Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu thu nhận Enzyme Chitinase từ vỏ hạt đậu nành (Glycine Max)

Hiện nay, chitinase đang được nghiên cứu và có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất thuốc cho người, dùng chẩn đoán sớm các bệnh cơ hội do vi nấm gây ra, tiềm năng sử dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

PHẠM KIM NGÂN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME CHITINASE

TỪ VỎ HẠT ĐẬU NÀNH (GLYCINE MAX)

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60 54 02

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG - HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Trần Bích Lam Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS Đồng Thị Thanh Thu Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Phan Thế Đồng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 13 tháng 01 năm 2015

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Chủ tịch 2 PGS TS Đồng Thị Thanh Thu Phản biện 1 3 TS Phan Thế Đồng Phản biện 2 4 TS Võ Thị Bạch Huệ Ủy viên 5 TS Trần Thị Ngọc Yên Ủy viên, Thư ký Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 605402

I Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME CHITINASE

TỪ VỎ HẠT ĐẬU NÀNH (GLYCINE MAX)

II Nhiệm vụ và nội dung Nhiệm vụ

Khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành; tạo chế phẩm enzyme thô và xác định các thông số tối ưu cho hoạt động xúc tác của enzyme

Nội dung nghiên cứu:

- Xác định phương pháp chuẩn bị nguyên liệu để trích ly chitinase; - Xác định các thông số của quá trình trích ly;

- Xác định các tác nhân kết tủa và cô đặc enzyme; - Tạo chế phẩm và xác định các tính chất của enzyme

III Ngày giao nhiệm vụ:

20/01/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -

V Cán bộ hướng dẫn: TS Trần Bích Lam

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 01 năm 2015 Cán bộ hướng dẫn Chủ nhiệm bộ môn

Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học

      

 

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô TS Trần Bích Lam, người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, những người đã nuôi dưỡng, dạy bảo, luôn luôn bên cạnh, khuyên nhủ, động viên tôi

Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong học tập cũng như trong cuộc sống

Cuối cùng, tôi chân thành cảm ơn những người bạn đã gắn bó, động viên và chia sẻ những khó khăn trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tại trường

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 01 năm 2015 Học viên

Phạm Kim Ngân

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, chitinase được trích ly từ vỏ hạt đậu nành (Glycine

max) chuẩn bị theo phương pháp ướt Các thông số của quá trình trích ly được khảo

sát nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để hoạt tính chitinase thu được là cao nhất Kết quả chọn được đệm citrate pH 5.5, với tỷ lệ giữa khối lượng nguyên liệu và dung dịch đệm là 1:20 (w/v), thời gian trích ly 210 phút ở nhiệt độ 36oC

Để thu chế phẩm, đã khảo sát phương pháp kết tủa chitinase bằng các tác nhân acetone, ethanol và muối amonium sulfate với các tỷ lệ khác nhau; phương pháp cô đặc bằng siêu lọc qua màng có kích thước 25 kDa cũng được thực hiện Kết quả, enzyme kết tủa bởi acetone với tỉ lệ giữa dịch trích ly và dung môi là 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi (74.567%) và độ tinh sạch (1.560 lần) cao nhất

Chitinase sau kết tủa được sấy đông khô trong 24h, chế phẩm thu được có hoạt tính 12.552 U/mg Nghiên cứu tính chất của enzyme cho thấy chitinase thu được từ vỏ hạt đậu nành có nhiệt độ xúc tác tối ưu là 40oC; pH tối ưu là 6.0; bị ức chế bởi các ion Al3+, Fe2+,Co2+, Fe3+, Hg+ và hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+ Các hằng số Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù là 0.435 g/L và 6.410 g/L.phút, tương ứng

ABSTRACT

In this study, chitinase was extracted from soybean seed coats (Glycine max),

prepared by the wet method The parameters of the extraction process were examined in order to find optimal conditions that chitinase activity was the highest The results showed that pH of citrate buffer solution at 5.5, ratio of material to buffer (w/v) at 1:20, extraction time at 210 minutes and extraction temperature at 36oC were appropriate parameters for chitinase extraction

To obtain crude enzyme, acetone, ethanol and ammonium sulfate were tested; enzyme was also concentrated by ultrafiltration (25 kDa membrane) As a result, using acetone (ratio of extracted solution to solvent at 1:4) for enzyme precipitation provided better results than using other methods Yield and purification fold of chitinase after precipitating by this method were 74.567% and 1.560 times

After precipitating, enzyme was dried for 24 hours by freeze dryer, chitinase activity of obtained preparation was 12.552 U/mg Some properties of chitinase were determined: optimum pH was at 6.0, optimum temperature was at 40oC and Al3+,Fe2+,Co2+, Fe3+, Hg+ were chitinase inhibitors; Mn2+, Cu2+ increased chitinase activity The Km and Vmax values of chitinase on colloidal chitin were 0.435 g/L and 6.410 g/L.min, respectively

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

Phạm Kim Ngân

  

1.1.1 Đặc điểm của hạt đậu nành 3

1.1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu nành 5

1.3.3 Cơ chế tác động của enzyme chitinase 12

1.3.4 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase 13

1.3.4.1 Trọng lượng phân tử 13

1.3.4.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis 14

1.3.4.3 Nhiệt độ và pH hoạt động của enzyme 14

1.3.4.4 Chất ức chế 14

1.3.5 Nguồn thu nhận 15

1.4 Vai trò của chitinase trong phản ứng phòng vệ thực vật 16

1.5 Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein enzyme 18

1.5.1 Phá vỡ tế bào 18

1.5.2 Ổn định protein trong dịch chiết thô 18

1.5.3 Phân riêng protein enzyme 18

1.5.4 Tinh sạch enzyme 22

1.6 Ứng dụng của enzyme chitinase 23

1.6.1 Trong nông nghiệp 23

1.6.2 Trong y học 23

1.6.3 Kiểm soát muỗi 24

1.6.4 Sản xuất protein đơn bào 24

1.6.5 Các ứng dụng khác 24

1.7 Các nghiên cứu về enzyme chitinase trên thực vật 25

1.7.1 Các nghiên cứu trên hạt đậu nành 25

1.7.2 Các nghiên cứu trên một số thực vật khác 25

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng 28

2.1.1 Nguyên liệu 28

2.2.2 Hóa chất 28

2.2.3 Dụng cụ - Thiết bị 28

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 28

2.2.2 Quy trình thu nhận enzyme chitinase 30

2.2.2 Phương pháp thực hiện 31

2.2.2.1 Khảo sát phương pháp xử lí nguyên liệu 31

2.2.2.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme 31

2.2.2.3 Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme 32

2.2.2.4 Sấy đông khô 34

2.2.2.5 Khảo sát các tính chất của enzyme 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1 Khảo sát hoạt tính enzyme ở các bộ phận khác nhau của nguyên liệu 40

3.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme chitinase 42

3.2.1 Ảnh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích ly enzyme 42

3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung dịch đệm đến trích ly enzyme 44

