Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu thu nhận Enzyme Invertase từ bã nấm men bia bằng phương pháp siêu âm

TÊN DE TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHAN ENZYME INVERTASE TU BANAM MEN BIA BANG PHUONG PHAP SIEU AM NHIEM VU VA NOI DUNG: - Khao sát đơn lẻ các yếu tố ảnh hưởng đến việc thu nhận enzyme invertase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

›`œ8

ĐÀO AN QUANG

NGHIÊN CỨU THU NHAN ENZYME INVERTASE TỪ BA

NAM MEN BIA BANG PHUONG PHAP SIEU AM

Chuyén nganh: CONG NGHE THUC PHAM & DO UONGMã số: 60 54 02

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bach Khoa - ĐHỌG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học:

TS TRẢN BÍCH LAMCán bộ cham nhận xét 1:

PGS.TS LE VAN VIỆT MANCán bộ cham nhận xét 2:

2 PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

3 PGS.TS Lê Phi Nga

4.TS Trần Bích Lam5.TS Trần Thị Ngọc YênXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành.

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRUONG KHOA KY THUAT HOA HỌC

TS PHAN THE DONG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: ĐÀO AN QUANG MSHV: 11110213

Ngày, tháng, năm sinh: 09-04-1985 Nơi sinh: Thái Nguyên

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm & Đồ Uống Mã số: 60 54 02I TÊN DE TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHAN ENZYME INVERTASE TU BANAM MEN BIA BANG PHUONG PHAP SIEU AM

NHIEM VU VA NOI DUNG:

- Khao sát đơn lẻ các yếu tố ảnh hưởng đến việc thu nhận enzyme invertasethô trong bã nắm men bia bằng phương pháp siêu âm

- Tiến hành tối ưu hóa việc thu nhận enzyme Invertase thô trong bã nắm menbia bằng phương pháp siêu âm

- Khảo sát các đặc tinh của chế phẩm enzyme thôIl NGÀY GIAO NHIỆM VU: thang 06/2013Ill NGAY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: thang 11/2013IV CAN BO HUONG DAN: TS TRAN BICH LAM

Tp HCM, ngày thang năm 2013

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

Trần Bích Lam Lê Văn Việt Mẫn

TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HỌC

LỜI CÁM ƠN

Qua thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ, tôi đã được sự giúp đỡ nhiệt tình của

Quý thay cô, Quý công ty, các bạn đồng nghiệp và các bạn sinh viên

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM đã tạo điều kiện

cho tôi được thực hiện và hoàn thành luận văn này.

- TS Trần Bich Lam đã tận tinh hướng dẫn và động viên tôi vượt qua mọikhó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận văn

- Truong Dai học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM đã tạo điều kiện cho tôi

trong thời gian thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin chân thành gửi lời cám ơn đến các Thầy Cô trong Bộ Môn CôngNghệ Thực Pham & D6 Uống đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt những năm

Học viên thực hiện

Đào An Quang

TÓM TẮTLuận văn “Nghiên cứu thu nhận enzyme invertase từ bã nam men bia bằngphương pháp siêu âm” này thực hiện trên đối tượng là bã nam men bia(S.carlsbergensis) Luận văn đã khảo sát được các yếu tố đơn lẻ ảnh hưởng đếnviệc ứng dụng sóng siêu âm dé thu nhận enzyme invertase thô từ bã nam men bia ởquy mô phòng thí nghiệm Tối ưu hóa việc thu nhận enzyme thô cụ thé cho thayhiệu quả thu nhận đạt cao nhất tại tỷ lệ nắm men 42%, công suất siêu âm 250W,thời gian siêu âm 8 phút với hoạt tính invertase đạt cao nhất là 20,54 [U/mg protein.

ABSTRACTThis thesis “Extraction of invertase from beer yeast residue by sonificationmethod" was focused on effect of ultrasond during invertase extraction from beeryeast residue (S.carlsbergensis), investigation of individual factors affecting on theapplication of ultrasound to obtain the enzyme and optimization of the extractiveconditions The results showed that the highest invertase activity of 20,54 [U/mgprotein was obtained at yeast concentration in suspension of 42% (w/w), ultrasoundtreatment time 8 min, and acoustic power 250W.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các sô liệu vàkêt quả nghiên cứu trong luận van này là trung thực và chưa có ai công bô trong batky công trình nào khác Moi trích dân trong luận van đêu đã được chỉ rõ nguồn gôc.

Tác giả

Đào An Quang

DANH MỤC BÁNGBang 2.1: Ung dung cua sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm -5- 15

Bang 3.1: Các nghiệm thức Của thi HgHiỆM Ì Ăn re 27Bang 3.2: Các nghiệm thức Của thi HgHiỆM 2 ccc SG v vvvvvvvree 27Bang 3.3: Các nghiệm thức Của thi nghi€m - cS SG re 28Bang 3.4: Các nghiệm thức Của thi HgHiỆM Ì cv ree 30Bang 3.5: Các nghiệm thức Của thi nghi€m 2 cS SG re 30

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của tỉ lệ nắm men/dung môi (%) đến hoạt tính riêng invertase 36Bang 4.2: Anh hưởng cua thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tinh invertase 38Bang 4.3: Anh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tinh invertase - 40Bang 4.4: Các mức của yếu tô trong thí nghiệm tối tu HÓA 55552555s+scecesscsd 4l

Bang 4.5: Ma trận thực nghiỆHH cọ và 42

Bang 4.6 : Kết quả tính todn và kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi qui 44Bang 4.7 : Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hôi qui 45Bang 4.8: Mức yêu tô thí nghiệm xác minh điểm tối Wu - 525555 s+c+csccscsccee 50Bang 4.9 : Anh hưởng nhiệt độ lên hoạt tinh chế phẩm enzyme th6 occcccceceseseeveveveveee 52Bang 4.10 : Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm enzyme thô - 2-5555: 53Bảng 4.11 : Tinh chất enzyme thô trước khi KE tI cecccececceesescssesesssessesesesessesssessesesseees 55Bảng 4.12 : Tinh chất enzyme thô sau khi ket td cececcsccscscscssessssessssssesessssessssesesssseseeseees 55Bang 4.13 : Tính chất enzyme thô sau khi sấy thăng NOG seecccccscecsscecscssessssesssssssssssseseees 55

DANH MỤC HÌNHHình 2.1: Thủy phân đường sucrose bằng enzyMe ÏIV€FÍ@S€ 5c CS EEEEcekererkrkrret 7

