Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu thu nhận một số hoạt chất từ vỏ trái cacao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

ĐẶNG THỊ BÙI OANH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ VỎ

TRÁI CACAO (THEOBROMA CACAO L.)

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2023

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS TS Đống Thị Anh Đào

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Mai Huỳnh Cang

5 Ủy viên, Thư ký: TS Nguyễn Quốc Cường

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Đặng Thị Bùi Oanh MSHV: 2070458 Ngày, tháng, năm sinh: 20/12/1985 Nơi sinh: Hà Tĩnh

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu thu nhận một số hoạt chất từ vỏ trái cacao (Theobroma

Cacao L.) - Research on obtaining some active ingredients from cocoa pod husk

(Theobroma cacao L.)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Tổng quan về nguyên liệu và các nghiên cứu trên thế giới về trích ly polyphenol và pectin

2 Thiết lập quy trình công nghệ thu nhận polyphenol và pectin từ vỏ trái cacao

3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hiệu suất trích ly TPC và khả năng chống oxi hóa của chúng

4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần acid trích ly đến hiệu suất trích ly và đặc tính của pectin

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 05/09/2022 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/12/2022 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS.TS Đống Thị Anh Đào

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc đến GS TS Đống Thị Anh Đào – người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt thời gian em nghiên cứu khóa luận Và cũng là người đưa ra những ý tưởng, kiểm tra sự phù hợp của luận văn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách Khoa TP HCM đã giảng dạy, và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Phạm Minh Tuấn đã luôn tận tình giúp đỡ và hỗ trợ trong quá trình thực hiện đề tài này

Tiếp theo, mình xin cảm ơn tất cả các bạn cùng làm luận văn tại phòng thí nghiệm B10 – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM, cảm ơn vì đã cùng nhau chia sẻ những niềm vui, nỗi buồn Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn đến hai bạn sinh viên: Bùi Ngọc Linh và Lê Minh Tùng đã đồng hành, sát cánh cùng mình trong suốt mùa luận văn vừa qua

Bên cạnh đó, mình xin gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Thắng đã cung cấp nguồn nguyên liệu cacao trong quá trình thực hiện đề tài này

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè, người thân, đồng nghiệp tại Trung tâm Kỹ thuật 3 đã luôn ở bên để động viên và là nguồn cổ vũ lớn lao, là động lực giúp em hoàn thành luận văn này

Mặc dù đã cố gắng hoàn thành luận văn trong phạm vi và khả năng có thể Tuy nhiên sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự cảm thông và tận tình chỉ bảo của quý Thầy, Cô và toàn thể các bạn

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2023

Học viên

Đặng Thị Bùi Oanh

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ

Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào 2 hướng ứng dụng khác nhau của vỏ cacao Hướng truyền thống là sản xuất pectin để ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm Hướng mới trong việc áp dụng là trích ly polyphenol – là một chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm bổ sung dinh dưỡng hoặc thực phẩm chức năng

Đối với hướng ứng dụng đầu tiên, chúng tôi đã thu nhận được pectin có các chỉ số phù hợp để sản xuất pectin thương mại Phương pháp phối trộn 2 loại acid có thể sử dụng để điều chỉnh chỉ số MeO và thay đổi mức độ methoxyl hóa của pectin thành phẩm Các thông số được chúng tôi chọn lựa trong nghiên cứu này là tỷ lệ thành phần của acid citric và acid acetic trong dung môi trích là 1:4 (v/v), pectin thu nhận được có chỉ số: MeO - 4,47%, AUA – 66,20%; DE – 38,33%; DA – 14,15%

Đối với hướng ứng dụng thứ 2 chúng tôi đã xác định được các điều kiện trích ly phù hợp nhất cho việc trích ly polyphenol từ vỏ cacao Sản phẩm thu được có hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH cao nhất, lần lượt là 4,94 mgGAE/g và 17,926 μmolTE/g (tính trên gam chất khô nguyên liệu) Tương ứng với các thông số trích ly như sau: nhiệt độ chần 90oC, thời gian chần 90 giây, nhiệt độ trích ly 60oC, thời gian trích ly 180 phút, nồng độ dung môi trích ly ethanol 70% (v/v), tỉ lệ nguyên liệu - dung môi trích ly 1:10 (w/v)

ABSTRACT

Our research focuses on 2 different application directions of cocoa pods The traditional direction is the production of pectin for application in the food industry A new direction in application is the extraction of polyphenols - a biologically active substance for the pharmaceutical, cosmetic and nutritional supplement or functional food industries

For the first direction of application, we obtained pectin with indicators suitable for commercial pectin production The method of mixing 2 acids can be used to adjust the MeO index and change the methoxylation level of the finished pectin The parameters we chose in this study are the ratio of components of citric acid and acetic acid in the extraction solvent to 1:4 (v/v), the obtained pectin has the index: MeO - 4.47 %, AUA – 66.20%; DE – 38.33%; DA – 14.15%

For the second application direction, we have determined the most suitable extraction conditions for the extraction of polyphenols from cocoa pods The obtained product had the highest polyphenol content and antioxidant activity according to DPPH, 4.94 mgGAE/g and 17.926 μmolTE/g, respectively (calculated on grams of dry matter) Corresponding to the extraction parameters as follows: blanching temperature 90oC, blanching time 90 seconds, extraction temperature 60oC, extraction time 180 minutes, extraction solvent concentration ethanol 70% (v/v), ratio of raw materials - extraction solvent 1:10 (w/v).

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn này là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Đống Thị Anh Đào Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực và không sao chép từ bất cứ một nguồn nào, dưới bất cứ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2023

Học viên

Đặng Thị Bùi Oanh

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Tính mới của đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về cacao 3

2.1.1 Giới thiệu chung 3

2.1.2 Cấu tạo, thành phần quả cacao 6

2.3.1 Giới thiệu về pectin 15

2.3.2 Cấu tạo pectin 17

2.3.3 Phân loại pectin 20

2.3.4 Đặc tính tạo gel của pectin 21

2.3.5 Các chỉ số đặc trưng của pectin 23

2.3.6 Pectin trong vỏ cacao 25

2.4 Tình hình nghiên cứu trích ly polyphenol và pectin 25

2.4.1 Các nghiên cứu trước đây về trích ly pectin 27

2.4.2 Các nghiên cứu trước đây về trích ly polyphenol 30

Chương 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

3.1 Nguyên liệu 34

3.1.1 Vỏ trái cacao 34

3.1.2 Xử lý nguyên liệu 34

3.2 Hóa chất, thiết bị 35

3.2.1 Hóa chất 35

3.2.2 Thiết bị 35

3.3 Đánh giá chất lượng vỏ cacao 35

3.4 Phương pháp nghiên cứu trích ly polyphenol và pectin 36

3.4.1 Sơ đồ nghiên cứu trích ly polyphenol 36

3.4.2 Sơ đồ nghiên cứu trích ly pectin 36

3.4.3 Quy trình thực hiện trích ly polyphenol và pectin 36

3.4.4 Thuyết minh quy trình 37

3.4.5 Nội dung nghiên cứu trích ly polyphenol 39

3.4.6 Nội dung nghiên cứu trích ly pectin 42

3.5 Các phương pháp phân tích 43

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 46

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47

4.1 Đánh giá chất lượng nguyên liệu 47

CPH: Vỏ cứng trái cacao DA: Chỉ số acetyl hóa DE: Chỉ số ester hóa

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam TDF: Xơ tổng

TE: Đương lượng trolox TPC: Polyphenol tổng

v/v: Tỷ lệ thể tích trên thể tích w/v: Tỷ lệ khối lượng trên thể tích

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Đặc tính hương vị của hạt cacao từ các nguồn gốc khác nhau 3

