Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu ứng dụng nấm men xử lý phế liệu tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

BÙI HỮU HƯNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NẤM MEN XỬ LÝ PHẾ LIỆU TÔM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2022

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Tạ Thị Minh Ngọc Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Hoài Hương Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Hoàng Kim Anh

Luận văn tốt nghiệp được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TPHCM

Thời gian bảo vệ: 13/07/2022

Thành phần hội đồng đánh giá luận văn bao gồm: 1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Tôn Nữ Minh Nguyệt 2 Phản biện 1: TS Nguyễn Hoài Hương

3 Phản biện 2: PGS.TS Hoàng Kim Anh 4 Ủy viên: TS Tạ Thị Minh Ngọc

5 Ủy viên, thư ký: PGS.TS Trần Thị Thu Trà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS.TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Bùi Hữu Hưng MSHV: 1870266 Ngày, tháng, năm sinh: 21/02/1993 Nơi sinh: Khánh Hòa Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu ứng dụng nấm men xử lý phế liệu tôm - Research on valorisation of shrimp by-product using yeast II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát khả năng xử lý phụ phẩm tôm của các chủng nấm men

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 13/07/2022 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Tạ Thị Minh Ngọc

Tp HCM, ngày 20 tháng 07 năm 2022

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1BCHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS Tạ Thị Minh Ngọc GS TS Lê Văn Việt Mẫn

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Sau cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập và nghiên cứu

ii

Tóm tắt

Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát khả năng loại bỏ protein, khoáng và lipid trong phụ phẩm tôm của một số loài nấm men Đầu tiên, thành phần hóa học của phụ phẩm tôm được xác định Sau đó, hiệu quả khử protein, hiệu quả khử khoáng và hiệu

quả khử lipid của nấm men Yarrowia lipolytica được xác định và so sánh với vi khuẩn

Bacillus subtilis và chế phẩm enzyme Alcalase Tiếp theo, với mục tiêu tìm ra loài

nấm men phù hợp với điều kiện thực tế địa phương, phụ phẩm tôm và nem chua được sử dụng như nguồn phân lập nấm men Đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý (khả năng sử dụng các loại đường, khả năng sinh urease, nhiệt độ sinh trưởng tối đa) và đặc tính sinh hóa (khả năng sinh protease, khả năng sinh lipase, khả năng sinh acid) của nấm

men Y lipolytica và các nấm men phân lập được xác định Song song đó, nấm men

phân lập được định danh bằng phương pháp giải trình tự Sanger Cuối cùng, hiệu quả khử khoáng, hiệu quả khử protein và hiệu quả khử lipid của các nấm men trên phụ phẩm tôm dưới sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và mật độ giống cấy được khảo sát

Kết quả cho thấy thành phần hóa học của phụ phẩm tôm gồm hàm lượng protein 48,3 ± 0,3%, hàm lượng lipid 5,0 ± 0,2%, hàm lượng tro 31,0 ± 0,3%, hàm lượng

chitin 17,6 ± 1,1% (khối lượng chất khô) So với vi khuẩn B subtilis và chế phẩm Alcalase, nấm men Y lipolytica thể hiện hiệu quả xử lý phụ phẩm tôm cao nhất với

hiệu quả khử protein 85,8 ± 0,6%, hiệu quả khử khoáng 49,4 ± 0,4%, và hiệu quả khử lipid 90,1 ± 0,1%, cho thấy tiềm năng sử dụng nấm men để xử lý phụ phẩm tôm Từ

phụ phẩm tôm và nem chua đã định danh được 2 loài nấm men lần lượt Candida

tropicalis và Pichia kudriavzevii 2 loài nấm men phân lập được có nhiệt độ sinh

trưởng tối đa cao (42⁰C), sử dụng được nhiều loại đường, có khả năng sinh protease,

lipase và acid vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, hiệu quả khử protein (26-33%),

hiệu quả khử khoáng (35-48%) và hiệu quả khử lipid (40-78%) của chúng thấp hơn so

với nấm men Y lipolytica

Các nấm men phân lập từ phụ phẩm tôm và nem chua mặc dù thể hiện hiệu quả xử lý phụ phẩm chưa tốt nhưng đáng được chú ý nghiên cứu sâu hơn Kết quả đề tài

cho thấy tiềm năng xử lý phụ phẩm tôm của nấm men nói chung hay nấm men Y

iii

lipolytica nói riêng, mở ra hướng nghiên cứu mới là thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm

sử dụng nấm men như tác nhân sinh học

iv

Abstract

This study aims to investigate deproteinization, demineralization and delipidation efficiency of several yeasts on shrimp processing by-product Firstly, chemical composition of the shrimp by-product was analyzed Next, deproteinization efficiency, demineralization efficiency and delipidation efficiency on shrimp by-product of