Hinh 2.2: SACCHALOMYCES COVEVISIAE 0000070 il

Hình 2.3: Các vùng tan số sóng âm và lĩnh vực ứng CUing.scceccccccscssssessscsvssssessesscsvsvesensasevevsvevens 13Hình 3.1: Quy trình thu nhận enzyme invertase từ bã nắm men Ùỉa s5 cececxsxecsree 23Hình 4.1: Anh hưởng của tỉ lệ nắm men/dung môi (% w/w) đến hoạt tinh invertase 35Hình 4.2: Anh hưởng của thời gian xử lý siéu âm đến hoạt tinh inverf4se -cscscecea 37Hình 4.3: Anh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tinh irVer†dS€ 5c cccecxceveevsree 39Hình 4.4 : Bê mặt dap ứng va biéu đồ đường động mức thé hiện ảnh hưởng của các yếu tô thi

nghiém én hoat tinh EnZyMe INVertAaseTEEN .addỤ 48

Hình 4.5A: Kết quả thi nghiệm xác minh anh hưởng của yếu to thời gian lên hoạt tinh riêng (p

CHUONG I:

MO DAU

Invertase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phan saccharose thành glucose và

fructose, còn gọi là đường nghịch đảo Đường nghịch đảo có nhiễu ưu điểm hơn đườngsucrose và được sử dụng rất phố biến trong sản xuất bánh kẹo và công nghiệp nước giải

khát.

Hiện nay ở Việt Nam chưa sản xuất được enzyme invertase ở quy mô côngnghiệp Do đó, enzyme này chủ yếu được nhập từ nước ngoài về dé sử dụng thủy phânđường sucrose trong sản xuất các loại bánh kẹo và nước giải khát Hệ quả là làm tăngchỉ phí cho sản xuất

Bên cạnh đó ngành công nghiệp bia ở nước ta hăng năm thải ra một lượng rất lớnbã nam men bia Trung bình sản xuất 100 lít bia sẽ thu được 2 lít bã nắm men bia vớiđộ âm là 88% (Halász A., 1991) Theo thống kê hiện nay cả nước có khoảng trên 320nhà máy bia và các cơ sở sản xuất bia với tong nang luc san xuất dat trên 800 triệulí/năm Ba nắm men bia chủ yếu được thải trực tiếp ra môi trường dưới hình thức là cóhoặc không qua quá trình xử lý làm tăng nguy cơ gây ô nhiễm Trong khi đó, trong tếbào nắm men có chứa enzyme invertase có thé thu nhận được

Việc thu nhận invertase từ bã nam men bia góp phan tái sử dụng nguồn phế phẩmngành bia đem lại hiệu quả kinh tế, giảm thiểu nguy cơ gây ô nhiễm môi trường đồngthời góp phần xây dựng quy trình sản xuất invertase trong nước Một số nghiên cứutrong nước trước đây đã quan tâm đến vẫn đề này: Trần Bích Lam và Nguyễn TuyếtMai (2004) Trần Thị Mai Anh (2005) Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thâm Minh Hoàng,Nguyễn Ngọc Tuyết Sương (2006) tập trung nghiên cứu quá trình tự phân và tinh sạchinvertase từ bã nam men bia

Ở nước ngoài, Marques và cộng sự, 2006 đã ứng dung xử lý siêu âm trong thunhận protein nội bào của nắm men bia ở tần số 20kHz và công suất 200W Kết quảnghiên cứu của Vargas và cộng sự (2003) cũng cho thay hiệu qua thu nhận invertase từAspergillus niger đạt tốt ở tan số 20kHz, biên độ siêu âm 40% và thời gian 5 phút.Những nghiên cứu nay đã rút ngắn được đáng kể thời gian và tăng hiệu suất

Chính vì các lý do trên, chúng tôi dé xuất dé tài “Nghiên cứu thu nhận enzymeinvertase từ bã nam men bia bang phương pháp siêu âm” dé góp phần nghiên cứu

phương pháp và tìm ra các điều kiện tôi ưu nhăm thu nhận chê phâm enzyme invertasethô từ bã nim men bia.

CHƯƠNG 2:

TÔNG QUAN

TÀI LIÊU

2.1 Enzyme invertase

a) Tong quan:Invertase được Bertholot tách chiết từ tế bào lần đầu tiên vào năm 1860 Có thénói Invertase đã đóng một vai trò khá quan trọng đối với ngành công nghệ enzym hiệnđại Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu vẻ tính chất của Invertase cũng như nghiêncứu về khả năng tách chiết và thu nhận chúng nhưng cho đến ngày nay người ta vẫnchưa thu được chế phẩm enzym hoàn toàn tỉnh khiết Nguyên nhân chính là do enzymnay ton tại trong tự nhiên ở dạng phức hop glycoprotein

Invertase, còn được gọi là Invertin, Sucrase hay Saccharase, là enzym xúc táccho phản ứng thủy phân đường saccharose thành đường glucose và đường fructose.

Hình 2.1: Thủy phân đường sucrose bang enzyme invertaseSản phẩm hình thành sau quá trình thủy phân được gọi là đường nghịch dao Sởdĩ nó mang tên này vì dung dịch sacchrose ban đầu có góc quay cực [ơ]p là +66,5°nhưng sau khi thủy phân hỗn hợp monosaccharide có độ quay cực bang -20° (+52,5°đối với D(+)-glucose và -92,4 đối với D(-)-fructose) Nghĩa là có sự thay đối góc quay

cực từ phải sang trái.

Invertase còn có tên gọi khác là B-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26), nó xúc tác

cho phản ứng thủy phân đường saccharose từ đầu tận cùng không khử fructofuranoside Do đó enzym này còn có thé thủy phân được những oligosaccharidecó nhóm fructose ở cuối mạch như raffinose, stachyose, verbacose, Ngoài Invertase,enzym a-D-glucosidase cũng có thé xúc tác cho phan ứng thủy phân đường saccharose

ÿ-từ đầu tận cùng glucose Saccharose cũng có thé bị thủy phân trong môi trường acid mà

không cân sự xúc tac của Invertase.

b) Đặc tính của Invertase trong tế bào nam men:Nhiều loài vi sinh vật có thể sinh tổng hợp được Invertase và sử dụng đườngsaccharose như một nguồn dinh dưỡng, đặc biệt là nắm men Hiện nay, Invertasethương phẩm được sản xuất chủ yếu từ 2 loài nắm men Saccharomyces cerevisiae hoặc

Saccharomyces carlsbergensis.

