Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm Colletotrichum Gloesporides của nanochitosan trong bảo quản thanh long

TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của nanochitosan trong bảo quản thanh long.. Để hạn chế bệnh thán thư trên thanh long sau thu hoạch,

-

LÊ HOÀNG THANH VY

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM

COLLETOTRICHUM GLOESPORIODES CỦA

NANOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN THANH LONG

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Trần Bích Lam

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 05 tháng 01 năm 2016

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 GS.TS Đống Thị Anh Đào - Chủ tịch hội đồng 2 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng - Phản biện 1 3 TS Tôn Nữ Minh Nguyệt - Phản biện 2 4 TS Nguyễn Hoài Hương - Ủy viên 5 TS Trần Thị Ngọc Yên - Ủy viên thư ký Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Hoàng Thanh Vy MSHV: 13111037 Ngày, tháng, năm sinh: 24/03/1989 Nơi sinh: TP.Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60540101

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của nanochitosan

trong bảo quản thanh long

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion với Sodium

Tripolyphosphate (STPP)

2 Xác định ngưỡng gây bệnh của nấm Colletotrichum gloeosporioides trên quả Thanh

long Bình Thuận 3 Khảo sát khả năng ức chế của nanochitosan lên sự sinh trưởng và phát triển của

Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vitro và ở điều kiện in vivo trên

quả Thanh long Bình Thuận 4 Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nanochitosan thông qua các chỉ tiêu

sinh lý, sinh hóa của thanh long Bình Thuận

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 08/2015 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2015 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Trần Bích Lam

Tp HCM, ngày 22 tháng 12 năm 2015

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS Trần Bích Lam

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Cao Đẳng Nghề TP.Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa công nghệ thực phẩm trường Cao Đẳng Nghề TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về thời gian cũng như hỗ trợ về trang thiết bị trong thời gian tôi học tập và làm luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các bạn cùng khóa đã hỗ trợ tôi trong thời gian làm thí nghiệm và trong suốt quá trình học tập

Và cuối cùng, con xin gởi lời cảm ơn đến bố mẹ, các thành viên trong gia đình, đã tạo điều kiện và ủng hộ cho con trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 12 năm 2015

Học viên thực hiện

Lê Hoàng Thanh Vy

TÓM TẮT

Thán thư là một loại bệnh rất phổ biến trên thanh long, do nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây ra Ngoài việc làm giảm năng suất, bệnh thán thư còn làm giảm

chất lượng trái thanh long sau thu hoạch Những năm gần đây, chitosan là một trong những hợp chất sinh học được nghiên cứu rất nhiều về khả năng ứng dụng trong bảo quản rau quả sau thu hoạch do nó có đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn và an toàn cho người tiêu dùng

Trong nghiên cứu này chúng tôi tạo ra chế phẩm nanochitosan bằng phương pháp gel ion có nồng độ 0,14% với các kích thước 157, 241 và 42nm Ngưỡng gây bệnh trên trái thanh long Bình Thuận 104 bào tử/ml Ở điều kiện in vitro nanochitosan

kích thước 157nm, nồng độ 0,04% có hiệu lực ức chế cao nhất là 82,59% so với các

kích thước 241, hay 42nm cùng nồng độ Điều kiện in vivo, hiệu lực ức chế cao nhất là

95,4% bởi nanochitosan kích thước 157nm nồng độ 0,14% so với nồng độ 0,06; 0,08; 0,1 và 0,12%

Chất lượng thanh long Bình Thuận được đánh giá sau 35 ngày bảo quản ở nhiệt độ 150C Kết quả là với mẫu có xử lý nanochitosan, giảm tỷ lệ hao hụt khối lượng 10,55% Các chỉ số hóa sinh đều biến đổi ít hơn so với mẫu không xử lý nanochitosan: pH, hàm lượng chất khô hòa tan và tỉ lệ hao hụt vitamin C so với mẫu đối chứng Sự biến thiên hàm lượng đường khử và đường tổng cũng diễn ra chậm hơn Như vậy

chitosan ở dạng nano có khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides và duy

trì chất lượng của thanh long Bình Thuận trong thời gian 35 ngày ở 150C

ABSTRACT

Anthracnose is a very common disease in the dragon fruit, caused by

Colletotrichum gloeosporioides Besides reduced productivity, anthracnose reduces

quality dragon fruit postharvest In recent years, chitosan is one of the biological compounds be studied a lot about the applicability in preserving fruits and vegetables postharvest because it has antifungal, antibacterial and safe for consumers

In this study, chitosan nanoparticles was received by ionic gelation method in the concentration of 0,14% with the size 157, 241 and 42nm Level the lowest disease of

Colletotrichum gloeosporioides in Binh Thuan dragon fruit is found 104 cfu/ml In the

in vitro chitosan nanoparticles size 157nm, concentration 0,04% had highest

inhibitory effect 82.59% compared with the particle size of 241, 42nm in same

concentration In the in vivo, chitosan nanoparticles the particle size 157nm had the

highest inhibitory effect 95.4% in theconcentration of 0,14% compared with concentration 0,06; 0,08; 0,1 and 0,12% in the same size

The quality Bình Thuan of dragon fruits coated with chitosan nanoparticles was evaluated after storaged at 150C for 35 day The results sample treatment chitosan nanoparticles, the weight loss ratio 10.55% The biochemists index change less than the sample untreated chitosan nanoparticles: pH, total soluble solid content and vitamin C loss ratio respectively over the control The changing in total sugar and reducing sugar took place with a slower speed compared with the control The results of this study show that chitosan nanoparticles is probably used in preservation to maintain the quality of dragon fruit for 35 days at 150C

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả và các kết luận trong luận văn này là trung thực không sao chép bất kỳ nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào và việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

Lê Hoàng Thanh Vy

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về quả thanh long 4

1.1.1 Đặc điểm thực vật học của quả thanh long 4

1.1.2 Một số loại thanh long phổ biến 5

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng 5

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thanh long 5

1.1.5 Thực trạng bảo quản 6

1.2 Tổng quan về nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides 7

1.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh học 7

1.2.2 Sinh lý học 8

1.2.3 Cơ chế gây thối hỏng trái cây của nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides 8 1.3 Tống quan về chitosan và nano chitosan 10

1.3.1 Tính chất chitosan và naono chitosan 10

1.3.2 Các phương pháp tạo nanochitosan 11

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan 13

1.4 Những công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 14

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 14

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu thanh long 17

2.1.2 Chế phẩm chitosan 17

2.1.3 Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.2 Phương pháp tạo chế phẩm nano chitosan 19

2.2.3 Bố trí thí nghiệm 20

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả thí nghiệm chế tạo nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion 26