Yarrowia lipolytica were determined and compared to those of Bacillus subtilis and

Alcalase preparation After that, as setting purpose of finding out yeast fitting to local

conditions, the shrimp by-product and Nem chua were used as sources to isolate yeast

species Morphology, physiological (sugar conversion ability, urease production, maximum growth temperature) as well as chemical and biological properties (protease production, lipase production, acid production) of these yeasts were examined Simultaneously, these isolated yeasts were identified using Sanger sequencing method Finally, their deproteinization efficiency, demineralization efficiency and delipidation efficiency on shrimp by-product under the effect of incubation time and inoculum size were evaluated

The results showed that chemical composition of the shrimp processing product including protein content of 48.3 ± 0.3%, lipid content of 5.0 ± 0.2%, ash

by-content of 31.0 ± 0.3%, chitin by-content of 17.6 ± 1.1% (on dry weight basis) Y

lipolytica expressed greater deproteinization efficiency (85.8 ± 0.6%),

demineralization efficiency (49.4 ± 0.4%) and delipidation efficiency

(90.1 ± 0.1%) on shrimp by-product than B subtilis and Alcalase did On the other hand, Candida tropicalis was identified from the shrimp by-product while from Nem

chua, Pichia kudriavzevii was determined They exhibited high maximum growth

temperature (42⁰C) and were able to converse various types of sugar as well as secret protease, lipase and acids However, their deproteinization efficiency (26-33%), demineralization efficiency (35-48%) and delipidation efficiency (40-78%) on shrimp

by-product were lower than those of Y lipolytica

Though yeasts isolated from the shrimp by-product and Nem chua expressed low

efficiency in removing non-chitin components in shrimp by-product, they deserved to be deeply investigated This study showed the great potential of employing yeast in

v

general or Y lipolytica in particular to treat shrimp by-product, which could be

considered as a new approach in chitin recovery from the by-product using yeast

vi

Lời cam đoan

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Học viên cao học

Bùi Hữu Hưng

1.2.1 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học 8

1.2.2 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa sinh 10

1.2.3 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp sinh học 11

1.3 Nấm men và ứng dụng trong xử lý phụ phẩm thực phẩm 13

1.3.1 Nguồn phân lập nấm men 13

1.3.2 Nấm men Y lipolytica và ứng dụng xử lý phụ phẩm thực phẩm 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Nguyên vật liệu, chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy 19

viii

2.4.1 Phương pháp xử lý phế phẩm tôm 22

2.4.2 Phương pháp phân lập và định danh nấm men 22

2.4.4 Phương pháp khảo sát các tính chất sinh hóa của vi sinh vật 23

2.4.5 Quy trình cấy giống trên phụ phẩm tôm 25

2.4.6 Quy trình sử dụng enzyme alcalase xử lý phế liệu tôm 25

2.5 Phương pháp phân tích 25

2.5.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học 25

2.5.2 Xác định hiệu quả khử khoáng 26

2.5.3 Xác định hiệu quả khử protein 26

2.5.4 Xác định hiệu quả khử lipid 27

2.5.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 27

2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Thành phần hóa học của phụ phẩm tôm 28

3.2 Khảo sát khả năng sử dụng nấm men để xử lý phụ phẩm tôm 29

3.2.1 Hiệu quả khử protein 29

3.2.2 Hiệu quả khử khoáng 32

3.2.3 Hiệu quả khử lipid 34

3.3 Phân lập nấm men từ nguồn nguyên liệu/thực phẩm Việt Nam 35

3.3.1 Phân lập nấm men từ phụ phẩm tôm và nem chua 35

3.3.2 Đặc điểm hình thái của nấm men 37

3.3.3 Đặc tính sinh lý 40

3.3.4 Đặc điểm sinh hóa 42

3.3.5 Định danh nấm men phân lập 46

3.4 Khảo sát khả năng xử lý phụ phẩm tôm của các chủng nấm men 47

ix

3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hiệu quả khử protein, hiệu quả

khử khoáng và hiệu quả khử lipid của các nấm men trên phụ phẩm tôm 47

3.4.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu quả khử protein, hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử lipid của các nấm men trên phụ phẩm tôm 51

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

x

Danh mục hình

Hình 1.1 Phụ phẩm tôm 4

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chitin 5

Hình 1.3 Cấu trúc 𝛼𝛼-chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾-chitin 6

Hình 1.4 Sự sắp xếp các vi sợi trong 𝛼𝛼-chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾-chitin 7

Hình 1.5: Mô phỏng quá trình thu nhận chitin từ tôm 7

Hình 1.6 Quy trình tổng quát thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm 8