Invertase tôn tại trong nam men ở dạng phức hop mannan — protein Người tanhận thấy nếu tách mannan ra khỏi enzym thì hoạt tính của enzym nhanh chóng bị giảmđi Invertase thuộc nhóm enzym thủy phân, nó không cần coenzym cho hoạt động xúctác của mình Trong cùng một loại nắm men, Invertase có thé tồn tại ở nhiều dạng,Invertase nội bao có khối lượng phân tử khoảng 135000 Daltons, trong khi đó Invertasengoại bảo có khối lượng phân tử khoảng 270000 Daltons

Không giống như một số enzym khác, Invertase có khả năng hoạt động trongmột khoảng pH tương đối rộng từ 3,5 — 5,5 với pH tối thích là 4.5; nhiệt độ tối ưukhoảng 55°C Invertase bat đầu bị vô hoạt ở nhiệt độ 65°C và hoàn toàn bi vô hoạt ở80°C Trong điều kiện bảo quan ở nhiệt độ lạnh từ 2°C — 8°C, enzym vẫn giữ được hoạt

Ví dụ khác, ion Ag* có thé tan công vào nhóm Histidine của mạch bên trong

phân tử Invertase làm cho nó bị vô hoạt.

Ngoài ra, nồng độ cơ chất cao, >20% (w/v), cũng có tác động kìm hãm enzym

Ngoài tác dụng xúc tác phản ứng thủy phân, Invertase còn có khả năng xúc tác

phản ứng chuyển vị Tuy nhiên tác dung phan ứng xúc tác nay rất yếu, chỉ thé hiện rõkhi nồng độ cơ chất tương đối cao

c) Các nguồn thu nhận Invertase:

Mặc dù vậy các sản phẩm Invertase thương phẩm hiện nay đều được sản xuất từ

nguôn nam men là Sacchromyces cerevisiae và Saccharomyces carlsbergensis.

Đề thu nhận enzyme nội bao người ta phải phá vỡ tế bao bang nhiéu phương pháp,

các phương pháp thường được sử dụng như:

— Phương pháp co học: nghiên bi, nghiền có chat trợ nghiền như bột thủy tinh,cát thạch anh, đồng hóa băng thiết bị đồng hóa

— Phương pháp vat lý: như sử dụng sóng siêu âm.— Phương pháp cơ học: như dùng các loại dung môi, bytylic, acetone

d) Các nghiên cứu về thu nhận enzyme Invertase

Trần Bích Lam và Nguyễn Tuyết Mai (2004) “Nghiên cứu thu nhận Invertase từnam men bia Saccharomyces carisbergensis ” thực hiện việc phá vỡ tế bào nam men biabang phương pháp tự phân trong dung dịch đệm acetate, có b6 sung dung môi Toluene,các tác giả nhận thấy ở điều kiện nhiệt độ phòng, huyền phù nắm men 10% (w/v) trongdung dịch đệm acetate pH 6,5; Toluene bổ sung với tý lệ 10% thể tích huyền phù tựphân trong thời gian khoảng 75 giờ thì cho dịch trích ly có hoạt tính Invertase cao nhất.Tinh sạch sơ bộ Invertase có trong dịch chiết băng cồn 96 độ với tỷ lệ 1:1 (v/v) Chếphẩm thu được hoạt động tôi ưu ở 55°C trong môi trường pHó và có hang số Michaelis-Menten Km băng 7,31.107 mol/I Nhiệt độ thích hợp khi ứng dụng Invertase trong sanxuất là 50°C Hoạt tinh của phế phẩm bảo quản ở 0-2°C sau 3 tuần không suy giảm

Tran Thị Mai Anh (2005) đã tiếp tục nghiên cứu thu nhận chế phẩm Invertase từnắm men bia Saccharomices carlsbergensis và thu được một số kết quả như sau:

Quá trình tự phân nam men bia phụ thuộc vảo trạng thái sống của tế bao Ở tế bàocòn sống pH ban đầu của quá trình tự phân là 6,5 với hệ đệm su dụng là đệm Acetat,nhiệt độ tự phân là 30°C, tỉ lệ nam men/dung dịch đệm: 1/10 (w/v), ti lệ Toluen/nam

men: 1/1 (v/w), thời gian tu phân: 75 gio.

Đối với bã nam men chết thi ti lệ Toluen/nam men giảm: 0,6/1 (v/w) và thời giantự phân cũng giảm: 50 giờ Chọn dung môi kết tủa thu nhận enzym là Ethanol với tỉ lệdung môi/enzym là 1/1 (v/v) Chế phẩm Invertase sau khi kết tủa bang ethanol có nhiệtđộ tối ưu là 45°C và pH tối ưu là 6,0 Tinh sạch Invertase băng phương pháp lọc gelSephadex G-100, thu được phân đoạn có độ tinh sạch cao gấp 32,61 lần so với chếphẩm thô Khi nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Invertase cho thấy có thé b6 sung chếphẩm Invertase với tỉ lệ 0,02% để chống hiện tượng tái kết tỉnh cho dung dịch đườngsaccharose 75%, có thể dùng chế phẩm Invertase để xác định hàm lượng đườngsaccharose trong nguyên liệu thực phẩm

Lê Văn Việt Man (2006) đã tiễn hành nghiên cứu “ Quá trình tự phân bã nammen bia dé thu nhận chế phẩm invertase” Trong nghiên cứu này tác giả và các cộng sự

đã khảo sat quá trình tự phân của ndm men bia Saccharomyces cerevisiae dé thu nhận

chế phẩm invertase và thu được những kết quả sau: tỉ lệ giữa nắm men/ dung môi (dungdịch đệm acetate): 1/6, nhiệt độ tự phân: 50°C, pH ban đầu là 5,5 và thời gian tự phân:

50 giờ.

2.2 Nắm men biaNắm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, ngành Ascomycota vàthuộc giới nam Saccharomyces carlbergensis có hình cầu hay hình trứng, có kíchthước nhỏ, từ 5-14 mircomet, sinh sản bang cách tạo chéi hay bao tử

Hình 2.2: Saccharomyces carlsbergensis(N guon: WWw.diwinetaste.com)

+ Cấu tạo:

Nam men Saccharomyces carlsbergensis gồm những thành phan chủ yếu sau:_ Thành tế bào: được cấu tạo bởi 2 lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chat glucan vàmannan, phan còn lại là protein, lipid và glucozamin Trên thành tế bào có nhiều lỗ,qua đó các chất dinh dưỡng được hấp thu và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất

được thải ra.

_ Màng tế bào chat: nam sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu là lipoprotein, giữ vai tròđiều hòa vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào

_ Tế bào chất gồm có mạng lưới nội chat là vị trí của nhiễu hệ thông enzyme khácnhau, đảm bảo sự vận chuyển vật chất cho tế bào và các cau tử khác nhau như bộ máyGolgi, lysosom, không bao, chứa các sản phẩm bi phân cắt, hay chất độc lạ có thé có

hại cho tế bảo Trong tế bào chất có nhân chứa thông tin dị truyền cho tế bào và cácthành phần liên quan trong quá trình sinh tổng hợp và sinh sản của tế bảo Năng lượngcung cấp cho tế bảo qua những phản ứng xảy ra trong ty thể cũng nằm trong tế bàochất Ngoài ra còn có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào (Trần

Liên Hà, 2007).