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến trích ly enzyme 46

3.2.5 Tối ưu hóa quá trình trích ly enzyme từ vỏ đậu nành bằng phương pháp 49 quy hoạch thực nghiệm 49

3.3 Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme 54

3.3.1 Kết tủa enzyme bằng acetone 54

3.3.2 Kết tủa enzyme bằng ethanol 56

3.3.3 Kết tủa enzyme bằng amonium sulfate 57

3.3.3.1 Trước khi thẩm tích 57

3.3.3.2 Sau khi thẩm tích 59

3.3.4 Cô đặc enzyme bằng siêu lọc 59

3.3.5 Chọn phương pháp kết tủa enzyme 61

3.4 Kết quả sấy đông khô 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần chính trong vỏ hạt đậu nành (trên 100g) 4 

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của hạt đậu nành 6 

Bảng 2.1: Các thông số của thiết bị và đặc tính kỹ thuật của màng sử dụng 33 

Bảng 3.1: Các yếu tố ảnh hưởng với các giới hạn và miền khảo sát 50 

Bảng 3.2: Ma trận và kết quả quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly enzyme 51 

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hoạt tính enzyme chitinase 52 

Bảng 3.4: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa 59 

bằng muối amonium sulfate và sau khi thẩm tích 59 

Bảng 3.5: Hiệu suất thu hồi enzyme, protein và độ tinh sạch 60 

enzyme chitinase sau khi cô đặc bằng siêu lọc 60 

Bảng 3.6: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme 62 

thu nhận bằng các phương pháp khác nhau 62 

Bảng 3.7: Hoạt tính enzyme và hàm lượng protein qua các giai đoạn 63 

Bảng 3.8: Tính chất enzyme chitinase từ một số nguồn thu nhận khác nhau 66 

Bảng 3.9: Các thông số xác định động học enzyme 67 

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hạt đậu nành 3 

Hình 1.2: Cấu trúc của vỏ hạt đậu nành 5 

Hình 1.3: Cấu trúc của chitin 7 

Hình 1.4: Trình tự sắp xếp các chuỗi của α, β, γ – chitin 7 

Hình 1.5: Vị trí phân cắt của enzym chitinase 9 

Hình 1.6: Cấu trúc chitinase của Saccharomyces cerevisiae (a) và ChiA1 của Bacillus circulans (b) 10 

Hình 1.7: Cơ chế tác động của enzyme chitinase 12 

Hình 1.8: Cơ chế thủy phân tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase 13 

Hình 1.9: Trình tự axit amin của protein chitinase 25 

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 29 

Hình 2.2: Quy trình thu nhận enzyme chitinase 30 

Hình 3.1: Hoạt tính enzyme chitinase của hạt đậu nành ở các bộ phận khác nhau và phương pháp thu nhận khác nhau 40 

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích ly enzyme chitinase 43 

Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung dịch đệm đến trích ly enzyme 45 

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến quá trình trích ly enzyme 47 

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly enzyme 49 

Hình 3.6: Đồ thị đáp ứng bề mặt hoạt tính enzyme theo phương trình hồi quy trên không gian ba chiều (a) và hai chiều (b) 53 

Hình 3.7: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa bằng dung môi acetone ở các tỷ lệ khác nhau 55 

Hình 3.8: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa bằng dung môi ethanol ở các tỷ lệ khác nhau 57 

Hình 3.9: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme chitinase sau khi kết tủa bằng muối amonium sulfate ở các % độ bão hòa khác nhau 58 

Hình 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chitinase 64 Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chitinase 65 Hình 3.12: Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme chitinase 66 Hình 3.11: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme 67 Hình 3.12: Đồ thị Lineaweaver Burk thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme 68 

MỞ ĐẦU

Đậu nành (Glycine max) là loại cây ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao, được

trồng phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam Sản phẩm của nó được sử dụng làm thực phẩm cho con người, thức ăn gia súc và nguyên liệu cho các ngành công nghiệp Phế phẩm từ các ngành này, vỏ hạt, thường được loại bỏ, ít được tận thu

Nghiên cứu của Gijzen và cộng sự (2001) trên đậu nành cho thấy có sự hiện diện của enzyme chitinase nhóm I có trọng lượng phân tử 32 kDa trong vỏ hạt, có vai trò quan trọng trong phản ứng tự phòng vệ chống lại nấm bệnh và côn trùng gây hại, xuất hiện trong giai đoạn phát triển của hạt ở giai đoạn trưởng thành và chín Ở các bộ phận khác như rễ, lá, phôi và trong mô nhiễm mầm bệnh của hạt cũng có sự hiện diện của chitinase; tuy nhiên hàm lượng enzyme đặc biệt cao ở vỏ hạt

Chitinase là enzyme thủy phân chitin, được tìm thấy ở hầu hết các loài sinh vật với chức năng khác nhau Hiện nay, chitinase đang được nghiên cứu và có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất thuốc cho người, dùng chẩn đoán sớm các bệnh cơ hội do vi nấm gây ra, tiềm năng sử dụng trong nông nghiệp như một loại thuốc trừ sâu sinh học, sản xuất protein đơn bào và các ứng dụng quan trọng khác Tuy nhiên, các chế phẩm enzyme chitinase hiện nay khá đắt nên việc ứng dụng còn hạn chế

Trên thế giới, các nghiên cứu về enzyme chitinase đã được thực hiện trên nhiều đối tượng khác nhau Tuy nhiên, nghiên cứu trong nước về enzyme này chưa nhiều, chủ yếu tập trung trên đối tượng là vi sinh vật, đặc biệt là vi nấm và một vài nghiên cứu về chitinase trên mủ cao su, khoai lang, chưa có nghiên cứu nào về enzyme này trên vỏ hạt đậu nành

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận

enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành (Glycine max)”

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

Khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành; tạo chế phẩm enzyme thô và xác định các thông số tối ưu cho hoạt động xúc tác của enzyme

Nội dung nghiên cứu:

- Xác định phương pháp chuẩn bị nguyên liệu để trích ly chitinase; - Xác định các thông số của quá trình trích ly;

- Xác định các tác nhân kết tủa và cô đặc enzyme; - Tạo chế phẩm và xác định các tính chất của enzyme

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về đậu nành

Đậu nành thuộc chi Glycine, họ đậu Leguninosae, họ phụ cánh bướm

Papilionoideae và bộ Phaseoleae, có tên khoa học là Glycine max (L) Merr là cây

trồng cạn, ngắn ngày có nguồn gốc từ Đông Á Thân cây mảnh, cao từ 0.8 đến 0.9m, có lông, cành hướng lên phía trên Lá mọc cách, có 3 lá chét hình trái xoan, mũi lá gần nhọn không đều ở gốc Hoa có màu trắng hay tím xếp thành chùm ở nách cành Quả thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông màu vàng,

thắt lại ở giữa (Trần Văn Điền, 2007)

Trên thế giới, đậu nành là cây trồng lấy hạt quan trọng, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô; tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ (trên 70%) tiếp đến là châu Á Trong nước, đậu nành cũng là cây trồng phổ biến, tập trung nhiều ở Đông Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông Cửu Long

1.1.1 Đặc điểm của hạt đậu nành

Hạt đậu nành có nhiều hình dạng và màu sắc khác nhau như: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt ; màu vàng, đỏ, xanh lục, nâu đen Trong đó, giống đậu nành màu vàng có giá trị thương phẩm cao Kích thước của hạt cũng khác nhau tùy loại giống, trung bình có trọng lượng từ 150-300gram/1000 hạt Hạt đậu nành gồm 3 bộ phận chính là: vỏ hạt, phôi và tử diệp (Trần Văn Điền, 2007)