Hình 3.5 Khuẩn lạc phân lập được từ phụ phẩm tôm 36

Hình 3.6 Hình thái tế bào S1 (a), S2 (b), S3 (c) và S11 (d) quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40X 36

Hình 3.7 Hình thái tế bào N1 (a), N2 (b) và N3 (c) quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40X 37

Hình 3.8 Khuẩn lạc nấm men Y lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c) trên môi trường thạch YPDA sau 2 ngày 38

Hình 3.9 Hình thái tế bào nấm men Y lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c) trên môi trường thạch YPDA trong 2 ngày quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40X 39

xi

Hình 3.10 Hình thái tế bào nấm men Y lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c) nuôi cấy trên

lam với môi trường thạch YPDA sau 24 giờ quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng

đại 40X 39

Hình 3.11 Kết quả khảo sát khả năng sinh protease sau 3 ngày của nấm men Y lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c) 43

Hình 3.12 Hoạt tính protease của môi trường sau 3 ngày nuôi cấy nấm men 43

Hình 3.13 Kết quả khảo sát khả năng sinh lipase quan sát trên đĩa thạch và dưới kính hiển vi sau 3 ngày của nấm men Y lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c) 44

Hình 3.14 Kết quả khảo sát khả năng sinh acid quan sát trên đĩa thạch YPDA có bổ sung CaCO3 sau 2 ngày của nấm men Y lipolytica (a), N3 (b) và S2 (c) 45

Hình 3.15 Trình tự DNA xác định từ nấm men N3 47

Hình 3.16 Trình tự DNA xác định từ nấm men S2 47

Hình 3.17 Hiệu quả khử protein của các chủng nấm men theo thời gian nuôi cấy 48

Hình 3.18 Hiệu quả khử khoáng của các chủng nấm men theo thời gian nuôi cấy 49

Hình 3.19 Hiệu quả khử lipid của các chủng nấm men theo thời gian nuôi cấy 50

Hình 3.20 Hiệu quả khử protein của các chủng nấm men thay đổi theo mật độ tế bào 52

Hình 3.21 Hiệu quả khử khoáng của các chủng nấm men thay đổi theo mật độ tế bào 53

Hình 3.22 Hiệu quả khử lipid của các chủng nấm men thay đổi theo mật độ tế bào 53

xii

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Hiệu quả khử khoáng và khử protein trên phụ phẩm tôm sử dụng phương

pháp hóa học 9

Bảng 1.2 Nghiên cứu thu nhận chitin từ vỏ tôm sử dụng phương pháp sinh học 12

Bảng 1.3 Loài và số lượng giống nấm men phân lập được từ nem chua 14

Bảng 1.4 Nấm men định danh được từ hệ tiêu hóa của tôm 15

Bảng 1.5 Ví dụ sử dụng Y lipolytica để xử lý hay nâng cao giá trị cho phụ phẩm 18

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng 20

Bảng 2.3 Phương pháp xác định thành phần hóa học 26

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của phụ phẩm tôm 28

Bảng 3.2 pH môi trường YPD và YP sau 2 ngày nuôi cấy các loài nấm men 45

1

Đặt vấn đề

Chitin và dẫn xuất của chitin (chitosan, tosyl chitin, chitin oligosaccharides, triyl chitin…) được ứng dụng trong nhiều ngành như thực phẩm, dược phẩm, y sinh, mỹ phẩm, với các vai trò khác nhau như màng bao tự phân hủy, chất mang dược phẩm, chất mang chất có hoạt tính sinh học [1], Bên cạnh đó, chúng còn thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng oxy hóa, chữa lành vết thương, [2] Chitin được thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu tự nhiên khác nhau như động vật giáp xác (tôm, cua, ruốc,…), côn trùng (kiến, bọ cạp, nhện,…), động vật thân mềm (mực, hàu, nghêu,…), tảo (tảo nâu, tảo xanh,…) và một số loài vi sinh vật [3] Trong đó, hiện nay, phụ phẩm tôm được xem là một nguồn sản xuất chitin tiềm năng và phổ biến

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, sản lượng tôm nuôi ở nước ta các loại năm 2021 đạt 970 nghìn tấn Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất sản phẩm từ tôm, chủ yếu là tôm đông lạnh, phụ phẩm chế biến tôm gồm đầu, vỏ, đuôi, chân tôm chiếm 48-56% khối lượng tôm bị thải bỏ [4] Chitin trong vỏ tôm chiếm khoảng 15-40% [5], hiện được thu nhận chủ yếu bằng phương pháp hóa học Phương pháp này sử dụng acid/base nồng độ cao, nguy cơ cao gây ô nhiễm môi trường Do đó, đòi hỏi có một phương pháp thân thiện với môi trường hơn để thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm

Phương pháp sinh học có ưu điểm thân thiện với môi trường, giảm được chi phí sử dụng hóa chất, enzyme, đã và đang được ứng dụng rộng rãi thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm nói riêng, và các nguồn khác nói chung [6] Phương pháp này sử dụng vi sinh vật có khả năng sinh acid hữu cơ và/hoặc protease ngoại bào để loại muối và protein phụ phẩm tôm

Nấm men Yarrowia lipolytica không những có khả năng sản xuất và tiết ra canh

trường nhiều loại enzyme tự nhiên như protease, lipase lip2p có hoạt tính cao mà còn tổng hợp được các acid hữu cơ như acid citric, acid isocitric, succinic acid, α-ketoglutaric acid, itaconic acid [7] Từ đó có thể thấy tiềm năng ứng dụng loài vi sinh vật này với mục đích loại khoảng và protein nhằm thu nhận chitin từ phụ phẩm

2

tôm Hơn nữa, hiện trên thế giới và ở Việt Nam, chưa tìm thấy có công bố sử dụng

nấm men nói chung hay nấm men Y lipolytica để thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm

Vì vậy, nghiên cứu này hướng đến đánh giá khả năng loại protein, lipid và khoáng

trong phụ phẩm tôm của nấm men Y lipolytica đồng thời so sánh với nấm men phân

lập từ nem chua và nấm men phân lập từ phụ phẩm tôm

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tôm và phụ phẩm chế biến tôm

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, năm 2021, diện tích tôm nước lợ thả nuôi đạt 747 nghìn ha (nuôi tôm sú là 626 nghìn ha, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng 121 nghìn ha) Sản lượng tôm nuôi các loại năm 2021 đạt 970 nghìn tấn (tăng 4,3% so với năm 2020); trong đó, tôm sú 265 nghìn tấn, tôm thẻ chân trắng 655 nghìn tấn, còn lại là tôm khác Kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2021 đạt 3,9 tỷ USD (tăng 5,4% so với năm 2020) Năm 2022, ngành thủy sản phấn đấu sản xuất khoảng 260-270 nghìn con tôm bố mẹ (tôm thẻ chân trắng 200-210 nghìn con, tôm sú 60 nghìn con); tôm giống khoảng 140-150 tỷ con (tôm thẻ chân trắng 100-110 tỷ con và tôm sú 30-40 tỷ con) Diện tích nuôi tôm đạt 750 nghìn ha; sản lượng tôm các loại 980 nghìn tấn, trong đó tôm sú 275 nghìn tấn, tôm thẻ chân trắng 675 nghìn tấn, còn lại là tôm khác Kim ngạch xuất khẩu tôm đạt 4 tỷ USD

Theo Bộ Công thương Việt Nam, phần lớn tôm xuất khẩu được đưa vào chế biến dưới dạng bóc vỏ bỏ đầu, tỷ lệ đầu chiếm 34-45%, phần vỏ còn lại chiếm 10-15% trọng lượng của tôm nguyên liệu do đó lượng phế liệu tôm ở Việt nam ước tính khoảng 325 nghìn tấn/năm (năm 2019) Ngành tôm tăng trưởng nhanh kéo theo lượng phụ phẩm tôm cũng gia tăng theo tỉ lệ thuận, có thể lên đến hơn 450 nghìn tấn vào năm 2025, tương ứng mỗi ngày có hơn 1 000 tấn phụ phẩm bị thải loại khỏi dây chuyền sản xuất

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2018, sản lượng nuôi trồng tôm là 766 nghìn tấn, giá trị xuất khẩu đạt 3,55 tỷ USD, trong đó tổng lượng phụ phẩm tôm đã 250-350 nghìn tấn; dự tính, tới giai đoạn 2021-2025, với sản lượng nuôi trồng 1,1 triệu tấn, Chính phủ kỳ vọng giá trị xuất khẩu đạt 10 tỷ USD, trong đó lượng phụ phẩm tôm sẽ là 400-500 nghìn tấn

Trên thế giới, khoảng 4 triệu tấn tôm được khai thác và chế biến (số liệu năm 2018) [1] Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất sản phẩm từ tôm, chủ yếu là tôm đông lạnh, phụ phẩm chế biến tôm gồm đầu, vỏ, đuôi, chân tôm chiếm 48-56% khối lượng tôm bị thải bỏ [2, 8] Việc thải bỏ phụ phẩm chưa qua xử lý dẫn đến nguy cơ cao gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người do các hợp chất phân giải bởi các vi sinh vật [9] Do đó, việc tập trung vào nghiên cứu tận dụng phụ phẩm của