+ Thanh phan hóa học:

Thanh phan hoá học của tế bào nắm men Saccharomyces carlsbergensis khácnhau tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cay, thành phan các chất dinh dưỡngtrong môi trường nuôi cay và tình trạng sinh lý của tế bảo

— Nắm men ép có chứa 70-75% nước, 25-75% còn lại là chất khô.— Nước: bao gồm phan nước năm bên ngoài tế bào là là phần nước nam trong

khoảng trong giữa tế bào và nước nằm bên trong tế bào (nội bào) là phần nướcnăm bên trong tế bào chất của tế bảo

— Thành phan chất khô của tế bảo nắm men bao gém protein và các chất có Nitơkhác chiếm 50%, chất béo 1,6%, hydrat cacbon 33,2%, mô tế bao 7,6%, tro7,6% Thanh phan của những chất nay không cố định, nó có thé thay đổi trong

quá trình nuôi cay cũng như quá trình lên men.

2.3 Tổng quát về sóng siêu âm

Mặc dù xuất hiện từ rất sớm nhưng cho đến ngày nay kỹ thuật siêu âm vẫn théhiện là kỹ thuật mang tính nối trội và nhiều triển vọng cho ngành công nghiệp chế biếnthực phẩm Tiềm năng ứng dụng của kỹ thuật này trong việc tạo ra các tác động cơ học,hóa học và hóa sinh đến sự biến đối của thành phan và tính chất nguyên — vật liệu thựcphẩm vẫn dang thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu về lĩnh vực chế biến thực phẩm nhằmtìm ra các giải pháp mới để thay thế hoặc hỗ trợ các kỹ thuật truyền thong nhu ky thuatdùng nhiệt, dùng hoá chat trực tiếp xử lý thực phẩm vốn được xem là những kỹ thuậtchưa hoàn thiện Điều này có nghĩa là, việc áp dụng các kỹ thuật truyền thống vẫn chưathực sự mang lại hiệu quả cao về kinh tế, chất lượng cảm quan cũng như tính an toàn và

thân thiện với con người khi sử dụng (Mason và cộng sự, 2005).

2.3.1 Định nghĩa

Siêu âm (ultrasound) là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động củacác phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của conngười (16-20kHz) Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc (longitudinal wave)hay sóng nén (compression wave), nghĩa là trong trường siêu âm các phan tử dao độngtheo phương cùng với phương truyền của sóng

2.3.2 Các đại lượng đặc trưng của sóng siêu âm

— Tần số (Frequency, Hz): là số dao động phan tử hay thực hiện được trong 1 giây,

(Hz).

— Biên độ (Amplitude): biểu thi mức độ thay đổi áp suất (so với áp suất cân bang

của môi trường) trong quá trình dao động.

— Cường độ (Intensity, W/m?): là năng lượng mà sóng siêu âm truyền trong mộtđơn vi thời gian qua một đơn vi diện tích đặt vuông góc với phương truyền âm.Công thức tính I = P/S; trong đó P là công suất của nguồn âm (W), S là diện tíchmiễn truyền âm (m?)

— Mức cường độ âm (Sound pressure level, B): là đại lượng được tính bởi công

thức: L = Ig(/I.) Trong đó I là cường độ âm tại điểm cần tinh, I là cường độ âmchuẩn (âm ứng với tan số f = 1000 Hz) có giá trị là: 1012 W/m?

2.3.3 Các hiệu ứng của tác động siêu âm lên hệ chat longHiện tượng sủi bóng (cavitation): Sóng siêu âm được tạo ra băng các dao độngco học ở tần số cao hơn 15kHz Khi truyền trong môi trường lỏng, các phan tử trongtrường siêu âm trải qua các chu trình nén (compression) và duỗi (rarefaction) và nhữngdao động này sẽ lan truyền cho các phan tử kế cận Khi năng lượng đủ lớn, tại chu trình

duôi, tương tác giữa các phân tử sẽ vượt quá lực hâp dân nội tại và các lô hông nhỏ

trong lòng chất lỏng được hình thành Hiện tượng trên còn được gọi là hiện tượng sủibóng Những bóng sti này sẽ lớn dan lên bởi quá trình khuếch tán một lượng nhỏ cáccầu tử khí (hoặc hoi) từ pha lỏng trong suốt pha dãn nở và không được hấp thụ hoàn

toàn trở lại trong quá trình nén.

Hiện tượng vỡ bong bóng: Khi chúng đạt đến một thể tích mà chúng không còncó thể hấp thu được năng lượng, chúng vỡ ra một cách đột ngột và nhanh chóng Trongsuốt quá trình vỡ, nhiệt độ và áp suất sẽ tăng lên rất cao (khoảng 5500°C và khoảng50MPa) Thể tích chất lỏng bi gia nhiệt là rất nhỏ và nhiệt nhanh chong bị tiêu tan, mặcdù nhiệt độ tại vùng này thì rất cao trong vài us Mặt khác, nhiệt độ và áp suất cao tạora khi nỗ bong bóng sẽ dẫn tới sự tạo thành các gốc tự do như là H va OH

2.3.4 Phạm vi áp dụng

Siêu âm là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trongngành công nghệ thực phẩm Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thườngđược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Có 2 lĩnh vực được ứng dụng chính trongcông nghiệp thực phẩm:

— Tần số cao và năng lượng thấp: siêu âm chuẩn đoán, trong khoảng tần số MHz.Phần này được sử dụng như một kỹ thuật phân tích đảm bảo chất lượng, qui trìnhđiều khiến và kiểm tra không làm phá huỷ cấu trúc, điều này được ứng dụngtrong xác định tính chất thực phẩm, đo tốc độ dòng chảy, kiểm tra bao gói thựcphẩm (Floros va Liang, 1994; McClements, 1995; Mason, Paniwnyk và

Lorimer, 1996; Mason1998).

— Tần số thấp và siêu âm năng lượng cao: Phần nay được ứng dụng rộng rãi nhưmột quy trình hỗ trợ trong hàng loạt các lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí, tríchly, lọc, đồng hoá, làm mềm thịt, quá trình oxi hoá, quá trình tiệt trùng (Floros

và Liang, 1994; Gennano va cộng sự, 1999; Mason, 1998; Mason va cộng sự,1996; McClements, 1995).

2.3.5 Một số ứng dụng chính của sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm

Bang 2.1: Ung dụng của sóng siéu âm trong công nghệ thực phẩmỨng dụng các hiệu ứng cơ học Ung dụng hiệu ứng hóa học và hóa sinh— Quá trình kết tinh chat béo, đường ;

— Diệt khuan.— Bài khí.

