TỔNG QUAN
Tôm và phụ phẩm chế biến tôm
Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, năm 2021, diện tích tôm nước lợ thả nuôi đạt 747 nghìn ha (nuôi tôm sú là 626 nghìn ha, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng 121 nghìn ha) Sản lượng tôm nuôi các loại năm 2021 đạt 970 nghìn tấn (tăng 4,3% so với năm 2020); trong đó, tôm sú 265 nghìn tấn, tôm thẻ chân trắng 655 nghìn tấn, còn lại là tôm khác Kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2021 đạt 3,9 tỷ USD (tăng 5,4% so với năm 2020) Năm 2022, ngành thủy sản phấn đấu sản xuất khoảng 260-270 nghìn con tôm bố mẹ (tôm thẻ chân trắng 200-210 nghìn con, tôm sú 60 nghìn con); tôm giống khoảng 140-150 tỷ con (tôm thẻ chân trắng 100-110 tỷ con và tôm sú 30-40 tỷ con) Diện tích nuôi tôm đạt 750 nghìn ha; sản lượng tôm các loại 980 nghìn tấn, trong đó tôm sú 275 nghìn tấn, tôm thẻ chân trắng 675 nghìn tấn, còn lại là tôm khác Kim ngạch xuất khẩu tôm đạt 4 tỷ USD
Theo Bộ Công thương Việt Nam, phần lớn tôm xuất khẩu được đưa vào chế biến dưới dạng bóc vỏ bỏ đầu, tỷ lệ đầu chiếm 34-45%, phần vỏ còn lại chiếm 10-15% trọng lượng của tôm nguyên liệu do đó lượng phế liệu tôm ở Việt nam ước tính khoảng 325 nghìn tấn/năm (năm 2019) Ngành tôm tăng trưởng nhanh kéo theo lượng phụ phẩm tôm cũng gia tăng theo tỉ lệ thuận, có thể lên đến hơn 450 nghìn tấn vào năm 2025, tương ứng mỗi ngày có hơn 1 000 tấn phụ phẩm bị thải loại khỏi dây chuyền sản xuất
Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2018, sản lượng nuôi trồng tôm là 766 nghìn tấn, giá trị xuất khẩu đạt 3,55 tỷ USD, trong đó tổng lượng phụ phẩm tôm đã 250-350 nghìn tấn; dự tính, tới giai đoạn 2021-2025, với sản lượng nuôi trồng 1,1 triệu tấn, Chính phủ kỳ vọng giá trị xuất khẩu đạt 10 tỷ USD, trong đó lượng phụ phẩm tôm sẽ là 400-500 nghìn tấn
Trên thế giới, khoảng 4 triệu tấn tôm được khai thác và chế biến (số liệu năm 2018) [1] Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất sản phẩm từ tôm, chủ yếu là tôm đông lạnh, phụ phẩm chế biến tôm gồm đầu, vỏ, đuôi, chân tôm chiếm 48-56% khối lượng tôm bị thải bỏ [2, 8] Việc thải bỏ phụ phẩm chưa qua xử lý dẫn đến nguy cơ cao gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người do các hợp chất phân giải bởi các vi sinh vật [9] Do đó, việc tập trung vào nghiên cứu tận dụng phụ phẩm của
4 ngành chế biến thủy hải sản tạo ra những sản phẩm có giá trị gia tăng đã và đang thu hút các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới
Nguồn: V Đức, “Thủy sản Việt Nam,” 20 03 2022 [Trực tuyến] Available: https://thuysanvietnam.com.vn/bot-dau-tom-nguyen-lieu-thuc-an-tu-phu-phe-pham-tom-su/
Phụ phẩm tôm được công bố có chứa 20-40% protein, 20-50% canxi carbonate, 15-40% chitin, hợp chất màu và lipid [10] Từ đó có thể thấy, phụ phẩm tôm là nguồn tiềm năng thu nhận các hợp chất sinh học như protein, chitin, các hợp chất màu,… Canxi carbonate từ phụ phẩm tôm được thu nhận, sau đó chuyển thành canxi oxit nhờ vào quá trình xử lý nhiệt và sử dụng như chất kháng khuẩn, kháng nấm, chất xúc tác cho quá trình sản xuất dầu diesel sinh học [11, 12] Protein trong phụ phẩm tôm được nhiều nhà khoa học tận dụng sản xuất dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng oxy hóa [13-15], hoạt tính liên kết sắt [16, 17], hoạt tính liên kết đồng [18],…Các nghiên cứu thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm cũng được nhiều nhà khoa học công bố [9, 21, 22].