Bảng 2.2: Thành phần của vỏ cứng cacao theo nhiều tác giả khảo sát trên các giống cacao 7

Bảng 2.3: Thành phần của vỏ hạt, vỏ cứng và lớp nhầy của trái cacao 9

Bảng 2.4: Các thành phần hóa học của vỏ cacao từ các nguồn gốc và cách xử lý khác nhau (g/kg chất khô) 15

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quá trình chần 40

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quá trình trích ly 42

Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi 43

Bảng 4.1 Thành phần hóa học vỏ quả cacao 47

Bảng 4 2 Hàm lượng một số thành phần hóa học vỏ quả cacao theo tham khảo các nghiên cứu trước 48

Bảng 4.3: Bước sóng tương ứng với các nhóm chức đặc trưng cho pectin 72

Bảng 4.4: Tổng kết số liệu các nghiệm thức trong trích ly pectin 75

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Các giống chính của cây cacao 5

Hình 2.2: (1) Cấu trúc tổng thể trái cacao; (2) Phần phụ phẩm của vỏ cacao 8

Hình 2.3: Sơ đồ phân loại polyphenol theo cấu trúc phân tử 10

Hình 2.4: Cấu tạo phân tử của nhóm acid phenolic 11

Hình 2.5: Cấu trúc khung cơ bản (basic skeleton) của flavonoid và các phân lớp của chúng 12

Hình 2.6: Cấu tạo pectin 16

Hình 2.7: Cấu trúc của thành tế bào Pectin thường liên kết với các thành phần khác của thành tế bào như cellulose hoặc hemicellulose trong các mô thực vật 16

Hình 2.8: Pectin với các đơn vị acid acid D – galaturonic liên kết với nhau bằng liên kết α–1,4 glycosid 17

Hình 2.9: [A] Các dạng axit galacturonic (GalA) được tìm thấy trong pectin: (i) GalA, (ii) GalA được metyl hóa và (iii) O-Acetyl hóa GalA; [B] Chuỗi pectin bao gồm liên kết cộng hóa trị (i) homogalacturonan (HGA), (ii) rhamnogalacturonan I (RG-I) và (iii) rhamnogalacturonan II (RG-II) 18

Hình 2.10: Sự gel hóa HMP được điều chỉnh bởi các liên kết hydro giữa các phân tử và tương tác kỵ nước giữa các metyl este 22

Hình 2.11: Cơ chế gel hóa LMP được điều chỉnh bởi liên kết chéo ion thông qua ion canxi (hóa trị hai) giữa hai nhóm cacboxyl từ hai chuỗi khác nhau ở gần nhau 23

Hình 2.12: Các ứng dụng của pectin dựa vào chỉ số DE 24

Hình 3.1: Nguyên liệu trái cacao 34

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu trích ly polyphenol 36

Hình 3.3: Sơ đồ nghiên cứu trích ly pectin 36

Hình 3.4: Quy trình trích ly polyphenol và pectin 37

Hình 4.1: Giá trị TPC và khả năng kháng oxy hóa theo DPPH tại các nhiệt độ khảo sát 49 Hình 4.2: Giá trị TPC và hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH tại thời gian khảo sát 51

Hình 4.3: Giá trị TPC và hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH tại các nồng độ ethanol

trong dung môi 52

Hình 4.4: Giá trị TPC và hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH tại các tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 54

Hình 4.5: Giá trị TPC và hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH tại các nhiệt độ khảo sát 55

Hình 4.6: Giá trị TPC và hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH tại các thời gian khảo sát 57

Hình 4.7: Hiệu suất trích ly pectin (theo chất khô nguyên liệu) tương ứng với dung môi hỗn hợp acid citric và acid acetic 58

Hình 4.8: Chỉ số methoxyl tương ứng với dung môi hỗn hợp acid citric và acid acetic 60

Hình 4.9: Chỉ số anhydrouronic acid tương ứng với dung môi hỗn hợp acid citric và acid acetic 62

Hình 4.10: Chỉ số ester hóa tương ứng với dung môi hỗn hợp acid citric và acid acetic 64

Hình 4.11: Chỉ số acetyl hóa tương ứng với dung môi hỗn hợp acid citric và acid acetic 66

Hình 4.12: Độ nhớt tương ứng với dung môi hỗn hợp acid citric và acid acetic 68

Hình 4.13: Phổ IR pectin thương mại 70

Hình 4.14: Phổ IR Pectin có tỷ lệ dung môi acid citric – acid acetic 1:04 70

Hình 4.15: Phổ IR mẫu Pectin có tỷ lệ dung môi acid citric – acid acetic 1:0 71

Hình 4.16: Phổ IR mẫu pectin có tỷ lệ dung môi acid citric – acid acetic 0:1 71

Hình 4.17: Hình ảnh chụp SEM mẫu pectin thương mại 76

Hình 4.18: Hình ảnh chụp SEM mẫu pectin trích ly với tỷ lệ acid citric – acid acetic 1:4 76

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

- Trong thời gian gần đây, giá trị của phụ phẩm trong công nghiệp ngày càng được chú trọng vì muốn tạo giá trị gia tăng cũng như là vấn đề về môi trường - Trong ngành công nghiệp sản xuất cacao, lượng phụ phẩm thải bỏ của trái

cacao bao gồm vỏ cacao (pod), vỏ trấu cacao (husk), cơm cacao Chúng chiếm hơn 60% tổng khối lượng của trái cacao Sản lượng hạt cacao trên thế giới mùa vụ 2020/21 theo ước tính của tổ chức cacao quốc tế (International cocoa organization) vào khoảng 5 244 ngàn tấn [1] Do đó với sản lượng này thì lượng vỏ cacao vào khoảng hơn 3 000 ngàn tấn/ mùa vụ Với thể tích lớn và cấu trúc cố định, các chất thải từ cacao rất khó xử lý và phân hủy Từ đó gây nên nhiều vấn đề nghiêm trọng cho môi trường [2]

- Vì vậy, trong các năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu để chuyển phụ phẩm vỏ cacao thành các thành phần của thực phẩm Trong vỏ cacao chứa nhiều thành phần tiềm năng có chứa hoạt tính sinh học như nguồn polyphenols đáng kể, hàm lượng xơ dồi dào với thành phần pectin cao (6,1 – 9,2 g/100g chất khô) cùng với các loại đường và các acid hữu cơ phức tạp Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát các điều kiện trích ly nhằm tìm ra điều kiện trích ly phù hợp để tăng lượng polyphenol được trích ly và cải thiện hiệu suất trích ly của pectin

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Thu nhận hoạt chất sinh học là hợp chất phenolic và pectin từ phụ phẩm vỏ cứng cacao bằng cách:

- Khảo sát các điều kiện trích ly: nhiệt độ chần, thời gian chần, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu – dung môi từ đó lựa chọn điều kiện phù hợp nhất để trích ly polyphenol từ vỏ cacao

- Khảo sát tỷ lệ của dung môi trong hỗn hợp dung môi dùng trích lý pectin từ vỏ cacao từ đó xác định cấu trúc của pectin thu được ứng với từng tỷ lệ dung môi khảo sát

1.3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

Đối tượng: Vỏ trái cacao thu được từ trái cacao được trồng tại các nông hộ ở Tiền Giang

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm B10 - Trường Đại học Bách Khoa TP HCM

Thời gian thực hiện: từ ngày 05/09/2022 đến ngày 10/12/2022 Nghiên cứu bao gồm những nội dung sau:

‐ Nội dung 1: Xác định các thành phần hóa học của vỏ cacao

‐ Nội dung 2: Khảo sát nhiệt độ và thời gian trong quá trình chần Hai yếu tố ảnh hưởng đến khả năng bất hoạt enzyme polyphenol oxydase và hiệu suất trích ly ‐ Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ trích ly, thời gian trích

ly, nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu – dung môi đến quá trình trích ly polyphenol từ vỏ cacao

‐ Nội dung 4: Khảo sát các tỷ lệ hỗn hợp dung môi trích ly pectin bởi citric acid và acetic acid Từ đó, xác định các đặc tích của pectin thu được

1.4 Tính mới của đề tài

Nghiên cứu trích ly polyphenol: Khảo sát trên nguyên liệu tươi và nguyên liệu đã qua chần Các nghiên cứu trước được tiến hành trên nguyên liệu đã sấy khô điều này sẽ làm mất đi lượng đáng kể polyphenol Vì vậy, nghiên cứu này hướng đến việc bảo toàn lượng polyphenol tối đa trong quá trình trích ly, đồng thời sử dụng phương pháp chần để làm bất hoạt enzym PPO giảm bớt sự tổn thất polyphenol

Nghiên cứu trích ly pectin: Khảo sát quá trình trích ly pectin bởi hỗn hợp dung môi của 2 axit yếu: acid citric và acid acetic để nhằm giảm thiểu sự phân cắt chuỗi polyme của pectin giúp tăng hiệu suất trích ly pectin so với sự trích ly bởi dung môi gồm các acid mạnh như HCl, HNO3

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về cacao

2.1.1 Giới thiệu chung

là ở các nước đang phát triển [4] Cacao là một trong những sản phẩm thực vật được sử dụng nhiều nhất trong sô cô la, đồ ăn nhẹ và đồ uống Sản lượng cacao hàng năm đạt khoảng 4,72 triệu tấn vào năm 2020, với giá trị bán ra dự kiến khoảng 20 tỷ USD vào năm 2021 [5] Mỗi loại cacao có đặc tính và hương vị khác nhau

Bảng 2.1: Đặc tính hương vị của hạt cacao từ các nguồn gốc khác nhau [6]

Côte d’Ivoire Forastero Hương cacao tốt, ít đắng, acid thấp, hương trái cây, mùi thơm.

Nigeria Hạt lai Forastero Hương cacao trung bình,São Tomé &

Arriba)

Forastero (Nacional)

Chocolate thấp, hương hoa, hương trái cây, mùi cỏ khô và mùi đất Mexico (Tabasco) Hạt lai

Criollo/Forastero

Chocolate thấp, acid cao, hương trái cây nhẹ

Panama Forastero Chocolate trung bình, vị chua, hương trái cây và tinh dầu

Cộng hòa Dominica (Sanchez)

Mùi rượu, mùi đất và có thể có mùi thuốc lá

Costa Rica Forastero Hương trái cây, hương cacao Trinidad & Tobago Trinitario Cacao cao, mùi đậu, mùi rượu và thơm

Grenada Trinitario Chocolate, hương trái cây, hương hoa, mùi cỏ khô và mùi gỗ

Có khoảng 20 loại cacao (T Cacao) trong đó có 3 loại phổ biến (Criollo, Forastero

và Trinitario) và 3 loại này chiếm sản lượng 95% trong tổng số sản lượng cacao trên thế giới [4] Gần đây, ngoài 3 giống cacao được trồng phổ biến trên thì có thêm một giống khác được trồng ở Ecuado, được gọi là Nacional

Các giống chính của cây cacao gồm:

- Forastero có nguồn gốc ở lưu vực sông Amazon [7]

- Criollo hiếm khi được trồng vì cây dễ nhiễm bệnh, cho sản lượng thấp

- Trinitario là cây lai giữa 2 giống Forastero và Criollo, với ưu điểm là năng suất cao và kháng bệnh tốt

- Nacional với sản lượng ít nhất nhưng lại đem đến hương vị hảo hạng, được trồng nhiều ở Ecuador

Các giống cây Forastero có sản lượng lớn nhất trên thế giới Sản lượng hạt cacao hàng năm trên thế giới khoảng 4,25 triệu tấn với các nhà sản xuất chính là Ghana, Indonesia, Brazil, Ecuador…

Hình 2.1: Các giống chính của cây cacao [8]

Cacao Forastero

Forastero có nguồn gốc từ cao nguyên Amazon và phần lớn được trồng ở Tây Phi và Đông Nam Á Nó chiếm khoảng 70% sản lượng cacao trên thế giới và được sử dụng nhiều nhất do năng suất cao hơn so với giống Criollo [9] Giống này được trồng chủ yếu ở Tây Phi, đặc biệt ở Bờ Biển Ngà, Ghana, Nigeria và Cameroon Hạt có màu tím (đỏ) đặc trưng, do sự biểu hiện của anthocyanin [10], có vị vị hơi đắng nhưng có hương vị mạnh nhất [11]

Cây cacao, giống Forastero có khả năng kháng sâu bệnh hại ở mức khá [10] Mặc dù sản lượng cao hơn, khả năng sinh trưởng tốt hơn nhưng chất lượng lại kém hơn loại Criollo (vị đắng hơn) Forastero khi chín có vỏ cứng, màu vàng và có dạng tròn như quả dưa Bên trong chứa khoảng 30 hạt hoặc nhiều hơn Chocolate được sản xuất từ hạt cacao này sẽ có hương vị rất phong phú [11] Forastero có nhiều phân loài: Amelonado, Cundeamor và Calabacillo, trong đó, Amelonado được trồng phổ biến nhất [6]

 Cacao Criollo

Criollo có nguồn gốc ở Châu Mỹ [12] Được khám phá bởi Christopher Columbus vào năm 1502 trên đảo Guanaja Là loại cây nhỏ, có chất lượng cao nhưng cây này có sức sống kém, dễ nhiễm bệnh và sự tấn công của côn trùng Sản lượng thu hoạch thấp nhưng giá lại đắt nên ít được trồng trên thế giới (chỉ khoảng 5 – 10% sản lượng cacao trên thế giới) Loại này hiện nay rất hiếm và chỉ có ở các đồn điền cũ ở Venezuela, Trung Mỹ, Madagascar, Sri Lanka và Samoa [11]

Hạt có màu trắng, trắng ngà hoặc có màu tím nhạt là do có gen gây ức chế hoạt động của anthocyanin [12] Hạt cacao của nó có chất lượng cao nhất, nó ít đắng hơn nhưng lại thơm hơn Đây cũng là lý do giá thành của nó cao hơn các loại khác [11] Hạt cacao giống này có chứa hàm lượng lớn pyrazine và pH thấp rất dễ ảnh hưởng đến hương vị [6]

Năng suất của Criollo thấp hơn so với các loại giống khác mặc dù cùng quy mô [11] Criollo cũng mẫn cảm với sâu bệnh hại Ngày nay, giống này chỉ được trồng giới hạn ở Trung Mỹ và một số vùng ở Châu Á [13] Quả của Criollo thường có vỏ mỏng mềm, màu đỏ và bên trong chứa từ 20 – 30 hạt Khi quả chín, quả dài, vỏ có màu vàng hoặc đỏ, có rãnh sâu và mụn cóc lớn [11]

 Cacao Trinitario

Trinitario có nguồn gốc từ Trinidad do đó tên của nó được đặt dựa theo tên của địa phương này, đây là sản phẩm lai tạo tự nhiên và tái tổ hợp giữa các quần thể Criollo và Forastero [14]