3.2 Kết quả xác định ngưỡng gây bệnh 28

3.3 Kết quả khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát triển của nấm

Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vitro 30

3.4 Kết quả khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vivo 37

3.5 Đánh giá chất lượng thanh long Bình Thuận bảo quản bằng nanochitosan 43

3.5.1 Thay đổi khối lượng 46

3.5.2 Sự thay đổi hàm lượng chất rắn hòa tan 48

3.5.3 Sự thay đổi pH 49

3.5.4 Sự thay đổi hàm lượng Vitamin C 50

3.5.5 Sự thay đổi hàm lượng đường khử 51

3.5.6 Sự thay đổi hàm lượng đường tổng 53

PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 73

PHỤ LỤC 3 THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN 83

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của chủng nấm C.gloeosporioides trên PDA 8

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể phương pháp nghiên cứu 19 Hình 3.1 Ảnh chụp trên kính hiển vi điển tử FE – SEM của 3 công thức nanochitosan

26

Hình 3.2 Vết bệnh trên thanh long khi tạo vết bệnh nhân tạo với các nồng độ bào tử

nấm C gloeosporioies (bào tử/ml) khác nhau sau 96 giờ 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nano chitosan đến đường kính tản nấm Colletotrichum

gloeosporioides sau 240h nuôi cấy 36

Hình 3.4 Vết bệnh trên thanh long phủ màng bao nanochitosan ở các nồng độ khác

nhau và lây bệnh nhân tạo sau 240 giờ 42

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nanochitosan đến khả năng bảo quản thanh long ở nhiệt độ

150C 45

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn % sự hao hụt khối lượng của thanh long sau 35 ngày bảo

quản ở nhiệt độ 150C 46

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất rắn hòa tan của thanh long sau

35 ngày bảo quản ở nhiệt độ 150C 48

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH của thanh long sau 35 ngày bảo quản ở nhiệt

độ 150C 49

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng Vitamin C của thanh long sau 35

ngày bảo quản ở nhiệt độ 150C 50

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử của thanh long sau 35

ngày bảo quản ở nhiệt độ 150C 52

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử của thanh long sau 35

ngày bảo quản ở nhiệt độ 150C 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của thanh long (Hylocereus undatus) trong 100g 5

Bảng 2.1 Bảng chỉ tiêu của chitosan của công ty TNHH Hùng Tiến 17

Bảng 2.2 Bảng bố trí điều kiện tạo nanochitosan 20

Bảng 3.1 Kết quả tạo nanochitosan ở các điều kiện 27

Bảng 3.2 Tỉ lệ vết bệnh (%) ở các nồng độ bào tử trên thanh long Bình Thuận 28

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nanochitosan đến đường kích tản nấm C.gloeosporioides 32

Bảng 3.4 Thời gian nảy mầm của Colletotrichum gloeosporioides ở các mẫu 33

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nanochitosan đến tỷ lệ vết bệnh và thời gian hình thành vết bệnh trên thanh long 38

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nanochitosan đến đường kính vết bệnh trên thanh long 40

Bảng 3.7 Sự biến đổi hóa sinh của thanh long trong thời gian bảo quản 43

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA Potato Dextro Agar

NCT Xử lý nanochitosan

DNA Deoxy ribonucleic acid

RNA Ribonucleotic acid

STPP Sodium tripolyphosphate

PIRG Percentage inhibition of radial growth

SEM Scanning electron microscope

DNS Dinitro salysilic acid

CT Công thức

CTV Công thức ở điều kiện in vivo

AA1 Kích thước nanochitosan được chọn để khảo sát ở điều kiện in vivo

MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam có điều kiện thời tiết thuận lợi cho việc trồng và phát triển thanh long Thanh long là loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao và giá trị xuất khẩu, loại quả có

kim ngạch xuất khẩu cao nhất so với các loại trái cây khác ở nước ta [1]

Việc xuất khẩu thanh long đang bị phụ thuộc vào thị trường Trung Quốc (chiếm 70 – 80%), việc xuất khẩu bị chi phối nhiều về vị trí địa lý do chúng ta chưa có biện pháp kéo dài thời gian bảo quản để vận chuyển đến các thị trường ở xa như Mỹ, Châu Âu…dẫn đến việc cạnh tranh về giá cả gặp nhiều khó khăn do chi phí vận chuyển

đường hàng không quá cao [1]

Thanh long sau thu hoạch dễ bị hư hỏng khi bảo quản mà chủ yếu do các chủng

nấm mốc sau gây ra: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium, Botryosphaeria

sp., và Colletotrichum gloeosporioides Trong đó, bệnh thán thư do Colletotrichum

gloeosporioides gây ra chiếm tỉ lệ lớn nhất [2], [3], [4]

Để hạn chế bệnh thán thư trên thanh long sau thu hoạch, ngoài việc hạn chế tổn thương trên quả thì ở Việt Nam sử dụng các phương pháp bảo quản như: bảo quản lạnh, xử lý hóa chất (carbenadazim, GA3, anolyte), chiếu xạ, xử lý hơi nước nóng… Trong đó chiếu xạ và xử lý hơi nước nóng là hai phương pháp được sử dụng cho xuất khẩu

Với thực trạng về vấn đề VSATTP cũng như vấn đề ô nhiễm môi trường thì xu hướng của ngành công nghiệp thực phẩm nói chung hay công nghệ sau thu hoạch nói riêng đang hướng tới sử dụng các phương pháp sinh học để dần thay thế cho các phương pháp hóa học

Trong những năm gần đây, chitosan là một trong những hợp chất sinh học được nghiên cứu rất nhiều về khả năng ứng dụng trong bảo quản rau quả sau thu hoạch do nó có đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn và an toàn cho người tiêu dùng Chitosan ở dạng

nano cho thấy được khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides tốt hơn khi sử dụng chitosan dạng thông thường trong điều kiện in vitro [3], [5], [6]

Từ thực tế đó, việc phát triển một phương pháp có thể kéo dài thời gian bảo quản thanh long để có thể đưa quả thanh long Việt Nam đi xa hơn, tăng cao khả năng cạnh tranh, tăng kim ngạch xuất khẩu, góp phần phát triển kinh tế đất nước là cần thiết Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng khả năng kháng nấm

Colletotrichum gloeosporioides của nanochitosan trong bảo quản thanh long”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được công thức bảo quản thanh long bằng màng nanochitosan để có thể kéo dài thời gian bảo quản lên đến 35 ngày ở điều kiện nhiệt độ 15 ±20C

3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện trên quả thanh long vỏ đỏ ruột trắng được trồng ở Bình Thuận, tỉnh có diện tích trồng thanh long lớn nhất cả nước

Bệnh thán thư thanh long do nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides

4 Nội dung nghiên cứu

Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion với Sodium

Tripolyphosphate (STPP)

Xác định ngưỡng gây bệnh của nấm Colletotrichum gloeosporioides trên quả

Thanh long Bình Thuận Khảo sát khả năng ức chế của nanochitosan lên sự sinh trưởng và phát triển của

Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vitro

Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nanochitosan đến sự sinh trưởng và phát triển

của Colletotrichum gloeosporioides ở điều kiện in vivo trên quả Thanh long Bình

Thuận Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nanochitosan thông qua các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của thanh long Bình Thuận

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp dữ liệu khoa học về khả năng của nanochitosan kháng bệnh thán thư do

nấm Colletotrichum gloeosporioides hại thanh long trong điều kiện in vitro và in vivo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về quả thanh long

Cây thanh long (tên tiếng Anh là Pitahaya, hay còn gọi là Dragon fruit), thuộc họ Xương rồng, có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia Thanh long được người Pháp đem vào trồng ở Việt Nam trên 100 năm nay, nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ thập niên 1980 [1]

1.1.1 Đặc điểm thực vật học của quả thanh long

Là cây có nguồn gốc nhiệt đới, chịu hạn, nên được trồng ở những vùng nóng Một số loài chịu được nhiệt độ từ 500C- 550C, nhưng nó không chịu được giá lạnh Sự phát triển của cây tốt ở nơi có cường độ ánh sáng mạnh [7], [8]

Rễ cây: rễ thanh long không mọng nước nên nó không phải là nơi tích trữ nước giúp cây chịu hạn Cây thanh long có hai loại rễ: địa sinh và khí sinh [8]

Rễ địa sinh phát triển từ phần lõi ở gốc hom Rễ địa sinh có nhiệm vụ bám vào đất và hút các chất dinh dưỡng nuôi cây [8]

Rễ khí sinh mọc dọc theo thân cây phần trên không, bám vào cây chống để giúp cây leo lên giá đỡ [8]

Thân, cành: Thanh long là một loại xương rồng có thân, cành trườn bò trên trụ đỡ Thân chứa nhiều nước nên nó có thể chịu hạn một thời gian dài Thân, cành thường có ba cánh dẹp, xanh Tiết diện ngang cho thấy có hai phần: bên ngoài là nhu mô chứa diệp lục, bên trong là lõi cứng hình trụ Mỗi cánh chia ra làm nhiều thùy có chiều dài 3 - 4cm [8]

Hoa: Thanh long là cây ngày dài Miền Nam Bộ ra hoa sớm nhất vào trung tuần tháng 3 – 10 hàng năm, rộ nhất từ tháng 5 dương lịch tới tháng 8 dương lịch Trung bình có từ 4 - 6 đợt ra hoa rộ mỗi năm Hoa lưỡng tính, rất to, có chiều dài trung bình 25 - 35 cm, nhiều lá đài và cánh hoa dính nhau thành ống, nhiều tiểu nhị và một nhụy cái dài 18 - 24 cm, đường kính 5-8 mm, nhụy cái chia làm nhiều nhánh Hoa thường nở

tập trung từ 20 - 23 giờ đêm và đồng loạt trong vườn Từ khi nở đến khi tàn kéo dài độ 2 - 3 ngày Thời gian từ khi xuất hiện nụ tới hoa tàn độ 20 ngày Các đợt nụ đầu tiên rụng từ 30% đến 40%, về sau tỉ lệ này giảm dần khi gặp điều kiện ngoại cảnh thuận lợi [8], [9]

1.1.2 Một số loại thanh long phổ biến

Quả thanh long có ba loại: [10]

 Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus: ruột trắng vỏ hồng

 Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus: ruột đỏ vỏ hồng

 Hylocereus megalanthus thuộc chi Selenicereus: ruột trắng vỏ vàng

(Thiamine)

0,04 mg

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thanh long

Hiện nay, nước ta đã xuất khẩu thanh long ra nhiều nước dưới dạng quả tươi Đối với thị trường Nhật do sự kiểm dịch thực vật khắt khe nên chỉ nhập thanh long dưới dạng đông lạnh Ở Bình Thuận nói riêng và Nam Bộ nói chung mùa thanh long tự nhiên từ tháng 4 tới tháng 10, rộ nhất từ tháng 5 tới tháng 8 Vài năm gần đây Thái

Lan, Taiwan và cả Trung Quốc cũng đã bắt đầu nghiên cứu trồng cây này [1], [12]

Trái thanh long Việt Nam đã có mặt ở 40 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó có cả các thị trường được coi là khó tính như Mỹ, Châu Âu, Nhật Bản…Tuy nhiên hiện nay, thanh long đạt chuẩn xuất khẩu sang các thị trường khó tính và mang lại giá trị cao như Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Châu Âu vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường không đủ hàng đạt chuẩn mà nhà nhập khẩu mong muốn [1]

Tính đến cuối năm 2014, tỉnh Bình Thuận có diện tích sản xuất thanh long lớn

nhất so với cả nước (24.212 ha) với sản lượng thu hoạch hàng năm trên 500.000 tấn

Và có 14 thị trường, trong đó Trung Quốc là thị trường tiêu thụ chủ lực thanh long Bình Thuận (ước tính 80-85% sản lượng) Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu, Trung Quốc đang có chính sách khuyến khích người dân phát triển trồng thanh long trên diện tích lớn tại hai tỉnh Quảng Đông và Quảng Tây, phía Nam Trung

Quốc (diện tích hiện nay là 20.000 ha) [1]

Trung Quốc là thị trường tiêu thụ hầu hết sản lượng thanh long của Việt Nam nói chung và Bình Thuận nói riêng Do vậy trong thời gian tới, thanh long Việt Nam sẽ phải cạnh tranh với thanh long Trung Quốc ngoài giá cả còn liên quan đến chất lượng, rào cản kỹ thuật trong thương mại mà Trung Quốc sẽ áp dụng trong tương lai [13]

1.1.5 Thực trạng bảo quản

Quả thanh long có thời gian bảo quản ngắn do có cường độ hô hấp cao, nếu bảo quản ở điều kiện thường, vỏ quả sẽ bị nhăn lại chỉ sau 7 – 8 ngày bảo quản Thành phần hóa học của quả thay đổi nhiều trong quá trình bảo quản [3]

Phương pháp bảo quản sử dụng kết hợp màng bao có chứa chitosan với nấm men đối kháng Candida sake TL01 giúp bảo quản thanh long được trong 37 ngày ở 50C, độ

ẩm 85 – 90% với tỉ lệ hư hỏng sau bảo quản là 5% [14]

Aspergillus niger và Colletotrichum gloeosporioides là 2 trong số các nấm mốc

chính gây hư hỏng quả thanh long [14] 1.1.5.1 Bảo quản ở nhiệt độ thường

Đây là cách bảo quản ở nhiệt độ và độ ẩm không khí tự nhiên Thanh long bảo quản trong điều kiện này với độ thoáng mát tốt, có thể giữ tươi được 5 – 8 ngày [15]