Chitin từ phụ phẩm tôm
Cấu trúc hóa học của chitin (poly (N-acetyl D-glucosamine) hoặc poly- 𝛽𝛽-[1,4]-N- acetyl-d-glucosamine) gần giống với cellulose nhưng nhóm hydroxyl (-OH) ở vị trí C2 được thay thế bởi nhóm acetyl amine (-NHCOCH3) [1] (Hình 1.2)
Nguồn: S M Joseph, S Krishnamoorthy, R Paranthaman, J A Moses, and C
Anandharamakrishnan, “A review on source-specific chemistry, functionality, and applications of chitin and chitosan,” Carbohydr Polym Technol Appl., vol 2, no January, p 100036, 2021, doi:
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chitin
Trong tự nhiên, chitin tồn tại 3 dạng dị hình, 𝛼𝛼-, 𝛽𝛽-, và 𝛾𝛾-chitin (Hình 1.3 và Hình 1.4):
𝛼𝛼-chitin là dạng tồn tại chủ yếu của chitin và được tìm thấy trong nhiều nguồn khác như như con ruốc, tôm hùm, cua và biểu bì côn trùng [1] Vi sợi trong 𝛼𝛼-chitin sắp xếp song song ngược chiều nhau, dễ dàng hình thành liên kết hydro nội phân tử, tạo ra cấu trúc chặt chẽ, tăng độ tinh thể và độ cứng [23]
𝛽𝛽-chitin có mặt trong nang mực và Aphrodite chaetae [1] 𝛽𝛽-chitin có sự sắp xếp các vi sợi song song cùng chiều nhau, hạn chế hình thành liên kết hydro nội phân tử, cấu trúc linh động hơn 𝛼𝛼-chitin [23]
𝛾𝛾-chitin được tìm thấy trong mực Loligo và bọ cánh cứng Ptinus [1] 𝛾𝛾-chitin là dạng hỗn hợp cấu trúc 𝛼𝛼-chitin và 𝛽𝛽-chitin [23]
Quá trình sinh tổng hợp chitin trong động vật giáp xác bắt đầu từ quá trình thủy phân glycogen bởi enzyme phosphorylase và sản phẩm được chuyển thành glucose-1-Phosphate Dưới tác động của enzyme phosphomutase, glucose-1-phosphate chuyển thành glucose-6-phosphate trước khi tạo thành fructose-6-phosphate bởi enzyme hexokinase Khi có mặt L-glutamine và enzyme aminotransferase, fructose-6- phosphate được chuyển hóa thành glucosamine-6-Phosphate Sau đó, N-
6 acetyltransferase chuyển gốc acetyl từ acetyl co-A vào glucosamine-6-Phosphate để tạo thành N-acetylglucosamine-6-Phosphate Tiếp theo, phosphoacetylglucosamine mutase xúc tác phản ứng chuyển N-acetylglucosamine-6-Phosphate thành N- acetylglucosamine-1-Phosphate và tiếp tục được chuyển hóa thành UDP-N- acetylglucosamine nhờ vào enzyme pyrophosphorylase Từ đó, chitin được hình thành dưới sự xúc tác của enzyme chitin synthase [24]
Nguồn: T Fgd, M Lel, A Sml, D Rjsp, R O V, and L Pighinelli, “Nanomedicine and Nanoscience Research Different Aspects of Chemical and Biochemical Methods for Chitin Production a Short Review,” J Nanomed Nanosci, no 2, pp 1–11, 2018, doi: 10.29011/2577-1477
Hình 1.3 Cấu trúc 𝛼𝛼 -chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾 -chitin
Vỏ tôm bao gồm 3 lớp màng: màng ngoài, màng giữa và màng trong Chitin có mặt chủ yếu ở màng trong của lớp vỏ và được bao bọc bởi protein, góp phần tạo nên độ cứng của vỏ tôm Lớp màng trung gian chứa chitin và khoáng trong khi lớp màng ngoài chứa canxi carbonate và protein [25, 26] Vì vậy, để thu nhận chitin cần loại bỏ
7 muối canxi carbonate và protein [27] (Hình 1.5) Tổng quát quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bao gồm tiền xử lý vỏ tôm và loại bỏ protein và khoáng (Hình 1.6)
Nguồn: T Fgd, M Lel, A Sml, D Rjsp, R O V, and L Pighinelli, “Nanomedicine and Nanoscience Research Different Aspects of Chemical and Biochemical Methods for Chitin Production a Short Review,” J Nanomed Nanosci, no 2, pp 1–11, 2018, doi: 10.29011/2577-1477
Trái sang phải: 𝛼𝛼-chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾-chitin
Hình 1.4 Sự sắp xếp các vi sợi trong 𝛼𝛼 -chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾 -chitin
Các phương pháp loại bỏ protein và canxi carbonate gồm phương pháp hóa học (sử dụng acid và kiềm mạnh), phương pháp hóa sinh (sử dụng chế phẩm enzyme), phương pháp sinh học (sử dụng vi sinh vật)
Nguồn: J Chakravarty, C L Yang, J Palmer, and C J Brigham, “Chitin extraction from lobster shell waste using microbial culture-based methods,” Appl Food Biotechnol., vol 5, no 3, pp 141–
Hình 1.5: Mô phỏng quá trình thu nhận chitin từ tôm
Hình 1.6 Quy trình tổng quát thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm
1.2.1 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học
Loại khoáng là quá trình loại bỏ khoáng khỏi phụ phẩm tôm, đặc biệt là canxi carbonate, bằng acid mạnh, thường dùng là sulfuric acid, hydrochloric acid, acetic acid, nitric acid, và formic acid [28] Trong những acid trên, hydrochloric acid (HCl) là acid được sử dụng phổ biến nhất Điều kiện loại khoáng thường được áp dụng gồm nồng độ HCl 0,25-2M, nhiệt độ gần 100⁰C, thời gian xử lý 0,5-48 giờ [1] Hydrochloric acid phản ứng với canxi carbonate (dạng rắn) tạo thành canxi clorua tan trong dung dịch và giải phóng khí CO2, phương trình phản ứng như sau [28]:
Loại protein là quá trình phá vỡ liên kết hóa học giữa protein và chitin bằng cách sử dụng base Để ứng dụng trong lĩnh vực y sinh, loại protein ra khỏi chitin là một bước rất quan trọng do protein có thể gây dị ứng cho con người Thông thường, dung dịch NaOH với nồng độ 0,125-5,0 M được sử dụng để loại protein trong vỏ tôm dưới điều kiện nhiệt độ 60-100⁰C, thời gian xử lý 1-72 giờ [1] Tuy nhiên, NaOH không chỉ loại protein mà còn deacetyl hóa chitin [28] Do đó mức độ acetyl hóa của chitin thu được khó kiểm soát
Trong vỏ tôm có chứa hợp chất màu, điển hình là carotenoid với hàm lượng 24-50 àg/g phụ phẩm tụm [29, 30] Do đú, trong quỏ trỡnh thu nhận chitin từ phụ
9 phẩm tôm đòi hỏi phải thực hiện quá trình khử màu để thu được sản phẩm chitin không màu Dung môi hữu cơ như hexane, acetone, natri hypochlorite, và hydrogen peroxide thường được sử dụng để khử màu chitin từ phụ phẩm tôm [28]
Chitin thu được bằng phương pháp xử lý hóa học ở nhiệt độ phòng có mức độ khử khoáng cũng như khử protein ở mức trung bình 70-80% Hiệu quả khử khoáng và khử protein có thể đạt tới 98-100% trong điều kiện xử lý nhiệt độ cao (50-90⁰C) trong thời gian dài (lên tới 24 giờ) hoặc cần nồng độ acid/ kiềm cao (1-2M) (Bảng 1.1)
Bảng 1.1 Hiệu quả khử khoáng và khử protein trên phụ phẩm tôm sử dụng phương pháp hóa học Điều kiện xử lý Hiệu quả khử khoáng
HCl 0,25 M, tỷ lệ 1:25 (g/ml), 2 giờ, nhiệt độ phòng
NaOH 0,5 M, tỷ lệ 1:25 (g/ml), 2 giờ, nhiệt độ phòng
HCl 0,55M, tỷ lệ 1:10 (g/ml), 15 phút, nhiệt độ phòng
NaOH 1M, tỷ lệ 1:1 (g/ml), 24 giờ, 70⁰C
HCl 1,55 M, tỷ lệ 1:10 (g/ml), 6 giờ, 50⁰C
NaOH 0,75M, tỷ lệ 1:2,25 (g/ml), 24 giờ, nhiệt độ phòng
HCl 1,1 M, tỷ lệ 1:10 (g/ml), 6 giờ, nhiệt độ phòng
NaOH 0,5M, tỷ lệ 1:30 (g/ml), 24 giờ, 90⁰C
HCl 0,5 M, tỷ lệ 1:10 (g/ml), 90 phút, nhiệt độ phòng
NaOH 2M, tỷ lệ 1:4 (g/ml), 4 giờ, 45⁰C
Mặc dù phương pháp hóa học hiệu quả trong việc loại khoáng, loại protein để thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm, nhưng xử lý phụ phẩm với nồng độ acid/base cao trong thời gian dài cộng thêm nhiệt độ xử lý cao dẫn đến thay đổi tính chất hóa lý, mức độ acetyl hóa, depolymer hóa và hoạt tính sinh học của chitin thu được [1, 3, 26] Bên cạnh đó, hóa chất sử dụng có nguy cơ cao gây ô nhiễm ô trường và năng lượng sử dụng để duy trì nhiệt độ xử lý cao cũng là nhược điểm đáng lưu ý của phương pháp
10 hóa học [26] Để thải bỏ ra môi trường an toàn, đòi hỏi quá trình xử lý hóa chất sử dụng, tăng chi phí sản xuất chitin trong công nghiệp [5] Ngoài ra, protein thu được trong phương pháp hóa học có giá trị thấp, thậm chí không thể sử dụng làm thức ăn chăn nuôi [3]
1.2.2 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa sinh
Trong phương pháp hóa sinh, protease, enzyme thủy phân protein, được sử dụng thay thế base để loại protein trong quá trình thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm Nhiều loại protease đã được sử dụng để thu nhận chitin từ vỏ động vật giáp xác như papain, trypsin, pepsin, devolvase, alcalase và pancreatin [28] Quá trình loại bỏ protein sử dụng protease có thể thực hiện trước hoặc sau quá trình loại khoáng Thông thường, loại khoáng được thực hiện trước nhằm hạn chế sự có mặt các chất ức chế đối với protease, tăng hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzyme [36] Tuy nhiên, loại protein sử dụng những chế phẩm enzyme kể trên khá tốn kém do chi phí sản xuất enzyme khá cao [37] Do đó, enzyme thô thu nhận từ nội tạng cá hoặc vi khuẩn được sử dụng thay thế Việc này tận dụng được nguồn phụ phẩm ngành công nghiệp chế biến cá đồng thời giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường của chúng [28]
Nấm men và ứng dụng trong xử lý phụ phẩm thực phẩm
1.3.1 Nguồn phân lập nấm men i) Nấm men phân lập từ nem chua
Nem chua là sản phẩm thịt lên men truyền thống của Việt Nam Nó được là từ thịt heo xay trộn với da heo thái mỏng, định hình thành khối lập phương, gói trong lá ổi Sau đó, nem tiếp tục được gói trong lá chuối tạo môi trường yếm khí cho quá trình lên men và ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh Quá trình lên men thực hiện bởi vi sinh vật tự nhiên trong nguyên liệu, xảy ra trong 2-4 ngày ở nhiệt độ thường [52] Trong ngày đầu của quá trình lên men, Thanh và Anh (2016) [53] nhận thấy có sự phát triển của nấm men Tuy nhiên, càng gần điểm kết của quá trình lên men, số lượng nấm men giảm mạnh do acid lactic và hợp chất kháng khuẩn sinh ra trong quá trình lên men lactic [53] Có hơn 80 giống nấm men được phân lập từ nem chua với mật độ 5x10 4 -4x10 5 cfu/g (Bảng 1.3) [54]
Bảng 1.3 Loài và số lượng giống nấm men phân lập được từ nem chua
