác giả khảo sát trên các giống cacao [4] Độ ẩm,
Lớp nhầy, trắng bao ngoài hạt – Cơm cacao (Pulp):
Cơm cacao là một lớp bao xung quanh từng hạt, chủ yếu bao gồm các tế bào kéo dài với không bào lớn Ở những quả chưa trưởng thành, cơm có màu trắng đến vàng và có cấu trúc cứng Trong quá trình chín của hạt, cơm chuyển sang dạng lớp nhầy, có mùi thơm đặc trưng và thay đổi tùy kiểu gen (chủng loại) [2]
Hạt cacao cơ bản gồm một lớp vỏ ngoài (Testa), chiếm khoảng 10-14% khối lượng khô của hạt; phôi nhũ (hay lá mầm) chiếm khoảng 86-90% khối lượng hạt, dự trữ toàn bộ các hợp chất quan trọng mang lại hương vị và mùi thơm đặc trưng của chocolate Kích thước hạt trung bình tối thiểu là 1g [23, 24]
Phôi nhũ (Cotyledon) ở bên trong cùng của hạt Chứa khoảng 33% nước, 33% là chất béo (hay còn gọi là bơ cacao) và phần còn lại bao gồm các hợp chất như polyphenol, tinh bột, đường, theobromine… và nhiều thành phần khác ở nồng độ nhỏ hơn Lá mầm có chức năng chính là dự trữ các chất dinh dưỡng cho sự phát triển của cây con [11]
Tổng quan về polyphenol
Polyphenol là một nhóm các hợp chất hóa học có nguồn gốc tự nhiên, chủ yếu ở thực vật, trái cây, rau quả có khả năng chống oxy hóa vô cùng hiệu quả Đặc biệt, ở thực vật, polyphenol cũng chịu trách nhiệm cho việc thể hiện màu sắc Các yếu tố chính tạo nên màu sắc là sự tương tác siêu phân tử Cách sắp xếp nhân thơm, đồng phân và pH cũng ảnh hưởng đến sự thay đổi màu sắc của polyphenol Đặc trưng của nhóm hợp chất này là sự hiện diện của vòng thơm benzen cùng với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng thơm [37] Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của nhóm hydroxyl (-OH) với khung hóa học mà tính chất hóa học hay hoạt tính kháng oxy hóa có thể thay đổi Các hợp chất polyphenol có thể tồn tại trong tự nhiên dưới dạng aglycones tự do hoặc ở trạng thái ester hóa với glucose và các carbohydrate khác (dạng glycoside) Tuy nhiên, trong tự nhiên polyphenol chủ yếu tồn tại ở dạng glycoside với các nhóm đường khác nhau và được acyl hóa ở các vị trí khác nhau ở khung xương polyphenol (do ở dạng aglycones tự do không bền, dễ bị phân hủy) [38, 39]
Polyphenol trong tự nhiên được phân bố rộng rãi và nhiều nhất là trong giới thực vật Hơn 8000 cấu trúc polyphenol được xác định, trong đó có hơn 4000 flavonoid đã được xác định Mặc dù tính chất hóa học của polyphenol được đặc trưng bởi các nhóm có cấu trúc phenol, những nhóm hợp chất này rất đa dạng, và có nhiều cấu trúc khác nhau Trái cây, rau, trà, rượu vang, chocolate là những nguồn giàu polyphenol Chính sự đa dạng này đã dẫn đến nhiều cách phân loại của hợp chất này Polyphenol có thể được phân loại theo nguồn gốc, chức năng sinh học hay cấu trúc hóa học Theo cấu trúc hóa học, polyphenol được chia thành 3 nhóm chính: phenolic acids, flavonoids, non- flavonoids [40]
Hình 2.3: Sơ đồ phân loại polyphenol theo cấu trúc phân tử [41]
Acid phenolic là hợp chất polyphenol không phải flavonoid, có thể chia thành 2 loại chính, acid benzoic và dẫn xuất acid cinnamic dựa trên mạch chính C1-C6 và C3- C6 Chúng có nguồn gốc từ acid hydroxycinnamic (acid caffeic, acid ferulic, acid p- coumaric ) và acid hydroxybenzoic (acid syringic, acid vanillic, acid gentisic ), trong phân tử của chúng có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl và nhóm acid cacboxylic được gắn trên một vòng benzene [41, 42]
Acid phenolic được tìm thấy ở hàm lượng cao trong nhiều loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật Chúng thường ở dạng liên kết như amit, este hoặc glycoside và hiếm khi ở dạng tự do [43] Các acid phenolic này chỉ có thể được giải phóng hoặc bị thủy phân dưới tác dụng của acid, kiềm hay các enzyme khác thủy phân [41, 42] Các axit phenolic tự do như axit benzoic, phenylacetic và cinnamic, có sinh khả dụng cao và khả năng hòa tan trong nước tốt [44] Chúng có thể được hấp thụ qua thành ruột dễ dàng hơn một số flavonoid [45, 46]
Hình 2.4: Cấu tạo phân tử của nhóm acid phenolic [46]
Flavonoid, một nhóm các chất tự nhiên có cấu trúc phenol thay đổi, được tìm thấy trong trái cây, rau, ngũ cốc, vỏ cây, rễ, thân, hoa, trà và rượu vang Flavonoid có thể được chia thành các nhóm phụ khác nhau tùy thuộc vào carbon của vòng C mà vòng B được gắn vào và mức độ không bão hòa và oxy hóa của vòng C Các flavonoid mà vòng
B liên kết ở vị trí 3 của vòng C được gọi là isoflavone Những loại trong đó vòng B được liên kết ở vị trí 4 được gọi là neoflavonoid, trong khi những loại mà vòng B được liên kết ở vị trí 2 có thể được chia thành nhiều nhóm nhỏ trên cơ sở các đặc điểm cấu trúc của vòng C Các phân nhóm này là: flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, flavanol hoặc catechin, anthocyanin và chalcon [47]
Hình 2.5: Cấu trúc khung cơ bản (basic skeleton) của flavonoid và các phân lớp của chúng [47]