Giống này có chất lượng cao hơn so với Criollo và năng suất cao hơn, kháng bệnh tốt hơn Forastero trước đây [15] Giống cây này chiếm khoảng 10 – 15% sản lượng cacao trên thế giới Trinitario có vỏ cứng, màu sắc của vỏ có thể thay đổi Chúng có thể dài hoặc tròn Bên trong chứa từ 30 hạt hoặc nhiều hơn [11] Hạt cacao trinitario có màu trắng và mức chống chịu sâu bệnh hại ở mức trung bình giữa Criollo và Forastero [10]

2.1.2 Cấu tạo, thành phần quả cacao

Quả cacao có cấu tạo như sau:

 Lớp vỏ cứng bên ngoài (Pod shell/Husk):

Vỏ cacao bao ở bên ngoài cứng và dày Vỏ cacao chiếm tỷ lệ 67-76% so với tổng khối lượng quả cacao và được cấu tạo bởi 3 lớp: Epicarp – Lớp ngoài cùng; Mesocarp

– Lớp trong; Endocarp – Lớp trong cùng Endocarp là một mô mềm màu trắng có chức năng bảo vệ các hạt ở bên trong Mesocarp có cấu trúc cứng, có khả năng giữ các hạt bên trong ngay ngắn dưới các tác động bên ngoài Và lớp ngoài cùng Epicarp tương đối mềm có màu vàng hoặc đỏ tím khi chín (tùy thuộc từng loại giống), chịu tác động trực tiếp của mặt trời, môi trường xung quanh [2]

Bảng 2.2: Thành phần của vỏ cứng cacao theo nhiều tác giả khảo sát trên các giống cacao [4]

Độ ẩm,

%

Protein, %

Tro, %

Lipid, %

TDF, %

Pectin, %

Lignin,

8,5 8,6 6,7 1,5 32,3 12,6 21,4 Vriesmann và cộng sự (2011) [16]

Cơm cacao là một lớp bao xung quanh từng hạt, chủ yếu bao gồm các tế bào kéo dài với không bào lớn Ở những quả chưa trưởng thành, cơm có màu trắng đến vàng và có cấu trúc cứng Trong quá trình chín của hạt, cơm chuyển sang dạng lớp nhầy, có mùi thơm đặc trưng và thay đổi tùy kiểu gen (chủng loại) [2]

 Hạt cacao

Hạt cacao cơ bản gồm một lớp vỏ ngoài (Testa), chiếm khoảng 10-14% khối lượng khô của hạt; phôi nhũ (hay lá mầm) chiếm khoảng 86-90% khối lượng hạt, dự trữ toàn bộ các hợp chất quan trọng mang lại hương vị và mùi thơm đặc trưng của chocolate Kích thước hạt trung bình tối thiểu là 1g [23, 24]

 Phôi nhũ (Cotyledon) ở bên trong cùng của hạt Chứa khoảng 33% nước, 33% là chất béo (hay còn gọi là bơ cacao) và phần còn lại bao gồm các hợp chất như polyphenol, tinh bột, đường, theobromine… và nhiều thành phần khác ở nồng độ nhỏ hơn Lá mầm có chức năng chính là dự trữ các chất dinh dưỡng cho sự phát triển của cây con [11]

 Vỏ hạt (Testa) được xem như một rào chắn bán dẫn cho các chất giữa hạt và cơm di chuyển qua lại Testa đã được chứng minh là có khả năng cho nước, ethanol, acid acetic, acid lactic và một số hợp chất hữu cơ dễ bay hơi đi Và lớp vỏ này cũng có tác dụng chứa đựng các chất từ hạt đi ra trong quá trình lên men [23]

Khi thu hoạch trái cacao, phụ phẩm ta thu được 3 phần: Vỏ cứng cacao (Cocoa pod husk – CPH); vỏ hạt cacao (cocoa bean shells – CBS) và lớp nhầy (cocoa mucilage/ pulp) (hình 2.2) với những thành phần hóa học khác nhau (Bảng 2.3) [4]

Hình 2.2: (1) Cấu trúc tổng thể trái cacao; (2) Phần phụ phẩm của vỏ cacao [4]

Bảng 2.3: Thành phần của vỏ hạt, vỏ cứng và lớp nhầy của trái cacao [4, 16, 21, 22, 25-36]

Thành phần Vỏ hạt cacao Vỏ cứng cacao Lớp nhầy

TDF 50,4 % – 63,6% 18,3 % – 59,0%

16,75 – 16,86 g /100g chất khô

0,69 – 0,78 g /100g chất khô

16,06 – 16,11 g /100g chất khô

TPC 1,32 – 5,78 g GAE/ 100g chất khô

4,6 – 6,9 g GAE/ 100g chất khô

-

Pectin 4,7 – 6,0 g/100g chất khô

glycoside) Tuy nhiên, trong tự nhiên polyphenol chủ yếu tồn tại ở dạng glycoside với các nhóm đường khác nhau và được acyl hóa ở các vị trí khác nhau ở khung xương polyphenol (do ở dạng aglycones tự do không bền, dễ bị phân hủy) [38, 39]

2.2.2 Phân loại

Polyphenol trong tự nhiên được phân bố rộng rãi và nhiều nhất là trong giới thực vật Hơn 8000 cấu trúc polyphenol được xác định, trong đó có hơn 4000 flavonoid đã được xác định Mặc dù tính chất hóa học của polyphenol được đặc trưng bởi các nhóm có cấu trúc phenol, những nhóm hợp chất này rất đa dạng, và có nhiều cấu trúc khác nhau Trái cây, rau, trà, rượu vang, chocolate là những nguồn giàu polyphenol Chính sự đa dạng này đã dẫn đến nhiều cách phân loại của hợp chất này Polyphenol có thể được phân loại theo nguồn gốc, chức năng sinh học hay cấu trúc hóa học Theo cấu trúc hóa học, polyphenol được chia thành 3 nhóm chính: phenolic acids, flavonoids, non-flavonoids [40]

Hình 2.3: Sơ đồ phân loại polyphenol theo cấu trúc phân tử [41]

2.2.2.1 Phenolic acid

Acid phenolic là hợp chất polyphenol không phải flavonoid, có thể chia thành 2 loại chính, acid benzoic và dẫn xuất acid cinnamic dựa trên mạch chính C1-C6 và C3- C6 Chúng có nguồn gốc từ acid hydroxycinnamic (acid caffeic, acid ferulic, acid p-coumaric ) và acid hydroxybenzoic (acid syringic, acid vanillic, acid gentisic ), trong phân tử của chúng có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl và nhóm acid cacboxylic được gắn trên một vòng benzene [41, 42]

Acid phenolic được tìm thấy ở hàm lượng cao trong nhiều loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật Chúng thường ở dạng liên kết như amit, este hoặc glycoside và hiếm khi

dưới tác dụng của acid, kiềm hay các enzyme khác thủy phân [41, 42] Các axit phenolic tự do như axit benzoic, phenylacetic và cinnamic, có sinh khả dụng cao và khả năng hòa tan trong nước tốt [44] Chúng có thể được hấp thụ qua thành ruột dễ dàng hơn một số flavonoid [45, 46].