Tên loài Số lượng giống
Yarrowia lipolytica 3 Chủng không xác định được 5 ii) Nấm men phân lập từ phụ phẩm tôm
Quần thể nấm men trong nước từ các ao nuôi tôm có mật độ khá cao Nguyên nhân là do chất hữu cơ bao gồm thức ăn thừa và phân của tôm làm tăng quần thể nấm men trong nước ao Chất hữu cơ không chỉ đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng mà còn là nguồn cacbon và nitơ, và một số thành phần cung cấp các chất thiết yếu cho sự phát triển của nấm men như vitamin Chúng có thể tích tụ carotenoid và các sắc tố chính như b-carotene, torulene và torularhodin [55] Khi tôm ăn vào, những sắc tố này đóng vai trò như một chất kháng oxy hóa, cải thiện sức đề kháng của tôm Ngoài ra, nấm men Rhodosporidium paludigenum được công bố làm tăng hoạt tính protease và lipase trong dịch gan và tụy tôm [56] 86 giống nấm men đã được định danh từ hệ tiêu hóa của tôm (Bảng 1.4) [55]
Bảng 1.4 Nấm men định danh được từ hệ tiêu hóa của tôm
Tên loài Số giống xác định được
1.3.2 Nấm men Y lipolytica và ứng dụng xử lý phụ phẩm thực phẩm
Y lipolytica là một nấm men nang (ascomycetous yeast) an toàn trong thực phẩm
Nó được chú ý và nghiên cứu nhiều vào đầu những năm 70 nhờ vào khả năng chuyển hóa nguyên liệu kỵ nước (alkanes, triglyceride và acid béo) để tạo ra protein Loài nấm men này không những có khả năng sản xuất và tiết ra canh trường nhiều loại enzyme tự nhiên như lipase lip2p, protease có hoạt tính cao mà còn tổng hợp được các acid hữu cơ và đường ol [7]
Y lipolytica thuộc họ Saccharomycetaceae, và thuộc giới nấm Ascomyces (dưới họ Sacchromycetoideae) [57] Nấm men này khác biệt về cấu trúc gen và tính chất sinh lý so với các nấm men khác và có những đặc tính phổ biến của nấm mốc và tế bào nhân thực bậc cao [58] Nó thường được tìm thấy trên các cơ chất có nguồn gốc động vật hoặc thực vật mà các nguồn cacbon chính dưới dạng các ankan; lipid hoặc protein Mặt khác nó được phân lập đầu tiên trên magarine Nấm men này có thể phân lập từ các thực phẩm giàu lipid và protein [59] như phomai [60] hoặc xúc xích [61]
Y lipolytica không gây bệnh [62] Nó rất nhạy cảm với nhiệt độ cao từ 32-34°C
[61] Nhiều nguồn Y lipolytica không có khả năng phát triển ở nhiệt độ 32°C và là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Y lipolytica đã được Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ FDA (American food and drug administration) cấp chứng nhận GRAS (Generally Recognized As Safe) là sản phẩm tuyệt đối an toàn Điều này cho phép chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc dược phẩm
Y lipolytica có khả năng đồng hóa nhiều loại đường như glucose, galactose hoặc manitol nhưng nó không có khả năng đồng hóa saccharose do thiếu hoạt động của enzyme invertase [63] Ngược lại, nấm men này có khả năng sử dụng các chất kỵ nước như alkan (như hexadecan, decan), các acid béo (như acid palmitic, acid rininoleic, acid lauric), và các triglycerid (trioleine, tripalmitine) Y lipolytica cũng có thể sử dụng acetate như một nguồn cacbon duy nhất [63] Y.lipolytica cũng có thể tăng trưởng trong môi trường có bổ sung lipid như ricinoleic (dầu thầu dầu), sử dụng lipid để tổng hợp thành lactone do hoạt động của enzyme lipase và esterase [64] i) Khả năng tổng hợp acid hữu cơ
Nấm men Y lipolytica được xem là một tác nhân sản xuất acid citric với số lượng lớn tiềm năng với những ưu điểm như sử dụng được nhiều loại cơ chất (đặc biệt có khả năng sử dụng cơ chất kỵ nước), tốc độ phản ứng hình thành sản phẩm cao, hiệu suất tổng hợp cao, chịu được nồng độ cơ chất cao, chịu được ion kim loại và nồng độ oxy thấp, kiểm soát quá trình dễ dàng, tối thiểu lượng chất thải và nước thải [65] Nghiên cứu hóa sinh chỉ ra rằng sự tích tụ acid acetic trong tế bào nấm men là do hoạt tính của enzyme tham gia vào quá trình đồng hóa cơ bản giảm trong điều kiện nguồn nitơ khan hiếm [66] Trong điều kiện bình thường, enzyme ATP-citrate lyase cắt acid citric thành oxaloacetate and acetyl-CoA [66] Tuy nhiên, khi nguồn nitơ cạn kiệt sẽ kích hoạt enzyme adenosine monophosphate deaminase chuyển hóa AMP Kết quả là giảm cofactor cần thiết cho enzyme ATP-citrate lyase, dẫn đến đứt đoạn chu trình Krebs và sự tích tụ của các sản phẩm trao đổi chất trong giai đoạn đầu chu trình, như là acid citric [7] Sau đó, acid citric trong ti thể đi ra tế bào chất do trao đổi với oxaloacetate trong tế bào chất trước khi tiết ra canh trường thông qua chất vận chuyển đặc hiệu Yhm2p [7] Quá trình tổng hợp và tiết acid citric diễn ra nhanh hơn ở pH trung tính do ở pH này, gen điều hòa tăng tổng hợp chất vận chuyển Yhm2p hoạt động [7] Thêm vào đó, tính toán động học và đề xuất rằng quá trình tiết acid citric có nhiều mặt lợi về năng lượng [7]