Flavonoids là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung gồm 2 vòng C6 (vòng A và vòng B) có bản chất là vòng benzen nối với nhau qua một mạch 3 carbon (dị vòng pyran) Do mô hình hydroxyl hóa và các biến thể trong vòng chromane (vòng C), flavonoid có thể được chia thành nhiều nhóm phụ khác nhau như anthocyanins, flavan 3-ols, flavon, flavanones và flavonols Trong khi phần lớn các flavonoid có vòng B gắn với vị trí C2 của vòng C, một số flavonoid như isoflavone và neoflavonoid, có vòng B được nối ở vị trí C3 và C4 của vòng C, cũng được tìm thấy trong thực vật Chalcones mặc dù không tìm thấy dị vòng C, vẫn được cho là thành viên của họ flavonoid [40, 41]
Ngoài các nhóm phenolic acid, flavonoid và phenolic amide, có một số polyphenolic không phải là flavonoids được tìm thấy trong thực phẩm và được xem là quan trọng đối với sức khỏe con người Trong số những hợp chất tìm được, resveratrol chỉ có ở trong nho và rượu vang nho; acid ellagic và các dẫn xuất của nó được tìm thấy trong các loại quả mọng như mâm xôi, dâu tây…[40, 41]
Non-flavonoids không có cấu tạo đặc trưng của acid phenolic hay flavonoids và gồm 2 nhóm nhỏ là Stilbenes và Lignans [48]
Lignans tồn tại ở dạng liên kết với chất xơ được tìm thấy trong các hạt lanh, hạt vừng và nhiều loại ngũ cốc khác [40, 41] Lignans là một nhóm nhỏ của các polyphenol không phải flavonoid Chúng phân bố rộng rãi trong giới thực vật, có mặt trong hơn 55 họ thực vật, nơi chúng đóng vai trò là chất chống oxy hóa và phân tử bảo vệ chống lại nấm và vi khuẩn gây bệnh Lignan là các dimer phenolic sở hữu cấu trúc 2,3- dibenzylbutane Các hợp chất như vậy được biết là tồn tại dưới dạng thành phần nhỏ của nhiều loại thực vật, nơi chúng tạo thành các khối xây dựng để hình thành lignin trong thành tế bào thực vật Các hợp chất xảy ra chủ yếu ở dạng glycosid [49]
Stilbenes có cấu trúc đặc trưng bởi sự hiện diện của nhân 1,2-diphenylethylene có thể được chia làm 2 loại là stilbene đơn phân và oligomeric Chúng có các đặc tính sinh học quan trọng như chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư và kháng khuẩn Chúng cũng có tác dụng bảo vệ gan, chống lại bệnh Alzheimer và ức chế sự gia tăng glucose và triglyceride trong huyết tương Điển hình như là hợp chất Curcumin được sản xuất từ củ nghệ [40, 41]
Vỏ cứng cacao (CPH) là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các hợp chất phenolic Các hợp chất phenolic trong vỏ cacao gồm có catechin, quercetin, epicatechin, gallic acid, coumaric, protocatechuic acid Thành phần phenolic trong vỏ cacao sẽ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố: môi trường (loại cacao, điều kiện khí hậu, điều kiện thổ nhưỡng, điều kiện chăm sóc, điều kiện bảo quản), điều kiện trích ly Khả năng oxy hóa trong vỏ cacao vào khoảng 24-42 àM TE/g; 18-34 àM TE/g và 0,7-2 àM TE/g (tương ứng theo các phương pháp ABTS, DPPH và FRAP) và cao hơn các phụ phẩm khác như vỏ hạt cacao, lớp nhầy, vỏ cà chua [4]
Vỏ cứng cacao tươi sẽ được sấy để đảm bảo tính ổn định của nguyên liệu Các phương pháp sấy khác nhau như sấy không khí nóng, sấy vi sóng, sấy lạnh có thể ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol đáng kể Nhiều nghiên cứu thấy rằng phương pháp sấy lạnh và sấy vi sóng có thể ngăn ngừa mất TPC so với sấy bằng không khí nóng [50]
Phương pháp chiết hợp chất phenolic phổ biến là trích ly bằng dung môi Hiệu quả trích ly có thể thay đổi tùy vào tính chất dung môi TPC của CPH trích ly bằng hỗn hợp methanol và acetol (2 mg GAE/g) cao hơn so với trích ly bằng ethanol (3,6 mg GAE/g) do khả năng hòa tan khác nhau [21] Trích ly siêu tới hạn được xem là công nghệ xanh và cũng được sử dụng để trích ly hợp chất phenolic từ CPH TPC thu được lên đến 12,97 mg GAE/g khi trích ly ở điều kiện 60 o C, 299 bar, 13,7% ethanol [21]
Bảng 2.4: Các thành phần hóa học của vỏ cacao từ các nguồn gốc và cách xử lý khác nhau (g/kg chất khô) [51]
Nguồn gốc Tây Ban Nha
Phương pháp xử lý Nướng
Các phương pháp khác Tiệt trùng Sấy (sấy hầm) Thành phần hóa học, g/kg chất khô
Tổng quan về pectin
Từ thời tiền sử, pectin đã có trong khẩu phần ăn của con người Nhưng chỉ khoảng
2 thế kỷ gần đây pectin mới được nghiên cứu chiết tách và sử dụng như chất tạo gel trong việc đa dạng hoá các sản phẩm thực phẩm [53]
Pectin là polysaccharide có trong thành tế bào của các mô thực vật, tạo độ bền và độ cứng của trái cây Trong quá trình chín của trái cây pectin bị biến đổi và thủy phân thành các đoạn ngắn bởi enzyme làm trái cây mềm hơn Pectin được cấu tạo từ các mono axit galacturonic, có chứa các nhóm metyl este hóa [54]
Pectin trong mô thực vật liên kết với các thành phần khác của thành tế bào như celluloses hoặc hemicelluloses, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng [55, 56]
Hình 2.7: Cấu trúc của thành tế bào Pectin thường liên kết với các thành phần khác của thành tế bào như cellulose hoặc hemicellulose trong các mô thực vật
Pectin là một thành phần phổ biến của các mô non, trái cây và rau quả [58] Nó có nhiều nhất ở các lớp phiến giữa, giữa các tế bào thực vật liền kề [59] Tiếp theo là thành tế bào sơ cấp của thực vật cũng chứa một lượng pectin khá cao [60] Lượng pectin bị giảm đi đáng kể hoặc thậm chí không có bắt đầu từ thành tế bào thứ cấp của thực vật hướng tới màng sinh chất của tế bào thực vật [61]
