Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu thu nhận N-Acetyl-Glucosamine từ nang mực ống bằng phương pháp Enzyme

Với hiệu suất 21.65% dé thu nhận N-acetylglucosamine là chưa cao nhưng dé taicũng đã góp ý tưởng phần nào cho việc tận dụng và định hướng khoa học trong quátrình xử lý phế liệu theo hướn

TONG QUAN VE CHITIN 1 Cau tao

Chitin là polime hữu co pho bién trong tự nhiên sau cellulose, được tach chiết lần đầu tiên vào năm 1811 bởi nhà dược hóa học người Pháp Henri Braconnot từ nắm.

[5] cua, ghe, loài chân đầu như muc, va vỏ tôm him có hàm lượng chitin cao chiém 60 — 75% Từ côn trùng thì có ở vỏ các loài như muỗi, gián, ong mật, nhộng tam,

Chitin cũng tồn tại pho bién trong gidi vi sinh vat nhu: vi nam, nam mốc, nam men, một số loài tảo và một số loài xa khuẩn Streptomyces Nhung nguôn khai thác chính là từ phế liệu thủy sản, vỏ của các loài giáp xác đặc biệt là từ tôm và cua.

Công thức phân tử là (CsHizOsN)n Trong đó: n thay đôi tùy thuộc vào loại nguyên liệu (mom the = 400500, niom ham = 700800, neua = 5002600).

Chitin là poly (B-(1—>4)- N-acetyl-D-glucosamine), một polisaccarit mach thăng không phân nhánh, được cau tạo bởi các monosaccharit N-acetyl-B-D-glucosamine liên kết với nhau băng liên kết B-I :⁄4 -glucoside, tạo nên một mạng lưới các sợi có tổ chức, có cau trúc tương tự như xenlulozo, ở carbon C-2 xenlulozo chứa nhóm hydroxyl (-OH) con chitin thì chứa nhóm acetyl (-COCHs) (Hình 1.5) [9], [10], [3],

Hình 1.6 Cau trúc hóa học của chitin Trong các loài giáp xác, chitin là thành phân cấu tạo chính tạo nên độ cứng chắc của vỏ giáp xác, chitin ít khi ở dạng tự do mà luôn kết hợp với protein dưới dạng phức hợp, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác.

Dựa vào nguồn tách chiết chitin người ta chia thành 3 dạng: a-chitin (từ tôm và cua), B-chitin (từ mực) và y-chitin (Hình 1.7)

- a-chitin là phô biên nhât, được tìm thay trong nam và thành tê bào nam men,nhuyén thê, gân và vỏ tom hum, cua, trong vỏ tôm và trong lớp biéu bì của côn trùng,có độ ran phân tử cao nhât và ở dạng ran chắc và các mạch chitin sap xêp song song nhưng ngược chiêu nhau.

- §-chitin hiếm gặp hon, thường có trong mực, bao gdm các mach chitin song song cùng chiêu nhau, có độ rắn thấp, tính hydrat hóa cao.

- _ -chiữin là bién thé của ơ-chitin, sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì có một mạch ngược chiêu. œ-chitin B-chitin y-chitin Hình 1.7 Sự sắp xếp của chuỗi polime của a-chitin, j-chitin, y-chitin 1.2.2 Tính chất của chitin

Chitin có màu trang, là một polime ki nước (hydrophobic polime), có cau trúc siêu lỗ, có khả năng hap phụ tốt, dé tao màng.

Tính chat hòa tan của chitin

Chitin là polime ky nước (đặc biệt là a-chitin), không tan trong nước, trong môi trường kiêm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu.,

Chitin hòa tan được trong dung dịch acid đậm đặc như HCl, H;aPOa, dimethylacetamide chứa 5% lithium chloride, trong dung dịch đặc nóng của muỗi tioxianat Liti (LISCN) và thioxianat canxi Ca(SCN)› tạo thành dung dịch keo.

Chitin tương đối ôn định với các chất oxy hóa khử, như thuốc tím (KMnO¿), H202, nước Javen (NaClO) hay Ca(ClO)ps, Độ deacctyl

Chitin có độ deacetyl thấp Chitin tự nhiên có độ deacetyl dao động trong khoảng từ 8-12%.

Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin bị khử mất gốc acetyl tạo thành chitosan.

Khi đun nóng chitin trong dung dịch HCI đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành các phân tử D-Glucosamin có hoạt tính sinh học cao và acid acetic [9], [10]

1.2.3 Các phương pháp sản xuất chitin

Trong phế liệu thủy sản (tôm, cua, ghe, mực, ) chiếm 15-40% chitin (tùy loài và mùa khai thác) và là nguôn chính sản xuất chitin trên thế giới.

Do tính chất khó hòa tan của chitin, thay vì hòa tan chitin từ nguyên liệu thành một dung dịch nao đó và thu hôi nó thì người ta phải hòa tan tất cả các chất không mong muốn ra khỏi nguyên liệu.

Chitin tồn tại trong nguyên liệu dưới dạng liên kết với protein, khoáng, nên trong quá trình sản xuất chitin cần phải khử các hợp chat phi chitin này ra khỏi chitin.

Các hợp chất phi chitin bao gồm protein, chất khoáng, chất màu, lipit và các hợp chất khác với hàm lượng biến đổi tùy theo loại nguyên liệu Có nhiều phương pháp sản xuất chitin khác nhau và quá trình sản xuất chitin tổng quát được thé hiện theo sơ đồ Hình 1.8:

Hình 1.8 So đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin-chitosan từ phê liệu thủy sản

Quá trình sản xuất chitin gồm các công đoạn chính: xử lý protein, xử lý khoáng và tây màu Do vậy, nguyên tắc chung của quá trình sản xuất chitin là phải sử dụng các biện pháp công nghệ để khử bỏ các tạp chất phi chitin (protein, khoáng, lipit, màu).

Quá trình xử lý protein

Quá trình khử protein đạt yêu cầu chất lượng chitin công nghiệp khi hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm phải nhỏ hon 1% [12]

Dé khử protein có thé sử dụng nhiều loại hoá chất như NaOH, NazCOs,NaHCOa, KOH, K2CO3, Ca(OH)ằ Tuy nhiờn, NaOH là được sử dụng nhiều nhất, với nhiều chế độ xử lí khác nhau tu thuộc vào nguôn nguyên liệu Các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình khử protein là nhiệt độ, thời gian khử, nồng độ NaOH, kích thước nguyên liệu, loại nguyên liệu (tươi hay khô) [12], [9] Protein tac dụng với NaOH bi phân cat thành acid amin và peptid.

Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các enzyme protease dé thực hiện quá trình khử protein của phế liệu tôm, các enzyme được dùng là: bromelin trong dịch ép vỏ dứa [13], papain [14], các enzyme từ vi sinh vật như: Bacillus subtilis [15],

Flavourzyme (Novozymes, Dan Mạch) chiết xuất từ Aspergillus oryzae [16],

Quá trình xử lý khoáng

TONG QUAN VE GLUCOSAMINE 1 Tinh hinh san xuat glucosamine

Từ những năm 1990, người ta đã chế tao được glucosamine từ vỏ tôm, cua, sò.

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng sản xuất glucosamine, chủ yếu là glucosamine sulfate, glucosamine hydrochloride Tuy nhiên, N-acetyl D- glucosamine không phô biến rộng rãi trên thị trường và có giá thành rat dat. b Việt nam

Tình hình sản xuất glucosamine ở Việt Nam còn khá hạn chế, I số ít các công ty sản xuất glucosamine (chủ yếu là glucosamine sulfate, glucosamine hydrochloride) xuất khâu qua Mỹ, Nhật như AFCP, VN organic,

Glucosamine tự nhiên là một amino - monosaccharide tham gia vào quá trình tổng hợp glucosaminoglycan tạo thành mô sun, tăng sản xuất chất nhày dịch khớp, kích thích sinh sản mô liên kết của xương, giảm quá trình mat calci của xương, đồng thời ức chế các enzyme phá hủy sụn khớp (collagenase, phospholinase A) và giảm các gốc tự do (superoxide) là những chất phá hủy các tế bào sinh sụn.

Trong cơ thộ động vat, glucosamine được cõu tao từ ứlucose và aminoacide glutamic Ở người sự sản xuất glucosamine sẽ giảm dan theo tudi.

Việt Nam là nước đã nghiên cứu chế tao được glucosamin từ vỏ tôm đạt kết qua tốt Năm 2004, các cán bộ giảng dạy thuộc Đại học Khoa Học Huế đã điều chế ứlucosamine từ vỏ tụm đạt tiờu chuẩn Dược dụng được Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương công nhận đạt tiêu chuẩn Dược điền Mỹ số 28.

Thủ tướng Chính phủ đã ra Quyết định số 61/2007 ngày 7/5/2007 phê duyệtChương trình Nghiên cứu khoa học trọng điểm quốc gia phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020, trong đó ghi: “Nghiên cứu chiết tách glucosamine sulfate từ vỏ tôm làm nguyên liệu sản xuất thuốc chữa bệnh viêm khớp”.

Bệnh xương khớp là một van dé lớn của nhân loại, có hơn 200 loại bệnh khác nhau Các khớp hay bị thoái hóa là: khớp cột sống (cô, thắt lưng), khớp gót chân, khớp gối, khớp hang Tổ chức Y tế Thế giới đã chọn thập niên đầu tiên của thé kỷ 21

(2001-2010) là “Thập niên xương khớp”.

1.3.2 Cau trúc lên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-B-D- ứlucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine.

Glucosamine là monomer của phan tu chitosan va N-acetyl glucosamine là monomer trong phan tu chitin.

Công thức phân tử: CeHi305N.

Hình 1.11 Cấu tạo hóa học của glucosamine

Glucosamine là một aminomonosaccharide, có trọng lượng phân tử 179.17 g/mol, đó là một thành phan của gan như tat cả các mô của con người, bao gồm cả cartilage.

Là thành phan chủ yếu của liên kết O và liên kết N của Glycosaminoglycans (GAGs), tạo thành mạng lưới của tat cả các mô liên kết Glucosamine được sản xuất trong cơ thé bang việc b6 sung các nhóm amin vào glucose; phân tử này sau đó được acetyl hóa tao acetyl glucosamine Hyaluronan, keratin sulfate và heparan sulfate được cau tao từ một phan của các don vi thuộc acetyl glucosamine lặp di lặp lại Trong keratan sulfate và heparin sulfate, sulfat được thêm vào ở các vi trí 4 hoặc 6 của glucosamine.