1.1.5.4 Phương pháp điều khiển thành phần không khí

Nguyên tắc của phương pháp này là làm tăng nồng độ khí CO2 và giảm nồng độ O2 trong không khí xung quanh trái để giảm cường độ hô hấp của trái Dùng túi polyetylen có đục 20 – 30 lỗ bằng kim, bao bọc trái thanh long và hàn kín bao lại Kỹ thuật này kết hợp với nhiệt độ lạnh ở 50C, thanh long có thể giữ tươi được 40 – 50 ngày [9]

1.1.5.5 Xử lý bằng ozon

Dùng dung dịch hoạt hoá anolyte (hay còn gọi là nước ozon), rửa sạch trái, sau đó hong khô, đóng gói, bảo quản trong nhà mát, thanh long giữ tươi được 25 ngày [9]

1.2 Tổng quan về nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides

1.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh học

Trên môi trường PDA (Potato dextrose agar), tản nấm của Colletotrichum

gloeosporioides có có màu trắng xám đến xám đậm Các tản nấm hình thành nên các

quả thể, chúng mọc riêng rẽ hoặc từng đám hình cầu hay hình quả lê, kích thước đường kính 85-350µm Bên trong quả thể có các túi bào tử nằm rải rác, xen kẽ với các sợi nấm vô tính, thường có 8 bào tử túi Bào tử túi hình trụ hoặc hình chuỳ, kích thước 35-80 x 8-14µm Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, hình trụ, đầu hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn, kích thước từ 9-24 x 3-6µm [16]

a b c

Hình 1.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của chủng nấm C.gloeosporioides trên PDA

a Tản nấm; b Khuẩn ty; c Bào tử

1.2.2 Sinh lý học

Nấm C gloeosporioides có khả năng sinh trưởng ở 40C, tối thích là từ 250-280C Bệnh phát triển mạnh mẽ khi độ ẩm và nhiệt độ tăng cao Quá trình nảy mầm, xâm nhiễm và sinh trưởng của nấm có thể bị ảnh hưởng nếu bề mặt mô bệnh ẩm ướt trong thời gian dài Ở điều kiện độ ẩm môi trường cao, bào tử nảy mầm và xâm nhiễm được ngay cả khi độ ẩm ở bề mặt quả ký chủ thấp Nấm bắt đầu phát triển mạnh mẽ và biểu hiện thành bệnh khi gặp độ ẩm thích hợp Thanh long có hàm lượng nước cao lên đến

87% là môi trường thuận lợi cho C gloeosporioides phát triển và gây hại [17]

1.2.3 Cơ chế gây thối hỏng trái cây của nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides

Nấm C gloeosporioides có thể tồn tại ở nhiều vị trí khác nhau của cây trồng: tồn

tại trong hạt giống, trên cây ký chủ và trên tàn dư cây trồng sau thu hoạch Chúng phát tán nguồn bệnh nhờ mưa và nước Sau khi tiếp xúc trên bề mặt quả, khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm, phát triển và gây bệnh [16]

Thanh long là loại quả rất dễ bị hư hại bởi các loại bệnh khác nhau, chúng có thể gây bệnh ở nhiều bộ phận, bằng nhiều con đường lây nhiễm khác nhau Gặp điều kiện thuận lợi (ẩm độ, nhiệt độ), bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm

Quá trình xâm nhập này có thể xảy ra qua hai con đường chính [16]: - Xâm nhập trực tiếp qua bề mặt ký chủ nguyên vẹn

- Xâm nhập thông qua các vết thương trên bề mặt quả do các tác động cơ học làm bầm dập, nứt quả

2.2.3.1 Xâm nhập trực tiếp qua bề mặt ký chủ nguyên vẹn

Colletotrichum spp thuộc nhóm nấm hoại dưỡng (necrotrophic), nghĩa là trong

quá trình xâm nhập luôn tiết ra các enzyme thủy phân và các độc tố để phá hủy mô tế

bào vật chủ Tuy nhiên trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhập, Colletotrichum

spp lại tấn công và tiến hành hoạt động giết chết tế bào chủ như một nấm sinh dưỡng (biotrophic), kết hợp với lượng lớn sợi nấm chính trong tế bào Quá trình sinh dưỡng

này thường không kéo dài lâu (từ ít hơn 24 giờ đến 42 giờ) nên Colletotrichum spp

còn gọi là loài nấm bán sinh dưỡng (hemibiotrophic), sau đó chúng sẽ phát triển sang

giai đoạn hoại dưỡng, kết hợp với các sợi nấm thứ cấp [2], [18]

Khi bào tử tiếp xúc với bề mặt kí chủ, chúng lắng đọng và gắn kết lại với nhau Gặp điều kiện thuận lợi, bào tử bắt đầu nảy mầm thành ống mầm, đầu ống mầm sẽ hình thành một cấu trúc đặc biệt gọi là giác bám hay còn gọi là vòi áp/vòi bám/đĩa áp (appressorium) Sau đó, giác bám hình thành đế xâm nhập hay còn gọi là vòi xâm nhập/móc xâm nhập (penetration peg) đâm xuyên qua mặt ký chủ gồm tầng cutin và vách tế bào Sự hình thành vòi xâm nhập đâm xuyên qua bề mặt ký chủ tạo ra cấu trúc vòi hút sau đó tạo ra áp lực thẩm tích cao hút nước từ bên ngoài vào trong giác bám và một áp suất trương lớn được tạo ra Áp suất cao sẽ cho phép nấm xâm nhập dễ dàng qua bề mặt ký chủ bằng đế xâm nhập Mặc dù sự xâm nhập bằng giác bám và đế xâm nhập là do lực cơ học nhưng nấm cũng tiết ra các enzyme để hỗ trợ sự xâm nhập như

các cellulase và pectinase [19]

Sau khi xâm nhập vào tế bào, các sợi nấm có thể trương phồng lên hình thành nên một túi bọng gọi là tiểu nang (vesicle) và sợi nấm chính (primari hyphae) Trong giai đoạn sinh dưỡng (biotrophic), các tế bào chủ vẫn còn sống, màng tế bào của nó có thể được nhìn thấy xung quanh các sợi nấm Một hai ngày sau màng tế bào phân cách đó mỏng dần và bắt đầu bị phân hủy, làm chết tổ chức tế bào ở đó Tương tự với các tế bào xung quanh, quá trình sinh dưỡng này cứ thế tiếp tục Tiếp theo đó, xảy ra

quá trình hoại dưỡng, phá vỡ tế bào dưới tác dụng của hệ thống enzyme do các sợi nấm thứ cấp sản xuất ra Bỏ qua giai đoạn sinh dưỡng, giai đoạn hoại tử nhanh chóng xảy ra trong trường hợp này các sợi nấm lây lan khắp các vách ngăn giữa các tế bào vật chủ và cả trong tế bào thông qua lớp biểu bì dưới, đồng thời tiết ra enzyme phân hủy vách tế bào và nguyên sinh chất của vật chủ, quá trình nhiễm trùng không đi kèm việc phát sinh các sợi nấm thứ cấp [20]