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 2 dạng: Dạng protopectin không tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào dưới dạng kết hợp với polysaccharide araban, dạng hòa tan của pectin tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào Dưới tác dụng của axit, enzyme protopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển sang dạng pectin hòa tan Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt axit (pH từ 3,1 – 3,5) và đường (65-70%), nó có khả năng tạo gel [62]
Phần lớn các quốc gia xem pectin là chất phụ gia tạo gel quý và vô hại trong thực phẩm, có thể sử dụng với liều lượng tùy ý tùy thuộc vào quy trình công nghệ, điều này được chứng minh bởi lượng ADI (acceptable daily intake value) cho phép là “không hạn định” được ban hành bởi các tổ chức JECFA (Joint Food Experts Committee), SCF (Scientific Committee for Food) ở Liên minh châu Âu, và GRAS (Generally Regarded)
Về mặt hóa học, pectin là polysaccharid có cấu trúc dị thể mạch thẳng với mạch chính được cấu tạo từ các đơn phân tử là acid D - galaturonic và chúng được liên kết với nhau bằng liên kết α–1,4 glycosid (còn được gọi là acid galactosyluronic) (GalA) Chiều dài của chuỗi acid polygalacturonic có thể biến đổi từ vài trăm đến hàng ngàn đơn vị acid galacturonic Pectin khác với carbohydrate thông thường là không phải được xây dựng từ các phân tử đường mà là từ acid galacturonic, mạch thẳng vì thế có tên gọi là homogalacturonan Công thức nguyên của acid galacturonic là C6H10O7
Hình 2.8: Pectin với các đơn vị acid acid D – galaturonic liên kết với nhau bằng liên kết α–1,4 glycosid [57]
Pectin được cấu tạo bởi ít nhất 17 monosaccharide khác nhau, trong đó GalA (Hình 2.9Ai) chiếm tỉ lệ nhiều nhất, tiếp theo là l-arabinose, d-galactose, l-rhamnose và những loại khác Các monosaccharide này có thể được nối với nhau thông qua 20 liên kết khác nhau [63] Trong các monome GalA, các nhóm cacboxylic hoặc hydroxyl có thể được metyl-este hoá (Hình 2.9Aii) hoặc O-acetyl-este hoá (Hình 2.9Aiii) Quá trình O- acetyl-ester hóa xảy ra chủ yếu ở vị trí O-3 và đôi khi ở vị trí O-2
Mạng pectin từ thực vật bao gồm các miền polysaccharide: homogalacturonan (HGA), rhamnogalacturonan I (RG-I), rhamnogalacturonan II (RG-II), xylogalacturonan và apiogalacturonan [64-66] HGA và RG-I là các thành phần chính chiếm lần lượt 60 – 65% và 20 – 35% tổng pectin [67] Các miền polysaccharide được liên kết cộng hóa trị và liên kết chéo về mặt ion với các sợi pectin khác để tạo thành các mạng pectic phân nhánh khắp thành tế bào sơ cấp (hình 2.9B) [65, 68, 69] Ba dạng pectin đã được nghiên cứu:
(a): mạch pectin bao gồm miền HGA và RGI xen kẽ [70]
(b): mạch pectin bao gồm miền RGI với HG được liên kết như chuỗi [71]
(c): mạch pectin bao gồm các sợi HGA liên kết vuông góc, xen kẽ với miền RGI [66]
Hình 2.9: [A] Các dạng axit galacturonic (GalA) được tìm thấy trong pectin: (i) GalA, (ii) GalA được metyl hóa và (iii) O-Acetyl hóa GalA; [B] Chuỗi pectin bao gồm liên kết cộng hóa trị (i) homogalacturonan (HGA), (ii) rhamnogalacturonan I (RG-I) và (iii) rhamnogalacturonan II (RG-II) [57]
HGA là một homopolyme tuyến tính của GalA được nối với nhau bằng liên kết α -1,4 và được gọi là “smooth region” (Hình 2.9Bi) Đây là một vùng pectin phong phú và phổ biến, chiếm khoảng 60–65% tổng lượng pectin [72] Khoảng 70 – 80% đơn vị GalA được methyl hóa hoặc O-acetyl-ester hóa ở O-2 hoặc O-3 [67, 73] Số lượng đơn vị GalA có trong một chuỗi HGA được ước tính khoảng 100–200 đơn vị [74] Vùng HGA đôi khi được nối bởi một hoặc hai liên kết α -1,2 l-rhamnopyranose và hầu hết các pectin có cấu trúc này Ngoài ra, các đơn vị GalA có thể được thay thế ở vị trí C-2 hoặc C-3 bằng xylose hoặc apiose để tạo ra các miền được gọi là xylogalacturonan hoặc apiogalacturonan [75]
RG-I được gọi là “hairy region”, bao gồm tối đa 100 đơn vị lặp lại của disaccharide bằng liên kết α - 1,2 l -rhamnose -α-1,4-d-GalA (Hình 2.9Bii) Hàm lượng rhamnose chiếm trên 30% pectin Trong các hàm lượng rhamnose này, 50–78% được ước tính là RGI [76] Các gốc GalA của RG-I không phải là metyl-este hóa, tuy nhiên, dư lượng GalA của RG-I có thể là O-acetyl-ester hóa [64] Trong hầu hết các trường hợp, 20– 80% hàm lượng rhamnose trong vùng này được thay thế ở vị trí C-4 bằng các mạch nhánh đường trung tính [67] Các mạch nhánh đường trung tính chủ yếu là galactose và arabinose, tạo thành galactan, arabinan và arabinogalactans Các loại đường khác như glucose, mannose, fucose, xylose, và axit glucuronic được tìm thấy liên kết cộng hóa trị với RG-I dưới dạng mạch nhánh Thành phần và kích thước của các mạch nhánh đường trung tính có thể là một gốc glycosyl đơn lẻ lên đến 50 hoặc nhiều hơn tạo thành mạch polysaccharid lớn với các liên kết glycosidic [72]