Glucosamine là chất rắn dạng tinh thể, không màu không mùi, điểm nóng chảy 88°C, điểm phân hủy 110°C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether va chloroform.

Khi thủy phân chitin trong môi trường acid HCl đậm đặc, các mối nối amid và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamine Yếu tố nồng độ acid và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của acid không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamine có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn.

Một sô phản ứng của glucosamine:

- Phan ứng với Cu(OH)2: sản phẩm có màu xanh - Phan ứng với CeHsCH=O: Phản ứng nhận biết sự cú mặt của NHằ Sản phẩm dạng keo sánh màu nau.

- _ Ở nhiệt độ thường, glucosamine phản ứng với casein, bi mat nhóm NHz tự do, hình thành màu nâu rất nhanh N-acetyl glucosamine va casein tạo màu nâu chậm hơn do NH> bị mat không đáng kể.

Glucosamine thường được sinh tổng hợp trong cơ thé Hầu hết glucosamine được thu nhận từ vỏ giáp xác hoặc cua băng cách khử chitin Glueosamine thương mại ở một số dang, trong đó có kết hợp với thảo dược, vitamin, creatine, chondroitin sulfate, acid ascorbic, mangan, hoặc dimethylsulfone .ph6 biến nhất kết hợp với chondroitin sulfate.

Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamine được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc. a Glucosamine hydrochloride lên gọi khoa hoc: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride;

Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride.

Cụng thức phan tử: CứHĂzOsN.HC]

Hình 1.12 Cấu tạo hóa học của Glucosamine hydrochloride

Phân tử lượng: Mgiucosamineci= 215.63 g/mol

Glucosamine hydrochloride là chất ran dạng tinh thé màu trang, không mùi Điểm nóng chảy 190-194°C hoặc 300°C Tan được trong nước 0.1Ig/mI [23] b Glucosamine sulfate Tén goi khoa hoc: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate.

Công thức phân tử: CeHi305N.H2SOz

Hình 1.13 Cấu tạo hóa học của Glucosamine sulfate

Phân tử lượng: MucosamineH2soa= 277.24 g/mol [23] c N-acetylglucosamine Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D-(+)- glucosamine; N-acetyl-B-D-glucosamineide; N-acetylchitosamine.

Công thức phan tử: CsH:zOsN.

Hình 1.14 Cấu tạo hóa học của N-acetylglucosamine Phân tử lượng: MN-aceryiglucosamine = 221.21 g/mol Dạng bột màu trang và hơi ngọt, nóng chảy ở nhiệt độ 221°C Độ tan cua GIcNAc là 25% trong nước, và 1% dung dịch không màu và trong suốt Là monomer của polymer chitin GlcNAc cũng là thành phan của các polysaccharide không đồng nhất, chang hạn như murein và acid hyaluronic (cũng được gọi là hyaluronan hoặc hyaluronate, HA) Murein là thành phan cơ bản của thành tế bào vi khuẩn gồm các chuỗi peptide lặp đi lặp lại các GlcNAc và acid muramic HA là một heteropolysaccharide bao gồm lặp lại các acid

1.3.3 Ung dung N-acetylglucosamine a Hỗ trợ điều trị bệnh viêm khớp

Glucosamine là thành phan cơ bản của sụn, tham gia quá trình chuyền hóa tong hợp nên thành phan của sụn khớp, giúp làm tăng sản xuất chất nhay dịch khớp, nên tăng độ nhớt, tăng khả năng bôi trơn của dịch khớp Vi thé glucosamine không nghững làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (dau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, năng chặn bệnh tiễn triển, phục hồi câu trúc sụn khớp.

PHƯƠNG PHAP SAN XUẤT GLUCOSAMINE

Dựa vào các phương pháp san xuất khác nhau có các dang hop chat glucosamine sau: glucosamine sulfate, glucosamine hydrochloride, N-acetyl D-glucosamine, chitosamine Các dang glucosamine thường được sản xuất bang ba phương pháp: phương pháp hóa học, phương pháp enzyme và phương pháp enzyme cải tiến.

Phương pháp nay thường dùng dé sản xuất glucosamine sulfate, glucosamine hydrochloride.

Thủy phân chitin hoặc chitosan bằng HCI đậm đặc: xử lý chitin bằng HCI 36%, t°

= 95-100°C (Đỗ Dinh Rang); xử lý chitosan băng HCI 35%, w/v = 1/4, t° = 95-100°C, 4 gio (Tran Thi Luyén) — Tay mau bang than hoạt tính — lọc bỏ cặn — kết tinh

—Loc lay tinh thé, rửa bang cồn — sấy khô — thu glucosamine hydrochloride tinh thé.

Do glucosamine sulfate dé bị hút âm va oxi hóa nên không được sản xuất trực tiếp băng các xử lý chitin — chitosan bằng HaSOa, mà đi gián tiếp từ glucosamine hydrochloride đồng kết tinh với KaSOa hoặc NazSOa [23]

Nguyên liệu chitin được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, nghiền nhỏ Sau đó thực hiện quá trình xử lý khoáng và protein, tay màu thu nhận chitin và sau cùng là thủy phân chitin băng cách lên men vi sinh vật tạo hợp chitinase và chitobiase hoặc sử dụng các chế phẩm enzyme (chitinase, chitinolytic, chitosanase ) Các bước tiến hành điều được thực hiện trong diéu kiện xử lý thích hợp cho từng loại nguyên liệu đầu vào.

Hoặc có thé đi từ nguồn nguyên liệu là các loại chitin (a, B chitin). a Quy trình sản xuất N-acetyl D-glucosamine của Charles A Haynes

Dun sôi với nước va H2SO4 1% hay DMA 1%

Loc ly tâm, rửa trung tinh (2 lần)

Tay màu bằng KMnOx 2%, rửa lại bằng acid oxalic 1%

Rửa bang acetone, thêm vào HCI 7-9%, làm lạnh 4°C tạo dang paste

Loc bỏ hạt, kết tủa dịch lọc bang ethanol 50%

Ly tâm, rửa bằng đệm phosphate, sau đó duy trì trong đệm pH 5-6

Lén men Serratia marcescens, lividans Streptomyces va liquefaciens Enterobacter, ở 30°C sinh tông hợp hôn hợp chitinase va chitobiase thuy phan thu nhan N-acetyl D-glucosamine

Hình 1.16 Quy trình sản xuất N-acetyl D-glucosamine của Charles A Haynes b Nghiên cứu cua Setthakaset et al.

Thu nhận N-acetyl glucosamine từ B-chitin (nang mực) sử dụng chung Aspergillus tao enzyme chitinase thông qua quá trình nuôi cay Các kết qua cho thay sự phát triển của nam trong môi trường ở pH 3.5 và 40°C, thời gian 5 ngày tao enzyme chitinolytic có hoạt tính tối đa là 3.1 U/ml Enzyme thô thu được từ sự phát triển của nam được sử dụng trong quá trình thủy phân ÿ-chiin ở pH 4 va 45°C sử dụng 22 U/g (enzyme/chitin) [25] c Nghién ciru cua Sun Y va cong sw

Sun Y và cộng sự sản xuất D-glucosamine bằng cách thủy phân chitosan bang cách sử dụng hai enzyme thô chitosanase và B-d-glucosaminidase, với điều kiện tối ưu là nhiệt độ 50°C, nông độ cơ chất 20 mg/mL, tỷ lệ enzyme/chitosan là 1.5 U/60 mg, pH 6.8 Theo các điều kiện trên, chitosan đã được thủy phân hoàn toàn trong 5 giờ và do đó phương pháp nay có thé được sử dụng hiệu quả dé sản xuất D- ứlucosamine [26]

1.4.3 Phương pháp enzyme cải tiến Đề cải thiện hiệu suất của phản ứng, người ta tập trung vào thay đổi cau trúc tinh thé chitin, tạo chitin huyền phù là cơ chất thích hợp cho phản ứng, dé bị thủy phân hơn Tạo chitin huyền phù bằng cách thủy phân sơ bộ bằng acid Hoặc sử dụng các loại enzyme không đặc hiệu trong quá trình thủy phân như: cellulsae, hemicellulose, amylase, glucoamylase, [24] a Nghiên cứu cua Hitoshi Sashiwa va cộng sự

Su dung nhiéu loai enzyme không đặc hiệu khác nhau để thủy phan B chitin tạo N-acetyl glucosamine, trong môi trường đệm AcOH, thu được hiệu suất như hình

1 Cellulase T v Tricoderma viride 26 2 Cellulase A Acremonium 29 3 Hemicellulase Aspergillus niger 5 4 Papain Carica papaya L 2 5 Lipase Aspergillus niger 7 6 Pectinase Aspergillus niger >

*Conditions: | ỉ-Chitin] mg/mL; [Enzyme ] mg/mL; pH=4.8 (0.1 M AcOH buffer); 37 °C; 4 days ’Yield was calculated as follows:

Yield (%) = GlcNAc obtained (mg/mL)/ B-Chitin added(mg/ml.).

Hình 1.17 Hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine theo các loại enzyme khác nhau trong cùng một điều kiện b K Jamialahmadi và cộng sự

Sản xuất N-Acetyl-D-Glucosamine từ chitin huyền phù 1% băng cách sử dụng chế phẩm enzyme thô của Aeromonas sp PTCC1691 Trong quá trình sản xuất, lượng oligomers GlcNAc tạo thành không đáng kế (dưới 0.5%), lượng GlcNAc tạo thành tối đa 79% thu được sau 24 giờ tủy phân ở 37°C với tỷ lệ enzyme/cơ chất là 2 U/mg.

Alcalase là tên thương mại của enzyme protease được tách chiết từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis có thé sinh trưởng va phát triển ở nhiệt độ lên đến 60°C, pH 9.0, sinh enzyme protease ngoại bào Enzyme protease do Bacillus licheniformis sản xuất có khả năng chịu nhiệt, hoạt động trong môi trường kiềm Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme protease là pH và nhiệt độ.

Theo M A Ferrero và các cộng sự năm 1996, enzyme protease phân lập từ

Bacillus licheniformis MIR 29 vẫn có thé hoạt động ở pH 13.0, hiệu quả hoạt động 100% ở 60°C trong 10 phút và duy trì đến 30 phút [29]

Alcalase là enzyme trước đây được sử dụng để thuỷ phân protein đậu nành va protein cá Nó được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm vì có giá thành rẻ.