2.2.3.2 Xâm nhập gián tiếp qua các vết nứt tự nhiên, các vết thương cơ giới

Sau thu hoạch, sức đề kháng của quả sẽ giảm dần trong thời gian chín và lưu trữ, lúc này các mầm bệnh dễ dàng nhiễm vào quả ký chủ và gây hại Quá trình xâm nhập sẽ diễn ra nhanh chóng hay kéo dài phụ thuộc vào khả năng kháng của vật chủ Trong quá trình thu hoạch, vận chuyển và bảo quản việc tạo ra các tổn thương cơ học khó tránh khỏi, đây là điều kiện thuận lợi cho các loại nấm xâm nhập và phát triển nhanh chóng, gây bệnh sau thu hoạch trên quả Thông thường, độ ẩm trên bề mặt quả không đáp được sự nảy mầm của bào tử, tuy nhiên nếu bào tử tiếp xúc tại vết thương, dịch quả tiết ra sẽ tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sự nảy mầm [19]

Sau khi xâm nhập thành công, sợi nấm tiết ra các độc tố ngấm vào mô quả để tiêu diệt các tế bào Các enzyme ngoại bào thực hiện chức năng chuyển hóa các chất phức tạp thành các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp mà tế bào nấm có thể hấp thu làm quả nhanh chóng bị hư hỏng [21]

1.3 Tống quan về chitosan và nano chitosan 1.3.1 Tính chất chitosan và naono chitosan

Chitosan là một aminopolysaccharide mạch thẳng của glucosamine và acetylglucosamine, thu được bằng cách khử acetyl của chitin giải phóng nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C (2), được chiết xuất từ vỏ các loài giáp xác (tôm, cua, hến, trai, sò, mai mực, …), cũng như từ các màng tế bào của một số loại nấm Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là Poly--(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi

N-là poly--(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose Chitin có mức độ khử acetyl khoảng 75% trở lên thường được gọi là chitosan [22]

Chitosan có những tính chất cơ bản sau:

 Tính tan: Chitosan không hoà tan trong nước và dung dịch kiềm Tan trong dung dịch acid loãng tạo nhành một dung dịch keo có độ nhớt cao

 Chitosan tác dụng với Iốt trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan

 Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH<6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2) Chính tính chất này giúp cho chitosan thể hiện được khả năng kháng nấm, kháng khuẩn cao của mình khi liên kết với phần mang điện tích âm trên thành thế bào vi sinh vật

 Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học

Nanochitosan không những mang đầy đủ các tính chất của chitosan thông thường như không độc, có khả năng thích ứng sinh học cao, khả năng tự phân hủy, khả năng tạo màng…mà ở kích thước nanomet, có diện tích bề mặt lớn với điện tích dương lớn hơn, do đó hoạt tính sinh học cao hơn nhiều so với chitosan Chính đặc điểm khác biệt này đã tạo ra sự quan tâm đáng kể theo hướng nghiên cứu ứng dụng chitosan ở kích thước nanomet trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp (kháng khuẩn, kháng nấm, kích thích sinh trưởng, bảo vệ cây trồng)

1.3.2 Các phương pháp tạo nanochitosan

Hiện nay, có nhiều phương pháp tạo nanochitosan Có các phương pháp phổ biến như sau: phương pháp khâu mạch nhũ tương; phương pháp tạo giọt/kết tủa; khuếch tán dung môi nhũ tương; phương pháp sấy phun; phương pháp tạo gel ion [21]

- Phương pháp hợp giọt nhũ tương

Phương pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang và kết tủa Một hệ nhũ tương W/O bền vững chứa chitosan trong dung dịch paraffin Đồng thời một hệ nhũ tương khác cũng được chuẩn bị song song bằng cách cho NaOH vào trong hỗn hợp nhũ tương giống như trên Sau đó, trộn đều hai hệ nhũ tương này vào nhau trong điều kiện có kết hợp cánh khuấy với tốc độ cao, nhờ tác dụng của cánh khuấy các giọt sẽ chuyển động liên tục, va chạm ngẫu nhiên vào nhau và kết tủa lại tạo các hạt có kích thước nanomet Phương pháp này cho thấy rằng khi mức độ deacetyl hóa của chitosan giảm dẫn đến các nối đôi được hình thành giảm, điều này sẽ làm tăng kích thước và giảm số lượng các hạt nano được hình thành [22], [23]

- Phương pháp khuếch tán dung môi nhũ tương

Phương pháp này liên quan tới việc bổ sung một pha dung môi hữu cơ như methylene clorua và acetone Hỗn hợp nhũ tương O/W được hình thành khi cho hỗn hợp dung môi hữu cơ trên vào khuấy trộn cùng dung dịch có chứa chitosan và chất ổn định như poloxamer và lecithin Hỗn hợp nhũ tương này sau đó được đưa đi đồng hóa dưới áp suất cao Ở giai đoạn này acetone sẽ khuyếch tán vào trong pha nước làm giảm khả năng hòa tan của chitosan và tạo thành các hạt kết tủa có kích thước nanomet Các hạt nano chitosan được thu hồi bằng cách ly tâm Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thực hiện phức tạp [24]

- Phương pháp tạo gel ionic (ionic gelation)

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và một polyanion như Sodium tripolyphosphat hoặc glutaraldehyde, Lúc này các nhóm -NH2 của chitosan sẽ liên kết với nhóm H3P3O102- của STTP hay -CHO của glutaraldehyde và nhờ đó các hạt nano chitosan được hình thành Đầu tiên chitosan được hòa tan vào dung dịch axit acetic Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục ở nhiệt độ phòng Kích thước và điện tích bề mặt phụ thuộc vào tỷ lệ chitosan và polyanion, pH, và loại polyanion khác nhau

Phương pháp này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản, chi phí thấp, dễ thực hiện, hạt nano chitosan có kích thước hạt nhỏ, phân bố kích thước đồng đều và điện thế hạt nano cao Đây cũng là phương pháp thường được lựa chọn phổ biến cho các nghiên cứu ứng dụng nanochitosan [24]

- Phương pháp sấy phun:

Sấy phun là kỹ thuật phổ biến ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm để tạo bột, hạt từ hỗn hợp huyền phù thuốc với tá dược, thực phẩm Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc dung dịch huyền phù được làm khô khi được phun trong dòng không khí nóng Trong phương pháp này, chitosan được hòa tan thành dung dịch, sau đó bổ sung hoạt chất khâu mạch và được phun vào dòng không khí nóng, kết quả các hạt nano chitosan được tạo thành [24]

- Phương pháp tạo giọt kết tủa (coacervation/precipitation)

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch kiềm hoặc acid đậm đặc Để tạo ra các hạt nano chitosan dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm, lúc này chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH - methanol hoặc ethandiamine [23]