Ngoài acid citric và acid isocitric, nấm men Y lipolytica còn có khả năng sinh tổng hợp và tiết ra canh trường những acid hữu cơ khác có thể kể đến như: acid isocitric, acid succinic, α -ketoglutaric acid, itaconic acid … [65]
17 ii) Khả năng tổng hợp protease
Nấm men Y lipolytica được chứng minh có khả năng tổng hợp alkaline extracellular protease, chiếm 1-2% tổng lượng protein của tế bào [67] Hơn 99% enzyme tổng hợp được tiết ra môi trường nuôi cấy và chỉ 1% enzyme được giữ lại bên trong tế bào [67] Ngoài alkaline extracellular protease, nấm men Y lipolytica còn có tiết ra môi trường ngoài ít nhất 3 loại acid protease và một ribonuclease [68]
Sinh tổng hợp protease ở nấm men Y lipolytica bị ảnh hưởng mạnh bởi pH môi trường Ở pH acid (pH < 6,8), phần lớn acid protease được tiết ra môi trường, ngược lại, ở pH kiềm (pH 9-10), alkaline extracellular protease được tổng hợp [68] iii) Khả năng tổng hợp lipase
Sinh tổng hợp lipase của nấm men Y lipolytica tăng cao khi môi trường nuôi cấy có chứa cơ chất kỵ nước như acid béo, triglyceride, methyl ester [69] Y lipolytica không chỉ sản sinh enzyme lipase ngoại bào mà còn còn sinh tổng hợp enzyme lipase liên kết với tế bào Trong điều kiện nguồn carbon trở nên khan hiếm và nấm men trong pha cân bằng của quá trình sinh trưởng, cả hai loại enzyme lipase trên đều được tiết ra môi trường ngoài [69] Điều kiện môi trường khan hiếm nguồn carbon hoặc nguồn nitơ ở dạng phức tạp sẽ thúc đẩy nấm men Y lipolytica tạo ra lipase [70] iv) Một số ứng dụng Y lipolytica trong xử lý phụ phẩm thực phẩm
Trong công nghiệp chế biến cá, chỉ hơn nửa lượng nguyên liệu được chế biến thành sản phẩm cho người Phần còn lại sinh ra lượng phụ phẩm, phụ phẩm khổng lồ thường được chế biến thành bột cá [67] Phụ phẩm từ cá thường có hàm lượng lipid cao, điều này làm giảm giá trị thương phẩm của bột cá Trong báo cáo của mình, Yano và cộng sự (2008) đã chỉ ra khả năng sử dụng Y lipolytica để xử lý hoặc nâng cao giá trị cho phụ phẩm từ cá [71] Tiến hành lên men ở trạng thái rắn cho cá xay nhỏ với Y lipolytica giúp giảm bớt hàm lượng chất béo trong phụ phẩm từ cá Sau khi ủ 96 giờ kết hợp với đảo trộn gián đoạn, lượng chất béo thô đã giảm tới 46% trong khi lượng protein hao hụt không đến 1% Với cùng thời gian lên men như vậy, sử dụng hỗn hợp vi khuẩn chỉ làm giảm được 28,3% lượng chất béo thô trong phụ phẩm từ cá [72].
Y lipolytica cũng được sử dụng để xử lý nước thải từ nhà máy sản xuất oliu, dầu cọ, bã dứa đề tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng cao như protein đơn bào, lipase, acid citric (Bảng 1.5).
Bảng 1.5 Ví dụ sử dụng Y lipolytica để xử lý hay nâng cao giá trị cho phụ phẩm
Chủng Phụ phẩm, phế thải Sản phẩm
ATCC 20255 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu Lipase, protein đơn W29 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu bàoLipase
CECT 1240 Các loại hạt nghiền nhỏ Lipase
ACA-DC 50109 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu Acid citric
NICM 3589 Phụ phẩm từ dứa Acid citric
UCP 0988 Phụ phẩm từ nhà máy tinh chế dầu thực vật Chất nhũ hóa
Nguồn: Bankar và cộng sự, 2009 [73]
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên vật liệu, chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy
Phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) thu được từ quá trình sản xuất tôm xuất khẩu tại nhà máy Nha Trang Seafood F17, Khánh Hòa, được cấp đông và vận chuyển đến phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh trong ngày Phụ phẩm tôm được rửa sạch, xay bằng máy xay trục vít tới kích thước 3mm, sau đó được chia nhỏ vào các túi sạch có khối lượng 100g và bảo quản lạnh đông ở nhiệt độ -20°C
Nấm men Y lipolytica VTCC 0544 từ bộ sưu tập giống của Trung tâm giống Quốc gia, được cung cấp bởi Viện Công nghiệp Thực phẩm, Hà Nội Nấm men này được giữ giống trong glycerol 20% ở -20°C trước khi thí nghiệm
Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật được sử dụng bao gồm:
• YP: cao nấm men 10 g/L, peptone 20 g/L
• YPD: cao nấm men 10 g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L
• YPDA: cao nấm men 10 g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L, agar 2 g/L
• Môi trường Skim Milk (thạch sữa gầy): hòa tan 15g agar trong 400ml nước cất và trộn với 600ml sữa tách béo
• Môi trường lên men M10: Peptone: 10,0 g/L, đường (glucose, fructose, saccharose, lactose): 5,0 g/L, cao nấm men: 5,0 g/L, Dung dịch bromothymol blue trong ethanol: 2,0 ml/L, pH cuối 7,0 ± 0,2
• Môi trường Tweens 80: Peptone: 10,0 g/L; NaCl: 5,0 g/L; CaCl 2 H 2 O: 0,1 g/L; Tweens 80: 10,0 ml/L; pH cuối 7,0-7,4.