5

Nguồn: S M Joseph, S Krishnamoorthy, R Paranthaman, J A Moses, and C Anandharamakrishnan, “A review on source-specific chemistry, functionality, and applications of chitin and chitosan,” Carbohydr Polym Technol Appl., vol 2, no January, p 100036, 2021, doi:

10.1016/j.carpta.2021.100036

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của chitin

Trong tự nhiên, chitin tồn tại 3 dạng dị hình, 𝛼𝛼-, 𝛽𝛽-, và 𝛾𝛾-chitin (Hình 1.3 và Hình 1.4):

𝛼𝛼-chitin là dạng tồn tại chủ yếu của chitin và được tìm thấy trong nhiều nguồn khác như như con ruốc, tôm hùm, cua và biểu bì côn trùng [1] Vi sợi trong 𝛼𝛼-chitin sắp xếp song song ngược chiều nhau, dễ dàng hình thành liên kết hydro nội phân tử, tạo ra cấu trúc chặt chẽ, tăng độ tinh thể và độ cứng [23]

𝛽𝛽-chitin có mặt trong nang mực và Aphrodite chaetae [1] 𝛽𝛽-chitin có sự sắp xếp

các vi sợi song song cùng chiều nhau, hạn chế hình thành liên kết hydro nội phân tử, cấu trúc linh động hơn 𝛼𝛼-chitin [23]

𝛾𝛾-chitin được tìm thấy trong mực Loligo và bọ cánh cứng Ptinus [1] 𝛾𝛾-chitin là dạng hỗn hợp cấu trúc 𝛼𝛼-chitin và 𝛽𝛽-chitin [23]

Quá trình sinh tổng hợp chitin trong động vật giáp xác bắt đầu từ quá trình thủy phân glycogen bởi enzyme phosphorylase và sản phẩm được chuyển thành glucose-1-Phosphate Dưới tác động của enzyme phosphomutase, glucose-1-phosphate chuyển thành glucose-6-phosphate trước khi tạo thành fructose-6-phosphate bởi enzyme hexokinase Khi có mặt L-glutamine và enzyme aminotransferase, fructose-6-phosphate được chuyển hóa thành glucosamine-6-Phosphate Sau đó, N-

6

acetyltransferase chuyển gốc acetyl từ acetyl co-A vào glucosamine-6-Phosphate để tạo thành N-acetylglucosamine-6-Phosphate Tiếp theo, phosphoacetylglucosamine mutase xúc tác phản ứng chuyển N-acetylglucosamine-6-Phosphate thành N-acetylglucosamine-1-Phosphate và tiếp tục được chuyển hóa thành UDP-N-acetylglucosamine nhờ vào enzyme pyrophosphorylase Từ đó, chitin được hình thành dưới sự xúc tác của enzyme chitin synthase [24]

Nguồn: T Fgd, M Lel, A Sml, D Rjsp, R O V, and L Pighinelli, “Nanomedicine and Nanoscience Research Different Aspects of Chemical and Biochemical Methods for Chitin Production a Short Review,” J Nanomed Nanosci, no 2, pp 1–11, 2018, doi: 10.29011/2577-1477

Hình 1.3 Cấu trúc 𝛼𝛼-chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾-chitin

Vỏ tôm bao gồm 3 lớp màng: màng ngoài, màng giữa và màng trong Chitin có mặt chủ yếu ở màng trong của lớp vỏ và được bao bọc bởi protein, góp phần tạo nên độ cứng của vỏ tôm Lớp màng trung gian chứa chitin và khoáng trong khi lớp màng ngoài chứa canxi carbonate và protein [25, 26] Vì vậy, để thu nhận chitin cần loại bỏ

Trái sang phải: 𝛼𝛼-chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾-chitin

Hình 1.4 Sự sắp xếp các vi sợi trong 𝛼𝛼-chitin, 𝛽𝛽-chitin và 𝛾𝛾-chitin

Các phương pháp loại bỏ protein và canxi carbonate gồm phương pháp hóa học (sử dụng acid và kiềm mạnh), phương pháp hóa sinh (sử dụng chế phẩm enzyme), phương pháp sinh học (sử dụng vi sinh vật)

Nguồn: J Chakravarty, C L Yang, J Palmer, and C J Brigham, “Chitin extraction from lobster shell waste using microbial culture-based methods,” Appl Food Biotechnol., vol 5, no 3, pp 141–154, 2018, doi: 10.22037/afb.v%vi%i.20787

Hình 1.5: Mô phỏng quá trình thu nhận chitin từ tôm

8

Hình 1.6 Quy trình tổng quát thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm

1.2.1 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học

Loại khoáng là quá trình loại bỏ khoáng khỏi phụ phẩm tôm, đặc biệt là canxi carbonate, bằng acid mạnh, thường dùng là sulfuric acid, hydrochloric acid, acetic acid, nitric acid, và formic acid [28] Trong những acid trên, hydrochloric acid (HCl) là acid được sử dụng phổ biến nhất Điều kiện loại khoáng thường được áp dụng gồm nồng độ HCl 0,25-2M, nhiệt độ gần 100⁰C, thời gian xử lý 0,5-48 giờ [1] Hydrochloric acid phản ứng với canxi carbonate (dạng rắn) tạo thành canxi clorua tan trong dung dịch và giải phóng khí CO2, phương trình phản ứng như sau [28]:

Loại protein là quá trình phá vỡ liên kết hóa học giữa protein và chitin bằng cách sử dụng base Để ứng dụng trong lĩnh vực y sinh, loại protein ra khỏi chitin là một bước rất quan trọng do protein có thể gây dị ứng cho con người Thông thường, dung dịch NaOH với nồng độ 0,125-5,0 M được sử dụng để loại protein trong vỏ tôm dưới điều kiện nhiệt độ 60-100⁰C, thời gian xử lý 1-72 giờ [1] Tuy nhiên, NaOH không chỉ loại protein mà còn deacetyl hóa chitin [28] Do đó mức độ acetyl hóa của chitin thu được khó kiểm soát

Trong vỏ tôm có chứa hợp chất màu, điển hình là carotenoid với hàm lượng 24-50 µg/g phụ phẩm tôm [29, 30] Do đó, trong quá trình thu nhận chitin từ phụ

9

phẩm tôm đòi hỏi phải thực hiện quá trình khử màu để thu được sản phẩm chitin không màu Dung môi hữu cơ như hexane, acetone, natri hypochlorite, và hydrogen peroxide thường được sử dụng để khử màu chitin từ phụ phẩm tôm [28]

Chitin thu được bằng phương pháp xử lý hóa học ở nhiệt độ phòng có mức độ khử khoáng cũng như khử protein ở mức trung bình 70-80% Hiệu quả khử khoáng và khử protein có thể đạt tới 98-100% trong điều kiện xử lý nhiệt độ cao (50-90⁰C) trong thời gian dài (lên tới 24 giờ) hoặc cần nồng độ acid/ kiềm cao (1-2M) (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Hiệu quả khử khoáng và khử protein trên phụ phẩm tôm sử dụng phương pháp hóa học

khử khoáng

Hiệu quả khử protein

HCl 0,25 M, tỷ lệ 1:25 (g/ml), 2 giờ, nhiệt độ phòng NaOH 0,5 M, tỷ lệ 1:25 (g/ml), 2 giờ, nhiệt độ phòng

80%

71%

[31]

HCl 0,55M, tỷ lệ 1:10 (g/ml), 15 phút, nhiệt độ phòng

99%

100%

[34]

HCl 0,5 M, tỷ lệ 1:10 (g/ml), 90 phút, nhiệt độ phòng NaOH 2M, tỷ lệ 1:4 (g/ml), 4 giờ, 45⁰C

10

hóa học [26] Để thải bỏ ra môi trường an toàn, đòi hỏi quá trình xử lý hóa chất sử dụng, tăng chi phí sản xuất chitin trong công nghiệp [5] Ngoài ra, protein thu được trong phương pháp hóa học có giá trị thấp, thậm chí không thể sử dụng làm thức ăn chăn nuôi [3]

1.2.2 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa sinh

Trong phương pháp hóa sinh, protease, enzyme thủy phân protein, được sử dụng thay thế base để loại protein trong quá trình thu nhận chitin từ phụ phẩm tôm Nhiều loại protease đã được sử dụng để thu nhận chitin từ vỏ động vật giáp xác như papain, trypsin, pepsin, devolvase, alcalase và pancreatin [28] Quá trình loại bỏ protein sử dụng protease có thể thực hiện trước hoặc sau quá trình loại khoáng Thông thường, loại khoáng được thực hiện trước nhằm hạn chế sự có mặt các chất ức chế đối với protease, tăng hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzyme [36] Tuy nhiên, loại protein sử dụng những chế phẩm enzyme kể trên khá tốn kém do chi phí sản xuất enzyme khá cao [37] Do đó, enzyme thô thu nhận từ nội tạng cá hoặc vi khuẩn được sử dụng thay thế Việc này tận dụng được nguồn phụ phẩm ngành công nghiệp chế biến cá đồng thời giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường của chúng [28]