— Xử lý dòng chảy (nước thai).— Phá bọt.

, — Điều chỉnh sự sinh trưởng của tê— Trích ly các chat thom „

„ , bao song.— Hồ trợ lọc va say tách âm đông ¬¬

„ ` — Biên đôi hoạt tính enzyme.— Khuây trộn và dong hóa „

„ — Tiệt trùng thiệt bi trong công— Kêt tụ các hạt bụi lơ lửng.

Ộ nghiệp.— Làm mêm thịt.

* Vô hoại vi sinh vat:

Công nghiệp chế biến thực phẩm thường tập trung chủ yếu vào quá trình vô hoạt(inactivation) hoặc tiêu diệt các vi sinh vật và enzyme nhăm mục đích kéo dai thời gianbảo quản sản phẩm Rất nhiều phương pháp vật lý được áp dụng vào mục đích này,trong đó phương pháp dùng nhiệt độ cao là phố biến và hiệu quả tiêu diệt vi sinh vậtcao nhất Thế nhưng việc sử dụng nhiệt độ cao có thé gay ra mot số bién đổi bat lợi đốivới sản phẩm như làm thất thoát một số chất dinh dưỡng và làm giảm các tính chất cảmquan của thực phẩm Do đó, yêu câu đặt ra cho các nhà nghiên cứu kỹ thuật thực phẩmlà tìm ra các giải pháp mới, các phương pháp vật lý khác dé thay thế hoặc hỗ trợ mộtphân phương pháp nhiệt trong quá trình thanh trùng và tiệt trùng sản phẩm

Kỹ thuật siêu âm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm đã biết từ rất sớm nhưngcho đến 10 năm trở lại đây thì mới có những tiễn bộ vượt trội (Mason và cộng sự,2003) Những thử nghiệm ban đầu của sóng siêu âm được báo cáo bởi 2 nhà khoa họcHarvey và Loomis (1920) Việc áp dụng quá trình siêu âm ở tần số cao (375 kHz) trongđiều kiện kiểm soát nhiệt độ (19°C) có thể ngăn ngừa sự tái hoạt của các tế bào vikhuẩn Bacillus fisheri và các tế bào đều bị chết khi quan sát dưới kính hién vi Các tácgiả cho răng quá trình sủi bóng khí đã gây ra sự phá vỡ tế bảo vi khuẩn Một số tác giảkhác (Lepeschkin và Goldman, 1952; Kinsloe, 1954) đã chỉ ra rang quá trình vô hoạt tế

bào vi sinh vật có thể thực hiện được theo cơ chế khác mà không cần hiện tượng suibóng khí Sau đó, rất nhiều nghiên cứu đã cho thay quá trình ức chế vi sinh vật phụthuộc rất nhiều vào đặc điểm hình thái, kích thước và trạng thái sinh lý của tế bảo visinh vật: ngoại trừ một vài ngoại lệ, các tế bào lớn sẽ nhạy cảm hơn các tế bao nhỏ; tébào dạng hình cầu sẽ chịu đựng tốt hơn tế bào hình que; vi khuẩn Gram duong chéngchịu tốt hon vi khuan Gram âm; các loài hiểu khí cũng dé kháng siêu âm tốt hon cácloài ky khí; các tế bảo trẻ nhạy cảm hơn tế bào già và bao tử chống chịu tốt hơn tế bao

sinh dưỡng Tuy nhiên, việc so sánh mức độ nhạy cảm giữa các loài vi sinh vật thậm

chí giữa các chủng trong cùng một loài lại gặp nhiều khó khăn do sự khác nhau về thiếtbị sử dung, điều kiện tiến hành và đặc biệt là sự kiểm soát nhiệt độ trong quá trình xử

lý.

Những báo cáo đầu tiên từ năm 1987 về quá trình kết hợp siêu âm với nhiệttrong quá trình vô hoạt vi sinh vật bởi tác giả Odonez và cộng sự (1987) cho thấy sự

giảm tác dụng của quá trình xử lý khi sử dụng sóng siêu âm tại nhiệt độ cao Năm 1989,

Burgos đã giải thích được nguyên nhân của kết quả này là do sự tăng cao áp suất hơibởi nhiệt độ cao trong môi trường siêu âm khiến cho cường độ vỡ các bóng khí bị hạnchế và yếu đi Hiện tượng nay có thé khắc phục bang cách tăng đồng thời áp suất từ bênngoải vào môi trường chiếu siêu âm còn gọi là manothermosonication — MTS (Sala và

cộng sự, 1993) Đây là một trong những giải pháp có tính đột phá và mang lại hiệu quảcao trong việc tăng cường khả năng tiêu diệt vi sinh vật bởi sóng siêu âm.

Quá trình siêu âm kết hợp với áp suất (manosonication-MS) được thực hiện bởimột số tác giả như Sala và cộng sự (1995), Manas và cộng sự (2000) trên các đối tượngvi sinh vật gây bệnh cũng cho thấy những kết quả rất khả quan Các nghiên cứu này chothay tại nhiệt độ thường quá trình xử lý siêu âm không hiệu quả với L monocytogenes(với thời gian chết nhiệt là D = 4.3 phút) Băng phương pháp siêu âm kết hợp với ápsuất (MS), giá trị D của vi khuẩn này giảm xuống còn 1.5 phút Khi gia nhiệt đến 50°C,hiệu quả của quá trình xử lý không đáng kế nhưng ở nhiệt độ cao hơn thì hiệu quả xử lýlại tốt hơn rất nhiều

Một điểm đáng lưu ý đối với kỹ thuật siêu âm so với kỹ thuật thanh trùng nhiệttruyền thống là ở phương pháp nhiệt, khả năng va cơ chế dé kháng của vi khuẩn là yếu

tố quan trọng cần được quan tâm trong quá trình xử lý Nhưng với kỹ thuật MTS vàMS, khả năng dé kháng nhiệt của vi khuẩn hầu như không có Do đó, kỹ thuật naymang lại nhiều triển vọng hơn bởi hiệu quả xử lý của nó không phụ thuộc vào điều kiệnxử lý và khả năng chống chịu nhiệt của vi khuẩn trong thực phẩm so với quá trìnhnhiệt Bên cạnh đó, nghiên cứu của Pagan và cộng sự (1999) cho thấy răng sự tốnthương của tế bào bởi nhiệt độ là thuận nghịch nhưng tôn thương gây ra bởi quá trìnhxu lý MTS là bất thuận nghịch.