Nó là một serine alkaline protease (thuộc nhóm endoproteinase) được tong hop boi vi khuan Bacillus licheniformis [30]

Alcalase được tách thành công lần đầu tiên bởi Guntelberg và Ottesent vào năm 1947 Thành phần chủ yếu của alcalase là subtilisin Carlsberg, còn được gọi là subtilisin, subtilisin A, subtilopeptidase, Acalase Novo Alcalase gồm 274 acid amin tạo thành một 1 chuỗi polypeptide Trong cau trúc phan tử không có liên kết disulfua.

Khối lượng phân tử của alcalase khoảng 27277 Da (27.3 kDa) pI là 9.4 [31] b Trung tâm hoạt động và cơ chế phan ứng

Trung tâm hoạt động của alcalase hình thành từ 3 acid amin: Aspartic 220,

Histidin 63 và Serine 32 và không cần coenzyme cho các hoạt động xúc tác Từ cầu tạo của trung tâm hoạt động của alcalase cho thay nó có tính đặc hiệu cho nhiều loại cơ chất [32], [33]

Quá trình xúc tác trong phản ứng của enzyme với cơ chất là một phản ứng phức tạp nhưng thường có 3 giai đoạn chủ yếu:

- _ Giai đoạn 1: enzyme kết hợp với co chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme-co chất.

- _ Giai đoạn 2: xảy ra sự biến đối cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá các liên kết đồng hoá trị tham gia phản ứng.

- Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm va enzyme được giải phóng [32]

Trong các phản ứng do enzyme thủy phân alcalase xúc tác luôn có nước tham gia.

Bởi vì nước là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng thủy phân Nước là môi

28 trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương, môi trường khuếch tán enzyme va cơ chat Cơ chế quá trình thủy phân có thé chia thành các bước sau:

- _ Bước 1: Phân tử enzyme sẽ nhận diện và cô định phân tử cơ chat băng các liên kết hydro.

Cũng như các enzyme khác dau tiên cơ chat bị gan vào enzyme băng các liên kêt hydro.

- Bước 2: Xảy ra chuỗi phản ứng khử proton của các acid amin, kích hoạt trung tâm hoạt động cua enzyme.

Acid amin Asp220 sử dụng nhóm -COO' còn lại để khử proton trên vòng imidazole của His63 Khi bị khử proton bởi Asp220, vòng imidazole có xu hướng lay proton từ Ser32 Như vậy tại vị trí Ser32 lúc này mang điện âm Do đầu Ser32 dư điện tử và mang điện âm nên có xu hướng nhường điện tử cho C tại liên kết peptide của cơ chất Liên kết đôi -C=O chuyển thành —C-O- Điện tử còn dư tại vị trí này tiếp tục chuyển về phía nguyên tử N trong liên kết pepitde, đập vào gốc -NHTM của vòng imidazole của His63, hình thành nên tứ diện trung gian (tetrahedral intermerdiate) Việc cho và nhận điện tử kết thúc khi gặp vòng imidazole của His63.

Tại đây nguyên tử N trong liên kết peptide giành proton tir -NHTM của His63.

Kết quả là phức hợp trung gian acyl-enzyme được hình thành và giải phóng peptide ở đầu -NHa, His63 quay trở lại trạng thái bị khử proton dư 2 điện tử (hình

Bước 3: Tạo thành sản phẩm và giải phóng enzyme.

Asp IR Ser Acyl-enzyme His

R! O-OH Nu = H;O, RÝ-OH, R3-NH;, HO. peracid formation R3 = H, alkyl, aryl, —-NR§,

Hình 1.18 Co chế thủy phan protein của enzyme alcalase Điện tử dư của His63 tiếp tục đập vao liên kết —C—Or giữa co chất và Ser32, làm cho liên kết này bị bẻ gãy, giải phóng chuỗi peptide đầu -COOH Sau khi giải phóng sản phẩm, Ser32 lại dư điện tử nên nó có xu hướng khử proton của His 63 gần đó dé cân bằng điện tích Kết qua là chuỗi peptide đầu -COOH được giải phóng His 63 quay về dạng bị khử proton còn dư 2 điện tử, mạch nhánh Ser 32 lại trở về gốc —OH như ban đầu và kết thúc 1 chu ki thuỷ phân của enzyme [34], [35]

Cellulase là enzym da cau tử gồm: endoglucanases (EC 3.2.1.4), exoglucanases, gom cellobiohydrolases (CBHs) (EC 3.2.1.91) va B-glucosidase (BG) (EC 3.2.1.21) hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose [36]

Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dung rat rộng rãi, chi đứng sau protease va amylase.

N eee” | OH OH OH |

Hình 1.20 Co chế tác động của phức hop enzyme cellulase Cơ chế của 1,4-B-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

Enzyme này còn có tên gọi khác như: exoglucanase, exo l,4-glucanase, cellobiohydrolase, exo — cellobiohydrolase, exo l ,4-glucan cellobiohydrolase, | ;‡-

B-D-glucan cellobiosidase, cellobiosidase, CBH 1, Cl cellulase, avicelase Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-B-D-glucoside từ dau không khử của chuỗi cellulose dé tạo thành celllobiose. if

Hình 1.21 Co chế của 1,4-B-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

Co chế 1,4-B-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Enzyme này còn có tên gọi khác như: Endoglucanase, Endo-1 ,4-f-D-glucanase, Endo-l,4 glucanase, ÿ-l,4endoglucan hydrolase, Carboxymethyl cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase A3, 9,5

Cellulase, Avicelase, Pancellase SS Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-

B-D-glucoside giữa mạch của chuôi cellulose, lichenin và các B-D-glucan của ngũ x : : id : a X4 = / LA —

Hình 1.22 Cơ chế 1,4-B-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Co ché B-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Enzyme này có tên gọi khác như là: B — glucosidase, B — D — glucosidase, B — 1,6

— glucosidase, — glucoside glucohydrolase, p — nitrophenyl B — glucosidase, aryl —

B — glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsin, elaterase, arbutinase, amygdalinase, primeverosidase, amygdalase, limarase, salicilinase Enzyme nay thủy phân gốc B —D — glucoside không khử ở dau tận cùng dé phóng thích ra B — D — glucose.

glucose

Hình 1.23 Cơ chế B-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

ĐÓI TƯỢNG 1 Nang mực ống

Địa chỉ: 62 Ngô Thời Nhiệm, Phường An Bình, Thành phố Rạch Giá, Tỉnh Kiên

Trọng lượng mực ống: 3 — 4 con/ kg, nang mực có chiều dài từ 15 — 20 cm, chiều rộng từ 2 — 3 cm, và dày từ 0.1 — 0.2 em Nang mực sau khi lay về được xử ly như sau: rửa sơ bộ băng nước lạnh, cho vào túi nilon loại 1 kg và được đem bảo quản lạnh đông -18 °C, thu gom 10kg, sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu.

2.1.2 Enzyme a Enzyme Alcalase 2.4L Enzyme Alcalase 2.4L mua của cong ty Brentag Việt Nam Địa chỉ: 202, Hoàng Văn Thu, Quận Phú Nhuận, Thanh phố Hồ Chi Minh, từ hãng (Novozymes, Dan Mach) được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus Licheniformis Enzyme alcalase 2.4L là một endo-protease Hoạt tính ghi trên nhãn 2.4 đơn vị Ason/g 2.4AU/g, tương đương 2400UI (1AU00UT); nhiệt độ hoạt động từ 55 - 70°C, pH hoạt động từ 6.5 - 8.5, tỷ trọng là 1.17 (g/ml). b Enzyme cellulase

Enzyme cellulase mua của công ty Brentnag Việt Nam Địa chỉ: 202, Hoàng Văn Thu, Quận Phú Nhuận, Thanh phố Hồ Chi Minh, từ hãng (Novozymes, Dan Mạch) được sản xuất từ vi khuẩn Trichoderma reesei, có tên thương mại là Viscoenzyme Cassava C Hoạt tính ghi trên nhãn 700 đơn vị EGU/g, nhiệt độ tối ưu từ 40 - 55°C, pH tối ưu từ 4.0 - 5.0, ty trọng là 1.22 (g/ml).

2.1.3 Hóa chấtHình 2.1 Hóa chất cần thiết sử dụng trong quá trình nghiên cứuSTT | Hóa chất Nguồn gốc Bảo quản

2 Casein Trung Quốc Thuong 3 TCA Trung Quốc Thuong

4 L-Tyrosine (CoH1;NO31.19) | Đức Thuong

5 Thuốc thir Folin Duc Chai sam mau

6 N-acetyl-Glucosamine 99% Sigma-Aldrich, My | Thường

DUNG CU VA THIET BI

Bang 2.1.Dung cụ sw dung trong quá trình nghiên cứuSTT Dung cu l Binh định mức 50ml, 100ml, 1000ml

Bảng 2.2.Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu STT | Thiết bị

| Bếp điện từ2 Thiết bị khuấy từ3 Bề điều nhiệt

4 Máy lắc 5 Tủ say 6 pH ké 7 May quang pho UV-VIS

9 Cân điện tử 2 và 4 số lẻ

12 Bo MicroKjeldahl, bình kjeldahl, gia đỡ

13 Thiết bị cô quay, bình cô quay 14 Máy say âm hong ngoại

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

Chuẩn bị chitin huyền phù Điều chỉnh về pH 7

Hình 2.2 So dé quy trình thu nhận N-acetylglucosamineThuyết minh quy trình

Mục đích: Giảm kích thước nguyên liệu để dễ dàng cho các quá trình xử lý, tạo độ đồng đều về kích thước.

Thực hiện: Rã đông nguyên liệu trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng và cắt nhỏ nang mực thành từng miếng có độ dài từ 2 — 3em.

Mục đích: loại bỏ thành phần protein trong vỏ tôm.

Thực hiện: Quá trình thủy phân băng enzyme alcalase được thực hiện trong bể điều nhiệt có kết hợp lắc đảo 120 vòng/phút nhằm tăng khả năng tương tác giữa enzyme và cơ chat dé quá trình thủy phân có hiệu quả cao.

Mục đích: làm khô mẫu dé dự trữ trong quá trình nghiên cứu.