Nhiều chế phẩm protease thương mại được sử dụng để loại protein trong quá trình thu nhận chitin từ động vật giáp xác như Alcalase 2.4L, Pancreatin, Delvolase, Cytolase PCL5, Econase CEPi và MP 100, Maxazime NNP và Cellupulin MG Trong đó, Alcalase 2.4L (Novo Nordisk A/S), một endo serine protease có nguồn gốc từ

Bacillus licheniformis, được sử dụng phổ biến nhất Chế phẩm Alcalase được chọn do

tính đặc hiệu của nó đối với các acid amin kị nước, tạo ra dịch thủy phân protein không có vị đắng cũng như quá trình thủy phân dễ kiếm soát Hơn nữa, dịch thủy phân protein tạo thành là một nguồn cung cấp acid amin thiết yếu tiềm năng [3] Hiệu quả khử protein của chế phẩm Alcalase trên vỏ tôm được công bố trong khoảng 54-97% [3]

Phương pháp hóa sinh hạn chế tối thiểu phản ứng depolymer hóa và deacetyl hóa chitin, dễ dàng thu được chitin có mức độ polymer hóa và mức độ acetyl hóa mong muốn [28] Bên cạnh đó, dịch thủy phân protein thu nhận được từ phương pháp hóa sinh có thành phần acid amin cân bằng, phù hợp ứng dụng trong thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi [3] Đặc biệt, dịch thủy phân protein phụ phẩm tôm sử dụng enzyme

11

Alcalase không có vị đắng, có thể dùng làm nguồn protein thay thế trong một số sản phẩm thực phẩm [3, 26] Ngoài ra, giảm lượng hóa chất sử dụng, giảm chi phí xử lý hóa chất trước khi thải ra môi trường cũng là ưu điểm của phương pháp này [1]

Tuy nhiên, hiệu quả loại protein của protease thấp hơn so với phương pháp hóa học Sau quá trình loại protein bằng protease, khoảng 5-10% protein còn tồn tại trong chitin thu nhận được, giới hạn phạm vi ứng dụng của chitin [3, 26, 36] Do đó, đòi hỏi quá trình xử lý bằng NaOH với điều kiện ôn hòa trong thời gian ngắn để loại bỏ hoàn toàn lượng protein còn sót [23, 28]

1.2.3 Thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật (vi khuẩn lactic hoặc vi khuẩn khác (non-lactic micro-organisms)) trực tiếp trên phụ phẩm tôm Trong quá trình phát triển, vi sinh vật sinh ra acid hữu cơ và protease ngoại bào giúp loại bỏ khoáng và protein [3] Phương pháp sinh học được chia thành lên men lactic và lên men khác (non-lactic fermentation)

Trong quá trình lên men lactic, 2 phân đoạn được thu nhận gồm phần dịch chứa protein, khoáng và sắc tố và phần rắn chứa chitin thô Chitin thô được rửa lại với nước để loại bỏ phần muối canxi lactate hình thành trong quá trình lên men lactic do acid lactic phản ứng với canxi carbonate Ngoài ra, acid lactic còn làm giảm pH của canh trường, ức chế sự phát triển của vi sinh vật lạ và hoạt động của protease (protease do vi khuẩn lactic sinh ra, protease nội bào có mặt trong phụ phẩm tôm), hạn chế các biến đổi không mong muốn của chitin thu nhận được [8, 37]

Khi sử dụng các vi sinh vật khác, acid hữu cơ sinh ra trong quá trình lên men phản ứng với ion khoáng trong phụ phẩm tôm, chuyển chúng thành dạng muối hữu cơ không tan, sau đó có thể loại bỏ chúng khi rửa lại chitin với nước cất [23] Tương tự, protease do sinh vật sinh ra và protease nội bào góp phần loại bỏ protein [38]

Phương pháp sinh học có thể được lặp lại trong thời gian ngắn và quan trọng là giảm thiểu sự phụ thuộc vào dung môi hóa học [1] Hơn nữa, cấu trúc chitin thu được từ phương pháp sinh học ít bị biến đổi nhất so với cấu trúc chitin thu nhận sử dụng phương pháp hóa sinh hay hóa học [1] Quy trình thực hiện đơn giản, thân thiện với môi trường, giảm được chi phí sử dụng enzyme cũng là những ưu điểm đáng kể của

12

phương pháp sinh học [26, 28] Tương tự như phương pháp hóa sinh, dịch thủy phân protein thu nhận từ phương pháp sinh học cũng có thành phần acid amin cân bằng, thể hiện hoạt tính sinh học, có thể ứng dụng trong thực phẩm như một nguồn bổ sung protein [38]

Tuy nhiên, khó khăn khi nâng lên quy mô công nghiệp là nhược điểm cần lưu ý khi sử dụng phương pháp sinh học [26, 38]