Hình 2.4: Cấu tạo phân tử của nhóm acid phenolic [46]

2.2.2.2 Flavonoids

Flavonoid, một nhóm các chất tự nhiên có cấu trúc phenol thay đổi, được tìm thấy trong trái cây, rau, ngũ cốc, vỏ cây, rễ, thân, hoa, trà và rượu vang Flavonoid có thể được chia thành các nhóm phụ khác nhau tùy thuộc vào carbon của vòng C mà vòng B được gắn vào và mức độ không bão hòa và oxy hóa của vòng C Các flavonoid mà vòng B liên kết ở vị trí 3 của vòng C được gọi là isoflavone Những loại trong đó vòng B được liên kết ở vị trí 4 được gọi là neoflavonoid, trong khi những loại mà vòng B được liên kết ở vị trí 2 có thể được chia thành nhiều nhóm nhỏ trên cơ sở các đặc điểm cấu trúc của vòng C Các phân nhóm này là: flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, flavanol hoặc catechin, anthocyanin và chalcon [47]

Hình 2.5: Cấu trúc khung cơ bản (basic skeleton) của flavonoid và các phân lớp của chúng [47]

Flavonoids là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung gồm 2 vòng C6 (vòng A và vòng B) có bản chất là vòng benzen nối với nhau qua một mạch 3 carbon (dị vòng pyran) Do mô hình hydroxyl hóa và các biến thể trong vòng chromane (vòng C), flavonoid có thể được chia thành nhiều nhóm

phụ khác nhau như anthocyanins, flavan 3-ols, flavon, flavanones và flavonols Trong khi phần lớn các flavonoid có vòng B gắn với vị trí C2 của vòng C, một số flavonoid như isoflavone và neoflavonoid, có vòng B được nối ở vị trí C3 và C4 của vòng C, cũng được tìm thấy trong thực vật Chalcones mặc dù không tìm thấy dị vòng C, vẫn được cho là thành viên của họ flavonoid [40, 41]

2.2.2.3 Non-Flavonoids

Ngoài các nhóm phenolic acid, flavonoid và phenolic amide, có một số polyphenolic không phải là flavonoids được tìm thấy trong thực phẩm và được xem là quan trọng đối với sức khỏe con người Trong số những hợp chất tìm được, resveratrol chỉ có ở trong nho và rượu vang nho; acid ellagic và các dẫn xuất của nó được tìm thấy trong các loại quả mọng như mâm xôi, dâu tây…[40, 41]

Non-flavonoids không có cấu tạo đặc trưng của acid phenolic hay flavonoids và gồm 2 nhóm nhỏ là Stilbenes và Lignans [48]

Lignans tồn tại ở dạng liên kết với chất xơ được tìm thấy trong các hạt lanh, hạt vừng và nhiều loại ngũ cốc khác [40, 41] Lignans là một nhóm nhỏ của các polyphenol không phải flavonoid Chúng phân bố rộng rãi trong giới thực vật, có mặt trong hơn 55 họ thực vật, nơi chúng đóng vai trò là chất chống oxy hóa và phân tử bảo vệ chống lại nấm và vi khuẩn gây bệnh Lignan là các dimer phenolic sở hữu cấu trúc 2,3-dibenzylbutane Các hợp chất như vậy được biết là tồn tại dưới dạng thành phần nhỏ của nhiều loại thực vật, nơi chúng tạo thành các khối xây dựng để hình thành lignin trong thành tế bào thực vật Các hợp chất xảy ra chủ yếu ở dạng glycosid [49]

Stilbenes có cấu trúc đặc trưng bởi sự hiện diện của nhân 1,2-diphenylethylene có thể được chia làm 2 loại là stilbene đơn phân và oligomeric Chúng có các đặc tính sinh học quan trọng như chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư và kháng khuẩn Chúng cũng có tác dụng bảo vệ gan, chống lại bệnh Alzheimer và ức chế sự gia tăng glucose và triglyceride trong huyết tương Điển hình như là hợp chất Curcumin được sản xuất từ củ nghệ [40, 41]

2.2.3 Polyphenol trong vỏ cacao

Vỏ cứng cacao (CPH) là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các hợp chất phenolic Các hợp chất phenolic trong vỏ cacao gồm có catechin, quercetin, epicatechin,

gallic acid, coumaric, protocatechuic acid Thành phần phenolic trong vỏ cacao sẽ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố: môi trường (loại cacao, điều kiện khí hậu, điều kiện thổ nhưỡng, điều kiện chăm sóc, điều kiện bảo quản), điều kiện trích ly Khả năng oxy hóa trong vỏ cacao vào khoảng 24-42 µM TE/g; 18-34 µM TE/g và 0,7-2 µM TE/g (tương ứng theo các phương pháp ABTS, DPPH và FRAP) và cao hơn các phụ phẩm khác như vỏ hạt cacao, lớp nhầy, vỏ cà chua [4]

Vỏ cứng cacao tươi sẽ được sấy để đảm bảo tính ổn định của nguyên liệu Các phương pháp sấy khác nhau như sấy không khí nóng, sấy vi sóng, sấy lạnh có thể ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol đáng kể Nhiều nghiên cứu thấy rằng phương pháp sấy lạnh và sấy vi sóng có thể ngăn ngừa mất TPC so với sấy bằng không khí nóng [50] Phương pháp chiết hợp chất phenolic phổ biến là trích ly bằng dung môi Hiệu quả trích ly có thể thay đổi tùy vào tính chất dung môi TPC của CPH trích ly bằng hỗn hợp methanol và acetol (2 mg GAE/g) cao hơn so với trích ly bằng ethanol (3,6 mg GAE/g) do khả năng hòa tan khác nhau [21] Trích ly siêu tới hạn được xem là công nghệ xanh và cũng được sử dụng để trích ly hợp chất phenolic từ CPH TPC thu được lên đến 12,97 mg GAE/g khi trích ly ở điều kiện 60oC, 299 bar, 13,7% ethanol [21]

Bảng 2.4: Các thành phần hóa học của vỏ cacao từ các nguồn gốc và cách xử lý khác nhau (g/kg chất khô) [51]

Nguồn gốc Tây Ban Nha

Ghana, Ecuador, Ivory coast

Tây Ban Nha

Ghana, Ecuador, Ivory

coast Phương pháp xử lý Nướng

2.3.1 Giới thiệu về pectin

Từ thời tiền sử, pectin đã có trong khẩu phần ăn của con người Nhưng chỉ khoảng 2 thế kỷ gần đây pectin mới được nghiên cứu chiết tách và sử dụng như chất tạo gel trong việc đa dạng hoá các sản phẩm thực phẩm [53]

Pectin là polysaccharide có trong thành tế bào của các mô thực vật, tạo độ bền và độ cứng của trái cây Trong quá trình chín của trái cây pectin bị biến đổi và thủy phân thành các đoạn ngắn bởi enzyme làm trái cây mềm hơn Pectin được cấu tạo từ các mono axit galacturonic, có chứa các nhóm metyl este hóa [54]

Hình 2.6: Cấu tạo pectin [54]

Pectin trong mô thực vật liên kết với các thành phần khác của thành tế bào như celluloses hoặc hemicelluloses, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng [55, 56]

Hình 2.7: Cấu trúc của thành tế bào Pectin thường liên kết với các thành phần khác của thành tế bào như cellulose hoặc hemicellulose trong các mô thực vật

[57]

Pectin là một thành phần phổ biến của các mô non, trái cây và rau quả [58] Nó có nhiều nhất ở các lớp phiến giữa, giữa các tế bào thực vật liền kề [59] Tiếp theo là thành tế bào sơ cấp của thực vật cũng chứa một lượng pectin khá cao [60] Lượng pectin bị giảm đi đáng kể hoặc thậm chí không có bắt đầu từ thành tế bào thứ cấp của thực vật hướng tới màng sinh chất của tế bào thực vật [61].