Thực hiện: Chitin được đựng trong rô nhựa và rửa sạch dưới vòi nước nhiêu lân, sau đó say khô băng tủ say

Chuan bi chitin huyền phù [37]

Mục đích: cat sơ bộ chitin, làm cho chitin hút nước trương nở nâng cao hiệu quả thủy phân.

Cách tiến hành: Xay nhuyễn ÿ chitin bằng máy xay trong thời gian 10 phút, sau đó cân l0g chitin, thêm vào 150ml dung dịch HCl đậm đặc giữ lạnh trong 2h ở 4°C (do trong quá trình phan ứng có tỏa nhiệt), cho thêm 1000ml nước cất và khuấy déu thu được chitin huyền phù, tiễn hành rửa chitin huyền phù bằng nước cất 4-5 lần, đồng thời lọc chitin huyền phù qua giấy lọc, lần rửa cuối không lọc hiệu chỉnh pH chitin huyền phù bang NaOH 5N đến pH 7, sau đó ly tâm tách nước với 3000rpm trong 15 phút, thu được chitin huyền phù.

Thủy phan chitin huyền phù tao N-acetyl glucosamine Mục dich: tìm ra điều kiện thủy phân thích hop nhất để thu nhận N- acetylglucosamine với hiệu suat cao nhat.

Thực hiện: thực hiện khảo sát vá tối ưu hóa chế độ thủy phân chitin bang enzyme cellulase nhăm tìm ra các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân

Mục đích: dùng nhiệt làm biến tính protein enzyme, làm cho enzyme mat kha năng hoạt động, dừng quá trình thủy phân.

Thực hiện: dun sôi 100°C trong 10 phút.

Mục đích: loại bỏ enzyme bị vô hoạt và chitin huyền phù còn sót, thu dịch thủy phân.

Thực hiện: ly tâm 3000 rpm trong 10 phút.

Mục đích: loại bỏ cặn còn sót

Thực hiện: lọc dịch qua giấy lọc không tro.

Mục đích: đuôi nước ra khỏi dung dịch, tăng nồng độ chất khô lên 20%.

Thực hiện: cô quay chân không ở 60°C, tốc độ quay 50rpm, áp suất chân không.

Say Mục đích: làm giảm ham am, kéo dai thời gian bảo quan N-acetyl glucosamine Thực hiện: phối trộn maltosextrin vào dịch, tiền hành say phun ở nhiệt độ 140°C, lưu lượng 10rpm ~ 485 ml/h.

Phân tích thành phần hóa học cơ bản cilia nano mire

Xác định hoạt tính của enzyme

Khảo sát các yéu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân protein nang mực

Phân tích thành phần hóa học cơ bản của chitin

Tỉ lệ nang: đệm pH

Ti lệ enzyme/cơ chất

Thời gian Hàm mục tiêu: Hàm lượng protein còn lại (%) (Theo khối lượng khô tuyệt đối)

Khao sát các yêu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu thu nhận N- acetyl glucosamine Ủ

Nông độ chitin huyén phù pH Nhiệt độ

Tỉ lệ enzyme/co chất

Thời gian Hàm mục tiêu: Hiệu suât thu nhận N- acetyl glucosamine (%).

Tối ưu hóa các yếu tô ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận

Phân tích sản phẩm N- acetyl-glucosamine pH Nhiệt độ

Ti lệ enzyme/cơ chất

Hàm mục tiêu: Hiệu suat thu nhận N- acetyglucosamine (%) là cao nhất.

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình nghiên cứuBồ trí thí nghiệm khứ protein bang enzyme alcalase 2.4L

Do hàm lượng khoáng trong nang mực rất ít dưới 1% đạt chỉ tiêu chitin thương mai nên bỏ qua công đoạn khử khoáng trong quy trình sản xuất Vì vậy khử protein là một công đoạn quan trọng trong việc tách chiết chitin nang mực Về bản chất, liên kết giữa protein trong phế liệu mực và các thành phần khác (khoáng, lipid, astaxanthin) rất chặt chẽ Việc khử protein cũng sẽ góp phan loại bỏ một phan khoáng, lipid và chất màu, tạo điều kiện thuận lợi hơn cho các công đoạn kế tiếp và giảm Sal số trong việc xác định hàm lượng protein hòa tan trong bán thành phẩm băng phương pháp so màu.

Thực hiện khử protein của nang mực băng chế phẩm enzyme Alcalase 2.4L (Novozyme, Đan Mạch) Dựa vào các tài liệu nghiên cứu trước đây và thông tin về enzyme của nhà sản xuất, chúng tôi tiễn hành 5 khảo sát để chọn ra các thông số: tỉ lệ nang:đệm, pH, nhiệt độ, tỉ lệ E/S, thời gian thích hợp cho quá trình khử protein trong nang mực băng enzyme alcalase 2.4L như hình 2.4.

Khao sat ti | ệ Nang:đệm

Khử protein ở các chế độ

Vv ` pH Nhiệt độ (°C) Tỉ lệ E/S (UI/g) Thời gian (phút)

Kiém tra lượng protein còn lại (%)

Chọn diéu kiện xử lý protein thích hợp

Hình 2.4 Bồ trí thí nghiệm khảo sát điều kiện thủy phân protein bằng enzyme alcalase 2.4L, a Thí nghiệm 1: Khao sát chọn tỉ lệ Nang: dung dịch đệm

Mục đích: Tìm được tỉ lệ Nang:đệm thích hợp để quá trình khử protein đạt hiệu qua cao nhat.

Thông số cố định: m= 20g; pH= 7.5:

Ti lệ E/S= 390UI/g, Thời gian= 30 phút. b Thí nghiệm 2: Khao sat chon pH xứ lý protein

Mục đích: Tim được pH thích hợp quá trình khử protein đạt hiệu quả cao nhất.

Cơ sở khoa học: Sự phan li khác nhau cua một phân tử protein ở các giá tri pH khác nhau làm thay đối tính chat của trung tâm liên kết với co chất và tính chất hoạt động của phân tử enzyme Điều này dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Theo Lê Ngọc Tú (2005) thì pH môi trường ảnh hưởng rất rõ rệt đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bên protein enzyme Nhận thay sự ảnh hưởng mạnh mẽ của giá trị pH môi trường đến hoạt độ của enzyme, chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát chọn pH đầu tiên.

Theo như phan tổng quan đã trình bay, khoảng pH hoạt động của alcalase khoảng 6.5 đến 8.5 nên chúng tôi quyết định thiết kế thí nghiệm như hình hình

Ti lệ nang: dém= Thi nghiệm 1;

Ti lệ E/S= 390UI/g,Thời gian= 30 phútCc Thi nghiém 3: Khao sat chon nhiét d6 xw ly protein

Mục đích: Tìm được nhiệt độ thích hợp cho quá trình khử protein đạt hiệu quả cao nhất.

Cơ sở khoa học: Đối với quá trình khử protein, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng Ở nhiệt độ thường, quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian thủy phân từ một ngày đến vài ngày Khi nâng nhiệt độ xử lí thì thời gian cần thiết để tách protein giảm đáng kể, tuy nhiên, cần phải lưu ý là sử dụng nhiệt độ cao hoặc thời gian xử lí dài sẽ dẫn đến quá trình cắt mạch của sản phẩm chitin Bên cạnh đó, việc chọn nhiệt độ xử lí phải nằm trong khoảng hoạt động của enzyme để tăng hiệu quả của quá trình tách protein.

Theo tài liệu của nhà sản xuất, enzyme Alcalase 2.4L, hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ trong khoảng 50°C đến 70°C Một số khảo nghiệm kiểm tra sự ảnh hưởng của các yếu tố khác như pH cũng được nhà sản xuất tiễn hành trong khoảng nhiệt độ này Do đó, chúng tôi quyết định bố trí khảo sát nhiệt độ ở công đoạn khử protein trong nang mực nam trong khoảng 50°C đến 70°C như hình 2.4.

Tỉ lệ nang: đệm= Thí nghiệm 1; pH: Thí nghiệm 2;

Tỉ lệ E/S= 390UI/g, Thời gian= 30 phút d Thí nghiệm 4: Khảo sát tỉ lệ enzyme thủy phân protein

Mục đích: chọn ra tỉ lệ enzyme thích hop dé quá trình khử protein đạt hiệu quả cao nhat.

Cơ sở khoa học: Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc

: ` {0 là van tốc phản ứng; tuyên tính vào nông độ enzyme: v = k[E] với cu P J

Cũng có trường hợp nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phan ứng tăng cham[1],[5] Qua thời gian tìm hiểu và thử nghiệm trước khi chính thức thực hiện đồ án này, chúng tôi quyết định bồ trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ enzyme như hình

Ti lệ nang: dém= Thi nghiệm 1; pH= Thí nghiệm 2;

Thời gian= 30 phút. e Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian xứ lý protein

Mục đích thí nghiệm: Cần chọn ra được thời gian thích hợp để hiệu quả của việc tách chiết là cao nhất, tức là lượng protein còn lại trong mẫu ở mức chấp nhận được, trong thời gian ngăn nhất.

Cơ sở khoa học: Thời gian xử lí là nhân tổ ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình và chi phí sản xuất Thí nghiệm được bồ trí như hình 2.4.

Tỉ lệ nang: đệm= Thí nghiệm 1; pH= Thí nghiệm 2;

2.3.3 Chuan bi chitin huyền phù Mục đích: cắt sơ bộ chitin, làm cho chitin hút nojéc trojong nở nâng cao hiệu qua thủy phan.

Cách tiễn hành: cân 10g chitin, thêm vào 150ml dung dich HCI đậm đặc giữ lạnh trong 2h ở 4°C, cho thêm 1000ml nước cất và khuấy đều thu được chitin huyền phù, tiến hành rửa chitin huyền phù bằng nước cat 4 - 5 lần, đồng thời lọc chitin huyền phù qua giấy lọc, lần rửa cuối không lọc hiệu chỉnh pH chitin huyền phù bằng NaOH 5N đến pH 7, sau đó ly tâm tách nước với 3000rpm trong 15 phút, thu được chitin huyền phù.

Bảo quản chitin huyền ở nhiệt độ 0 — 4°C.