% Lô hoạt enzyme:

Trong nhiều năm gan đây, sóng siêu âm được sử dụng như là một phương phápức chế hoạt động của các enzyme Khoảng 70 năm trước Chambers (1937) cho rằngpepsin có thể bị ức chế bởi sóng siêu âm theo cơ chế của sự sủi bóng Sự ức chếenzyme băng siêu âm cũng đã thành công trong việc ức chế enzyme nghịch đảo đường

sucrose (Crawford,1955).

Các enzym peroxidase, có nhiều trong các loại trái cây va rau qua tuoi, chúng lànguyên nhân gây ra những biến đổi xấu làm tạo thành một số mùi không mong muốnvà làm rau trái hoá nâu Ảnh hưởng của sóng siêu âm (20 kHz, 371 W/cm?) lên enzyme

peroxidase (Sigma-P8000) được hoa tan vào dung dịch đệm kali phosphate 0.1M pH =7

ở 20°C cho thay các enzym peroxidase có thé bi ức chế 90% khi chiếu siêu âm trong 3

giờ (Wiltshire, 1992) Sự giảm hoạt tính của enzyme peroxidase được giải thích bởi sựphân tách nhóm heme (prosthetic) cua enzyme bởi năng lượng bức xạ siêu âm này, cơ

chế này cũng tương tự như cơ chế ức chế peroxidase bởi nhiệt độ (Lopez và Burgos,

1995).

Việc nghiên cứu ức chế enzym peroxydase loại VI cũng được tiễn hành bởi cáctác giả L De Gennaro và các cộng sự Quá trình được tiễn hành ở 80°C sử dụng siêuâm với các tần số 20, 40 và 60 kHz, theo đó công suất siêu âm thay đổi trong khoảng từ0 — 120 W Khi siêu âm năng lượng cao truyền vào chất lỏng, các bọt khí nhỏ sé pháttriển và bị vỡ mãnh liệt, điều đó sẽ làm tăng nhiệt độ và áp suất đột ngột ở vùng xungquanh nó (EL’piner, 1964) Sự kết hợp của siêu âm với nhiệt hoặc áp suất hoặc cả hai

sẽ cho hiệu quả ức chê enzyme cao.

Sự ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính của các enzym khác cũng đã được dénghị, trong đó enzym oxidase thường bị ức chế bởi sóng siêu âm, trong khi các enzymcatalase chỉ bị ảnh hưởng khi chúng ở nồng độ thấp (Naimark và Mosher, 1953) Tuy

nhiên, các enzym reductase va amylase lai có khả năng kháng siêu âm cao.

Protease va lipase từ vi khuẩn ưa lạnh Pseudomonas cũng được xem là hai đốitượng enzyme đáng chú ý đối với các sản phẩm sữa tiệt trùng UHT Cả hai enzyme trêncó thể bị vô hoạt với tốc độ nhanh gấp 10 lần bằng phương pháp xử lý MTS so vớiphương pháp nhiệt truyền thống (Vercet va cộng sự, 1997)

Các enzyme pectin methylesterase từ những enzyme có trong cam và có thể gâyđục cho các sản phẩm nước ép trong quá trình chế biến và bảo quản Do đó, chúng cầnphải được vô hoạt để đảm bảo chất lượng cảm quan của sản phẩm Vercet và cộng sự(1999) đã chứng minh được khả năng làm vô hoạt enzyme này bằng phương pháp xử lýMTS với kết quả là làm giảm hoạt tính nhanh gấp 500 lần so với phương pháp truyềnthống ở cùng một nhiệt độ

2.3.6 Cơ chế phá vỡ tế bào của sóng siêu âmSóng siêu âm được tạo ra băng các rung động cơ học ở tan số cao hơn 15kHz.Khi những sóng này truyền trong môi trường lỏng, chu trình nén và duỗi tuần tự xảy ra.Trong suốt chu trình duỗi, siêu âm cường độ cao hình thành các bong bóng nhỏ tronglòng chất lỏng Khi chúng đạt đến một thể tích mà chúng không còn có thể hấp thuđược năng lượng, chúng vỡ ra một cách mãnh liệt Hiện tượng này được biết như làhiện tượng sủi bong bóng Trong suốt quá trình nỗ, nhiệt độ rất cao (khoảng 5500°C) vàáp suất cao (khoảng 50MPa) đạt đến trong những bong bóng này Theo một số tác giả,đây là nguyên nhân làm phá vỡ tế bao của sóng siêu âm

Khi bong bóng bị nổ, nhiệt độ tạo ra trong chất lỏng xung quanh các lỗ hongnày Thể tích chất lỏng bị gia nhiệt là rất nhỏ và nhiệt nhanh chóng bị tiêu tan, mặc dùnhiệt độ tại vùng nay thì rất cao trong vài us

Khi các bong bóng bị vỡ, cùng với nhiệt độ sẽ hình thành một sự thay đôi ápsuất đột ngột Vi sinh vật có thể chịu đựng áp suất cao nhưng không thể chịu được sựthay đối áp suất đột ngột Va đây được xem là nguyên nhân chủ yếu làm phá vỡ tế bảo

Thực tế quan sát bằng kính hién vi cho thấy thành tế bào bị phá vỡ khi tế bao bị chiếu

siêu âm.

Mặt khác, nhiệt độ và áp suất cao tạo ra khi nỗ bong bóng sẽ dẫn tới sự tạo thànhcác gốc tự do như là H* va OH’ Những gốc tự do nay cũng góp phan tác động và gâyphá vỡ tế bào

CHƯƠNG 3:

VAT LIEU VA

PHUONG PHAP

NGHIEN CUU

3.1 Vật liệu nghiên cứu3.1.1 Nguyên liệu

Ba nam men bia (S.carlsbergensis) sử dụng trong nghiên cứu được cấp bởi nha

máy bia Sài Gòn — Bình Dương.

3.1.2 Thiết bị nghiên cứuThiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm: máy phát siêu âm, máy ly tâm

— Máy phát siêu âm SONICS 750-Watt

Thông số Đặc tính kỹ thuật

Kích thước 220x 190x340 mm

Công suất 750 WThể tích tôi đa 1000 mL,Tân sô siêu âm 20 kHz

Nguôn điện 220v

_ Máy ly tâm Z 206 A

Thông số Đặc tính kỹ thuậtHãng sản xuất HermaleTốc độ xoay tôi đa 6000 vòng/phút

Công suất 55 kWNguôn điện 220v

_ Máy ly tâm Rotofix 32A

Thông số Đặc tính kỹ thuật

Hãng sản xuất Hettich

Tốc độ xoay tôi đa 4000 vòng/phútCông suất 55 kWNguôn điện 220v

_ Máy Quang phố WTW_ Bề 6n nhiệt Memmert_ May say thăng hoa EYBA FD-2100Đề tài được thực hiện tai cơ sở thi nghiệm-thực hành Trường Đại Học CôngNghiệp Thực Phẩm Thành Phó Hồ Chí Minh.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình công nghệ thu nhận enzyme invertase từ bã nam men bia3.2.1.1 Sơ đồ công nghệ