Hóa chất và thiết bị sử dụng
Chế phẩm protease thương mại Alcalase 2.5L PF, chiết xuất từ Bacillus licheniformis (pH tối ưu 7-10, nhiệt độ tối ưu 30-65°C), cung cấp bởi Novozymes, Đan Mạch
Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê ở bảng 2.1
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ
D-Glucose Xilong, TQ Methylene blue Xilong, TQ
Cao nấm men AngleYeast, TQ Axit trichloroacetic Xilong, TQ
Pepton Xilong, TQ Tyrosine MERCK, Đức
Agar Việt Nam Casein MERCK, Đức
NaCl Xilong, TQ Thuốc thử Folin MERCK, Đức
Bromothymol blue Xilong, TQ KH2PO4 Xilong, TQ
KH2PO4 Xilong, TQ Diethyl Ether Xilong, TQ
CaCl2.H2O Xilong, TQ H2SO4 đậm đặc Xilong, TQ
Tweens 80 Xilong, TQ H2O2 30% Xilong, TQ
Skim milk Glanbia, Ireland NaOH Xilong, TQ
Cồn 96° Việt Nam HCl đậm đặc Xilong, TQ
Phenolphthalein MERCK, Đức Na2HPO4.12H2O, Xilong, TQ
Sử dụng các thiết bị chủ yếu có trong phòng thí nghiệm Vi sinh B2-307 và Hóa sinh B2-305 của trường, cụ thể ở bảng 2.2:
Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng
Thiết bị Xuất xứ Thiết bị Xuất xứ
Cân 4 số lẻ Sartorius Đức Nồi hấp tiệt trùng tự động
Autoclave Sturdy SA- 300VF Đài Loan
Tủ sấy đối lưu Memmert Đức Buồng cấy Việt Nam
Kính hiển vi Olympus CX23 Trung
Quốc Tủ ấm Memmert Đức
Lò nung LENTON EF11/8B Anh Máy lắc IKA KS250 Đức
Máy ly tâm Tomy LC-122 Nhật Bản Cân sấy ẩm Denver IR35 Đức
Máy đo quang phổ UV-Vis
Quốc Máy votex Hwa-sin
Tủ hút khí độc Việt Nam Bộ cất đạm thủ công Trung
Máy đo pH Hanna HI2211 Ý Bể điều nhiệt Memmert QuốcĐức
Dụng cụ: bộ soxhlet, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, buồng đếm hồng cầu, nhiệt kế, micropipet, pipet 10ml, pipet 1 ml, bóp cao su …
Bố trí thí nghiệm tổng quát
Bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện ở hình 2.1 Đầu tiên, thành phần hóa học của phụ phẩm tôm gồm hàm lượng ẩm, protein, béo và tro được xác định Song song đó, nấm men trên phụ phẩm tôm và nem chua Nha Trang được phân lập và định danh Đồng thời, hiệu quả khử protein, hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử lipid của nấm men Y lipolytica được so sánh với vi khuẩn B subtilis và chế phẩm Alcalase nhằm đánh giá tiềm năng xử lý phụ phẩm tôm của nấm men Tiếp theo, đặc điểm hình thái, nhiệt độ sinh trưởng, đặc tính sinh hóa (khả năng sinh urease, khả năng sinh protease, hoạt tính protease và khả năng sinh acid) của nấm men Y lipolytica và nấm men phân lập được đánh giá Song song, các nấm men phân lập được định danh Cuối cùng, hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử protein của chúng trên phụ phẩm tôm được khảo sát
Hình 2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp xử lý phế phẩm tôm
Phụ phẩm tôm được nghiền tới kích thước khoảng 3 mm bằng máy xay trục vít và được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20°C Trước khi tiến hành thí nghiệm xử lý với vi sinh vật hoặc chế phẩm Alcalase, mẫu được rã đông, cân chính xác khối lượng vào các bình tam giác đậy kín và được hấp tiệt trùng ở điều kiện 121°C trong 15 phút
2.4.2 Phương pháp phân lập và định danh nấm men i) Phương pháp phân lập nấm men
Cấy dịch chứa vi sinh vật đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng
(YPDA và PDA có bổ sung kháng sinh chloramphenicol với nồng độ 0,0001%) Nuôi vi sinh vật đã cấy trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi sinh vật thuần khiết ii) Phương pháp định danh nấm men
Giải trình tự Sanger: Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là
“chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một dideoxynucleotide (ddNTP) được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene
Trình tự DNA được so sánh với dữ liệu thư viện phổ chuẩn vi sinh vật GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
2.4.3 Phương pháp nuôi cấy, xác định đặc điểm hình thái của tế bào sinh dưỡng các chủng nấm men
23 i) Phương pháp hoạt hóa giống
Nấm men Y lipolytica VTCC 0544 và các nấm men phân lập được hoạt hóa trên môi trường thạch YPDA
Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A ii) Phương pháp tiền tăng sinh
Nấm men Y lipolytica VTCC 0544 và các nấm men phân lập được tiền tăng sinh trên môi trường YPD (môi trường cấp 1)
Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A iii) Phương pháp tăng sinh
Sau khi tiền tăng sinh trong môi trường YPD 24 giờ, các nấm men tiếp tục được tăng sinh trên môi trường YPD (môi trường cấp 2) iv) Phương pháp xác định mật độ tế bào
Mật độ tế bào nấm men trong môi trường lỏng được xác định bằng phương pháp đếm số tế bào trong buồng đếm Malassez [74]
Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A v) Phương pháp xác định đặc điểm hình thái