2.3.4 BO trí thí nghiệm tạo N-acetylglucosamine bang enzyme

Thực hiện quá trình thủy phân chitin huyền phù bằng chế phẩm enzyme

Viscoenzyme Cassava C Dựa vào các tài liệu nghiên cứu trước đây va thông tin về enzyme của nhà sản xuất, chúng tôi tiến hành 5 khảo sát để chọn ra các thông số: nồng độ chitin huyền phù, pH, nhiệt độ, tỉ lệ enzyme, thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân tạo N-acetylglucosamine bang enzyme Viscoenzyme Cassava

Khao sát nồng độ chitin huyền phù (%)

Thủy phân thu nhận GIcNAc ở các chế đô

Tỉ lệ E/S (%) Thời gian (gid)

0,1,2,3, 4,5,6 Đánh gia hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine (%) y

Chon điều kiện thủy phân thu nhận N-acetylglucosamine thích hợp

Hình 2.5 Bồ trí thí nghiệm thúy phan chitin huyền phù băng enzyme

Viscoenzyme Cassava C a Thí nghiệm 6: Khao sát chọn nông độ chitin huyền phù

Mục dich: Tim được nong do chitin huyén phù thích hợp để hiệu suất thu nhận N-acetylglucosamine là cao nhất.

Thông số cố định: pH= 5;

Tỉ lệ E/S= 2%, Thời gian= 2 giờ. b Thi nghiệm 7: Khảo sát chọn pH thủy phan thu nhận GluNAc

Mục dich: Tìm được pH thích hop để hiệu suất thu nhận N-acetylglucosamine là cao nhất.

Cơ sở khoa học: Theo Lê Ngọc Tú (2005) thì pH môi trường ảnh hưởng rất rõ rệt đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bên protein enzyme [32] Nhận thấy sự ảnh hưởng mạnh mẽ của giá trị pH môi trường đến hoạt độ của enzyme, chúng tôi quyết định tiễn hành khảo sát chọn pH đầu tiên.

Theo như phan tổng quan đã trình bay, khoảng pH hoạt động của Viscoenzyme Cassava C khoảng 4.0 đến 5.0 nên chúng tôi quyết định thiết kế thí nghiệm như hình

Nông độ chitin huyền phù: Thí nghiệm 6;

KET QUA VA BAN LUAN 3.1 XÁC ĐỊNH THÀNH PHAN HOA HOC NANG MUC

XAC DINH THANH PHAN HOA HOC CHITIN Tiến hành xác định thành phan hóa học của chitin thu nhận kết quả sau

Bang 3.2 Thành phan hóa học của chitin

* Tinh trên khối lượng khô tuyệt doi Nito tong= nito protein + nito chitin 3.3 XAC DINH HOAT DO ENZYME

Trong suốt quá trình nghiên cứu chúng tôi bảo quản enzyme ở điều kiện nhiệt độ 0 - 5°C theo đúng chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Chế phẩm Enzyme Alcalase dé thi nghiệm được xác định lại hoạt độ theo phương pháp Ason trước khi sử dụng, có hoạt độ 1356 UI/ml.

Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm thủy phân casein trong | phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho độ hap thu cực đại ở bước sóng 660nm tương ứng với ¿mol tyrosine trong đường chuẩn.

3.3.2 Hoạt độ enzyme Viscoenzyme Cassava C

Hoạt độ riêng của enzyme Viscoenzyme Cassava C trên nền mau chitin huyền phù là 60.11 U/ml.

Enzyme được bao quan trong ngăn mat tủ lạnh (0 — 5°C) trong suốt quá trình nghiên cứu (theo đúng chỉ dẫn của nhà sản xuất) Và kiểm tra định kì 1 tuần/lần cho thay hoạt độ thay đổi không đáng kế ( hiệu quả thủy phân giảm vì vậy hàm lượng protein còn lại trong mẫu vẫn còn cao Đối với tất cả các mẫu đều có sự khác biệt rõ ràng về hàm lượng protein hòa tan còn lại trong mẫu bởi vì đối với bản thân enzyme nói chung và alcalase nói riêng chỉ thay đổi giá trị pH dù ở một khoảng rất nhỏ cũng dẫn đến sự thay đối không thuận nghịch tinh chất và khả năng thủy phân của nó Như vậy kết quả mà chúng thu được trong khảo sát này phù hợp với lí thuyết.

Két luan: Tu két quả trên, độ pH là 7.5 được lựa chon cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm thủy phân nang mực có hàm lượng protein còn lại thấp nhất.

3.5.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ xứ lý protein

- _ Khối lượng nang mực: 20g/mẫu.

- _ Tỉ lệ nang:đệm là: 1: 5 (w/w)

- Tong khối lượng nang mực và dung dịch: 120g/mẫu.

- Ty lệ E/S là: 390 UI/g (v/wpr) - hoi gian: 45 phút.

Hàm lượng protein còn lại (3%) = = 2 — l= i) + ON 00 le

Hình 3.3 Anh hướng của nhiệt độ đến hàm lượng protein còn lạiNhận xét: Kết quả hình 3.3 cho ta thấy rang nhiệt độ có ảnh hưởng đáng ké đếnCpr (%) Dựa vào đồ thị (hình 3.) cho thay khi tăng nhiệt độ từ 50°C đến 60°C thi Cp,(%) giảm 2.2 lần (từ 1.16 + 0.005% xuống 0.53 + 0.006%) Tuy nhiên khi nhiệt độ tiếp tục tăng trên 60°C thì mức độ thủy phân giảm dẫn tới Cpr (%) tăng lên, cụ thé ở các mức nhiệt độ 65°C, 70°C Cpr (%) lần lượt là 0.85 + 0.005%; 1.29 + 0.013%.

Giải thích: Theo Dang Thị Thu (2012), tác động của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme là kết quả của hai hiện tượng: nhiệt hoạt hóa các phản ứng hóa học; nhiệt làm biến tính protein và làm vô hoạt hóa enzyme [40] Điều này giải thích cho khoảng nhiệt độ từ 50°C đến 60°C hoạt độ của enzyme tăng dẫn đến hàm lượng protein hòa tan còn lại trong nguyên liệu giảm dan Theo Lê Ngọc Tú (2005), vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó các phân tử enzyme vẫn còn bên chưa bị biến tính [32] Điều này giải thích cho điều kiện khử protein trong nang mực ở nhiệt độ 65 và 70°C, kết quả kiểm tra hàm lượng protein hòa tan trong mẫu cao hơn so với kết quả thu được của mẫu xử lí ở nhiệt độ 60°C ve li thuyết, khi tăng nhiệt độ tốc độ phản ứng sẽ tang, do các phân tử chuyén động nhiệt và tần số tiếp xúc giữa enzyme-cơ chất tăng, bên cạnh đó cũng diễn ra quá trình tự hủy của enzyme Hai chiều phản ứng này diễn ra song song, nhưng tùy thuộc vào phản ứng nào chiếm ưu thế mà quá trình sẽ theo hướng có lợi hoặc bat lợi Ta có thé tăng vận tốc của một phản ứng hóa học băng cách tăng nhiệt độ môi trường, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’-Hoff Điều nay có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 10°C thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần [39] Đối với phản ứng enzyme xúc tác ta cũng có thể áp dụng quy luật này trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein Khi tăng nhiệt độ vượt quá nhiệt độ tối ưu của enzyme, tốc độ phản ứng sẽ giảm.

Kết luận: Từ kết quả trên, nhiệt độ là 60°C được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm thủy phân nang mực có hàm lượng protein còn lại thấp nhất.

3.5.3 Thí nghiệm 4: Khao sát tỉ lệ E/S xử lý protein

- Tong khối lượng nang mực va dung dịch đệm: 120g/mau.

Hàm lượng protein còn lại (3%) — cm”)

Hình 3.4 Anh hướng của tỉ lệ E/S đến hàm lượng protein còn lại Nhận xét: Từ kết quả ở hình 3.4 cho ta thấy tỉ lệ E/S (UI/g) trong quá trình thủy phân có ảnh hưởng đáng kế đến Cpr (%) Cpr (%) ở tỉ lệ E/S tại giá trị 0 Ul/g có giá trị cao nhất là 6.26 + 0.008% Ở các mức tỉ lệ E/S là 130 UI/g và 260 UI/g thì Cpr (%) lần lượt giảm xuống là 1.75 + 0.005%và 0.88 + 0.002% Ở mức tỉ lệ E/S là 390 U1/g; 520 UI/g; 650 UI/g thì Cp: (%) thấp nhất và gần như 6n định, ở các mức này không có sự khác biệt về ý nhĩa thống kê p < 0.05 với các giá trị lần lượt là 0.52 + 0.005%; 0.53

Giải thích: Trong điều kiện dư thừa co chat, nghĩa là [S] >> [E] thì tốc độ phản ứng tuyến tính với tỷ lệ enzyme, v = K[E] có dạng y = ax, nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phan ứng enzyme càng lớn [39] nên tỉ lệ E/S tăng từ 130 — 260 UI/g thi Cpr (%) càng giảm Và tỉ lệ E/S từ 260 — 650 UI/g thì Cpr (%) thấp nhất và 6n định,điều này có thé giải thích là do lượng cơ chất có trong nguyên liệu là không đổi nên khi tăng tỉ lệ E/S (UI/g) tới một giới han nhất định thì lượng [ES] không đối do đó tốc độ phản ứng đạt đến giá tri cực đại và duy trì ôn định theo mô hình của Michaelis- Menten, kết quả là Cpr (%) đạt giá tri thấp nhất và 6n định.

Kết luận: Từ kết quả trên, hàm lượng enzyme/co chất (E/S) là 390 UI/g được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm thủy phân nang mực có hàm lượng protein còn lại thấp nhất.

3.5.4 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian xứ lý protein

- Tong khối lượng nang mực va dung dịch đệm: 120g/mau.

- Tỉ lệ E/S là 390 UI/g (v/wpr)

Thời gian thúy phần (phút) i) oS) + tủ > [E] thì tốc độ phản ứng tuyến tính với ty lệ enzyme, v = K[E] có dạng y = ax, nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn [39] Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chat Kim hãm enzyme bằng nồng độ cao của CƠ chất gol la “kim ham CƠ chất” có thé do nguyên nhân sau: tồn tại nhiều trung tâm liên kết với co chất băng các ái lực khác nhau Khi nồng độ co chất thấp thi enzyme có thé chỉ liên kết với một phân tử cơ chất, còn khi ở nồng độ cơ chất cao nó liên kết với nhiều cơ chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động [39] Khi nồng độ enzyme cao hơn cơ chất thì xảy ra hiện tượng các phân tử enzyme cạnh tranh cơ chất dẫn đến quá trình thủy phan không đạt hiệu qua cao, nên HeiuNAc giam.