Phương pháp này có thể được cải tiến hơn bằng cách nhỏ dung dịch natri sunphat vào dung dịch chitosan (pH acid có chất hoạt động bề mặt) trong điều kiện khuấy và tác động của sóng siêu âm (ultrasonic) Hạt nano chitosan thu được bằng cách ly tâm,

sau đó tiếp tục bước làm cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với glutaraldehyde

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan

Cơ chế hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm của nanochitosan: Nanochitosan xâm nhập vào tế bào chất của vi sinh vật và thông qua liên kết của chúng với DNA, gây trở ngại đến sự tổng hợp của mRNA và protein [25], [26]

Nanochitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một lớp polymer bán thấm làm thay đổi tính thấm của tế bào và ngăn ngừa các chất dinh dưỡng đi vào tế bào [27]

Màng tế bào vi sinh vật có chứa các gốc tích điện âm, màng có vai trò điều hòa sự trao đổi chất giữa tế bào và môi trường xung quanh Khi có mặt chitosan sẽ xảy ra liên kết giữa các gốc tích điện dương trên phân tử của chúng với các gốc tích điện âm trên màng ngoài tế bào vi sinh vật dẫn đến những thay đổi trong cấu trúc màng tế bào và tính thấm của màng, rò rỉ tế bào chất Vì vậy, chế phẩm nanochitosan làm thay đổi các chức năng sinh hóa và sinh lý của vi sinh vật dẫn đến rối loạn trao đổi chất và cuối cùng là vi sinh vật chết

Nanochitosan đóng vai trò như một chất tạo phức, là chất liên kết có chọn lọc với các kim loại vết, sau đó ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật

Nanno chitosan kích hoạt một số phản ứng phòng vệ trong mô vật chủ để chống lại các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài môi trường bằng việc kích ứng cho hoạt động sản sinh các enzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, glucanase và phenylalanine ammonia-lyase Đồng thời làm tăng việc tổng hợp các hợp chất phytoalexin, chất ức chế protease và lignin, các hợp chất phenolic (axit ferulic, axít salicylic, axit p-coumaric) là các thành phần quan trọng trong hoạt động bảo vệ vật chủ trước sự xâm nhập của các tế bào gây bệnh [28]

1.4 Những công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu ứng dụng nanochitosan trong y dược và thực phẩm để kháng khuẩn, kháng nấm gây hại trên các đối tượng rau quả sau thu hoạch đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, tuy nhiên số lượng các nghiên cứu này vẫn chưa nhiều

Năm 2006, T.T Hoa và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về phương pháp xử lý hơi nước nóng trên thanh long cho kết quả phương pháp xử lý hơi nước nóng có thể giúp kéo dài thời gian bảo quản thanh long lên 4 tuần ở nhiệt đô 50C [29]

Năm 2010, A Ali và cộng sự nghiên cứu bảo quản một số loại trái cây nhiệt đới bằng nano chitosan có kích thước 200, 400, 600, 800 và 1000 nm ở các nồng độ khác

nhau trong điều kiện in vitro với các chủng thán thư phân lập từ chuối, đu đủ và thanh

long Kết quả kích thước nano chitosan 200nm có hiệu quả trên chuối, 600nm có hiệu

quả trên đu đủ và thanh long với các chủng thán thư phân lập trên các loại trái cây ở

điều kiện in vitro và duy trì chất lượng ở tất cả trái cây sau 28 ngày bảo quản lạnh [30]

Năm 2011, A Ali và cộng sự nghiên cứu bảo quản đu đủ bằng chitosan kết quả chitosan giúp hạn chế sự thất thoát khối lượng, duy trì cấu trúc cũng như tính chất cảm quan của quả đu đủ sau 5 tuần bảo quản ở 120C, độ ẩm 85 – 90% [31]

Năm 2012, N Zahid, A Ali và cộng sự nghiên cứu tác dụng của nanochitosan ở

kích thước 200nm, 600nm và 1000nm đối với Colletotrichum gloeosporioides gây

bệnh thán thư trên quả thanh long Kết quả cho thấy với kích thước 600nm đạt hiệu quả

kháng nấm tốt nhất trong điều kiện in vitro, thể hiện ở việc ức chế sự hình thành bào

tử, nảy mầm của bào tử và sinh khối Một kết quả trong nghiên cứu khi chitosan sử dụng ở nồng độ lớn hơn 1,5% gây ra những ảnh hưởng xấu đến chất lượng của trái cây [6]

Năm 2013, A.Ali và cộng sự nghiên cứu hiệu quả của nano chitosan trong kiểm soát bệnh thán thư và duy trì chất lượng của thanh long Kết quả kích thước nano

chitosan 600nm nồng độ 1% có hiệu quả kháng nấm Colletotrichum gloesporioides

phân lập từ thanh long duy trì chất lượng 28 ngày ở 10+- 20C [3] Năm 2013, A Fabregas và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số vật lý tổng hợp hạt nanochitosan dựa trên phương pháp ion gel hóa của chitosan với STPP Kết quả tạo ra các kích thước nano chitosan kích thước dao động từ 113 đến 296 nm [32]

Năm 2014, N.Zahid, S.Manickam và A.Ali nghiên cứu khả năng trị bệnh của nanochitosan và sinh trưởng của cây thanh long Kết quả kích thước 600nm nanochitosan 1% có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh thán thư trên cây thanh long [33]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Khả năng kháng nấm nanochitosan đã được khẳng định trong nhiều nghiên cứu với nhiều đối tượng khác nhau ở nước ngoài trong những năm gần đây Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng nanochitosan vẫn còn khá mới

Năm 2011, Dương Thị Ánh Tuyết và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo nanochitosan bằng phương pháp tạo gel ion làm chất hấp phụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc Kết quả cho thấy với tỷ lệ chitosan/STPP là 6/1 tại pH 4 cho chế phẩm nanochitosan có kích thước nhỏ nhất 48,70nm Sử dụng chế phẩm này làm chất hấp phụ protein cho thấy khả năng hấp phụ cao 96,41 % (1,93 mg/mg) tại 0,5 mg hạt nanochitosan [34]

Năm 2013, Lê Thanh Long và các cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân chitosan tạo oligochitosan bằng H2O2, và ứng dụng vào việc kháng E.coli và

kháng thán thư trên xoài [35], [36] Tóm lại, theo các công bố trong và ngoài nước các phương pháp phổ biến để chế tạo nanochitosan là tạo gel ion Các nghiên cứu về ứng dụng nanochitosan tạo màng bao nhằm mục đích bảo quản rau quả hiện nay vẫn đang phát triển Đề tài sẽ góp phần vào phương pháp bảo quản thanh long một cách an toàn và hiệu quả

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu thanh long

Mẫu thanh vỏ đỏ ruột trắng thu nhận từ vườn thanh long xã Hàm Thắng, Huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận Có đặc điểm:

 Độ chín: 5 điểm (sau 30 ngày kết trái)