Miền RG-II có thể là sự tiếp nối của HGA và cũng có thể được metyl hóa một phần [77] Nó là một miền pectic phân nhánh chứa khung HGA RG-II là một homopolyme có cấu trúc cao bao gồm khoảng chín đơn vị GalA liên kết α -1,4 (trong đó một số là methylesterified) với bốn chuỗi bên polyme có cấu trúc khác nhau được gắn vào Các chuỗi bên này chứa mười một loại đường hiếm bao gồm apiose, 2-O- metyl-fucose, 2-O-metyl-d-xylose, 3-C-cacboxy-5-deoxy-l-xylose (acerin acid), 3- deoxy-d-axit manno-octulosonic và 3-deoxy-d-axit lyxoheptulosaric [78] Các nghiên cứu chỉ ra rằng các đầu của RG-II được liên kết glycosidic với các miền HGA Nó là một miền được phân lập với thành tế bào bởi sự phân cắt endopolygalacturonase, cho thấy sự liên kết cộng hóa trị của nó với HGA Ngoài ra, RG-II liên kết chéo hai phân tử pectin (gốc apiosyl) trong thành tế bào bằng các liên kết borat este [66]
2.3.3.1 Phân loại theo tính tan trong nước
Dựa vào tính tan trong nước nguời ta thấy hai dạng tồn tại của pectin là protopectin không tan và pectin tan Độ hòa tan trong nước liên quan đến mức độ trùng hợp của chúng, số lượng và sự phân bố của các nhóm methoxyl Độ hòa tan tăng khi khối lượng phân tử giảm và tăng trong nhóm cacboxyl được este hóa, mặc dù pH dung dịch, nhiệt độ, bản chất và nồng độ của chất tan có ảnh hưởng rõ rệt đến độ hòa tan [79-82] Protopectin làm nên cấu trúc vách tế bào Pectin tan có trong thành phần dịch bào thực vật Dưới tác dụng của nhiệt độ, acid hoặc enzym protopectinase, protopectin không tan chuyển thành pectin tan
2.3.3.2 Phân loại theo sự methoxyl hóa
Mức độ ester hóa (DE) là phần trăm đơn vị galacturonic acid bị ester hóa trên tổng số đơn vị galacturonic acid trong phân tử pectin Pectin được chia làm 2 nhóm chính với đặc tính khác biệt, đặc biệt về khả năng tạo gel: pectin methoxy thấp (LMP) và pectin methoxy cao (HMP)
HMP (High Methoxyl Pectin): HMP có DE lớn hơn 50% [83] HMP tạo gel ở nồng độ chất tan cao (55–75%) và có tính axit (pH 2,5–3,5) [84] Nó chủ yếu được sử dụng cho các ứng dụng đóng hộp và để tạo gel HMP đòi hỏi lượng đường cao và rất nhạy cảm với độ chua [84] HMP tạo gel ở giá trị pH thấp và ở nồng độ chất rắn hòa tan cao do sự hiện diện của liên kết hydro và tương tác kỵ nước giữa các chuỗi pectin [84, 85]
Tình hình nghiên cứu trích ly polyphenol và pectin
Pectin thường được phân loại theo các quy trình được sử dụng để chiết xuất chúng từ thành tế bào Có 3 loại: pectin hòa tan trong nước có thể chiết xuất bằng nước hoặc dung dịch muối loãng; pectin hòa tan chelator có thể trích ly được bằng dung dịch của các chất chelat hóa canxi như axit etylendiamitetraacetic (EDTA), (axit xyclohexanediaminotetraacetic (CDTA), hoặc hexametaphosphat; và protopectin trích ly bằng dung dịch kiềm hoặc axit loãng nóng Khó khăn trong quá trình chiết protopectin có thể do các liên kết giữ chặt protopectin bên trong thành tế bào sơ cấp, tuy nhiên các liên kết này không bền với axit và/ hoặc kiềm [129]
Tỷ lệ của các loại pectin này khác nhau đáng kể giữa các tế bào thực vật khác nhau Trong cà rốt và vỏ đậu (Sajjaanantakul và cộng sự, 1989) hầu hết pectin thuộc loại hòa tan được chelator Ở những quả táo chín và thậm chí già, hầu hết thuộc loại protopectin (Massey và cộng sự, 1964; O'Beirne và cộng sự, 1982) Trong một số loại trái cây chín khác, chẳng hạn như đào freestone (Postlmayr và cộng sự, 1956), hầu hết pectin thuộc loại tan trong nước, trong khi ở đào chín, tỷ lệ gần như bằng nhau của cả ba loại đã được tìm thấy Trong các mô như cà rốt, khoai tây và vỏ đậu có tỷ lệ pectin hòa tan trong chelator cao, việc truyền các chất chelat vào mô dẫn đến mất liên kết đáng kể (Linehan và Hughes, 1969; Van Buren và cộng sự, 1988) Các mô như rễ củ cải đường, với tỷ lệ protopectin cao, ít bị mất liên kết khi xử lý bằng các chất chelat (S Shannon, 1975) [129] Đối với vỏ cacao điều kiện trích ly (dung môi, nhiệt độ, pH, thời gian ) ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất trích ly cũng như tính chất của pectin chiết từ vỏ cứng cacao Dung môi thường sử dụng để trích ly pectin từ CPH là nước, hydrochloric acid, nitric acid, citric acid Nhiệt độ cao, pH thấp là điều kiện giúp tăng hiệu suất trích ly pectin Dung dịch pectin vỏ cacao được chiết bằng nước nóng và citric acid có tính dẻo hơn so với dung dịch pectin táo (ở cùng nồng độ) [4]
Phương pháp trích ly phổ biến của các hợp chất phenolic từ CPH là sử dụng các dung môi hữu cơ Hiệu quả trích ly có thể thay đổi tùy theo tính chất hóa học của dung môi hữu cơ [130]
2.4.1 Các nghiên cứu trước đây về trích ly pectin
Năm Tên đề tài Phương pháp thực hiện Kết quả/kết luận TLTK
Các nghiên cứu trích ly trên các nguyên liệu không phải vỏ cacao
Trích ly bằng axit và đặc tính hóa lý của pectin từ vỏ trái cây Cubiu
Ban đầu trích ly vỏ trái Cubiu (Solanum Sessiliflorum D.) bằng HNO3, citric acid ở pH 2; nhiệt độ trích ly 100 o C; thời gian trích ly 1 giờ Sau đó lựa chọn nghiệm thức trích ly có hàm lượng uronic acid cao nhất trích ly trong HNO3 Và sử dụng nghiệm thức này tiếp tục trích ly trong HNO3, pH 1,0; 1,5; 2,0; nhiệt độ trích ly