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 2 dạng: Dạng protopectin không tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào dưới dạng kết hợp với polysaccharide araban, dạng hòa tan của pectin tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào Dưới tác dụng của axit, enzyme protopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển sang dạng pectin hòa tan Đặc tính quan trọng của

pectin là khi có mặt axit (pH từ 3,1 – 3,5) và đường (65-70%), nó có khả năng tạo gel [62]

Phần lớn các quốc gia xem pectin là chất phụ gia tạo gel quý và vô hại trong thực phẩm, có thể sử dụng với liều lượng tùy ý tùy thuộc vào quy trình công nghệ, điều này được chứng minh bởi lượng ADI (acceptable daily intake value) cho phép là “không hạn định” được ban hành bởi các tổ chức JECFA (Joint Food Experts Committee), SCF (Scientific Committee for Food) ở Liên minh châu Âu, và GRAS (Generally Regarded)

2.3.2 Cấu tạo pectin

Về mặt hóa học, pectin là polysaccharid có cấu trúc dị thể mạch thẳng với mạch chính được cấu tạo từ các đơn phân tử là acid D - galaturonic và chúng được liên kết với nhau bằng liên kết α–1,4 glycosid (còn được gọi là acid galactosyluronic) (GalA) Chiều dài của chuỗi acid polygalacturonic có thể biến đổi từ vài trăm đến hàng ngàn đơn vị acid galacturonic Pectin khác với carbohydrate thông thường là không phải được xây dựng từ các phân tử đường mà là từ acid galacturonic, mạch thẳng vì thế có tên gọi là homogalacturonan Công thức nguyên của acid galacturonic là C6H10O7

Hình 2.8: Pectin với các đơn vị acid acid D – galaturonic liên kết với nhau

bằng liên kết α–1,4 glycosid [57]

Pectin được cấu tạo bởi ít nhất 17 monosaccharide khác nhau, trong đó GalA (Hình 2.9Ai) chiếm tỉ lệ nhiều nhất, tiếp theo là l-arabinose, d-galactose, l-rhamnose và những loại khác Các monosaccharide này có thể được nối với nhau thông qua 20 liên kết khác

nhau [63] Trong các monome GalA, các nhóm cacboxylic hoặc hydroxyl có thể được metyl-este hoá (Hình 2.9Aii) hoặc O-acetyl-este hoá (Hình 2.9Aiii) Quá trình O-acetyl-ester hóa xảy ra chủ yếu ở vị trí O-3 và đôi khi ở vị trí O-2

Mạng pectin từ thực vật bao gồm các miền polysaccharide: homogalacturonan (HGA), rhamnogalacturonan I (RG-I), rhamnogalacturonan II (RG-II), xylogalacturonan và apiogalacturonan [64-66] HGA và RG-I là các thành phần chính chiếm lần lượt 60 – 65% và 20 – 35% tổng pectin [67] Các miền polysaccharide được liên kết cộng hóa trị và liên kết chéo về mặt ion với các sợi pectin khác để tạo thành các mạng pectic phân nhánh khắp thành tế bào sơ cấp (hình 2.9B) [65, 68, 69] Ba dạng pectin đã được nghiên cứu:

(a): mạch pectin bao gồm miền HGA và RGI xen kẽ [70]

(b): mạch pectin bao gồm miền RGI với HG được liên kết như chuỗi [71]

(c): mạch pectin bao gồm các sợi HGA liên kết vuông góc, xen kẽ với miền RGI [66]

Hình 2.9: [A] Các dạng axit galacturonic (GalA) được tìm thấy trong pectin: (i) GalA, (ii) GalA được metyl hóa và (iii) O-Acetyl hóa GalA; [B] Chuỗi pectin

bao gồm liên kết cộng hóa trị (i) homogalacturonan (HGA), (ii) rhamnogalacturonan I (RG-I) và (iii) rhamnogalacturonan II (RG-II) [57]

2.3.2.1 Homogalacturonan (HGA)

HGA là một homopolyme tuyến tính của GalA được nối với nhau bằng liên kết α -1,4 và được gọi là “smooth region” (Hình 2.9Bi) Đây là một vùng pectin phong phú và phổ biến, chiếm khoảng 60–65% tổng lượng pectin [72] Khoảng 70 – 80% đơn vị GalA được methyl hóa hoặc O-acetyl-ester hóa ở O-2 hoặc O-3 [67, 73] Số lượng đơn vị GalA có trong một chuỗi HGA được ước tính khoảng 100–200 đơn vị [74] Vùng HGA đôi khi được nối bởi một hoặc hai liên kết α -1,2 l-rhamnopyranose và hầu hết các pectin có cấu trúc này Ngoài ra, các đơn vị GalA có thể được thay thế ở vị trí C-2 hoặc C-3 bằng xylose hoặc apiose để tạo ra các miền được gọi là xylogalacturonan hoặc apiogalacturonan [75].

2.3.2.2 Rhamnogalacturonan I (RG-I)

RG-I được gọi là “hairy region”, bao gồm tối đa 100 đơn vị lặp lại của disaccharide bằng liên kết α - 1,2 l -rhamnose -α-1,4-d-GalA (Hình 2.9Bii) Hàm lượng rhamnose chiếm trên 30% pectin Trong các hàm lượng rhamnose này, 50–78% được ước tính là RGI [76] Các gốc GalA của RG-I không phải là metyl-este hóa, tuy nhiên, dư lượng GalA của RG-I có thể là O-acetyl-ester hóa [64] Trong hầu hết các trường hợp, 20–80% hàm lượng rhamnose trong vùng này được thay thế ở vị trí C-4 bằng các mạch nhánh đường trung tính [67] Các mạch nhánh đường trung tính chủ yếu là galactose và arabinose, tạo thành galactan, arabinan và arabinogalactans Các loại đường khác như glucose, mannose, fucose, xylose, và axit glucuronic được tìm thấy liên kết cộng hóa trị với RG-I dưới dạng mạch nhánh Thành phần và kích thước của các mạch nhánh đường trung tính có thể là một gốc glycosyl đơn lẻ lên đến 50 hoặc nhiều hơn tạo thành mạch polysaccharid lớn với các liên kết glycosidic [72].

2.3.2.3 Rhamnogalacturonan II (RG-II)

Miền RG-II có thể là sự tiếp nối của HGA và cũng có thể được metyl hóa một phần [77] Nó là một miền pectic phân nhánh chứa khung HGA RG-II là một homopolyme có cấu trúc cao bao gồm khoảng chín đơn vị GalA liên kết α -1,4 (trong đó một số là methylesterified) với bốn chuỗi bên polyme có cấu trúc khác nhau được gắn vào Các chuỗi bên này chứa mười một loại đường hiếm bao gồm apiose, 2-O-

metyl-fucose, 2-O-metyl-d-xylose, 3-C-cacboxy-5-deoxy-l-xylose (acerin acid), 3- deoxy-d-axit manno-octulosonic và 3-deoxy-d-axit lyxoheptulosaric [78] Các nghiên cứu chỉ ra rằng các đầu của RG-II được liên kết glycosidic với các miền HGA Nó là một miền được phân lập với thành tế bào bởi sự phân cắt endopolygalacturonase, cho thấy sự liên kết cộng hóa trị của nó với HGA Ngoài ra, RG-II liên kết chéo hai phân tử pectin (gốc apiosyl) trong thành tế bào bằng các liên kết borat este [66]

2.3.3 Phân loại pectin

2.3.3.1 Phân loại theo tính tan trong nước

Dựa vào tính tan trong nước nguời ta thấy hai dạng tồn tại của pectin là protopectin không tan và pectin tan Độ hòa tan trong nước liên quan đến mức độ trùng hợp của chúng, số lượng và sự phân bố của các nhóm methoxyl Độ hòa tan tăng khi khối lượng phân tử giảm và tăng trong nhóm cacboxyl được este hóa, mặc dù pH dung dịch, nhiệt độ, bản chất và nồng độ của chất tan có ảnh hưởng rõ rệt đến độ hòa tan [79-82] Protopectin làm nên cấu trúc vách tế bào Pectin tan có trong thành phần dịch bào thực vật Dưới tác dụng của nhiệt độ, acid hoặc enzym protopectinase, protopectin không tan chuyển thành pectin tan