 Khối lượng trung bình 450-600g

Độ tan Không tan trong nước, tan trong kiềm và dung mô hữu cơ tan

trong dung dịch acid loãng, tạo thành dung dịch keo trong suốt màu vàng

Chỉ tiêu hóa lý

Mức độ acetyl hóa 97,2% Phân tử lượng 57,7kDa

2.1.3 Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides

Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được lấy từ trung tâm nông nghiệp

công nghệ cao Củ Chi –TP.HCM

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được chuẩn bị và gây nhiễm ở các

nồng độ khác nhau và quan sát sự phát triển của nấm thông qua đường kính tản nấm để

xác định ngưỡng gây bệnh

Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được nuôi cấy trên môi trường thạch

Potato Dextro Agar (PDA) có nanochitosan để khảo sát ảnh hưởng của nanochitosan

đến khả năng sinh trưởng, phát triển của đối tượng nấm mốc trong điều kiện in vitro Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides được cấy nhân tạo trên quả thanh long

và xử lý nanochitosan, khảo sát ảnh hưởng của nanochitosan đến khả năng sinh trưởng,

phát triển của đối tượng nấm mốc trong điều kiện in vivo

Kích thước hạt nanochitosan được chụp và xác định bằng kính hiển vi điện tử quét SEM, tại trung tâm Công Nghệ Cao Thành phố Hồ Chí Minh

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể phương pháp nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp tạo chế phẩm nano chitosan

Nanochitosan được tạo bằng phương pháp tạo gel ion với STPP tham khảo kết quả của A Fabregas và cộng sự [32]

Cách tiến hành:

Dung dịch chitosan nồng độ 0,2% (w/v) được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong dung dịch acid acetic 1% (w/v), tiến hành lắc hòa tan trong 2 giờ ở nhiệt độ thường Sau đó, điều chỉnh pH của dung dịch đến pH = 5,0 bằng NaOH 5N và đem lọc thu dung dịch

Sau đó nhỏ từ từ STPP 0,84 mg/ml vào dung dịch chitosan bằng thiết khuấy từ ở nhiệt độ phòng, tốc độ như bố trí như bảng 2.2 Với tỷ lệ chitosan/STPP là 2,5/1 (v/v) theo thời gian khuấy tạo gel ion như đã bố trí

Xác định ngưỡng gây bệnh nhân tạo của

nấm Colletotrichum gloeosporioides trên

quả thanh long

Khảo sát thời gian bảo quản thanh long ở điều kiện 150C kết hợp với nanochitosan ở kết quả

in vivo

Khảo sát khả năng kháng

nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây bệnh trên

thanh long trong điều kiện in

vivo

Xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát triển

của nấm Colletotrichum

gloeosporioides trong điều kiện in

vitro

KÍCH THƯỚC

NANO

Chỉ tiêu theo dõi: Hình ảnh và kích thước hạt nanochitosan được chụp và xác định bằng kính hiển vi điện tử FE - SEM, Hitachi Nhật, tại trung tâm công nghệ cao TP.HCM

Bảng 2.2 Bảng bố trí điều kiện tạo nanochitosan

(phút)

Tốc độ khuấy (vòng/phút)

2.2.3.1 Thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh nhân tạo của nấm Colletotrichum

gloeosporioides trên quả thanh long

Nguyên tắc: Tạo vết thương nhân tạo đồng đều trên quả thanh long ở các công

thức khảo sát, cấy bào tử nấm vào vết thương đã tạo và theo dõi sự hình thành vết bệnh, tỷ lệ mắc bệnh Ở nồng độ bào tử thấp nhất mà 100% các vết bệnh được hình thành sau thời gian theo dõi được lấy là ngưỡng gây bệnh của nấm

Các bước tiến hành: Colletotrichum gloeosporioides được nuôi cấy trên môi

trường PDA, thu bào tử và pha loãng thành các nồng độ tương ứng với các công thức [37]

 NBĐ (mẫu đối chứng): 0 bào tử/ml,

Lấy 3 quả thanh long, tiến hành tạo 5 vết bệnh giống nhau trên mỗi quả bằng cách tạo vết thương trên quả bằng dao mổ nhọn sâu 1mm, sau đó nhỏ 10 µl bào tử ở các công thức thí nghiệm trên vào vết thương, để khô tự nhiên Thực hiện thí nghiệm 3 lần [38]

Đặt mẫu quả vào khay nhựa đã được sát trùng bằng cồn 700, sau đó ủ mẫu ở nhiệt độ phòng Tiến hành theo dõi thời gian hình thành vết bệnh và tỉ lệ bệnh ở các công thức [38]

Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Thời gian hình thành vết bệnh (giờ) + Theo dõi tỷ lệ bệnh (TLB) ở các công thức TLB của nhóm bệnh được tính theo công thức sau [39]:

( )

∑

Trong đó:

TLB: tỉ lệ vết bệnh VB : số vết bệnh hình thành VT: số vết thương nhân tạo

2.2.3.2 Thí nghiệm xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát triển

của nấm Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện in vitro

Thực hiện nuôi cấy bào tử nấm mốc trên môi trường PDA có bổ sung nanochitosan ở các nồng độ khác nhau 0%; 0,04%; 0,06%; 0,08%; 0,1%; 0,14% mỗi nồng độ 3 kích thước NCT1, NCT2, NCT3 và theo dõi khả năng phát triển của chúng thông qua thời gian nảy mầm và tốc độ phát triển đường kính tản nấm tạo thành Ở nồng độ mà đường kính tản nấm càng nhỏ thì khả năng ức chế càng cao

Cách tiến hành: Thí nghiệm được bố trí trên đĩa petri với 15 công thức và 1 mẫu

đối chứng, lặp lại 3 lần trên môi trường PDA Các đĩa môi trường PDA được bổ sung nano chitosan theo 15 công thức (CT) sau:

 CT 1 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,04%)

 CT 2 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,06%)

 CT 3 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,08%)

 CT 4 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,1%)

 CT 5 (nano chitosan kích thước hạt NCT1, nồng độ 0,14%)

 CT 6 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,04%)

 CT 7 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,06%)

 CT 8 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,8%)

 CT 9 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,1%)

 CT 10 (nano chitosan kích thước hạt NCT2, nồng độ 0,14%)

 CT 11 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,04%)

 CT 12 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,06%)

 CT 13 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,08%)

 CT 14 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,1%)

 CT 15 (nano chitosan kích thước hạt NCT3, nồng độ 0,14%)

Cấy 10µl bào tử nấm theo công thức thu được từ thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh vào giữa đĩa petri đã chuẩn bị sẵn

+ Xác định hiệu lực ức chế được tính theo tỷ lệ phần trăm (%) ức chế tốc độ phát triển của đường kính tản nấm, PIRG (%) (Percentage Inhibition of Radial Growth) [36] [40]

PIRG(%)=

Nguyên tắc: Tiến hành việc phủ màng nanochitosan ở các công thức khác nhau,

lây bệnh nhân tạo bằng bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides trên quả thanh long