Hình 1.1: Hạt đậu nành

Vỏ ngoàiRốn hạtChồi mầm

Trụ dưới lá mầm Trụ trên lá mầm

Rễ mầm Tử diệp

Lỗ noãn

 

1.1.1.1 Vỏ hạt

Vỏ hạt đậu nành chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng hạt với các thành phần được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1: Thành phần chính trong vỏ hạt đậu nành (trên 100g)

Isoflavones 90-600 µg Phommalth et al., 2008 Trypsin inhibitors 44 mg/g Sessa & Wolf, 2001 Phytic acid 0.12-0.50 g/100g Lehrfeld, 1989; Sutardi &

Buckle, 1985

Isoflavones 0.11-0.20 mg/g Eldridge & Kwolek, 1983 Nguồn: Tổng hợp bởi O’Bryan và cộng sự (2014)

Vỏ hạt có chức năng bảo vệ phôi và các thành phần bên trong, đảm bảo cho sự nẩy mầm của phôi, chúng gồm nhiều lớp tế bào, thể hiện ở hình 1.2

Ngoài cùng là lớp sáp không ngấm nước Kế tiếp là lớp tế bào rào, macrosclereids, các tế nào này có vách dày, thon dài và vuông góc với bề mặt của hạt, đóng vai trò quan trọng cho sự cứng chắc của vỏ hạt

Bên trong lớp tế bào rào là lớp tế bào đồng hồ cát (hourglass), osteosclereids, lớp tế bào này lớn hơn các lớp tế bào lân cận, khoảng gian bào rộng Các tế bào có không bào lớn và chứa nhiều loại protein đặc biệt là peroxidase (5% tổng protein hòa tan) (Gijzen và cộng sự, 1993) Cũng như các tế bào rào, vách tế bào đồng hồ cát cũng có vai trò trong tạo độ cứng chắc cho vỏ hạt

Tiếp giáp với lớp tế bào đồng hồ cát là nhu mô bên trong, hình thành bởi 6-8 lớp mỏng, các tế bào nhu mô được kéo dài, chúng phân bố đều khắp các vỏ hạt,

ngoại trừ ở rốn Trong lớp hạt trưởng thành, khi phôi được mở rộng lớp nhu mô thường bị chèn ép (Miller và cộng sự, 1999) Ngay sau lớp nhu mô của vỏ hạt là lớp tế bào aleurone và lớp nhu mô của nội nhũ

phôi 1.1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu nành

Đậu nành là loại hạt có hàm lượng dinh dưỡng cao, giàu protein, glucid, lipid, muối khoáng và vitamin (Nguyễn Danh Đông, 1982; Ngô Thế Dân và cộng sự, 1999)

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của hạt đậu nành

Thành phần Tỷ lệ

(%)

Protein (%)

Lipid (%)

Tro (%)

Carbohydate (%)

- Glucid: chiếm khoảng 35% khối lượng khô của hạt, phần lớn là cellulose, hemicellulose, tinh bột và một lượng nhỏ đường

- Lipid: chiếm khoảng 20% khối lượng khô hạt, lipid của đậu nành chứa một tỉ lệ cao các acid béo không no (khoảng 60-70% lượng acid béo của hạt) gồm linoleic (52-65%), oleic (25-36%), linolenic (2-3%)

- Chất khoáng và vitamin: thành phần khoáng chiếm 5% trọng lượng khô của hạt Trong đó đáng chú ý nhất là canxi, photpho, mangan, kẽm, sắt Ngoài ra, còn có các vitamin quan trọng khác như PP, A, E, K, D, C

Với thành phần giàu các chất dinh dưỡng, hạt đậu nành chủ yếu được ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị cao như: sữa đậu nành, đậu hủ, tương, chao, dầu nành, sản xuất các chất phụ gia cho thực phẩm các phụ phẩm của ngành chế biến đậu nành được sử dụng làm thức ăn gia súc có giá trị dinh dưỡng khá cao

1.2 Chitin

Chitin là polyme sinh học rất phổ biến và là nguồn tài nguyên tái tạo dồi dào nhất sau cellulose (Deshpande, 1986) Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật Trong giới động vật, nó là thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ của hầu hết các động vật không xương sống như động vật chân đốt, thân mềm, giun đốt dưới dạng phức hợp với các thành phần khác như chất béo, canxi

cacbonate, protein và các chất màu, hàm lượng chiếm khá cao từ 14-35% trọng lượng khô (Joiles và Muzzaralli, 1999) Trong giới thực vật, chitin ít được tìm thấy,

chỉ có ở một số tảo Chlorophiceae Ở vi sinh vật, chitin nằm trong thành tế bào của

nấm sợi, nấm men và vi khuẩn (Hirano and Nagano, 1989; Wang, 1992) Trong nấm, chitin kết hợp với polysaccharide khác, chẳng hạn như cellulose, glucan, mannan và polygalactosamine

1.2.1 Cấu trúc phân tử

Chitin (C8H13NO5)n là một polysaccharide mạch thẳng gồm các đơn vị là acetyl D-glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glycoside (Cabib, 1987)

N-Hình 1.3: Cấu trúc của chitin

Về cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, γ Sự khác nhau này thể hiện ở cách sắp xếp các chuỗi Chuỗi α-chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, đây là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, cua, trong các loài nhuyễn thể, trong dây chằng cũng như biểu bì của các loại côn trùng; hiếm hơn là dạng β-chitin, các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, được tìm thấy trong protein của mực ống; còn γ -chitin thì rất hiếm, các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc (Đinh Minh Hiệp, 2001)

Hình 1.4: Trình tự sắp xếp các chuỗi của α, β, γ – chitin

1.2.2 Tính chất của chitin

Trong tự nhiên, chitin tồn tại ở dạng tinh thể, là chất rắn màu trắng, không tan trong nước, dung dịch kiềm hoặc acid loãng, các dung môi hữu cơ như ete, rượu và thuốc thử Schweitzer; nhưng có thể tan trong một số dung dịch như HCl đậm đặc, HNO3, acid fomic khan và một số muối trung tính (Shubakov và Kucheryavykh, 2004)

1.2.3 Ứng dụng của chitin

Trong nông nghiệp, chitin và dẫn xuất của nó, chitosan, được sử dụng nhằm bảo vệ cây trồng, chống sâu bệnh; thúc đẩy chất đối kháng vi sinh vật, kiểm soát sinh học Nó là chất cảm ứng tốt cho cơ chế phòng vệ thực vật, việc bổ sung chitin vào đất làm tăng mật độ của các vi sinh vật chứa enzym chitinase (chitinolytic organisms), phá hủy trứng và lớp biểu bì của tuyến trùng non có chitin trong thành phần của chúng (Gooday, 1990) Chitin cũng hỗ trợ các mối quan hệ cộng sinh có lợi thực vật-vi sinh vật; điều hòa sinh trưởng và phát triển thực vật, nó cũng được đánh giá là một loại phân bón sinh học có thể cải thiện năng suất cây trồng (Yamaguchi và cộng sự, 2000)

Trong công nghiệp, chitin có thể tạo lớp màng ăn được hoặc là chất phụ gia làm dày và ổn định thực phẩm, có thể tạo độ bền dai cho thực phẩm thay thế một số chất không cho phép như hàn the Chitin cũng hoạt động như một chất kết dính trong vải nhuộm Ngoài ra, xử lí nước thải cũng là một trong những ứng dụng quan trọng của chitin (Annamalai et al, 2010; Nguyễn Quang Nhân, 2009)