2.3.3.2 Phân loại theo sự methoxyl hóa

Mức độ ester hóa (DE) là phần trăm đơn vị galacturonic acid bị ester hóa trên tổng số đơn vị galacturonic acid trong phân tử pectin Pectin được chia làm 2 nhóm chính với đặc tính khác biệt, đặc biệt về khả năng tạo gel: pectin methoxy thấp (LMP) và pectin methoxy cao (HMP)

 HMP (High Methoxyl Pectin): HMP có DE lớn hơn 50% [83] HMP tạo gel ở nồng độ chất tan cao (55–75%) và có tính axit (pH 2,5–3,5) [84] Nó chủ yếu được sử dụng cho các ứng dụng đóng hộp và để tạo gel HMP đòi hỏi lượng đường cao và rất nhạy cảm với độ chua [84] HMP tạo gel ở giá trị pH thấp và ở nồng độ chất rắn hòa tan cao do sự hiện diện của liên kết hydro và tương tác kỵ nước giữa các chuỗi pectin [84, 85]

 LMP (Low Methoxyl Pectin): LMP có DE nhỏ hơn 50% [83] và được hình thành bởi quá trình khử este hóa của HMP [72, 86] LMP tạo gel với sự hiện diện của các

cation trên phạm vi pH rộng [87-89] Nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để tạo thành mứt ít đường vì không cần lượng đường lớn để tạo gel LMP ít nhạy cảm hơn với acid và liên kết với các ion Ca2+ để tạo thành gel [84] Bốn loại tác nhân như axit, kiềm, pectin metyl esterase và amoniac trong rượu hoặc amoniac trong nước đậm đặc, chủ yếu được sử dụng để điều chế LMP từ HMP [90]

Ngoài LMP và HMP, còn có một loại pectin thương mại khác là amidated low methoxy pectin (ALMP) ALMP thu được từ quá trình khử este bằng amoniac của HMP Sự khác biệt giữa LMP và ALMP là có các nhóm amit chính trong cấu trúc hóa học, thay thế các nhóm metyl-este trên các nhóm cacboxyl trong HMP Mức độ amid hóa (DAm) là phần trăm biểu thị tỷ lệ mol của nhóm amit sơ cấp có trên các đơn vị GalA (bao gồm cả GalA tự do và GalA thay thế) Hầu hết ALMP thương mại có DAm từ 15–25

2.3.4 Đặc tính tạo gel của pectin

Đặc tính nổi bật và độc đáo của pectin là khả năng tạo gel khi có mặt ion Ca2+

hoặc đường và acid Chính đặc tính này của pectin đã làm cho chúng trở thành một thành phần quan trọng của nhiều sản phẩm thực phẩm Tùy loại pectin có mức độ methoxyl hoá khác nhau mà có cơ chế tạo gel khác nhau Gel hóa là sự hình thành mạng lưới ba chiều (3D) của các chuỗi polyme với dung môi và chất hòa tan [91-94] Các điều kiện cần thiết để tạo gel và các đặc tính của gel cuối cùng phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, lực giữa các phân tử và bản chất của các vùng tiếp giáp mà tại đó các phân tử polyme được liên kết chéo HMP và LMP có các cơ chế tạo gel khác nhau vì các đặc tính của gel bị ảnh hưởng bởi các thành phần, kích thước và cấu trúc của các polymer [89].

2.3.4.1 Pectin methoxyl cao (HMP)

Gel HMP thu được ở pH dưới 3,6 khi có nồng độ đường sucrose cao hoặc các chất có tính tan tương tự Nồng độ đường sucrose cao làm giảm hoạt độ nước cần thiết để thúc đẩy các tương tác chuỗi - chuỗi hơn là các tương tác chuỗi - dung môi; trong khi pH thấp tạo ra dư lượng cacboxylate, giảm thiểu lực đẩy tĩnh điện [95]

Hình 2.10: Sự gel hóa HMP được điều chỉnh bởi các liên kết hydro giữa các phân tử và tương tác kỵ nước giữa các metyl este [57]

Các liên kết hydro giữa các phân tử pectin được tạo ra bởi sự hình thành của các đơn vị GalA liền kề Các liên kết hydro riêng lẻ tương đối yếu, nhưng một số lượng lớn trong số chúng mang lại sự ổn định nhiệt động lực học đáng kể cho gel [96] Liên kết hydro là tương tác chính duy trì cấu trúc gel HMP Tương tác kỵ nước rất cần thiết cho quá trình gel hóa HMP Sự đóng góp của các tương tác kỵ nước vào năng lượng tự do của các vùng tiếp giáp trong HMP (với DE = 70%) bằng một nửa so với sự phát sinh từ liên kết hydro [84] Tương tác bất lợi giữa các metyl este không phân cực của pectin và các phân tử nước dẫn đến hiệu ứng kỵ nước này [86] Guimaraes và cộng sự (2009) đã công bố HPM nhớt hơn là do sự gia tăng của các tương tác kị nước này [97]

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh tầm quan trọng của mô hình methyl hóa đối với sự tạo gel của HMP [98, 99] Pectin tạo gel với tốc độ nhanh hơn khi có sự phân bố khối của các đơn vị metyl este hóa-GalA, so với pectin có cùng DE, nhưng có sự phân bố ngẫu nhiên của metyl este [98]

2.3.4.2 Pectin methoxyl thấp (LMP)

Gel LMP được ổn định bằng liên kết chéo ion qua cầu canxi giữa hai cacboxylat từ hai chuỗi khác nhau, thay vì liên kết hydro và tương tác kỵ nước [89] Đây được gọi là mô hình “hộp trứng” [100-103]

Hình 2.11: Cơ chế gel hóa LMP được điều chỉnh bởi liên kết chéo ion thông qua ion canxi (hóa trị hai) giữa hai nhóm cacboxyl từ hai chuỗi khác nhau ở

gần nhau [57]

Một quá trình hai giai đoạn đã được nghiên cứu với sự dimer hóa ban đầu của hai đại phân tử và sự kết hợp của các chất dimer này [56, 104] Các điểm nối được hình thành giữa các khối galacturonan không phân nhánh, không ester hóa liên kết với nhau thông qua các ion canxi tạo ra cấu trúc mới thay đổi vị trí của các nhóm cacboxyl hướng ra ngoài tạo điều kiện thuận lợi cho liên kết hydro giữa các chuỗi [105, 106] Tương tác trong và giữa các phân tử của polyme được thay đổi bởi mật độ điện tích và sự phân bố của các nhóm cacboxyl không metyl este hóa Tóm lại, các hộp trứng hình thành giữa hai chuỗi lân cận được ổn định chủ yếu bằng tương tác tĩnh điện, tiếp theo là liên kết hydro và sau đó là tương tác Van Der Waals

Việc hình thành các hộp trứng chỉ có thể thực hiện được khi có sự xuất hiện của các đơn vị GalA không bị metyl hóa và chỉ bền khi có ít nhất sáu nhóm cacboxyl liên tiếp ở bên trong mỗi chuỗi tham gia [103, 107] Khi DE giảm, hỗn hợp LMP-canxi chuyển từ dạng lỏng sang dạng gel, do đó tăng độ bền của gel khi giảm DE [108]