Các chủng nấm men được cấy trên môi trường thạch YPDA và PDA trên đĩa petri, ống thạch nghiêng và lam ở 30⁰C Sau 2 ngày, quan sát hình thái khuẩn lạc và ghi nhận màu sắc, hình dạng và tình chất bề mặt Đồng thời, đặc điểm tế bào được quan sát dưới kính hiển vi vi) Phương pháp xác định nhiệt độ sinh trưởng tối đa
Các chủng nấm men được cấy zigzag trên môi trường thạch nghiêng YPDA và YPA, nuôi cấy ở các nhiệt độ 30⁰C, 37⁰C và 42⁰C Kiểm tra khả năng sinh trưởng sau
2.4.4 Phương pháp khảo sát các tính chất sinh hóa của vi sinh vật i) Khảo sát khả năng sử dụng các loại đường
Sản phẩm của quá trình chuyển hóa các loại đường có thể là các loại acid hữu cơ, các loại rượu hay một số các hợp chất khác không có tính acid Quá trình chuyển hóa có thể tạo ra khí, cũng có thể không tạo ra khí cacbonic Môi trường M10 dùng để xác định khả năng chuyển hóa các loại đường khác nhau của vi sinh vật và đánh giá khả
24 năng tạo thành một số sản phẩm của quá trình như acid và khí cacbonic Acid tạo ra trong môi trường sẽ làm bromothymol blue có màu vàng Nếu môi trường không có acid, dung dịch sẽ có màu xanh Khí cacbonic được tạo ra sẽ bị giữ lại trong ống Durham [74] ii) Khảo sát khả năng sinh urease
Cấy nấm men (1-2 vòng que cấy) vào dung dịch 10 mM đệm kali phosphate (pH 6,0, chứa Phenol Red (20–50 mg/L) và urea (20 g/L)) và nuôi cấy ở 37⁰C trong 5 giờ Nấm men có khả năng sinh urease sẽ chuyển màu môi trường thành màu đỏ đậm [75] iii) Khảo sát khả năng sinh protease ngoại bào
Các chủng nấm men được kiểm tra khả năng sản xuất protease ngoại bào trên đĩa thạch sữa gầy [75] Nấm men được cấy trong đĩa thạch sữa gầy và ủ ở 30°C trong 3 ngày Các vùng trong suốt (vùng thủy phân) được phát hiện xung quanh các khuẩn lạc nấm men nếu nó có khả năng sinh protease ngoại bào iv) Xác định hoạt độ enzyme trong dịch nuôi tăng sinh
Cấy 1 vòng que cấy vào các bình tam giác chứa 50mL môi trường nuôi cấy lỏng YPD Các bình tam giác được lắc ở tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau thời gian ủ, ly tâm tách sinh khối, lấy phần dịch nuôi cấy để xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến [76] v) Khảo sát khả năng sinh lipase
Các chủng nấm men được kiểm tra khả năng sản xuất lipase trên đĩa thạch môi trường Tweens 80 Các nấm men được cấy riêng biệt trong đĩa thạch Tweens 80 và ủ ở 30°C trong 3 ngày Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành quan sát đĩa thạch và đồng thời soi dưới kính hiển vi Nếu nấm men có hoạt tính phân giải lipid thì có thể dễ dàng quan sát thấy quầng mờ đục xung quanh các khuẩn lạc Khi quan sát bằng kính hiển vi, những quầng mờ đục này bao gồm các tinh thể của muối canxi không hòa tan của axit béo vừa được hình thành [77] vi) Khảo sát khả năng sinh acid
Nuôi cấy nấm men trong đĩa petri chứa môi trường YPDA có bổ sung CaCO3 5 g/L Vi sinh vật có khả năng sinh acid sẽ hòa tan CaCO3 hình thành vùng trong suốt gần khuẩn lạc
Nuôi cấy nấm men trên môi trường lỏng YPD hoặc YP trong 2 ngày, ly tâm loại sinh khối và xác định pH của dịch canh trường
2.4.5 Quy trình cấy giống trên phụ phẩm tôm
Phụ phẩm tôm xay sau khi rã đông được cân chính xác khoảng 10g cho vào erlen có chứa 20ml nước cất Các erlen tôm được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút Sinh khối vi sinh vật sau khi nuôi tăng sinh được ly tâm tách sinh khối với tốc độ
3000 vòng/phút trong 5 phút, rửa lại bằng đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH 5,6) 3 lần Cấy chính xác lượng dịch treo tế bào cần vào erlen tôm đã tiệt trùng sao cho đạt mật độ 10 6 , 10 7 hoặc 10 8 cfu/g tôm Lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-5 ngày
Kết thúc quá trình nuôi cấy, mẫu tôm được rây qua rây 140 mesh để tách ra phần vỏ tôm còn dư Phần rắn gồm vỏ tôm còn sót lại được rửa sạch với nước và sấy đến khối lượng không đổi và xác định hàm lượng protein, lipid và tro Đối với vi khuẩn B subtilis, thực hiện tương tự như trên với mật độ 10 8 cfu/g tôm
2.4.6 Quy trình sử dụng enzyme alcalase xử lý phế liệu tôm
Phương pháp phân tích
2.5.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học
Thành phần hóa học của nguyên liệu và chất rắn thu được sau quá trình xử lý với vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme được xác định theo TCVN (Bảng 2.3)
Bảng 2.3 Phương pháp xác định thành phần hóa học
Thành phần Phương pháp Tiêu chuẩn
Tro Đốt cháy tro trong lò nhiệt độ 550°C÷600°C TCVN 4327-86 Độ ẩm Sấy khô ở 105°C đến khối lượng không đổi (AOAC, 2000) Chitin Minh và cộng sự (2017) [79]
* Hàm lượng protein = Hàm lượng Nitơ tổng x 6,25
Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A
2.5.2 Xác định hiệu quả khử khoáng
Hiệu quả khử khoáng là tỷ lệ phần trăm của lượng khoáng tách được so với lượng khoáng có trong mẫu tương ứng trước khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme, được xác định theo công thức sau:
DA (%): Hiệu quả khử khoáng.