100 o C; thời gian chiết 2 giờ hoặc 4 giờ,
Pectin trích ly bằng HNO3; pH 1,5; thời gian trích ly 2 giờ có hiệu suất và uronic acid cao nhất tương ứng là 14,2% và
Trích ly pectin từ vỏ bí
Trích ly pectin bằng acid citric từ vỏ bí với các yếu tố thay đổi là tỷ lệ nguyên liệu – dung môi 1:30; 1:40; 1:50; 1:60;
Hiệu suất tối ưu 22,1% ở tỷ lệ nguyên liệu – dung môi 1:60; Hiệu suất trích ly tối ưu với gian trích ly
150 phút là 24,6% Đặc tính pectin DA 37,77%,
Cải thiện sản xuất pectin từ bã táo bằng cách trích ly
Trích ly pectin từ bã táo bằng acid acetic 5; 10; 20; 30; 40%
Nghiệm thức trích ly bằng acid acetic 10% ở 100 o C,
110 phút đạt hiệu suất cao nhất 19,6% Trích ly bằng acid acetic có hiệu suất,
[133] trong axit axetic nguyên liệu-dung môi 1:25 (w/v) Nghiệm thức so sánh trích ly bằng H2SO4, HCl, HNO3 ở pH 2,4; nhiệt độ
100 o C; 110 phút khối lượng phân tử, AUA,
DE cao hơn nghiệm thức đối chứng, tuy nhiên hàm lượng đường trung tính thấp hơn
2020 Ảnh hưởng của kích thước hạt và loại acid đến quá trình trích ly pectin
Trích ly pectin từ vỏ dưa ở nhiệt độ 90 o C; thời gian 90 phút; tỷ lệ nguyên liệu-dung môi 1:30 với các dung môi acid tartaric, acid citric, acid hydrochloric, acid acetic, acid lactic, acid nitric, acid phosphoric, acid sulfuric; pH
Hiệu suất cao nhất khi trích ly trong acid citric là
Chiết xuất pectin từ vỏ dưa hấu và ứng dụng trong chế biến mứt đông dứa và nha đam
Trích ly pectin từ vỏ quả dưa hấu bằng acid nitric 1N hoặc HCl 1N; dung môi kết tủa ethanol hoặc isopropanol (tỷ lệ dung môi-dịch chiết 1:1 (v/v), pH 1,65; Nhiệt độ trích ly 85, 90, 95 o C, thời gian trích ly 40, 60, 80,90 phút; thay đổi tỷ lệ nguyên liệu – nước (g/ml) lần lượt 1,25:50; 2,5:
Sử dụng acid nitric ở pH 1,65; dung môi kết tủa là isopropanol; tỷ lệ nguyên liệu/nước là 2,5:50 (g/mL) và nhiệt độ 95°C trong 90 phút sẽ thu được pectin với khối lượng cao Nồng độ pectin thích hợp tạo gel cho mứt đông là 1,5%
Sử dụng phụ phẩm của cây jaboticaba
Trích ly pectin từ nho thân gỗ sử dụng acid citric ở khoảng nhiệt độ 30; 50; 90 o C; khoảng
Pectin trích ly ở điều kiện tối ưu là trong môi trường acid citric 0,75M, nhiệt độ
Berg.) để trích ly pectin thời gian trích ly 30; 60; 90 phút
70 o C, thời gian trích ly nhỏ hơn 75 phút Pectin thu được có AUA dao động từ 22,82% đến 65,35%, DE từ 26,72 đến 77,50%; hàm lượng pectin từ 25,5 – 66,12% Pectin trích ly ở điều kiện môi trường acid citric 0,75M, nhiệt độ trích ly 50 o C, thời gian trích ly 60 phút cho thấy đặc tính tốt nhất với DE cao nhất
Các nghiên cứu trên nguyên liệu vỏ cacao
Trích ly và xác định đặc tính tạo gel và nhũ hóa của pectin từ CPH
Trích ly pectin bằng dung môi HNO3 1N điều chỉnh ở các pH 1,0; 2,0; 3,0; tỷ lệ nguyên liệu – dung môi 1:25 (w/v); nhiệt độ trích ly 75 o C; thời gian trích ly 90 phút
Hiệu suất thu hồi từ 3,7 đến 8,6% Pectin thu được có AUA 74,8%, DA 3,2 –
2013 Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hiệu suất và tính chất hóa học của pectin từ vỏ cacao
Trích ly pectin tử vỏ cacao bằng nước, acid citric, HCl ở pH 2,5; 4,0; tỷ lệ nguyên liệu – dung môi 1:25 (w/v); 1:10 (w/v); nhiệt độ 90 o C; 50 o C; thời gian 1,5 giờ; 3 giờ
Hiệu suất cao nhất (7,62%) thu được ở điều kiện trích ly trong acid citric, pH 2,5; tỷ lệ nguyên liệu - dung môi 1:25 (w/v); nhiệt độ trích ly 95 o C; thời gian trích ly
2020 Đặc tính của pectin trích ly từ CPH
Trích ly pectin từ vỏ cacao trong dung môi HCl, nhiệt độ 65; 80; 95 o C; thời gian 40; 60;
Hiệu suất trích ly cao nhất ở nhiệt độ trích ly 80 o C, thời gian 60 phút là 7,7%;
MeO (4,86%) cao nhất ở điều kiện chiết 65 o C, 60 phút, thấp nhất ở 95 o C, 60 phút AUA cao nhất thu được ở điều kiện trích ly
95 o C, 80 phút; DE cao nhất thu được ở điều kiện
Trích ly pectin từ vỏ quả cacao
(Theobroma cacao L.) bằng phương pháp thủy phân với acid citric và acid acetic
Trích ly pectin từ vỏ cacao bằng acid citric hoặc acid acetic ở pH 2; 2,5; 3; nhiệt độ
90 o C; thời gian trích ly 90 phút
Trích ly bằng acid citric ở pH 2 có hiệu suất và MeO cao nhất tương ứng là 18,12% và 15,5% Trong khi trích ly bằng acid acetic pH 3 cho pectin có AUA tốt hơn với giá trị
Phân lập pectin từ CPH bằng
Dung môi sử dụng HCl, khảo sát 3 yếu tố: nồng độ HCl, nhiệt độ và thời gian trích ly
Hiệu suất tối ưu ở điều kiện trích ly: nồng độ HCl 1,58; nhiệt độ 62,28 o C; thời gian trích ly 4,8 giờ là 12%; pectin trích ly được có MeO 58,45%;
2.4.2 Các nghiên cứu trước đây về trích ly polyphenol
Năm Tên đề tài Phương pháp thực hiện Kết quả/kết luận TLTK
Các nghiên cứu trên nguyên liệu không phải vỏ cacao
2014 Ảnh hưởng quá trình trích ly đến hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa từ đậu nành
Nghiên cứu được tiến hành trên cơ sở xác lập điều kiện tối ưu của các biến phụ thuộc ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly polyphenol và khả năng chống oxy hóa của đậu nành (Glycine max L.)