Trong y học, chitin được sử dụng để làm chỉ phẫu thuật, miếng xốp phân hủy sinh học, băng; nó cũng được báo cáo là có một số tính chất khác thường đẩy nhanh lành vết thương ở người Oligosaccharide chitin, là các đoạn mạch ngắn của chitin, được báo cáo là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, hạ huyết áp, thuốc chống ung thư (Patil và cộng sự, 2000, Purwani và cộng sự, 2004) Các đơn phân của chitin là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN), là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột và viêm dạ dày Trong hóa sinh, chitin được sử dụng làm chất mang trong cố định enzyme hay cố định tế bào (Trần Đình Toại và cộng sự, 2008)

1.3 Enzyme chitinase (EC 3.2.1.14) 1.3.1 Định nghĩa

Chitinase [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân chitin thành các chitobiose hay chitotriose thông qua việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine trong chitin

Hình 1.5: Vị trí phân cắt của enzym chitinase

Chitinase được tạo ra từ nhiều sinh vật, từ những loài có thành phần cấu trúc là chitin đến những loài không có chitin Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin tạo ra nguồn carbon Ở thực vật và động vật, chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm Chân khớp và nấm, chitinase có vai trò trong sự phân chia tế bào để tăng trưởng và được tạo thành trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm Đối với nấm sợi, chitinase tham gia nhiều chức năng như phân giải thành tế bào, nảy mầm bào tử, phát triển khuẩn ty và tự phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, đồng hóa chitin và ký sinh (Li, 2006; Adam, 2004; Haran và cộng sự, 1996)

1.3.2 Cấu trúc, phân loại

1.3.2.1 Cấu trúc

Cấu trúc enzyme chitinase khác nhau, tùy vào nguồn thu nhận Kuranda và Robbins (1991) cho rằng chitinase ngoại bào nấm men có 4 domain, bao gồm: một chuỗi tín hiệu, một domain xúc tác, một vùng giàu serine / threonine và một domain

C-terminal gắn kết chitin (Hình 1.6a) Chitinase từ hai loại nấm khác, Rhizopus

oligosporus , R niveus, và ký sinh trùng Brugia malayi cũng có sự hiện diện của

vùng giàu serine / threonine (Blaak và cộng sự, 1993) Watanabe và cộng sự (1993) báo cáo sáu chitinase khác nhau (A1, A2, B1,

B2, C, và D) được tiết vào trong môi trường bởi Bacillus circulans Trong đó,

chitinase A1 được sản xuất nhiều nhất và cho ái lực mạnh với chitin không hòa tan Nghiên cứu để xác định domain chức năng của chitinase ChiA1 cho thấy domain C- terminal là một domain gắn kết chitin và domain lớn N-terminal có vị trí xúc tác của enzyme, domain chức năng thứ ba là domain fibronectin type III (Hình 1.6b) Việc loại domain này không ảnh hưởng đến sự gắn kết chitin nhưng giảm hoạt tính thủy phân đối với cơ chất không tan như chitin huyền phù; tuy nhiên, quá trình thủy phân cơ chất hòa tan, hoặc carboxymethyl chitin hoặc chito - oligomer không bị ảnh hưởng đáng kể Ngoài ra domain type III có thể tham gia vào cơ chế thủy phân exo-

Chuỗi nhận biết Vùng giàu Ser/Thr Domain xúc tác Domain gắn kết chitin Fibronectin type III domain

Hình 1.6: Cấu trúc chitinase của Saccharomyces cerevisiae (a) (Kuranda và Robbins, 1992) và ChiA1 của Bacillus circulans (b) (Watanabe và cộng sự,1993)

1.3.2.2 Phân loại

Dựa vào hệ thống phân loại enzyme: Chitinase thuộc 2 họ là Glycohydrolase

18, Glycohydrolase 19 (Liau và Lin, 2008) - Họ Glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, các chitinase này hoạt động thông qua một

cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là anomer Chúng được tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetylglucosaminidase

β Họ Glycohydrolase 19: họ này gồm 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật,

ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus

influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn α và hoạt động thông

qua cơ chế nghịch chuyển

Dựa vào trình tự amino acid:

Thực vật sản xuất một số lượng lớn các isozyme chitinase, như phản ứng phòng vệ chống lại tác nhân gây bệnh Chúng được phân thành 6 nhóm dựa theo các đặc tính về: trình tự N-terminal, vị trí của các enzyme, pH đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng (Iseli và cộng sự, 1996)

- Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cysteine, peptide nhận biết giàu leucine hoặc valine (Flach et al, 1992) Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác mà cần để tạo các đặc tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở nhiều loài khác nhau Nhóm I còn được chia nhỏ thành phụ Nhóm Ia và Ib dựa trên bản chất là acid hay base của chitinase Các chitinase có nguồn gốc từ thực vật thường thuộc nhóm I Hầu hết các chitinase nhóm I là endo-chitinase

- Nhóm II: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I; chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn Chitinase nhóm II thường là exo-chitinase

- Nhóm III: Chitinases nhóm III có trình tự amino acid hoàn toàn khác với

chitinase nhóm I và II (Collinge et al, 1993) nhưng giống về trình tự với lysozyme ở

Hevea Brasiliensis Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh và

được tiết ra ngoại bào - Nhóm IV: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I,

phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I (Collinge và cộng sự, 1993)

- Nhóm V và VI: Dựa trên những dự liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

Dựa vào phản ứng phân cắt: Dựa vào phản ứng phân cắt, chitinase có thể

được phân thành 2 nhóm: - Endo-chitinase ( EC 3.2.1.14) cắt ngẫu nhiên bên trong phân tử chitin tạo thành các phân tử có trọng lượng thấp hơn như: chitotriose, chitotetraose, diacetylchitobiose;

- Exo-chitinase có thể chia thành 2 nhóm nhỏ: chitobiosidase (EC 3.2.31.29) xúc tác cho phản ứng giải phóng diacetylchitobiose bắt đầu từ đầu không khử và β-(1,2) N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30) phân tách các sản phẩm oligomer của endo-chitinase và chitobiosidase tạo các monomer GlcNAc (Sahai and ManoCha, 1993)

1.3.3 Cơ chế tác động của enzyme chitinase

Enzyme chitinase xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-β-glycoside trong phân tử chitin tạo các sản phẩm khác nhau như chitobiose, chitotriose, sau đó các chất này tiếp tục bị phân cắt tạo thành các monomer là N-acetyl D-glucosamin Các enzyme xúc tác và sản phẩm tạo thành được thể hiện ở hình 1.7

Hình 1.7: Cơ chế tác động của enzyme chitinase (Đinh Minh Hiệp, 2007)

Sự thủy phân chitin bởi chitinase có thể tạo ra hai sản phẩm khác nhau với cấu hình α và β Vì các phân tử GlcNAc trong chitin liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 nên sản phẩm thủy phân với cấu hình α được nghịch chuyển từ dạng β (hình 1.8) Một số chitinase họ Glycohydrolase 18 thủy phân theo cơ chế giữ lại cấu trúc β, trong khi Glycohydrolase 19 thường nghịch chuyển từ dạng β-anomer sang dạng α-anomer