3.7.4 Thí nghiệm 10: Khao sát thời gian thủy phân thu nhận GlcNAc

- _ Nồng độ chitin huyền phù 0.5%

- _ Thể tích chitin huyền phù và dung dịch đệm: 100ml

Thời gian thủy phan (gid)

Hình 3.10 Ảnh hướng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận N- acetylglucosamine

Nhận xét: Theo kết qua thu được từ hình 3.10 ta thay thời gian có ảnh hưởng đến

Hoicxac (%) Nhìn chung, khi kéo dai thời gian thủy phân thì HeicxAc (%) tăng Khi thời gian thủy phân là 0 giờ thì hiệu suất thu nhận băng 0 Khi tăng thời gian thủy phân từ 1 giờ lên 4 giờ thì Heiexac (%) tăng lên 1.44 lần (14.91 + 0.11% lên 21.42 +0.38%) Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian thì Hoinac (%) có xu hướng 6n định như ở mức 4 giờ và các giờ tiếp theo là 5 giờ, 6 giờ thì các giá trị HeiexAc (%) lần lượt là

21.79 +0.28%; 21.42 +0.11% Các giá trị này không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê p< 0.05.

Giải thích: sau khi enzyme có khoảng thời gian để hoạt hóa và thích ứng với môi trường thủy phân thì enzyme bắt đầu hoạt động mạnh, vận tốc phản ứng tăng làm choHeLcnac tăng mạnh Sau đó, do lượng sản phẩm tạo thành cao sẽ ức chế quá trình xúc tác thủy phân của enzyme đồng thời lượng co chất dang bị giảm dan theo thời gian thủy phân Ở điều kiện nảy, sự tiếp xúc của enzyme và cơ chất cũng trở nên khó khăn.

THÍ NGHIEM 11: TOI UU HÓA CAC YEU TO ANH HUONG DEN HIEU SUAT THU NHAN N-ACETYLGLUCOSAMINE

3.8.1 Xem xét sự anh hưởng của các yếu tố đối với hiệu suất thu nhận

Xem xét sự ảnh hưởng của các biến (yếu tố) lên hàm mục tiêu hiệu suất thu nhận N-acetyl glucosamine HelenAc (%) và loại các biến không ảnh hưởng băng ma trận

Bang 3.3 Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman

Yếu tố Biến Khoảng biến thiên eu to

-ữ Mire (-1) | Mức (+1) +a pH XI 4.0 4.5 5.5 6.0 Nhiét d6 (°C) Xa 45 50 60 65

Tỉ lệ enzyme/co chất (%) X3 2.0 2.5 3.5 4.0

Ta thu được ma trận Plackett-Burman như sau:

Bang 3.4 Bảng kết qua thí nghiệm theoma trận Plackett-Burman

Thí Biến Biến thực Hetenac nghiệm | Xt [ Xz [Xs | Xs | pH | Nhiệt [ Tile | Thời | (%)

| Py || ld ss | 50 25 3 | 14172 Py ! || ll ss | 60 25 3 | 14.543 Py Ey ty ll} ss | 60 3.5 3 | 14664 Py ! |!| Pol ss | 60 3.5 5 | 16.255 ty} Ey ty) ! |4ãs | 60 3.5 5 | 17236 Py |! | Lo} ss | so 3.5 5 | 16.997 | lft} tol as | 60 2.5 5 | 15.15 g Py hyP | lt} ss | sọ 3.5 3 | 16389 LỊ | 1| | |sós | ứ0 25 5 | 1478 io | | ! || l|a4s| 60 3.5 3 | 15.521 Tye} ty Po las | 50 3.5 5 | 16.9912 Py || Pol ss | so 2.5 5_ | 15273 | | ! | 1| l|4s| 60 25 3 | 144214 | | tpt] l|a4s| so 3.5 3 | 15.76

Bang 3.5 Anh hướng của các biến trong ma trận Plackett-Burman

Biến Mức độ ảnh hưởng

* la bién với mức ảnh hưởng có ý nghĩa p < 0.05

Từ kết quả ở bảng 3.5, yếu tố nào có mức ảnh hưởng dương và lớn có ý nghĩa p

< 0.05 sẽ ảnh hưởng mạnh nhất hiệu suất thu nhận N-acetyl glucosamine Vậy 2 yếu tố ty lệ E/S và thời gian ảnh hưởng lớn đến Hoicxac Và đây là mô hình hồi quy đáng tin cậy (Q2 > 0.5, R2 > 0.8) Vì vậy, có thé loại bỏ yếu tố pH và nhiệt độ, còn lại 2 yếu t6 tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân sẽ được chon dé thiết kế thí nghiệm tối hóa băng phần mềm Modde 5.0.

3.8.2 — Tối ưu hóa 2 yếu to ty lệ E/S và thời gian Sau khi loại 2 yếu tố pH và nhiệt độ, ta chỉ còn 2 biến là Xa và Xa.

Bang 3.6.Các mức yếu tô thí nghiệm tối ưu hóa trong bài toán tối ưu hóa 2 yếu tô ty lệ E/S và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận N-acetyl glucosamine (%)

Biên Các mức yêu tô

Tỉ lệ /S (%) Xa 253 |3 3453 10.5 Thời gian thủy phân (giò) | X4 3 4 5 l

Các mức của biên mã hóa: mức trên: +1, mức cơ sở: 0, mức dưới: -1.

Số thí nghiệm được tính theo công thức:

Trong đó: e k: Số yếu tô thí nghiệm (k = 2) e no: SỐ thí nghiệm tại tâm (no = 3) Ma trận thực nghiệm thé hiện sự kết hợp của các mức yếu tố được trình bày ở bảng 3.7.

Bang 3.7 Kết qua hiệu suất thu nhận GleNẹAc (%) theo cỏc yếu tố khi tiền hành thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm.

Thí pH Nhiệt Biến thực Biến mãhóa | Heknac nghiệm độ ÓC) | Z4 Z4 Xa Xu (%)

2.5 3 Toy -Ì | 1769

PHAN TICH CHE PHAM N-ACETYLGLUCOSAMINE THO THU ĐƯỢC

3.9.1 Hình SEM thể hiện cau trúc bề mặt của nang mực va B-chitin

3.9.2 Thanh phan mẫu chế phẩm N-acetylglucosamine thô

Bảng 3.11 Thành phần hóa học của chế phẩmSTT Tên thành phần Hàm lượng (%)

6 Khoi lượng phân tirché phẩm | 3.3 KDal

* Tính trên khối lượng khô tuyệt đối 2 Phân tích chế phẩm N-acetylglucosamine thô bằng HPLC

Nhận xét: Nghiên cứu của Paraman Ilankovan và cộng sự khi sử dụng enzyme pepsin thủy phân chitin ở pH 54, nhiệt độ 44 °C, sau thời gian 24h thu được 71.5% chitobiose [GIcNAc]2, 19% N-acetylglucosamine va 9.5% chitotriose [GlcNAc]a

[41], điều này cho thay hiệu suất thu nhận N-acetyl glucosamine từ quy trình thu được kết quả tương đối phù hợp khi sử dung enzyme không đặc hiệu dé thủy phân thu N- acetyl glucosamine.

KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 4.1 KÉT LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được quy trình thu nhận N-acetyl glucosamine từ nang mực ống tươi, qua hai công đoạn chính: là thủy phân loại protein của nang băng enzyme alcalase 2.4L thu B-chitin và thủy phân B-chitin bằng enzyme Viscoenzyme Cassava C thu nhận N-acetylglucosamine với hiệu suất toàn quy trình là 16.67%

Khi tién hành thủy phân loại protein của nang mực bang enzyme alcalase 2.4L dé thu B-chitin, chúng tôi thu được các thông số sau:

- Tỉ lệ nang:dém là 1:05 (w/w) - pH: 7.5

- Nhiệt độ: 60°C - Tỉ lệ E/S: 390 UI/g - Thời gian thủy phan: 45 phút.

Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát và tối ưu hóa các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình thủy phân B-chitin thành N-acetylglucosamine bằng enzyme Viscoenzyme Cassava C thu được kết quả như sau:

- Nông độ chitin huyền phù thích hop dé thủy phân là 0.5% (w/v)

- pH: 5.0 - Nhiệt độ: 55°C - Tỉ lệ E/S: 3.28% (v/v) - Thời gian thủy phan: 4.48 giờ

Qua nhiều gia đoạn thì chúng tôi thu được chế phẩm có hàm lượng N- acetylglucosamine là 16.67%.

Dựa vào kết quả thu được như trên chúng tôi dé xuất quy trình như hình:

Khir protein bang enzyme Alcalase 2.4L

Tỉ lệ nang:dém là 1:05 (w/w) pH= 7.5 Nhiệt độ: 60°C Ty lệ E/S: 12.6 Ul/g Thời sian: 45 nhiit

Chuan bi chitin huyén phi

Nhiệt độ: 0 - 4°C; Thời gian: 2 gid

Thùy phân chitin huyền phù bang enzyme Viscoenzyme Cassava C

Nông độ chitin huyền phù: 0.5% (w/v) pH= 5.0; Nhiệt độ: 55°C

Nhiệt độ: 100°C, Thời gian: 10 phút

Tốc độ: 3000 rpm, Thời gian: 10 phút

Tốc độ: 50 rpm, Nhiệt độ: 60°C Áp suất chân không, chất khô:

Phối trộn i} Ti lệ maltodextrin: 10%

- _ Cân nâng cao hiệu suất thủy phân thu nhận N-acetylglucosamine từ nang mực.

- _ Cân có những nghiên cứu phương pháp tinh sạch N-acetylglucosamine để chế phẩm có độ tinh khiết cao.

- _ Xác định một số tính chất của chế phẩm: thời gian bảo quản, hoạt tính sinh học của chế phẩm

- Nghiên cứu ứng dụng tạo ra các loại thực phẩm chức năng làm giảm giá thành sản phầm hơn sản phâm ngoại nhập.

Kim Moo Sang, "Reduction and Utilization of Squid Wastes," Republic of Korea, 2013.