Các yếu tố khảo sát bao gồm loại dung môi sử dụng (methanol, ethanol và acetone); nồng độ dung môi (40, 50, 60, 70, 80 và
90 % v/v); tỷ lệ đậu nành trong dung môi (1:4, 1:6, 1:8, 1:10) và số lần trích ly (2, 3, 4); thời gian trích ly (2, 3, 4 giờ) và nhiệt độ (30, 40, 50, 60 o C)
Hiệu quả quá trình trích ly polyphenol thể hiện qua hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) và flavonoid tổng số (TFC) và khả năng trung hòa gốc tự do DPPH Hiệu suất trích ly cao khi sử dụng dung môi acetone 70%; tỷ lệ đậu nành và dung môi thích hợp là 1:6 với 3 lần trích ly Hiệu suất trích ly có thể được nâng cao khi trích ly ở nhiệt độ
40 o C trong 3 giờ cho mỗi lần trích
2018 Ảnh hưởng của dung môi và pH đến quá trình trích ly các hợp chất có khả năng kháng oxy hóa từ tía tô (Perilla frutescens)
Khảo sát các yếu tố loại dung môi, tỷ lệ nguyên liệu-dung môi, pH với các nghiệm thức thay đổi dung môi gồm nước cất, ethanol 99,7%; methanol 99,5%; tỷ lệ nguyên liệu- dung môi 1:20; 1:25;
Dung môi thích hợp sử dụng trích ly là ethanol 60% với tỷ lệ nguyên liệu - dung môi là 1/35 (w/v) trong điều kiện trích ly tốt nhất là pH 3 Hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng kháng oxy hóa
2,5; 3; 3,5; 4; nhiệt độ trích ly 50 o C, 1 giờ; lần lượt là 0,781 ± 0,005 g acid gallic/100 g chất khô; 0,308 ± 0,001 g quercetin/100 g chất khô; 125,091 ± 0,211 mg vitamin C/L
2011 Ảnh hưởng của dung môi trích ly polyphenol và chất chống oxi hóa của một số loại rau sống
Trích ly 37 loại rau để thu nhận polyphenol và các chất chống oxi hóa bằng cách sử dụng dung môi acetone 70%; ethanol 70%; methanol 70%, nước cất
Sử dụng dung môi acetone 70% cho thấy các chỉ số TPC, TFC, FRAP cao hơn các dung môi khác, trong khi trích ly bằng methanol 70% cho DPPH cao hơn các nghiệm thức khác
Các nghiên cứu trên nguyên liệu vỏ cacao
Trích ly hợp chất có hoạt tính từ vỏ cacao làm chất kháng nấm
Trích ly bằng hỗn hợp dung môi acetone - nước với tỉ lệ 7:3 và ethanol:nước (7:3)
Tổng phenolic trích ly được bằng hỗn hợp acetone - nước là 94,92 GAE/ g trích ly, cao hơn so với trích ly bằng ethanol - nước
Tính chất của các chất kháng oxy hóa trong vỏ cacao
Trích ly bằng dung dịch cồn - nước 80% (v/v)
Tổng phenolic trích ly là 49,54±3,69 mg GAE/g dịch trích ly
Trích ly bằng enzym và xác định đặc tính của pectin từ vỏ quả cacao
Sử dụng enzyme Cellulase để xúc tác thủy phân phá thành tế bào để trích ly pectin, sau đó tinh sạch
Thu được 10,2 g pectin/100g vỏ, cao hơn so với trích ly bằng acid citric (8,08 g/100g vỏ)
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là trái cacao giống Trinitario, được trồng tại Tiền Giang
Hình 3.1: Nguyên liệu trái cacao
Trái cacao được thu hoạch từ những cây 3 - 4 năm tuổi trở lên, từ lúc thụ phấn đến lúc thu hoạch khoảng 6 tháng Chỉ thu hái trái chín, có vỏ ngoài đã chuyển hẳn từ xanh sang vàng hoặc ngả màu cam
Sau quá trình thu hoạch, trước khi tiến hành tách vỏ, quả được bảo quản ở nơi khô ráo theo hình thức đổ đống, hạn chế tiếp xúc trực tiếp ánh nắng, thời gian lưu tối đa là
4 ngày Nguyên liệu sau khi được thu nhận xử lý theo quy trình sau:
- Quả cacao được sàng lọc để loại bỏ các quả bị hỏng dập hay sâu bệnh
- Rửa trái sạch bụi, tạp chất và vi sinh vật bằng dung dịch chlorin 200ppm
- Trái đạt yêu cầu tiến hành chặt/ tách vỏ trong điều kiện sạch
- Sau khi tách vỏ, vỏ đã được tách khỏi cơm và hạt, cho vào các túi nilon đen, buộc kín để tránh tiếp xúc với ánh sáng và không khí Sau đó tiến hành trữ đông
- Bảo quản nguyên liệu bằng cách trữ đông: nguyên liệu được bảo quản kín trong túi tối màu và lưu trữ trong tủ đông ở nhiệt độ -18 o C cho đến khi thực hiện các quá trình tiếp theo.
Hóa chất, thiết bị
Các hóa chất gồm: Folin-ciocalteu (Merck, Đức), Acid gallic (Merk, Đức), Trolox (Sigma Aldrich, Mỹ), Gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Merck, Đức), Pectin (Himedia), và các hóa chất khác như NaOH, CuSO4, NaCl, CH3COOH, CaCl2, ethanol, methanol, acid citric, acid acetic, AgNO3, Na2CO3, HCl đạt cấp độ phân tích
Bể ổn nhiệt (Memmert, WNB22, Đức)
Máy đo pH (Thermo, Orin 3 star, Mỹ)
Máy quang phổ (Thermo, Genesys 10UV, Mỹ)
Máy chưng cất (Foss, Kjeltec 2200, Thụy Điển)
Máy UV-vis (Perkin Elmer Lambda 35)
Cân sấy ẩm hồng ngoại (Ohaus MB45)
Máy lắc (Ika KS 260 Basic)
Hệ thống cô quay chân không (Buchi Rota Vapor R-II)
Tủ sấy (Shel lab, SGO1, Mỹ)
Đánh giá chất lượng vỏ cacao
Xác định thành phần hóa học, hàm lượng protein, lipit, đường tổng, xơ tổng, tro tổng nhằm đánh giá sơ bộ chất lượng nguyên liệu đầu vào, từ đó đưa ra các phương pháp thích hợp để xử lý nguyên liệu thu nhận các hoạt chất
Các chỉ tiêu phân tích
Phương pháp nghiên cứu trích ly polyphenol và pectin
3.4.1 Sơ đồ nghiên cứu trích ly polyphenol
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu trích ly polyphenol 3.4.2 Sơ đồ nghiên cứu trích ly pectin
Hình 3.3: Sơ đồ nghiên cứu trích ly pectin
3.4.3 Quy trình thực hiện trích ly polyphenol và pectin
Hình 3.4: Quy trình trích ly polyphenol và pectin
Mục đích: Tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với nước trong giai đoạn chần Chuẩn hóa nguồn nguyên liệu, làm cho nguyên liệu được đồng nhất
Thực hiện: Vỏ cacao được cắt lát thủ công với kích thước 1 mm
Mục đích: Bất hoạt enzyme polyphenol oxidase có thể xúc tác quá trình oxy hóa polyphenol có trong nguyên liệu
Thực hiện: Sử dụng tỉ lệ nước chần - nguyên liệu là 1:20 và thực hiện quá trình chần với các điều kiện của quá trình chần như nhiệt độ, thời gian được lần lượt thay đổi theo bố trí thí nghiệm như trình bày ở bảng 3.1
Mục đích: Giảm nhiệt độ của nguyên liệu tránh làm mất polyphenol
Thực hiện: Cho nguyên liệu vào thau chứa nước lạnh (nhiệt độ khoảng 25 o C)