Hình 1.8: Cơ chế thủy phân tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase (Đinh Minh Hiệp, 2001) 1 Cơ chế giữ lại các cấu tử β-anomer (chitinase họ Glycohydrolase 18) 2 Cơ chế nghịch chuyển từ dạng β-anomer sang dạng α-anomer (chitinase họ

Glycohydrolase 19) (A: Glu 67, B: Glu 89)

1.3.4 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase

1.3.4.1 Trọng lượng phân tử

Chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa, riêng chitinase trích ly từ mầm, chồi, lá khoai lang có trọng lượng phân tử 16 kDa (Hou và cộng sự, 1998) Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn khoảng 120 kDa; chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến động 30-12 kDa Một số enzyme chitinase có trọng lượng phân tử thấp có thể được tạo ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một phần protein (Joile và Muzzarelli, 1999)

1.3.4.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện thay đổi rộng, từ 3-10 ở thực vật bậc cao và tảo; từ 4.7-9.3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; từ 3.5 – 8.8 ở vi sinh vật Hằng số Michaelis là 0.010-0.011 (g/100 mL) (Joile và Muzzarelli, 1999)

1.3.4.3 Nhiệt độ và pH hoạt động của enzyme

Nhiều nghiên cứu cho thấy chitinase hoạt động giới hạn trong khoảng nhiệt độ từ 20-50oC Tuy nhiên còn tùy thuộc vào nguồn thu nhận; nhiệt độ tối ưu của chitinase thu nhận từ vi sinh vật thường khoảng 40oC; một số chitinase thu nhận từ vi sinh vật phát triển trong suối nước nóng có thể chịu được nhiệt độ cao đến 80oC

Chitinase hoạt động trong giới hạn pH từ 4.0-9.0 đối với các enzyme chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, ở động vật là 4.9-7.5 pH tối thích của enzyme chitinase có thể có sự phụ thuộc vào cơ chất sử dụng Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối thích khoảng 5.0 khi cơ chất là chitin Tùy mục đích phân tích, những cơ chất hòa tan như glycol chitin và N-acetyl chitooligosaccharide được sử dụng thay thế cho chitin pH tối thích của enzyme chitinase khi cơ chất là glycol chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu (Guthrie và cộng sự, 2005)

Hoạt tính của enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH<4.5, ngoại trừ chitinase trong dạ dày của động vật có xương sống vẫn hoạt động ở pH 3.0

1.3.4.4 Chất ức chế

- Allosamidin: là một pseudotrisacchride gồm 2 đơn vị N-acetylallosamin gắn

với nhau nhờ liên kết β-1,4 và một nhóm allosamizoline, là chất ức chế cạnh tranh với chitinase Allosamidin ức chế chitinase đầu tiên được phân lập từ khuẩn ty của

Streptomyces sp Allosamidin và những dẫn xuất của nó ức chế enzyme chitinase được tổng hợp từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật (Piromyces communis,

Streptomyces sp và Streptomyces olivaceoviridis) Ngoài ra, allosamidin còn có khả

năng gắn kết với các enzyme chitinase thực vật như hevamine (từ cây cao su) và ức chế các enzyme chitinase thực vật thuộc họ Glycohydrolase 18, không ức chế enzyme chitinase thuộc họ Glycohydolase 19 (Joile và Muzzarelli, 1999)

- Các ion kim loại: Các ion kim loại nặng như Hg+, Ag+ thường là những chất ức chế đối với enzyme chitinase

1.3.5 Nguồn thu nhận

Chitinase từ vi khuẩn: Vi khuẩn sản sinh enzyme chitinase nhằm phân giải chitin đáp ứng nguồn cacbon cho nhu cầu sinh trưởng và phát triển Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase để có thể phân cắt được các loại chitin đa dạng trong tự nhiên Enzyme chitinase được tìm thấy trong một số lòai vi khuẩn như:

Micrococcus (Annamalai và cộng sự, 2010); Bacterium (Yong và cộng sự, 2005), Streptomyces (Kim và cộng sự, 2002)

Chitinase từ nấm: Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm (Adams, 2004) Các chủng nấm mốc cho enzyme chitinase cao

như: Aspergillus và Coccidioides (Haran và cộng sự, 1996; Reichard và cộng sự, 2000; Nguyễn, 2012), Verticillium (Tikhonov và cộng sự, 2002)…

Chitinase từ động vật: Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt, có thể thu nhận được enzyme chitinase Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình lột xác Chitinase từ động vật ít được nghiên cứu hơn so với chitinase từ vi sinh vật, nấm và thực vật (Nguyễn Quang Nhân, 2009)

Chitinase từ thực vật: Enzyme chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm kí sinh gây bệnh cho cây trồng Các thực vật bậc cao có khả

năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), lúa mạch đen, đậu Hà Lan, đậu nành, củ

từ Chitinase thực vật tồn tại chủ yếu ở các mô nhất định hoặc cơ quan sinh sản

như hạt giống, củ, hoa và được cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân gây hại trên thực vật

1.4 Vai trò của chitinase trong phản ứng phòng vệ thực vật

Ở nhiều loài thực vật, sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh gây ra sự sản xuất PR- protein như chitinase, β -1,3-glucanase, proteinase, chất ức chế proteinase (Kombrink và Somssich, 1995) Nấm và các loài côn trùng gây bệnh có chứa chitin trong lớp vỏ bảo vệ của chúng tác động đến sự cảm ứng của chitinase trên thực vật Hầu hết các chitinase được cảm ứng sản sinh ở các cơ quan sinh dưỡng của thực vật ở các bộ phận bị tấn công, đồng thời cũng được báo cáo là có hoạt tính cao ở hạt giống (Patil và cộng sự, 2000)

Chitinase liên quan đến việc tác động đến thành tế bào của nấm, việc kích hoạt enzyme này có thể xảy ra trước bởi hoạt động thủy phân của các enzym khác như β-1,3-glucanse hoặc đồng thời với các enzym này Chitinase và β-1,3-glucanse có thể hoạt động hỗ trợ nhau trong sự ức chế phát triển của nấm Chúng có thể tác động trực tiếp bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của sợi nấm đang xâm nhập không gian giữa các tế bào và có thể gián tiếp bằng cách giải phóng elicitor, gây ra hoạt tính chitinase bổ sung và các phản ứng tự vệ khác trong vật chủ Theo quan điểm này, chitinase không bào hoạt động muộn trong quá trình bị xâm nhiễm khi sự hư hại tế bào giải phóng không bào đi vào gian ngoại bào (Collinge và cộng sự, 1993)

Nghiên cứu của Hadwiger và Beckman (1980) cho thấy chất chiết từ vỏ trong hạt đậu Hà Lan chứa hoạt tính chitinase và chitobiase Bằng chứng cho thấy sự đóng góp rõ hơn của chitinase thực vật trong phản ứng phòng vệ là sự hình thành

của chitosan trong các thành tế bào của nấm đậu, Uromyces viciae – fabae, để

chống lại các hoạt tính của chitinase (Deising và Siegrist, 1995) Hầu hết các chitinase ưu tiên tác dụng lên cơ chất được acetyl hóa và hoạt tính giảm với mức độ giảm của các gốc acetyl Vì vậy, sự gia tăng mức độ deacetyl trên bề mặt của sợi nấm nhằm giúp các loại nấm chống lại chitinase thực vật