Vazhiyil Venugopal, "Marine Polysaccharides: Food Applications," CRC Press, 2016.

Hong K No PhD, Samuel P Meyers PhD, "Preparation and Characterization of Chitin and Chitosan—A Review," Journal of Aquatic Food Product, vol.

Abdou, et al, "Extraction and characterization of chitin and chitosan from local sources," Bioresource Technology, vol 99, pp 1359-1367, 2008.

Dal Kyoung Youn, et al, "Preparation and characteristics of squid pen B-chitin prepared under optimal deproteinisation and demineralisation condition,"

International Journal of Food Science & Technology , vol 48, pp 571-577, 2013.

Cortizo, et al, "Characterization of chitin from Illex argentinus squid pen,"

Kurita, Keisuke, et al, "Squid chitin as a potential alternative chitin source: deacetylation behavior and characteristic properties," Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, vol 31, pp 485-491, 1993.

Trang Sĩ Trung va cộng sự, Chitin-Chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dung,Nhà xuất bản Nông Nghiệp, 2010.

[10] Trang Si Trung, Pham Thi Dan Phuong, “Chitin,” 2012.

[11] Rinaudo Marguerite,, “Chitin and chitosan: properties and applications,”

[12] Tran Thi Luyến (Chu biên), Đỗ Minh Phụng va Nguyễn Anh Tuan, "Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phé liệu thủy sản," Nhà xuất bản Nông Nghiép,, TP Hồ Chí Minh, 2006.

[13] Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú, "Nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu - vỏ tôm băng các phương pháp sinh học," Tạp chí khoa học và công nghệ, vol 45, pp 43-50, 2007.

[14] Trần Thị Luyén, "Nghiên cứu sản xuất chitosan bang phương pháp papain,"

Tập san Khoa học công nghệ Đại học Thuỷ Sản số 1, 2003.

[15] Đỗ Thị Bích Thuỷ, " Nghiên cứu sử dung Bacillus subtilis dé tách protein từ phé liệu tôm trong quy trình sản xuất chitin ở quy mô tiền pilot," Nông nghiệp và phát triển nông thôn, vol tập 8, 2008.

[16] Se-Kwon Kim, Eresha Mendis, and Fereidoon Shahidi, "Marine fisheries by- products as potential nutraceuticals: An overview, in Marine nutraceuticals and functional foods," Colin J Editors Barrow and Fereidoon Shahidi, CRC Press: London, England, vol p 1, 2007.

[17] M Khorrami, et al, " Production of Chitin and Chitosan from Shrimp Shell in Batch Cuture of Lactobacillus plantarum," Chemical & Biochemical

Engineering Quarterly, vol số 26(3), pp 217-223, 2012.

[18] Nguyen Van Toan, " Production of Chitin and Chitosan from Partially Autolyzed Shrimp Shell Materials," The Open Biomaterials Journal, vol 1, pp 21-24, 2009.

[19] Jun Huang, et al, "Biochemical activities of low molecular weight chitosans derived from squid pens," Carbohydrate Polymers, vol 87, p 2231-2236, 2012.

[20] A Tolaimate, et al, "On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin," Polymer, vol.

[21] Theruvathil K Sini, Sethumadhavan Santhosh, and Paruthapara T.Mathew,

"Study on the production of chitin and chitosan from shrimp shell by using Bacillus subtilis fermentation," /nternational Journal of Biological

[22] Yoshihiro Shigemasa and Saburo Minami, " Applycation of Chitin and Chitosa for Biomaterials," Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, vol 13, pp 383-420, 1995.

[23] Nguyễn Tan Man và cộng su, "Preperation of glucosamine hydrochloride and glucosamine sulfate from irradiated chitin," The Annual Report for 2008, VAEC 08 27, pp 218 - 222, 2008.

[24] Chen JK, Shen CR, Liu CL, "N-acetylglucosamine: production and applications.," Mar Drugs, vol 8, p 2493-2516, 2010.

[25] Setthakaset P, et al, "Preparation of N-acetyl-D-Glucosamine using Enzyme from Aspergillus sp," J Metals, Mater Minerals, vol 18, pp 53 - 57, 2008.

[26] Sun Y, et al, "Preparation of d-glucosamine by hydrolysis of chitosan with chitosanase and B-d-glucosaminidase.," Int J Biol Macromol , vol 61, p 160- 163, 2013.

[27] Hitoshi Sashiwa et al, "Production of N-Acetyl-D-glucosamine from B-Chitin by Enzymatic Hydrolysis," Chemistry Letters , vol 31, p 308-309, 2001.

[28] K Jamialahmadi, et al, "Enzymatic Production of N-Acetyl-D-Glucosamine from Chitin Using Crude Enzyme Preparation of Aeromonas sp PTCC1691,"

[29] M.A Ferrero, et al., "Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29: isolation, production and characterization," Appl Microbiol Biotechnol, vol 45, pp 327-332, 1996.

[30] Ekuwa Enyonam Quist, "Peanut (arachis hypogaea |.) as a source of antihypertensive and antimicrobial peptides, in Faculty of the University of Georgia in Partial Fulfillment Master's Thesis," In Faculty of the University of Georgia in Partial Fulfillment Master's Thesis, University of Ghana, Ghana, 2001.

[31] Shui Tein Chen, et al, "Industritral protease “Alcalase” as a catalyst in organic synthesis: Resolution of Natural and unnatural amino acids," Journal of the Chinese Chemical society, vol 39, pp 91- 99, 1992.

[32] Lê Ngoc Tú va công sự, Hóa sinh công nghiệp, Hà Nội: Nha xuất bản Khoa

[33] Mala B Rao, et al, "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases," Microbiology and molecular biology reviews, vol 3, p 597-635,1998.

[34] L polgár, "The catalytic triad of serine peptidases," Cellular and Molecular Life Sciences, vol 62, p 2161— 2172, 2005.

[35] Divya Jose, "Protease from an environmental isolate of pseudomonas Aeruginosa MCCB 123 and their application, in Enviromental

Biotechnology," Cochin University of Science and Technology, Kochi, Kerala, 2011.

[36] Xiao-Zhou Zhang and Yi-Heng Percival Zhang, Cellulase: characteristics, sources, production,and applications, John Wiley & Sons, Inc, 2013.

[37] N Mathivanan, et al, "Studies on extracellular chitinase and secondary metabolites produced by Fusarium chlamdosporum, an antagonist to Puccinia arachidis, the rust pathogen of groundnut," 1995.

[38] J A Vazquez, "Optimisation of the extraction and purification of chondroitin sulphate from head by products of Prionace glauca by environmental friendly processes," Food Chemistry, 2015.

[39] Đỗ Quy Hai va cộng sự, Giáo trình hóa sinh, Nhà xuất ban Dai Học Hué.

[40] Đặng Thị Thu và cộng sự, Công nghệ Enzyme, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 2012.

[41] Paraman Ilankovan et al, "Production of N-acetyl chitobiose from various chitin substrates using commercial enzymes," Carbohydrate Polymers, vol.

[42] Elson and Morgan, "A Colorimetric method for the determination of glucosamine," Chem Ind, vol 53, p 844, 1933.

[43] Benjamin Schloss, "Colorimetric Determination of Glucosamine," Analytical Chemistry, vol 23, pp 1321-1325,195 1.

[44] TCV N3700-90, "Thuy san — Phương pháp xác định ham lượng nước".

[45] TCVN5105:2009, "Thủy sản va san phẩm thủy san — Phương pháp xác định hàm lượng tro".

[46] TCVN3705-90, "Thủy sản — Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số va protein thô”.

[47] San Hein, Chuen-How Ng, and Willem F Stevens, "Development of analytical protocols for quality assessement of chitin/chitosan: Protein content, crystallinity and assay of insolubles," in Proceedings of 9th International Conference on chitin and chitosan, Montréal, Quebec, Canada., 2004.

[48] Lâm Thị Kim Chau, Van Đức Chín, và Ngô Đại Nghiệp, Thực tap lớn sinh hóa, TP Hỗ Chí Minh: Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP Hỗ Chí Minh,

[49] Hitoshi Sashiwa, et al, "Production of N-acetyl-D-Glucosamine from beta- chitin by the Enzymatic," Carbohydrate Research, pp 563-8577, 2001.

[50] Hitoshi Sashiwa, et al, "Enzymatic production of N-acetyl-D-glucosamine from chitin Degradation study of N-acetylchitooligosaccharide and the effect of mixing of crude enzymes," Carbohydrate polymer, pp vol 337, 761-763, 2002.

[51] Michael W Rey et al, "Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species,"

[52] Xia Wensui, “Advance in chitosan hydrolysis by non-specific cellulases,”

[53] Araki, Yoshio, and Eiji Ito,"A pathway of chitosan formation in Mucor rouxii: enzymatic deacetylation of chitin," Biochemical and biophysical research communications, vol 56, pp 669-675, 1974.

[54] MargueriteRinaudo, "Chitin and chitosan: properties and applications,"

Progress in polymer science, vol 31, pp 603-632, 2006.

[55] Ritu Raval, Keyur Raval, and M BM, "Enzymatic Modification of ChitosanUsing Chitin Deacetylase Isolated from Bacillus cereus," Open AccessScientific Reports,, vol 2(1), 2013.

CAC PHUONG PHAP PHAN TICH

A.1 Xác định hoạt độ enzyme Viscoenzyme Cassava C và lượng glucosamine tao thành theo phương pháp Elson-Morgan [42], [43] s* Xác định lượng N-acetylglucosamine tao thành

- Phuong pháp nay dựa trên sự hình thành các dẫn xuất pyrrole khi glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetylacetone Cac pyrrole này sẽ phản ứng tạo mau với thuốc thử Ehrlich.

- Ham lượng glucosamine tỉ lệ thuận với cường độ màu của dung dich - Cac phản ứng của quá trình trên xảy ra theo trình tự sau:

Ethyl ester của 2-methyl-5-tetrahydroxybutylpyrrole-3-carboxylic acid

CH,OH L ¿ở L bạ 1. ba bu h H

CH,OH CH, 1L ba bp Ấm

3-Acetyl-2-methyl-4-tetrah ydrox ybutylpyrrole

- Thuốc thử acetylacetone: hòa tan Iml acetylacetone trong 50ml dung dịch NazCO2¿ 0.5N Dung dich được 6n định trong 2 - 3 giờ ở 18°C trước khi sử dụng.