A 0 , A R : Hàm lượng tro (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme.
O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme.
2.5.3 Xác định hiệu quả khử protein
Hiệu quả khử protein là tỷ lệ phần trăm của lượng protein tách được so với protein có trong mẫu tương ứng trước khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme, được xác định theo công thức sau:
DP (%): Hiệu quả khử protein.
P 0 , P R : Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme, xác định bằng phương pháp Kjeldahl.
O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme
2.5.4 Xác định hiệu quả khử lipid
Hiệu quả khử lipid là tỷ lệ phần trăm của lượng lipid tách được so với lượng lipid có trong mẫu tương ứng trước xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme, được xác định theo công thức sau:
DL (%): Hiệu quả khử lipid.
L 0 , L R : Hàm lượng lipid (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme, xác định bằng phương pháp Soxhlet.
O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau khi xử lý bằng vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme.
2.5.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme
Nguyên lý: Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin [76]
Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A
2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại từ 3 đến 4 lần và tiến hành xử lý số liệu dựa trên phần mềm Statgraphic centurion và Microsoft Excel 2016
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thành phần hóa học của phụ phẩm tôm
Kết quả phân tích thành phần hóa học của phụ phẩm tôm được thể hiện ở bảng 3.1
Kết quả cho thấy protein chiếm hàm lượng cao nhất trong thành phần chất khô của phụ phẩm, đạt 48,3±0,3%, phù hợp với kết quả công bố trong tài liệu [1, 9] Hàm lượng protein của phụ phẩm tôm trong nghiên cứu này cao hơn so với vỏ tôm hồng
Parapenaeus longirostris (27,6%) [21] và vỏ tôm đuôi xanh Metapenaeus monoceros
(30,0%) [19] Trong vỏ tôm, protein tồn tại chủ yếu ở màng trong và màng trung gian, tạo nên độ cứng cho vỏ [25, 26] Ở màng trong, protein tạo thành mạng lưới bao bọc chitin, do đó để thu nhận chitin cần phải loại bỏ protein
Hàm lượng khoáng chiếm 31,0% khối lượng chất khô trong vỏ tôm, tương đồng với kết quả công các nghiên cứu của Vo và cộng sự (2020) [18], Younes và cộng sự (2016) [19], Hamdi và cộng sự (2018) [80] Chúng tồn tại ở màng trung gian và màng ngoài của vỏ [25, 26] Vì vậy, để thu nhận chitin cần phải loại bỏ khoáng
Lipid chiếm lượng nhỏ trong chất khô của phụ phẩm tôm, 5,0% khối lượng chất khô, thấp hơn so với kết quả công bố trong nghiên cứu trước đây [1, 15] Tuy nhiên, để thu nhận chitin có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực cần phải loại bỏ béo Phụ phẩm tôm trong nghiên cứu này có hàm lượng chitin đạt 17,6 ± 1,1% (khối lượng chất khô), phù hợp với công bố của Tan và cộng sự (2021) [8] và Liu và cộng sự (2020) [22] cho rằng hàm lượng chitin trong phụ phẩm tôm từ 14 đến 27% khối lượng chất khô Hàm lượng chitin của phụ phẩm tôm sử dụng trong nghiên cứu này cao hơn so với hàm lượng chitin của vỏ cua sứ Allopetrolisthes punctatus (7,9% khối lượng chất khô) [81] và tôm he Nam Cực (2,0% khối lượng chất khô) [82] Từ đó cho thấy phụ phẩm tôm là nguồn thu nhận chitin tiềm năng
Bảng 3.1 Thành phần hóa học của phụ phẩm tôm
Thành phần Hàm lượng (% khối lượng chất khô) Ẩm 70,0 ± 0,4
Khảo sát khả năng sử dụng nấm men để xử lý phụ phẩm tôm
Hình 3.1 cho thấy hiệu quả khử protein phụ phẩm tôm của nấm men Y lipolytica cao nhất đạt 85,8 ± 0,6% sau 5 ngày lên men, lần lượt cao hơn 1,2 và 1,1 lần so với hiệu quả khử protein của vi khuẩn B subtilis và chế phẩm enzyme Alcalase Xu hướng này có liên quan đến hoạt tính protease của môi trường nuôi cấy (Hình 3.2) Hoạt tính protease càng cao thì hiệu quả khử protein càng cao
Các ký tự khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p