Roberts và Selitrennikoff (1998) nghiên cứu chitinase vi khuẩn và thực vật về hoạt tính kháng nấm cho thấy các chitinase phân lập từ hạt lúa mì, lúa mạch, ngô hoạt động như endo-chitinase và ức chế sự kéo dài sợi nấm Điều này có thể là do

trong quá trình phát triển, chitin và sợi β-1,3-glucan được tổng hợp đồng thời tại đỉnh của sợi nấm Trong các thành tế bào trưởng thành xa đỉnh, các polysaccharide được liên kết ngang để tạo thành sợi phức hợp chitin-glucan và có thể được phủ lên bởi các polysacchride và các lớp protein khác Vì thế, tại các đỉnh, để lộ các chuỗi chitin mới hình thành thì nhạy cảm với sự thủy phân bởi chitinase, trong khi lớp chitin trong vách tế bào trưởng thành thì enzyme không thể tiếp cận Nghiên cứu

trên Cercospora beticola cho thấy chitinase tinh sạch từ củ cải đường đã có thể

phân giải chitin mới tổng hợp ở đỉnh sợi nấm nhưng lại không có tác dụng trên lớp chitin trong vách tế bào trưởng thành

Một số loài nấm nhỏ là tác nhân kiểm soát sinh học các nấm gây bệnh thực vật và côn trùng Các nấm này kí sinh vào nấm và côn trùng gây bệnh sản xuất chitinase cho sự xâm nhập và là một trong những thành phần giết vật chủ (Mathivanan và cộng sự, 1998; Higuchi và cộng sự, 1998)

Chủng Fusarium chlamydosporum và nấm kí sinh trên đậu phộng, Puccinia

arachidis sản xuất endochitinase, ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm kí sinh cho

thấy sự đóng góp đáng kể của chitinase trong kiểm soát sinh học của nấm hại đậu phộng (Mathivanan và cộng sự, 1998) Nghiên cứu của Deshpande (2005) cho thấy

M verrucaria sản xuất enzyme mycolytic ngoại bào như chitinase , β-1 ,3-

glucanase và proteinase Các mycolytic thô đã cho thấy có hiệu quả chống lại S

rolfsii, một loài nấm gây bệnh ở rễ trên đậu phộng Govindsamy và cộng sự (1998)

cũng báo cáo sử dụng chitinase tinh khiết từ M verrucaria để kiểm soát nấm hại đậu phộng, P arachidis

Chitinase cũng được thử nghiệm để kiểm soát các loài gây hại như bọ cánh cứng sừng dài và rệp, việc xử lí enzyme trước hoặc đồng thời cùng với các nấm gây bệnh trên côn trùng đã có hiệu quả tích cực (Higuchi và cộng sự, 1998) Các loại

nấm gây bệnh trên côn trùng, Beauveria bassiana, B brongniartii, và Verticillium

lecanii sản xuất enzyme làm hư hại biểu bì khi được phát triển trên môi trường chứa

chitin (Patil và cộng sự, 2000). 

1.5 Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein enzyme 1.5.1 Phá vỡ tế bào

Phá vỡ tế bào nhằm giải phóng các chất có bên trong tế bào và là bước đầu tiên để thu nhận enzyme nội bào Có nhiều phương pháp được thực hiện như: dùng phương pháp cơ học (áp suất cao, nghiền, đồng hóa áp lực cao…); phương pháp hóa học (dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào); phương pháp vật lý (sử dụng sóng siêu âm, sốc nhiệt); phương pháp sinh học (dùng enzyme) Việc chọn phương pháp để giải phóng các chất bên trong tế bào tùy thuộc vào đặc điểm nguồn nguyên liệu và enzyme cần thu nhận

1.5.2 Ổn định protein trong dịch chiết thô

Sau khi giải phóng khỏi vách tế bào, protein bắt đầu chịu tác động phá hoại của nhiều yếu tố khác nhau Do đó cần phải tạo điều kiện ổn định cho protein Sự ổn định của protein phụ thuộc vào độ phân cực hay lực ion, pH, sự có mặt hay vắng mặt của các ion kim loại, sự oxy hóa, protease nội bào và nhiệt độ Thông dụng nhất là sử dụng pH sinh lý hoặc các đệm Một số ion kim loại nặng Ag+, Cu2+, Hg+

thường làm biến tính protein, đặc biệt là protein chứa nhóm –SH, để tránh nhiễm bẩn bởi ion kim loại nặng người ta thường bổ sung EDTA vào dung dịch đệm Để giảm thiểu tác động của quá trình oxy hóa thường bổ sung mercaptoethanol, cystein, dithiothreitol (Nguyễn Thanh Điền, 2006)

1.5.3 Phân riêng protein enzyme

Dịch trích ly thu được sau khi phá vỡ tế bào chứa nhiều thành phần không phải protein enzyme mong muốn, do đó cần được loại bỏ khỏi dung dịch Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ, muối trung tính là những phương pháp được sử dụng rất rộng rãi để thu các chế phẩm protein enzyme trong các nghiên cứu về enzyme trong phòng thí nghiệm cũng như sản xuất enzyme quy mô công nghiệp Ngoài ra, siêu lọc, dùng nhiệt, kết tủa bởi các polymer hay kết tủa ở điểm đẳng điện là những phương pháp cũng có thể được sử dụng để loại bỏ bớt những thành phần không mong muốn (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012)

1.5.3.1 Kết tủa protein enzyme bằng dung môi hữu cơ

Cơ sở của kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ dựa vào độ hoà tan của protein thông qua tác động lên hằng số điện môi của dung dịch Các dung môi hữu cơ có hằng số điện môi nhỏ, làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường, ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein, tức là làm giảm độ hòa tan của protein trong dung dịch và dẫn đến kết tủa protein Các dung môi thường được sử dụng là acetone, ethanol, isopropanol Khi tiến hành kết tủa bằng dung môi hữu cơ cần chú ý đến nhiệt độ, enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của dung môi nên khi tiến hành kết tủa phải làm lạnh của dung môi và dung dịch enzyme, nhiệt độ thường là 3-10oC

1.5.3.2 Kết tủa protein enzyme bằng muối trung tính

Khi cho muối trung tính vào protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, ở nồng độ ion thấp, độ tan của protein tăng theo lực ion Tới giới hạn nồng độ muối tăng nhất định các các cation và anion muối hấp phụ trên bề mặt phân tử protein, làm cho điện tích của protein trở thành không đáng kể, protein rơi về trạng thái đẳng điện do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại Khi đạt điểm muối tích thì protein bắt đầu kết tủa Trong số các muối trung tính thì muối ammonium sulfate là tốt nhất và được dùng phổ biến vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể 35-40oC, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme người ta thường làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn lại với nhau Nồng độ muối để kết tủa enzyme thường rất rộng tùy loại enzyme và được xác định cụ thể trong phòng thí nghiệm

Enzyme sau khi kết tủa vẫn còn một lượng muối, do đó sau quá trình kết tủa cần phải có bước loại muối Có nhiều phương pháp để loại muối; trong đó thẩm tích thường được sử dụng Cơ sở của phương pháp này là phân tách các chất tan dựa trên kích thước của chúng khi cho khuếch tán qua một màng bán thấm Dung dịch cần phân tách được chứa trong một túi bán thấm và đặt trong một thể tích đệm lớn có lực ion thấp Các lỗ trên màng có kích thước nhỏ và chỉ có các phân tử nhỏ mới

khuếch tán được qua các lỗ này Sự khuếch tán xảy ra cho đến lúc nồng độ trong và ngoài màng bằng nhau