- _ Thuốc thử Ehrlich: 0.8g p-Dimethylaminobenzaldehyde hòa tan trong 30ml ethanol và thêm vào 30ml dung dịch HCI đậm đặc Thuốc thử có màu vàng nhạt

- Dung dịch chuẩn glucosamine (N-acetylglucosamine 99%) e 250ppm: hòa tan0.0025g N-acetylglucosamine trong nước cat, định mức 10ml Dựng đường chuẩn Glucosamine 0 - 25ppm

Ong nghiém Dung dịch hóa chat

Thuốc thử acetylacetone l l l l l l Nước cất (trang thành ông nghiệm) |2 18 |16 |14 |12 |1

Dun cách thủy ở 100°C trong 20 phút Làm nguội dưới vòi nước chảy

*Lưu ý: đậy kin nắp ông nghiệm (tránh bay hơi acetylacetone), dun nước ngập dụng dịch bên trong ông nghiệm

Lắc nhẹ ở 65°C trong 10 phút (đuối khí) Làm nguội đến 18°C Sau đó đo OD ở bước sóng 530nm (lắc nhẹ trước khi so màu). Ông số 0 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ông thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Glucosamine tương quan giữa lượng Glucosamine (zg/ml) và AOD

- Hut 3ml mẫu (dịch thủy phân) cho vào ống nghiệm, cho thêm 1ml thuốc thử acetylacetone, Iml nước cất (tráng thành ống nghiệm) Sau đó đun cách thủy ở 100°C trong 20 phút, làm nguội dưới vòi nước chảy

- _ Tiếp theo cho 5ml nước cất và thêm 1ml thuốc thử Ehrlich vào ông nghiệm.

Dun cách thủy ở 65°C trong 10 phút (đuôi khí), làm nguội đến 18°C.

- Lac nhẹ sau đó tiễn hành so mau dung dịch trên ở bước sóng 530nm - Tw giá tri OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn dé suy ra hàm lượng glucosamin (C‘).

* Cr - Ham lượng glucosamine trong mau (C): C = (ug/ml)

10 mx 100 V(ml)x a( £2) x 100 ul mọ X (1—W) Mo(g)x (1— w) x 106 - Hiéu suất thủy phân (%) Trong đó e m- lượng glucosamine trong mau (ug), m = Viml) x a(— e mo- khối lượng chitin ban đầu (g) © -d6 âm của chitin. Đường chuẩn N-acetylglucosamine 25ppm

Hàm lượng N-acetylglucosamine s* Xác định hoạt độ ezyme Viscoenzyme Cassava C

- - Hoạt tính chitinase của enzyme Viscoenzyme Cassava C được xác định dựa theo hàm lượng N-acetylglucosamine thu nhận được cua quá trình thủy phan chitin.

- Phương pháp này dựa trên sự hình thành các dẫn xuất pyrrole khi N- acetylglucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetylacetone Các pyrrole này sẽ phản ứng tạo mau với thuốc thử Ehrlich Hàm lượng N-acetylglucosamine tỉ lệ thuận với cường độ màu của dung dịch.

Chuan bị mau chitin huyền phù [37]

- Chitin huyền phù: cân 10g chitin, thêm vào 150ml dung dịch HCI đậm đặc giữ lạnh trong 2h ở 4°C, cho thêm 1000ml nước cất và khuấy đều thu được chitin huyền phù, tiền hành rửa chitin huyền phù bằng nước cat 4 - 5 lần, đồng thời lọc chitin huyền phù qua giấy lọc, lần rửa cuối không lọc hiệu chỉnh pH chitin huyền phù bang NaOH 5N đến pH 7, sau đó ly tâm tách nước với 3000rpm trong 15 phút, thu được chitin huyền phù.

Cách tiền hành - Pha chitin huyền phù 0.5% băng dung dịch đệm citrate - Hut 4ml chitin huyền phù 0.5% và Iml enzyme, lắc ở 37°C trong 60 phút, sau đó đun sôi hỗn hợp trong 10 phút (bất hoạt enzyme) Làm mẫu trang song song bang cách thay enzyme bằng nước cất.

- Sau đó ly tâm, pha loãng 10 lần, hút 3ml mẫu đã pha loãng, cho thêm Iml thuốc thử acetylacetone Sau đó đun cách thủy ở 100°C trong 20 phút, làm nguội dưới vòi nước chảy

- _ Tiếp theo cho 5ml nước vào va thêm Iml thuốc thử Ehrlich vào ống nghiệm.

Dun cách thủy ở 65°C trong 10 phút, làm nguội đến 18°C - Lac nhẹ sau đó tiễn hành so màu ở bước sóng 530nm - Tw giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy ra hàm lượng N-acetyl glucosamine trong mẫu Tu đó tính được hoạt độ enzyme

- Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn (a’) để suy ra hàm x ar lượng N-acetylglucosamine trong mau (a): a = —3- (ug/ml)

- Tu đó tinh được hoạt độ chitinase cua enzyme cellulose trên cơ chat chitin:

Một đơn vi hoạt độ cua enzyme chitinase tương ứng với lug N-acetylglucosamine tạo thành trong thời gian thủy phan chitin là 1 phút ở nhiệt độ phản ứng

axn - Hoat độ enzyme Viscoenzyme Cassava C = ——rr (UD)

Trong do e a- Hàm lượng N-acetylglucosamine tạo thành tinh theo đường chuẩn (ug/ml) e n- hệ số pha loãng enzyme e Vị - lượng enzyme sử dung (Iml) e V>- lượng dịch phân tích (2ml) e t- Thời gian phản ứng (20 phút).

A.2 Xác định độ am bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [44]

Dùng nhiệt dé loại bỏ nước khỏi mẫu thử Hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng nước có trong mẫu thử. Đối tượng áp dụng của phương pháp Xác định hàm lượng nước đối với các nguyên liệu, bán thành phẩm va sản phẩm thủy sản.

Dụng cụ - Chén cân, dung tích 30ml

- Can phân tích, độ chính xác 0.001g

- - Tủ sấy, độ chính xác + 29C.

Chén say được say khô ở nhiệt độ 105°C trong 5 giờ (đến khối lượng không đổi), sau đó dé trong bình hút 4m dé làm nguội Cân xác định khối lượng của chén sấy là

Cân chính xác 3-5 g (3g) mẫu thử cho vào chén cân Cho chén vào tủ say và say ở 60-80°C (60°C) trong 2 giờ, sau đó nâng nhiệt độ lên 100-150°C (105°C) và giữ ở nhiệt độ đó trong 3 giờ.

Sau khi sấy 5 giờ, cho vào bình hút âm, để nguội 30 phút, đem cân Lại sấy tiếp 30 phút nữa, để nguội và đem cân như trên Tiến hành sấy và cân cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 0.001g.

% Hàm lượng âm (X1) tính băng phan trăm theo công thức:

A.3 Xác định hàm lượng tro bang phương pháp nung [45]

CÁC GIA TRI PHAN TICH THỰC NGHIỆM 1 Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát tỉ lệ

Bang: Anh hưởng của ti lệ nang: dung dich đệm đến kha năng khử protein dich Sem CN) Ham lwong protein hoa tan con lai (%)

1:07 0.73 + 0.0048 Độ hap thu | Độ am | Trung Độ

- (A) (%) y x % protein binh lệch STT | Mau chuan

B.2 Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát pH Bang: Anh hưởng của pH đến kha năng khử protein

Giá trị pH Hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) 6.5 I.55+0.007

B.3 Kết quả hàm lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát nhiệt độ Bang: Anh hướng của nhiệt độ đến khả năng khử protein

Nhiệt độ (°C) Hàm lượng protein hòa tan còn lại (%)

H Độ sor | Mau thu (A) ( % ) y X % protein | Trung bình lệnh

I3 | 85 0.327 4.22 0.235 10.169 | 1.76414 | 85 0.328 5.2 0.236 | 0.170 | 1.790 1.78 0.019IS 18.5 0.327 6.17 0.235 {0.169 | 1.801 Độ hấp thu|Độ ẩm _ | Trung | Độ lệch

STT |Mẫu |(A) (%) y | protein | tình _ | chuẩn

B.4 Kết quả ham lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát tỉ lệ E/S Bang: Anh hưởng của tỉ lệ E/S đến kha năng khử protein

Ti lệ E/S uUG Hàm lượng protein hòa tan còn lại (%)

- Độ hấp thu|Độ ẩm Trung | Độ lệch

STT Mau (A) (%) y x % protein | binh | chuan

B.5 Kết qua ham lượng protein hòa tan còn lại (%) khi khảo sát thời gian thúy phân

Bảng: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng khử protein

Thũi gian thủy |,, ơ ` phân (giờ) Hàm lượng protein hòa tan còn lại (%)

P Độ hấp thu| D6 4m _ | Trung | Độ lệch

STT Mau (A) (%) y X % protein binh chudn

B.6 Kết qua hiệu suất thu hồi GluNAc thô (%) theo nồng độ chitin huyền phù

Bang: Anh hưởng của nồng độ chitin huyền phù tới hiệu suất thu nhận N- acetyl-glucosamine

Hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine (%) huyền phù (%)

12.94+0.21* vere độ chitin huyen) 945 lọs |07s |1

B.7 Kết qua hiệu suất thu hoi GluNAc thô (%) theo pH Bang: Anh hưởng của pH tới hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine

Hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine pH HeicnAc (%)

B.8 Kết qua hiệu suất thu hoi GluNAc thô (%) theo nhiệt độ Bang: Anh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine

Hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine HeicnxAc (%)

B.9 Kết qua hiệu suất thu hoi GluNAc thô (%) theo tỉ lệ E/SBang: Anh hưởng của tỉ lệ E/S tới hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine

Tỉ lệ E/S (% v/v) Hiéu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine

B.10 Kết quả hiệu suất thu hồi GluNAc thô (%) theo thời gian thủy phân Bảng: Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine

Thời gian (giò) | Hiệu suất thu nhận N-acetyl-glucosamine (%)

CAC KET QUA GUI MẪU Đồ thị kết quả xác định chat chuẩn GluNAc 91% bang HPLC

00 1.0 20 3.0 40 9.0 min Đồ thị kết qua xác định ham lượng GluNAc trong mẫu bang HPLC mV 300-D etector A:195nm

Pho đồ FTIR của ÿ-chifin

Ket quả GPC của chê pham