3.2.1.2 Thuyết minh sơ đồ công nghệ% Nguyên liệu:

— Nguyên liệu là bã nắm men bia (S.carlsbergensis) lay từ nhà máy bia Sài GònBình Dương và được bảo quản lạnh trong suốt quá trình nghiên cứu Nhiệt độ

bao quản từ 0-5°C.+ Làm sạch:

Trong quá trình bảo quản, nam men bia trong bã tự lắng xuống đáy Tiến hành

gan bỏ phân lỏng bên trên và thu lây nam men bên dưới rồi tiên hành làm sạch.Quá trình làm sạch được thực hiện qua hai công đoạn:

— Rửa với nước vô khuan:+ Mục đích: Nhăm loại bỏ cặn, đường còn sót sau lên men cũng như các tạp

chất khác có trong bã nam men.Tiến hành: trộn đều nước vô khuẩn với bã nam men lăng bên dưới theo tỉ lệ3/1 (w/w), để yên ở điều kiện lạnh cho nắm men lắng xuống Sau 3 giờ lăng,tiễn hành gan bỏ phần nước phía trên rồi thu nhận phần nắm men lắng bên

dưới.— Rửa voi hước mudi:

+ Nước mudi được su dụng dé rita nam men có nông độ 0,5%.+ Mục đích: rửa dich nam men với nước mudi nhăm loại bỏ các chat nhớt có

trong dịch nắm men.Tiến hành: nắm men được rửa với nước muối nông độ 0.5% theo tỉ lệ nướcmuối/nắm men là 3/1 (w/w), để lang trong 3 giờ rồi thu lay phần men bêndưới, loại bỏ phan nước bên trên Phần nam men bên dưới sẽ được mang di

ly tam tach nước trước khi siêu âm— Yêu câu:

+ Nam men sau khi rửa không còn chứa đường (còn lại sau lên men) cũng nhưcác tạp chất khác

Nam men phải được bảo quản lạnh trong suốt quá trình rửa cũng như khi đã

rửa xong.

— Lưu ý: sau khi rửa xong, phải tiến hành kiểm tra xem trong men có còn đườngkhử không, nếu còn thì phải tiến hành rửa lại với nước vô khuẩn đến khi hết

đường khử

+ Ly tâm lân 1:— Mục đích: Loại bỏ nước ra khỏi nắm men đã làm được làm sạch.— Tién hành:

+ Quá trình ly tâm được tiễn hành băng thiết bị ly tâm Rorofix 32A+ Chế độ ly tâm: 3000 vòng/phút và được thực hiện trong 3 phút_ Yêu cầu : Nam men sau khi được ly tâm có độ âm 89% (w/w)+ Xứ lý siêu âm:

— Mục đích: phá vỡ tế bào nam men, giải phóng enzyme invertase.— Tiễn hành: Ba nắm men (chứa 89% âm) được trộn với nước cất vô trùng để tạo

thành hỗn hợp huyền phù Ở mỗi nghiệm thức, 100 gram huyền phù chứa trongbecher 250 ml được chiếu siêu âm bằng thiết bị SONICS 750-Watt với đầu phátsiêu âm được nhúng ngập 3cm trong huyền phù, chế độ phát siêu âm là liên tụcvà tần số siêu âm là 20kHz Ty lệ nắm men trong huyền phù và chế độ siêu âmđược điều chỉnh theo kế hoạch thực nghiệm ở mục 3.2.2

— Thiết bị phát siêu âm được sử dụng trong nghiên cứu là SONICS 750-Watt+ Ly tâm lần 2:

— Mục đích: tách riêng phan dịch (chứa enzyme invertase) và phan xác tế bào nammen bị phá vỡ nhằm thu dịch chiết enzyme invertase thô

— Tién hành:+ Quá trình ly tâm được tiến hành bang thiết bị ly tâm Hermale Z206A+ Chế độ ly tâm: 6000 vòng/phút va được thực hiện trong 20 phút.+ Kết tủa :

— Mục đích : kết tủa protein có trong dịch trích— Tiến hành : Sử dụng Ethanol 70° với tỉ lệ VEthanol/V dich trích = 4:14 Ly tâm lần 3 :

— Mục đích : thu kết tủa— Tiến hành :

+ Quá trình ly tâm được tiễn hành băng thiết bị ly tâm Rorofix 32A+ Chế độ ly tâm: 4000 vòng/phút và được thực hiện trong 10 phút4 Sấy thăng hoa

— Mục đích : Sấy kết tủa thu được ở trên— Tiến hành : Say thăng hoa băng thiết bị say thăng hoa

Say thăng hoa xong, thu được enzyme invertase thô 3.2.2 Phương pháp bồ trí thí nghiệm

- Phan 1 : Khao sát các yếu tố độc lập ảnh hưởng đến quá trình thu nhận enzymeInvertase Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu thí nghiệm một nhân tố, mô hình bé trí thínghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên

+ Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nắm men/dung môi (%

w/w)+ Thi nghiệm 2: Khảo sat ảnh hưởng của thời gian xu lý siêu âm (phút)

+ Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm (W)- Phần 2: Tối ưu hóa quá trình thu nhận enzyme invertase từ S.carlsbergensisbăng siêu âm Thí nghiệm ở phan nay được thực hiện bằng phương pháp bé mặt đáp

Trong thí nghiệm nay, ty lệ nấm men/dung môi được khảo sát ở nhiều mức khácnhau, thay đổi từ 30 đến 60% Bang 3.1 trình bày các nghiệm thức của thí nghiệm 1.

Bang 3.1: Các nghiệm thức cua thi nghiệm 1

Yếu to thay doi ¬

Nghiệm thức „ Yêu tô cô định

Ty lệ nam men/dung môi (% w/w)1 30

- Hàm mục tiêu : + Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme (UU/mg pr) là cao nhất

+ Hoạt tính tong của dịch chiết enzyme UI là hiệu quả nhất

b) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hướng của thời gian xử lý siêu âm- Mục dich:

Thí nghiệm nay nhăm khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm đến hoạttinh của enzyme thu được dé tìm ra khoảng thời gian thích hợp nhất để xử lý siêu âm

- Phương pháp bố trí thí nghiệm:Trong thí nghiệm này, thời gian xử lý siêu âm được khảo sát ở nhiều mức khácnhau từ 4 phút đến 12 phút Bảng 3.2 trình bày các nghiệm thức của thí nghiệm 2