2.3.5 Các chỉ số đặc trưng của pectin

 Chỉ số methoxyl (MeO): biểu hiện tỷ lệ methyl hóa, là phần trăm trọng lượng nhóm methoxyl (-OCH3) trên tổng trọng lượng phân tử pectin [109] Pectin sẽ được phân loại là pectin methoxyl cao (HMP) với chỉ số methoxyl ≥ 7% Pectin có methoxyl thấp (LMP) nếu

chỉ số methoxyl < 7% [110, 111] Hàm lượng methoxyl là một yếu tố quan trọng trong việc xác định năng lực hình thành gel, kiểm soát thời gian đông kết của pectin, khả năng kết hợp của chúng với các ion kim loại [112] Khả năng liên kết đường của pectin được tăng lên khi tăng hàm lượng methoxyl (Madhav và Pushpalatha, 2002) [113]

 Chỉ số ester hóa (DE): là tỷ lệ phần trăm axit galacturonic được ester hóa trong tổng lượng axit galacturonic [114, 115] Tùy thuộc vào mức độ ester hóa, pectin được phân loại thành pectin methoxyl cao (HMP với DE >50%) và pectin methoxyl thấp (LMP với DE <50%) [116] và do đó pectin sẽ có cơ chế tạo gel khác nhau (xem mục 2.3.4.1 và 2.3.4.2) Mức độ este hóa của axit galacturonic ảnh hưởng đến cả mật độ điện tích của polyme và số lượng vị trí tương tác kỵ nước Vì các phân tử pectin có mức độ ester hóa cao sẽ ít tích điện hơn nên chúng có thể tạo gel ở độ pH cao hơn và cũng sẽ bắt đầu tạo gel ở nhiệt độ cao hơn [117] Dựa vào chỉ số DE mà pectin có thể có những ứng dụng khác nhau

Hình 2.12: Các ứng dụng của pectin dựa vào chỉ số DE [115]

 Chỉ số acetyl hóa (DA/ DAc): phần trăm galactorunic acid được acetyl hóa Đặc tính tạo gel kém là do sự hiện diện nhóm acetyl trong pectin với một lượng lớn [118] Cả DE và DA của pectin có thể khác nhau tùy thuộc vào phương pháp trích ly và nguồn gốc thực vật [119] DA có tác động đáng kể đến tính chất và hoạt động sinh lý của pectin và đóng vai trò quan trọng đối với độ bền và tính linh hoạt của thành tế

bào thực vật, chẳng hạn như làm mềm trái cây trong quá trình bảo quản do quá trình khử ester của pectin gây ra [120, 121] DA cũng ảnh hưởng đến quá trình tạo gel, ổn định và làm đặc của pectin [122, 123] Đặc tính của pectin không chỉ bao gồm phân tích thành phần đường và trọng lượng phân tử mà còn cả DA [124]

 Chỉ số anhydrouronic acid/ galacturonic acid (AUA): tỷ lệ phần trăm nhóm acid galacturonic trong phân tử pectin Hàm lượng axit anhydrouronic (AUA) biểu thị độ tinh khiết của pectin được chiết xuất với giá trị được khuyến nghị không thấp hơn 65% đối với pectin được sử dụng làm phụ gia thực phẩm hoặc cho mục đích dược phẩm [125, 126] Theo quy định EU số 231/2012 và QCVN 4-21:2011/BYT, để sử dụng làm pectin trong thực phẩm thì hàm lượng axit galacturonic không được thấp hơn 65% Việc ước tính hàm lượng axit anhydrouronic là cần thiết để xác định độ tinh khiết và mức độ este hóa cũng như để đánh giá các tính chất vật lý [127] Giá trị AUA thấp có nghĩa là pectin được trích ly có thể có một lượng lớn protein, tinh bột và đường trong kết tủa pectin (Ismail et al., 2012) [128]

2.3.6 Pectin trong vỏ cacao

Vỏ cứng cacao là nguồn chất xơ quan trọng (chiếm khoảng 59% vỏ) gồm cả xơ hòa tan (SDF) và xơ không tan (IDF) Trong đó, tổng chất xơ hòa tan chiếm khoảng 11% gồm pectin, β-glucan, oligosaccharides, hemicellulose Hàm lượng chất xơ trong vỏ cứng cacao cao hơn nhiều so với các nguồn chất xơ khác (chất xơ trong vỏ cam chanh chứa khoảng 35-37%, vỏ táo 51%, vỏ chuối 33-52%) Trong các chất xơ hòa tan này thì pectin chiếm chủ yếu [4] Pectin là SDF chiếm ưu thế trong CPH dựa trên cân bằng khối lượng và thành phần hóa học của nó Vì CPH chứa IDF cao hơn nhiều so với SDF, nên cần tiền xử lý hóa học CPH, ví dụ: thủy phân bằng axit/nước, có thể hòa tan axit uronic trong IDF và tăng lượng SDF [36]

2.4 Tình hình nghiên cứu trích ly polyphenol và pectin

Pectin thường được phân loại theo các quy trình được sử dụng để chiết xuất chúng từ thành tế bào Có 3 loại: pectin hòa tan trong nước có thể chiết xuất bằng nước hoặc dung dịch muối loãng; pectin hòa tan chelator có thể trích ly được bằng dung dịch của các chất chelat hóa canxi như axit etylendiamitetraacetic (EDTA), (axit xyclohexanediaminotetraacetic (CDTA), hoặc hexametaphosphat; và protopectin trích

ly bằng dung dịch kiềm hoặc axit loãng nóng Khó khăn trong quá trình chiết protopectin có thể do các liên kết giữ chặt protopectin bên trong thành tế bào sơ cấp, tuy nhiên các liên kết này không bền với axit và/ hoặc kiềm [129]

Tỷ lệ của các loại pectin này khác nhau đáng kể giữa các tế bào thực vật khác nhau Trong cà rốt và vỏ đậu (Sajjaanantakul và cộng sự, 1989) hầu hết pectin thuộc loại hòa tan được chelator Ở những quả táo chín và thậm chí già, hầu hết thuộc loại protopectin (Massey và cộng sự, 1964; O'Beirne và cộng sự, 1982) Trong một số loại trái cây chín khác, chẳng hạn như đào freestone (Postlmayr và cộng sự, 1956), hầu hết pectin thuộc loại tan trong nước, trong khi ở đào chín, tỷ lệ gần như bằng nhau của cả ba loại đã được tìm thấy Trong các mô như cà rốt, khoai tây và vỏ đậu có tỷ lệ pectin hòa tan trong chelator cao, việc truyền các chất chelat vào mô dẫn đến mất liên kết đáng kể (Linehan và Hughes, 1969; Van Buren và cộng sự, 1988) Các mô như rễ củ cải đường, với tỷ lệ protopectin cao, ít bị mất liên kết khi xử lý bằng các chất chelat (S Shannon, 1975) [129]

Đối với vỏ cacao điều kiện trích ly (dung môi, nhiệt độ, pH, thời gian ) ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất trích ly cũng như tính chất của pectin chiết từ vỏ cứng cacao Dung môi thường sử dụng để trích ly pectin từ CPH là nước, hydrochloric acid, nitric acid, citric acid Nhiệt độ cao, pH thấp là điều kiện giúp tăng hiệu suất trích ly pectin Dung dịch pectin vỏ cacao được chiết bằng nước nóng và citric acid có tính dẻo hơn so với dung dịch pectin táo (ở cùng nồng độ) [4]

Phương pháp trích ly phổ biến của các hợp chất phenolic từ CPH là sử dụng các dung môi hữu cơ Hiệu quả trích ly có thể thay đổi tùy theo tính chất hóa học của dung môi hữu cơ [130]