Bình Thuận Sau đó theo dõi sự phát triển của bệnh Ở công thức mà số vết bệnh tạo

thành càng ít, đường kính bệnh càng nhỏ thì hiệu quả càng cao

Cách tiến hành: Chọn kích thước thu được ở điều kiện in vitro (AA1) cho hiệu

quả để thực hiện khảo sát Nồng độ nanochitosan 0,06; 0,08; 0.1; 0,12; 0,14% dùng

trong thí nghiệm này được chuẩn bị theo các công thức

Thí nghiệm được bố trí 5 công thức, lặp lại 3 lần

 CTV 1 (nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,06%)

 CTV 2 (nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,08%)

 CTV 3 (nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,1%)

 CTV 4 (nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,12%)

 CTV 5 (nano chitosan kích thước hạt AA1, nồng độ 0,14%) Mẫu thanh long sau khi mua về được tiến hành rửa sạch qua bằng nước, khử trùng bề mặt bằng cồn 70o rồi rửa lại bằng nước cất và làm khô bề mặt tự nhiên Sau khi bề mặt quả đã khô, tiến hành tạo màng bao trên bề mặt quả bằng cách nhúng quả vào dung dịch nanochitosan theo các công thức đã bố trí [38]

Bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides thu được đã xác định nồng độ bào tử

và tiến hành lây bệnh nhân tạo trên quả thanh long bằng cách: Sử dụng dao mổ nhọn vô trùng để lây bệnh, mỗi quả tạo 5 vết thương, với độ sâu và rộng là 1 mm Dùng pippet lấy 10 µl bào tử nấm đã chuẩn bị ở trên cho vào các vết

thương đã tạo, để khô tự nhiên, mỗi công thức tiến hành trên 3 quả Thực hiện thí nghiệm ba lần

Cho các mẫu quả vào khay được lót giấy vô trùng, tiến hành ủ bệnh ở 280C Sau khi vết bệnh bắt đầu hình thành, tiến hành đo đường kính vết bệnh hằng ngày bằng thước đo và xác định mức độ phát triển bệnh ở các công thức thí nghiệm

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Thời gian hình thành vết bệnh (h) + Theo dõi tỷ lệ bệnh ở các công thức + Kích thước vết bệnh (mm)

Tỷ lệ bệnh ở các công thức được tính theo công thức [39]:

( )

∑

Trong đó:

TLB: tỉ lệ vết bệnh VB : số vết bệnh hình thành VT: số vết thương nhân tạo

nanochitosan ở kết quả in vivo

Thí nghiệm được thực hiện đồng thời trên mẫu có sử dụng nanochitosan và mẫu

đối chứng không có nanochitosan và so sánh các kết quả thu được

Cách tiến hành: Thanh long lành bệnh được mua về và rửa sạch bằng nước để

khô tự nhiên.Sau đó, nhúng vào dung dịch nanochitosan trong 2 phút để khô tự nhiên Thanh long được bảo quản trong khay có lót giấy vô trùng ở 15 ± 20

C, độ ẩm 85% Theo dõi trong thời gian 35 ngày

Các chỉ tiêu theo dõi:

a Hao hụt khối lƣợng tự nhiên

Khối lượng quả trước và sau thời gian bảo quản sẽ được xác định bằng cân phân tích ADAM, giới hạn 0,000 – 3000g Tiến hành cân 3 quả sau mỗi 7 ngày bảo quản

Hao hụt khối lượng tự nhiên sẽ được tính bằng công thức:

( )

Trong đó:

X: hao hụt khối lượng tự nhiên (%) M1: khối lượng quả trước bảo quản (g) M2: khối lượng quả sau bảo quản (g)

b Xác định hàm lƣợng chất rắn hòa tan

Hàm lượng chất khô hòa tan được xác định bằng khúc xạ kế cầm tay PAL1, biểu thị bằng độ Brix Xay nhuyễn 100g thịt quả (được lấy ngẫu nhiên từ 3 quả), sau đó chiết lọc qua vải lọc và tiến hành đo Tiến hành đo sau mỗi 7 ngày

ATAGO-c Xác định pH

pH được xác định bằng máy đo pH cầm tay EUTECH-pH6 + biểu thị bằng pH giới hạn đo từ 0 ~ 14pH Xay nhuyễn 100g thịt quả (được lấy ngẫu nhiên từ 3 quả), sau đó chiết lọc qua vải lọc và tiến hành đo Tiến hành đo sau mỗi 7 ngày

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả thí nghiệm chế tạo nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion

Dung dịch nanochitosan được tạo bằng phương pháp tạo gel ion với sodium tripolyphosphate (STTP) với tốc độ khuấy và thời gian tạo gel, hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét FE - SEM S4800 Kết quả thu được ba kích thước nanochitosan

Hình 3.1 Ảnh chụp trên kính hiển vi điển tử FE – SEM của 3 công thức nanochitosan

(a) Nanochitosa kích thước trung bình 157nm (b) Nanochitosan kích thước trung bình 241nm (c) Nanochitosan kích thước trung bình 42nm

Ảnh FE-SEM của nanochitosan hình 3.1 cho thấy sự khác biệt kích thước của nanochitosan với ba công thức khác nhau Thông qua phản ứng tạo gel ion với STTP, các hạt hình cầu được hình thành với kích thước xác định

Bảng 3.1 Kết quả tạo nanochitosan ở các điều kiện

ion (phút)

Tốc độ khuấy (vòng/phút)

Tốc độ nhỏ STPP (ml/phút)

trung bình tạo đƣợc (nm)

Sự khác nhau của các kết quả trên thể được giải thích do sự khác biệt tác nhân tạo nối STPP về tốc độ khuấy, thời gian tạo gel

STPP là một polyanion, dung dịch chitosan là một polycation khi xảy ra phản ứng liên kết ion giữa nhóm NH3+ của chitosan và nhóm (H3P3O10)2- của STPP Khuấy từ ở tốc độ cao, liên tục trong suốt quá trình tạo liên kết Nanochitosan sẽ được tạo ra dưới hai chiều hướng khác nhau Một dưới tác dụng của lực khuấy, các phần tử chitosan còn vướng lại với nhau sẽ bị cắt thành những phần tử nhỏ hơn, sau đó tham gia phản ứng tạo

gel ion với những phân tử STPP các hạt nhỏ được hình thành Hai các phần tử trong quá

trình chuyển động không bị vướng lại với nhau, quá trình khuấy trộn sẽ kéo, tách những phân tử này xa nhau hơn Sau đó khi phản ứng với STPP chúng hình thành những hạt lớn hơn [43]

Tóm lại, khi sử dụng STTP trong việc tạo hạt với chitosan, phản ứng tạo liên kết ngang giữa một polyanion và một polycation dưới tác dụng của lực khuấy cắt đã tạo được hạt cấu trúc nanochitosan so với chitosan ban đầu