Bảng 3.2: Các nghiệm thức của thí nghiệm 2

Yếu tô thay doiNghiệm thức Yếu tổ cô định

Thời gian xử lý siêu âm (phút)l 4 „

e Công suât: 225W,

2 6

3 S e Tỷ lệ nam men/dung môi: Tôi

ưu của thí nghiệm |.4 10

5 12

- Hàm mục tiêu : + Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme (UI/mg pr) là cao nhất

+ Hoạt tính tong của dịch chiết enzyme UI là hiệu quả nhấtc) Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm

- Mục dich:

Khảo sát sự ảnh hưởng của công suất xử lý siêu âm đến hoạt tính của enzymeinvertase thu được để tìm ra mức công suất tôi ưu

- Phương pháp bố trí thí nghiệm:Trong thí nghiệm này, công suất xử lý siêu âm được khảo sát ở nhiều mức khácnhau từ 187,5 đến 375W Bảng 3.3 trình bày các nghiệm thức của thí nghiệm 3

Bảng 3.3: Các nghiệm thức của thí nghiệm 3

Yéu to thay doi ¬

Nghiệm thức „ Yêu tô cô định

Công suât xử lý siêu âm (W)l 187,5

2 225 e Thời gian xử lý: Tôi ưu của

thí nghiệm 2.3 262 5 on

e Ty lệ nam men/dung môi: Tôi

4 300

ưu của thí nghiệm |

5 3375

- Hàm mục tiêu : + Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme (UI/mg pr) là cao nhất

+ Hoạt tính tong của dịch chiết enzyme UI là hiệu quả nhất3.2.2.2.Phan 2: Tối ưu hóa quá trình thu nhận enzyme invertase thô từS.carlsbergensis băng sóng siêu âm:

a) Thí nghiệm tối ưu hóaThí nghiệm này được tiễn hành nham tìm ra điều kiện của quá trình xử lý siêuâm dé hoạt tính riêng của enzyme invertase đạt cao nhất Kết quả của thí nghiệm khảosát ở 3 thí nghiệm trên được chon làm cơ sở dé thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology — RSM)với phương án quay bậc 2 có tâm (cánh tay đòn a = 1,682) được áp dung để tối ứu

hóa các điêu kiện của quá trình xử lý siêu âm đê thu nhận enzyme invertase

> Yếu tô ảnh hưởng (k): bao gôm 3 yếu tô độc lập.~ X 1: tỷ lệ nắm men/dung môi (%w/w)

X2: công suất siêu âm (W)

X3: thời gian xử lý siêu âm (phút)

Vậy số nghiệm thức N cân thực hiện:

thực nghiệm Kết quả thực nghiệm sẽ được so sánh với kết quả dự đoán để kiểm tra sự

khác biệt vé mặt thông kê với p< 0,05

3.2.2.3.Phan 3: Khảo sát các đặc tính của enzyme thôa) Thí nghiệm 1 : Khảo sát nhiệt độ hoạt động tôi ưu của enzyme thô.- Mục đích : Khảo sát tìm ra nhiệt độ tối ưu cho enzyme thô hoạt động- Phương pháp bố trí thí nghiệm :

Bang 3.4: Các nghiệm thức cua thí nghiệm 1

Nghiệm thức | Giá trị nhiệt độ (°C) Yếu tổ cô định

| 302 353 401 15 e pH:5,55 50

6 557 60

_ Kết quả thu được cho phép xác định được hoạt tính của enzyme tương ứng vớicác nhiệt độ khác nhau Từ đó xác định nhiệt độ tối ưu cho enzyme thô hoạt động

b) Thí nghiệm 2 : Khảo sát pH hoạt động tối ưu của enzyme thô.- Mục đích : Khảo sat tìm ra pH t6i ưu cho enzyme hoạt động- Phương pháp bố trí thí nghiệm :

Bang 3.5: Các nghiệm thức cua thi nghiệm 2

Nghiệm thức | Giá trị pH Yếu tô cô định

Ï 42 453 s e Nhiệt độ : Tôi ưu của thí

nghiệm |4 55

5 66 6.5_ Tao ra môi trường pH trong thí nghiệm khảo sát : sử dụng các loại đệm ( phụlục 3)

_ Kết quả thu được cho phép xác định được hoạt tính của enzyme tương ứng vớicác pH khác nhau Từ đó xác định pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động

c) Thí nghiệm 3 : Tiến hành thu enzyme thô và tính hiệu quá thu nhận- Mục đích : Tiến hành thu nhận enzyme thô để dễ dàng cho quá trình sử dụng,đồng thời xác định hiệu qua của quá trình thu nhận

- Tiến hành : Kết tủa dịch trích enzyme thô và tiến hành sấy thăng hoa, sau đó xácđịnh khối lượng và hoạt tính tong của chế phẩm thô thu được, qua đó tình hiệu suất của

quá trình thu nhận.3.3 Phương pháp phân tích và tính toán

3.3.1 Xác định hoạt tính enzyme invertase

Một don vi hoạt tính của enzym Invertase là lượng enzym cần thiết để thủy phân1 nmol saccharose trong thời gian 1 phút ở điều kiện nhiệt độ 37°C

Thí nghiệm được tiễn hành với dung dịch đường sucrose có nồng độ 0.5M đượctrộn với dung dịch chế phẩm invertase theo tỷ lệ 1:1 Hỗn hop được giữ ở nhiệt độ 36 +38°C trong khoảng thời gian đúng 10 phút để phản ứng thủy phân tạo đường khử xảyra Sau đó, hỗn hợp được xử lý nhiệt ở 90°C trong 5 phút để bất hoạt invertase

Công thức tính HT như sau:

= * xxx (IU/mlddE)

360.102 7yxX, 1 V, 1 K TẢx-xkx—*'x—— (1U/ø chê phâm

Mcp: khối lượng chế phẩm enzym đem hòa tan (g)k: hệ số pha loãng

3.3.2 Hoạt tính riêng của invertase

Hoạt tính riêng của enzyme (HTR) là số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg proteincủa chế phẩm (IU/mg protein) Công thức tính như sau:

AT

HTR = ([U/mg protein)

‘protein

Trong đó:- HT: hoạt tính invertase (U/ml ddE)- H protein: ham lượng (mg/ml ddE)

3.3.3 Nông độ Protein— Nông độ protein hòa tan: được xác định bằng phương pháp Lowry (xem phụ lục

3.3.4 Phương pháp xác định đường khử

— Hàm lượng đường khử: được xác định bằng phương pháp Miller (xem phụ lục

1, trang 63).

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Số liệu thí nghiệm được trình bày dướidạng giá trị trung bình (+ SD) Phần mềm Modde 5.0 (Umetrics AB) và StatgraphicsCenturion XV được ứng dụng để xử lý số liệu thực nghiệm

KET QUA VÀ THẢO

LUẬN