Mục đích: Tăng diện tích tiếp xúc giữa dung môi, nguyên liệu, thuận lợi hơn cho quá trình trích ly
Thực hiện: Sử dụng máy xay sinh tố Philip xay trong khoảng 30s
Mục đích: Trích ly các hợp chất polyphenol trong vỏ cacao
Thực hiện: Các điều kiện của quá trình trích ly như nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nguyên liệu – dung môi, nồng độ ethanol của dung môi được lần lượt thay đổi theo bố trí thí nghiệm như trình bày ở bảng 3.2 Sau khi khảo sát xong các điều kiện quá trình trình ly polyphenol, chọn điều kiện tốt nhất để sử dụng cho thí nghiệm trích ly pectin
Mục đích: Thu hồi dịch trích chứa các hợp chất polyphenol trong vỏ cacao và phần bã được sử dụng để trích ly tiếp pectin
Thực hiện: Sử dụng thiết bị lọc chân không
Mục đích: Loại bớt nước để thu nhận polyphenol ở dạng cao, tăng thời gian bảo quản
Thực hiện: Cô đặc dịch trích ly ở điều kiện tốc độ quay 40 rpm, áp suất 175 mbar, thời gian 10 phút
Mục đích: Trích ly pectin hòa tan trong vỏ cacao
Thực hiện: Phần bã sau khi lọc sẽ được sử dụng để trích ly pectin với tỷ lệ nguyên liệu – dung môi là 1/25 ở 90 o C, 90 phút, trong dung môi acid citric 0,5N và acid acetic 0,5N theo các tỷ lệ như trong phần bố trí thí nghiệm như trình bày ở bảng 3.3
Mục đích: Thu hồi dịch trích chứa pectin trong vỏ cacao
Thực hiện: Sử dụng thiết bị lọc chân không
Mục đích: Thu hồi pectin trong dịch trích ly
Thực hiện: Dịch sau khi lọc được tủa với cồn 96 o trong 4 giờ, tỷ lệ dịch lọc - cồn là 1:3
Mục đích: Loại bỏ phần disaccharides và tạp chất, thu hồi pectin trong dịch trích ly
Thực hiện: Kết tủa sau khi thu được sẽ được rửa với cồn 96 o
Mục đích: Tách nước, tăng thời gian bảo quản cho pectin thô
Thực hiện: Phần tủa sau khi rửa được sấy ở nhiệt độ 40 o C trong 8 giờ
Mục đích: Giảm kích thước của pectin thô để thuận lợi cho quá trình phân tích mẫu
Thực hiện: Pectin được nghiền bằng cối nghiền
3.4.5 Nội dung nghiên cứu trích ly polyphenol
3.4.5.1 Khảo sát quá trình chần
Thực hiện quá trình chần nhằm bất hoạt enzyme PPO có thể xúc tác quá trình oxy hóa polyphenol có trong nguyên liệu, làm ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol thu nhận được Tuy nhiên một số loại hợp chất polyphenol có thể kém bền nhiệt Do đó, việc khảo sát quá trình chần nhằm giúp xác định các thông số chần để bất hoạt enzyme PPO và ít ảnh hưởng đến các hợp chất polyphenol có trong nguyên liệu Quá trình khảo sát gồm 2 yếu tố là nhiệt độ và thời gian chần
Sau khi thực hiện quá trình chần như quy trình nêu tại hình 3.4 và bố trí thí nghiệm nêu tại bảng 3.1, tiến hành làm mát, xay sau đó trích ly bằng cồn 70% với tỷ lệ nguyên liệu – dung môi là 1:10 (w/v), điều kiện trích ly ở nhiệt độ 55 o C trong thời gian 35 phút Lọc và thu nhận dịch trích và tiến hành phân tích Lặp lại các bước trích ly, lọc và phân tích như trên đối với mẫu không chần để làm đối chứng
Các yếu tố cần khảo sát cụ thể như sau:
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần ở các mốc nhiệt độ: 85 o C, 90 o C, 95 o C
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần ở các mốc thời gian: 0s, 30s, 60s 90s, 120s
Các thí nghiệm được sắp xếp và bố trí như trong bảng dưới
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quá trình chần
TN Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
1 Thời gian chần: 60 giây Nhiệt độ chần: 85 o C,
- Hàm lượng polyphenol tổng (TPC)
- Hoạt tính kháng oxy hóa (AC)
2 Nhiệt độ chần: nhiệt độ được chọn ở thí nghiệm 1
3.4.5.2 Khảo sát quá trình trích ly polyphenol từ vỏ quả cacao
Quá trình trích ly polyphenol là quá trình chính để thu nhận polyphenol từ CPH Tại đây chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện bao gồm: nồng độ ethanol của dung môi trích ly, tỉ lệ nguyên liệu - dung môi, thời gian trích ly, nhiệt độ trích ly để tìm ra điều kiện tốt nhất cho quá trình trích ly polyphenol
Sau khi tiến hành trích ly theo các điều kiện nêu tại bảng 3.2, tiến hành lọc thu lấy dịch trích và thực hiện các bước phân tích
Các yếu tố khảo sát cụ thể như sau:
- Khảo sát nồng độ ethanol của dung môi trích ly: 50 o , 60 o , 70 o , 80 o
- Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu - dung môi: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20
- Khảo sát nhiệt độ trích ly: 30 o C, 40 o C, 50 o C, 60 o C, 70 o C
- Khảo sát thời gian trích ly: 120 phút, 180 phút, 240 phút, 300 phút
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quá trình trích ly
TN Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
- Tỉ lệ nguyên liệu - dung môi:
- Thời gian trích ly: 120 phút
Hàm lượng ethanol trong dung môi (%v/v):
- Hàm lượng polyphenol tổng (TPC)
- Hoạt tính kháng oxy hóa (AC)
- Nồng độ ethanol của dung môi được chọn từ thí nghiệm 1
- Thời gian trích ly: 120 phút
Tỉ lệ nguyên liệu - dung môi: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 (w/v)
- Hàm lượng ethanol trong dung môi: được chọn từ thí nghiệm 1
- Tỉ lệ nguyên liệu - dung môi được chọn từ thí nghiệm 2
- Thời gian trích ly: 120 phút
- Nồng độ ethanol của dung môi: được chọn từ thí nghiệm 1
- Tỉ lệ nguyên liệu - dung môi được chọn từ thí nghiệm 2
- Nhiệt độ trích ly được chọn từ thí nghiệm 3
3.4.6 Nội dung nghiên cứu trích ly pectin
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi dùng trích ly đến chất lượng pectin
Mục đích nghiên cứu Đánh giá mức độ ảnh hưởng của tỷ lệ sử dụng dung môi trong hỗn hợp dung môi dùng trích ly đến chất lượng pectin, từ đó đánh giá chất lượng pectin thu được
Trong thí nghiệm trích ly pectin: ban đầu sẽ tiến hành trích ly polyphenol sử dụng các điều kiện trích ly polyphenol tốt nhất (đã khảo sát ở phần 3.4.5), sau đó lọc lấy phần bã và tiến hành trích ly pectin theo các bước nêu tại mục 3.4.4
Yếu tố cần khảo sát cụ thể như sau:
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi acid citric: acid acetic ở các tỷ lệ: 1:0, 0:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1
Thí nghiệm được sắp xếp và bố trí như trong bảng dưới
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi
TN Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
- Thời gian trích ly: 90 phút
- Tỷ lệ nguyên liệu – dung môi:
Tỷ lệ acid citric: acid acetic trong dung môi chiết: 1:0, 0:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 (v/v) (Nồng độ acid citric 0,5N; Nồng độ acid acetic 0,5N)
Các phương pháp phân tích
W1: khối lượng vỏ cacao ban đầu tính trên chất khô (g) = Khối lượng vỏ cacao x (100 – Độ ẩm vỏ cacao)
W2: khối lượng pectin thu được tính trên chất khô (g) = Khối lượng pectin thu được x (100 – Độ ẩm pectin)
3.5.2 Phương pháp xác định chỉ số methoxyl hóa, chỉ số anhydrouronic acid, chỉ số ester hóa
Xác định chỉ số methoxyl hóa, hàm lượng anhydrouronic acid theo phương pháp của Owens và cộng sự (1952) [148]
Giá trị MeO được tính theo công thức như sau:
𝑚 Giá trị AUA được tính theo công thức như sau:
𝑚 Giá trị DE được tính dựa trên % MeO, % AUA như sau:
AUA: Hàm lượng anhydrouronic acid m (mg): khối lượng mẫu (tính theo chất khô)
V1 (ml): thể tích NaOH 0,1N ở lần chuẩn độ đầu tiên
V2 (ml): thể tích NaOH 0,1N ở lần chuẩn độ tiếp theo
3.5.3 Phương pháp xác định chỉ số acetyl hóa
Xác định chỉ số acetyl hóa theo phương pháp của Kliemann (2009) [149]
Chỉ số acetyl hóa được tính bằng công thức:
Trong đó, NNaOH là nồng độ đương lượng; mLNaOH là tổng thể tích chuẩn độ của NaOH – tổng thể tích NaOH chuẩn độ mẫu trắng; Wt: khối lượng của mẫu (g)
3.5.3 Phương pháp xác định độ nhớt Độ nhớt được đo bằng nhớt kế Cannon ở nồng độ 0,03%
3.5.4 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu vỏ cacao Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi, sử dụng thiết bị đo độ ẩm hồng ngoại
3.5.5 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp quang phổ màu với thuốc thử là Folin Ciocalteu [150-152]
3.5.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) được tham khảo theo phương pháp của Molyneux và cộng sự (2004) [153, 154]
3.5.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Kjeldahl [155]
3.5.8 Phương pháp xác định hàm lượng béo
Hàm lượng béo được tham khảo theo phương pháp FAO FNP 14/7 - 1986 (p 214) [155]
3.5.9 Phương pháp xác định hàm lượng xơ thô
Hàm lượng xơ thô được tham khảo theo phương pháp FAO FNP 14/7 - 1986 (p 230) [155]
3.5.10 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng
Hàm lượng đường tổng được tham khảo theo phương pháp TCVN 4594:1988 [156]
3.5.11 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng
Hàm lượng tro tổng được tham khảo theo phương pháp FAO FNP 14/7 - 1986 (p.228) [155].
Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình (mean) ± độ lệch chuẩn
Sử dụng phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XV để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm và đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu
Phân tích ANOVA nhằm kiểm tra độ tin cậy với mức ý nghĩa 5% để đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu phân tích có ý nghĩa về mặt thống kê hay không Nếu p-value < 0,05 thì sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê Nếu p-value > 0,05 thì sự khác biệt giữa các mẫu sẽ không có ý nghĩa về mặt thống kê.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đánh giá chất lượng nguyên liệu
Thành phần hóa học của vỏ cacao được trình bày trong bảng dưới
Bảng 4.1 Thành phần hóa học vỏ quả cacao
Thành phần Kết quả thực tế đo từ nguyên liệu
Kết quả thực tế từ nguyên liệu tính theo g/kg chất khô Độ ẩm 86,5 -
Kết quả phân tích tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3
Bảng 4 2 Hàm lượng một số thành phần hóa học vỏ quả cacao theo tham khảo các nghiên cứu trước
Z.S Vásquez và cộng sự (2019) [2] (g/kg chất khô)
Francis và cộng sự (2009) [157] (g/kg chất khô)
Dieni Mansur và cộng sự (2014) [158] (g/kg chất khô) Độ ẩm - - -
Nhìn chung thành phần hóa học của nguyên liệu trong nghiên cứu có nhiều điểm tương đồng và khác biệt Chênh lệch lớn nhất là hàm lượng đường tổng khi hàm lượng này trong nguyên liệu cao gấp hơn 4 lần so với giống cacao ở Ghana trong nghiên cứu của Francis và cộng sự (2009) Ngoài ra hàm lượng protein, lipid và xơ thô cũng có sự khác biệt so với các nghiên cứu Trong đó hàm lượng protein có sự tương đồng khi thuộc khoảng kết quả của các nghiên cứu phân tích ở nghiên cứu của Z.S Vásquez và cộng sự (2019) và Dieni Mansur và cộng sự (2014) nhưng thấp hơn hẳn so với nghiên cứu Francis và cộng sự (2009), hàm lượng lipid cao hơn so với nghiên cứu ở Z.S Vásquez và cộng sự (2019) hơn 1,5 lần và hàm lượng xơ thô không có sự chênh lệch lớn, thấp hơn kết quả ở nghiên cứu Francis và cộng sự (2009) và thuộc khoảng kết quả ở nghiên cứu của Dieni Mansur và cộng sự (2014) Hàm lượng tro tổng cũng không khác biệt lớn giữa kết quả các nghiên cứu
Sự chênh lệch lớn về hàm lượng đường có thể liên quan đến sự chênh lệch về hàm lượng xơ thô giữa nguyên liệu và nghiên cứu của Francis và cộng sự (2009), do độ chín khác nhau giữa các đối tượng nghiên cứu Quá trình chín làm phân giải các polysaccharide tạo thành các loại đường đơn Do đó có thể nguyên liệu trong nghiên cứu của chúng tôi có độ chín cao hơn Ngoài ra sự chênh lệch các thành phần có thể do sự khác biệt về điều kiện trồng trọt như giống cây trồng, đất đai, khí hậu, phương pháp canh tác và thời gian thu hoạch.
Phần 1: Trích ly polyphenol
4.2.1 Khảo sát quá trình chần
4.2.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ chần
Hình 4.1: Giá trị TPC và khả năng kháng oxy hóa theo DPPH tại các nhiệt độ khảo sát
Các ký tự trên các cột cùng màu khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p