1.5.3.3 Siêu lọc

Siêu lọc là quá trình phân tách các thành phần trong dung dịch dựa trên kích thước các phân tử khi cho chúng chảy qua một màng lọc trong điều kiện có áp suất Động lực của quá trình này là sự chênh lệch áp suất hai bên màng Khi đó, các phân tử nhỏ hơn kích thước mao quản của màng sẽ đi qua màng, các phân tử lớn hơn được giữ lại Kích thước mao quản của màng siêu lọc được tính theo khối lượng phân tử của hợp chất được giữ lại (molecular weight cut off (MWCO)) Giá trị này được hiểu là có hơn 90% lượng cấu tử có khối lượng phân tử tương ứng được giữ lại trên màng Giá trị MWCO của màng siêu lọc nằm trong khoảng từ 1 – 1000 kDa Quá trình siêu lọc có thể được vận hành theo mô hình dead – end hoặc cross – flow

- Mô hình phân riêng dead-end: là mô hình trong đó dòng nhập liệu chảy vuông gốc với màng Dung môi và các phần tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ mao quản sẽ chảy qua màng bởi áp suất, các phần tử lớn hơn được giữ lại trên màng Theo thời gian, các phần tử này tích tụ trên màng làm tăng trở lực cho quá trình phân riêng, lưu lượng dòng qua màng giảm dần

- Mô hình phân riêng cross – flow: là mô hình mà trong đó dòng nhập liệu chảy song song với bề mặt màng lọc Dung môi và các phần tử có kích thước nhỏ hơn lỗ màng sẽ đi qua màng nhờ áp suất bơm và tạo thành dòng qua màng, các phần tử không qua màng sẽ chảy ra ngoài, đồng thời dòng này sẽ kéo theo các phần tử bám trên bề mặt màng nên mô hình này ít bị tắc nghẽn hơn mô hình dead-end

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân riêng bằng màng siêu lọc, chúng có thể được chia thành ba nhóm sau (Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự, 2011):

• Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu cần phân riêng

Nồng độ chất khô và thành phần hóa học của dung dịch phân riêng: Khi nồng độ chất khô trong dòng nhập liệu càng cao thì giá trị áp suất thẩm thấu của nguyên liêu càng lớn, do đó áp lực qua màng sẽ giảm Hơn nữa, nồng độ chất khô cao trong nguyên liệu còn dễ gây ra hiện tượng tập trung nồng độ trên bề mặt hoạt động của màng; làm tăng độ nhớt của nguyên liệu Các vấn đề trên đều làm giảm lưu lượng

dòng qua màng Ngoài ra, các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu cũng sẽ có sự tác động khác nhau đến quá trình phân riêng Chúng có thể tương tác với nhau, chẳng hạn sự tương tác giữa protein và chất béo, hay tương tác với vật liệu màng, chẳng hạn sự tương tác giữa các nhóm kỵ nước của protein với các nhóm kỵ nước của màng; những điều này cũng làm giảm lưu lượng dòng qua màng

pH mẫu nguyên liệu: Đối với quá trình phân riêng protein, pH của nguyên liệu ảnh hưởng đến sự tích điện và kết tụ của các phân tử Các nghiên cứu cho thấy, khi tiến hành phân riêng dung dịch protein ở xa điểm đẳng điện của protein thì thông lượng dòng qua màng cao, ít xảy ra nghẽn màng hơn so với các thí nghiệm dung dịch protein có pH gần giá trị pI

• Các yếu tố liên quan đến màng siêu lọc

Màng có thể làm từ những vật liệu khác nhau như cellulose acetate, polysulfone, polyamide có thể được chia làm 2 nhóm là kỵ nước và ưa nước Tùy thuộc vào đặc điểm của dung dịch cần phân riêng mà chọn vật liệu màng thích hợp Việc chọn màng không phù hợp có thể gây ra sự tương tác giữa các thành phần trong dung dịch cần phân riêng và màng gây tắc nghẽn Ngoài ra, bề mặt màng cũng ảnh hưởng đến quá trình phân riêng Những màng có bề mặt gồ ghề làm một số hợp chất trong dòng nhập liệu, chẳng hạn protein, dễ bị hấp phụ trên các bề mặt này, kéo theo thông lượng dòng qua màng giảm

Kích thước mao quản cũng ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình phân riêng Nếu màng có kích thước quá nhỏ so với các cấu tử trong dung dịch thì lưu lượng dòng qua màng sẽ thấp; ngược lại, chọn màng có kích thước lớn hơn các cấu tử trong dung dịch thì khả năng giữ lại các cấu tử trên màng thấp Tùy thuộc vào loại protein cần thu nhận mà lựa chọn kích thước mao quản cho phù hợp

• Các thông số kỹ thuật của quá trình phân riêng protein

Áp lực qua màng là động lực chính của quá trình phân riêng Áp lực tăng thì thông lượng dòng qua màng cũng tăng, nhưng tăng đến một giai đoạn nào đó thì gần như là không thay đổi do xảy ra hiện tượng tập trung nồng độ Thêm vào đó, sự tiếp xúc của các cấu tử protein với bề mặt màng còn bị ảnh hưởng bởi tốc độ khuấy

đảo Khi tốc độ khuấy đảo tăng dần thì hiện tượng tập trung nồng độ khó hình thành, nên thông lượng dòng qua màng tăng

1.5.3.4 Dùng nhiệt độ

Ngoài áp lực và tốc độ khuấy đảo, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến quá trình phân riêng Nhiệt độ tăng, độ nhớt dung dịch giảm, nên thông lượng dòng qua màng tăng Tuy nhiên, đối với việc phân riêng những thành phần mẫn cảm với nhiệt, như enzyme, thì việc lựa chọn nhiệt độ thích hợp cần phải được quan tâm vì có thể gây biến đổi tính chất của các thành phần này

Nguyên tắc là dựa trên sự khác nhau về khả năng chịu nhiệt của enzyme; do đó tùy nguồn thu nhận và tính chất từng loại enzyme mà có chế độ gia nhiệt thích hợp Tuy nhiên, phương pháp này thường khó áp dụng do enzyme rất nhạy với nhiệt độ

1.5.3.5 Kết tủa enzyme bằng polymer

Polyethylene glycol, polyethylene amine với khối lượng phân tử khác nhau thường được sử dụng để kết tủa protein Cơ chế kết tủa protein bởi polymer giống như cơ chế tạo kết tủa bởi các dung môi hữu cơ Ưu điểm của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ bình thường, lượng polymer sử dụng không nhiều, thông thường từ 15-20% Nếu sử dụng ở nồng độ cao sẽ làm tăng độ nhớt, gây khó khăn cho kỹ thuật làm sạch sau này

1.5.3.6 Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện

Protein có tính chất lưỡng cực, có cả nhóm acid và base Mức độ hòa tan của chúng phụ thuộc và pH, ở điểm đẳng điện mức độ này là tối thiểu Tuy nhiên, thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme nên phương pháp này thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, ít thực hiện ở quy mô công nghiệp

1.5.4 Tinh sạch enzyme

Để tiến hành tinh sạch enzyme người ta thường dùng nhiều phương pháp khác nhau Tùy thuộc vào nguồn cho enzyme, loại enzyme mà sử dụng phương pháp này hoặc khác Một số phương pháp thường được sử dụng để tinh sạch enzyme là sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel, sắc kí ái lực, điện di chế phẩm…

1.6 Ứng dụng của enzyme chitinase 1.6.1 Trong nông nghiệp

Chitinase kiểm soát sinh học các loài nấm, côn trùng bao gồm nhiều loại sâu bệnh gây hại Người ta có thể sử dụng chitinase như một tác nhân điều chỉnh sinh học an toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu hóa học bằng cách cho enzyme tiếp xúc với nấm hay côn trùng hoặc dùng dưới dạng xịt hay thuốc bột Ngoài ra, chitinase có thể ứng dụng trong nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học Các enzyme lột xác côn trùng như chitinase có vai trò quan trọng đến sự phát triển của chúng, nó có vai trò trong sự phát sinh hình thái và phân chia tế bào nấm Các pseudotrisaccharide, allosamidi, là một chất ức chế mạnh của chitinases, nó ức chế

sự phát triển của ve bét, Tetranychus urticae và ấu trùng của ruồi, M Domestica sau

khi vào bụng Do đó, các chất ức chế chitinase có thể được ứng dụng như thuốc trừ sâu sinh học tiềm năng (Patil và cộng sự, 2000)

1.6.2 Trong y học

Chitinase được ứng dụng để phân giải, tạo ra glucosamine, N-acetyl glucosamine và các chitooligosaccharide Glucosamine và N-acetyl glucosamine có khả năng chống viêm, điều trị các chứng viêm khớp, hữu ích để điều trị viêm loét đại tràng và rối loạn viêm nhiễm đường tiêu hóa khác Các chitooligosaccharide được ứng dụng như tác nhân kháng khuẩn, làm tăng miễn dịch (Wen et al, 2002) Các chitohexaose và chitoheptaose có khả năng chống khối u Chitinase từ vi khuẩn

Vibrio alginolyticus được sử dụng để tạo chitopentaose và chitotriose từ chitin dạng

huyền phù N,N’- Diacetylchitobiose đã được sử dụng rộng rãi như một nguyên liệu

ban đầu để tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học Chitinase từ Bacillus cũng

được dùng để tổng hợp chitobiose bằng cách kết hợp GlcNAc và một dẫn xuất đường oxazoline

Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng chitinase trong việc chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra, họ đề xuất phương pháp dùng

chitinase được phân lập từ Vibrio parahemolyticus, enzyme này kết hợp với chitin

và có thể sử dụng như mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện

một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh (Nguyễn Quang Nhân, 2009)

1.6.3 Kiểm soát muỗi

Myrothecium verrucaria, một loại nấm hoại sinh, có khả năng tạo ra phức

hợp enzyme có thể làm hư hại biểu bì của côn trùng Ấu trùng ở giai đoạn I và IV

của muỗi Aedes aegypti, có thể bị giết chết trong vòng 48 giờ dưới sự tác động của enzyme thô từ M verrucaria Với endochitinase đã tinh sạch, thời gian gây chết

(LT50) tương ứng là 48 giờ và 120 giờ cho giai đoạn ấu trùng I và IV; tuy nhiên, thời gian gây chết có thể giảm xuống tương ứng với 24 giờ và 48 giờ khi chitinase tinh sạch được bổ sung với hoạt tính lipolytic (Patil và cộng sự, 2000)

1.6.4 Sản xuất protein đơn bào

Để tận dụng chất thải từ các nguồn nguyên liệu chứa chitin, chitinase từ

Saccharomyes marcescens đã được sử dụng để thủy phân nguồn nguyên liệu chitin

và nấm men Pichia kudriavzevii để sản xuất protein đơn bào Những nấm thường được sử dụng để sản xuất protein đơn bào là Hansenula polymorpha, M verrucaria,

Candida tropicalis, P kudriavzevii , S cerevisiae , v.v (Revah - Moiseev và

Carrod 1981; Vyas, 1991)

1.6.5 Các ứng dụng khác

Thể nguyên sinh của nấm có vai trò quan trọng trong nghiên cứu về nấm cũng như trong việc cải thiện chủng cho các ứng dụng công nghệ sinh học Một trong các thành phần chính của phức hợp enzyme phân giải thành tế bào nấm là chitinase/chitosanase Phức hợp gồm nhiều chế phẩm enzyme phá hủy màng tế bào nấm khác nhau đơn lẻ hoặc kết hợp để tách thể nguyên sinh (Kelkar và cộng sự, 1999)

Các enzyme như tannase được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để loại bỏ tannin không mong muốn và cho sản xuất axit galic Các enzyme sản xuất

bởi Aspergillus niger, được gắn kết mạnh bởi các sợi nấm và sự phóng thích của nó

bởi giải phóng vật lí và hóa học thì không hiệu quả Enzyme thủy phân thành tế bào sử dụng chế phẩm chitinase cho thấy có hiệu quả trong việc thu hồi enzyme tannase (Barthomeuf và cộng sự, 1994)

1.7 Các nghiên cứu về enzyme chitinase trên thực vật 1.7.1 Các nghiên cứu trên hạt đậu nành

- Nghiên cứu của Gijzen và cộng sự (2001) trên đậu nành cho thấy có sự hiện diện của enzyme chitinase nhóm I có trọng lượng phân tử 32 kDa trong vỏ hạt, trong phân tử có 320 amino acid (hình 1.8); bao gồm 1 peptide nhận biết N-terminal (màu xanh lá), domain gắn kết chitin (màu cam), proline hinge (màu xanh da trời) và domain xúc tác (màu đen) Hai gốc Glu chuyên biệt định vị tại trung tâm hoạt động và tham gia xúc tác được thể hiện trong màu đỏ

Hình 1.9: Trình tự axit amin của protein chitinase

Chitinase xuất hiện trễ trong sự phát triển của hạt ở giai đoạn trưởng thành và chín, đặc biệt cao ở vỏ hạt Ở các bộ phận khác như rễ , lá , và phôi, và trong mô nhiễm bệnh cũng có sự hiện diện của chitinase Nghiên cứu này cho thấy sự khác biệt trong thành phần protein của các mô hạt khác nhau và chứng minh rằng các protein liên quan đến phản ứng phòng vệ chủ yếu trong vỏ hạt

- Nghiên cứu khác của Yeboah và cộng sự (1998) trên hạt đậu nành khô trưởng thành cũng cho thấy có sự hiện diện của chitinase nhóm III có trọng lượng phân từ 28kDa Enzyme tinh sạch thu được có điểm đẳng điện pI 5.7; hoạt tính riêng 133 U/mg protein ở pH 5.2

1.7.2 Các nghiên cứu trên một số thực vật khác

- Nghiên cứu của Hou và cộng sự (1998) trên khoai lang cho thấy có sự hiện diện của enzyme chitinase ở các bộ phận khác nhau Trong đó, hoạt tính thể hiện cao nhất ở lá, kế đến là chồi, vỏ rễ và rễ đã được bóc vỏ Nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính của enzyme chitinase ở lá cao hơn ở thân dây khoai lang; lá bị côn trùng