Hầu hết các nghiên cứu đã công bố đều sử dụng vi khuẩn để xử lý phế liệu tôm

(Bảng 1.2) Hiệu quả khử protein sử dụng các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp dao

động trong khoảng 78,0-98,6%, trong khi hiệu quả khử khoáng cao có thể lên tới

99,6% Bên cạnh đó các chủng vi khuẩn Bacillus spp được sử dụng nhiều mang lại

hiệu quả khử protein trên 70%; và hiệu quả khử khoáng dao động từ 60-90%

Bảng 1.2 Nghiên cứu thu nhận chitin từ vỏ tôm sử dụng phương pháp sinh học

Vi sinh vật sử dụng Mục đích sử dụng

Hiệu quả khử khoáng

Hiệu quả khử protein

Lactobacillus plantarum PTCC 1058

Sinh acid và sinh protease

13 protease

Lactobacillus pentosus L7 và Bacillus thuringiensis SA

Sinh acid và sinh protease

Bacillus mojavensis A21, Bacillus subtilis A26, Vibrio metschnikovii J1, Bacillus licheniformis MP1

Sinh acid và sinh protease

Paenibacillus woosongensis TKB2

Penaeus aeruginosa, Serratia marcescens, và Bacillus pumilus

Sinh acid và sinh protease

78,46% 74,76% [50]

Bacillus subtilis và Acetobacter pasteurianus

Sinh acid và sinh protease

92% 94,5% [6]

1.3 Nấm men và ứng dụng trong xử lý phụ phẩm thực phẩm 1.3.1 Nguồn phân lập nấm men

Nem chua là sản phẩm thịt lên men truyền thống của Việt Nam Nó được là từ thịt heo xay trộn với da heo thái mỏng, định hình thành khối lập phương, gói trong lá ổi Sau đó, nem tiếp tục được gói trong lá chuối tạo môi trường yếm khí cho quá trình lên men và ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh Quá trình lên men thực hiện bởi vi sinh vật tự nhiên trong nguyên liệu, xảy ra trong 2-4 ngày ở nhiệt độ thường [52] Trong ngày đầu của quá trình lên men, Thanh và Anh (2016) [53] nhận thấy có sự phát triển của nấm men Tuy nhiên, càng gần điểm kết của quá trình lên men, số lượng nấm men giảm mạnh do acid lactic và hợp chất kháng khuẩn sinh ra trong quá trình lên men lactic [53] Có hơn 80 giống nấm men được phân lập từ nem chua với mật độ 5x104-4x105 cfu/g (Bảng 1.3) [54]

14

Bảng 1.3 Loài và số lượng giống nấm men phân lập được từ nem chua

Tên loài Số lượng giống

ii) Nấm men phân lập từ phụ phẩm tôm

Quần thể nấm men trong nước từ các ao nuôi tôm có mật độ khá cao Nguyên nhân là do chất hữu cơ bao gồm thức ăn thừa và phân của tôm làm tăng quần thể nấm men trong nước ao Chất hữu cơ không chỉ đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng mà còn là nguồn cacbon và nitơ, và một số thành phần cung cấp các chất thiết yếu cho sự phát triển của nấm men như vitamin Chúng có thể tích tụ carotenoid và các sắc tố chính như b-carotene, torulene và torularhodin [55] Khi tôm ăn vào, những sắc tố này đóng vai trò như một chất kháng oxy hóa, cải thiện sức đề kháng của tôm Ngoài ra,

nấm men Rhodosporidium paludigenum được công bố làm tăng hoạt tính protease và

lipase trong dịch gan và tụy tôm [56] 86 giống nấm men đã được định danh từ hệ tiêu hóa của tôm (Bảng 1.4) [55]

15

Bảng 1.4 Nấm men định danh được từ hệ tiêu hóa của tôm

Tên loài Số giống xác định được

Y lipolytica là một nấm men nang (ascomycetous yeast) an toàn trong thực phẩm

Nó được chú ý và nghiên cứu nhiều vào đầu những năm 70 nhờ vào khả năng chuyển hóa nguyên liệu kỵ nước (alkanes, triglyceride và acid béo) để tạo ra protein Loài nấm men này không những có khả năng sản xuất và tiết ra canh trường nhiều loại enzyme tự nhiên như lipase lip2p, protease có hoạt tính cao mà còn tổng hợp được các acid hữu cơ và đường ol [7]

Y lipolytica thuộc họ Saccharomycetaceae, và thuộc giới nấm Ascomyces (dưới

họ Sacchromycetoideae) [57] Nấm men này khác biệt về cấu trúc gen và tính chất

sinh lý so với các nấm men khác và có những đặc tính phổ biến của nấm mốc và tế bào nhân thực bậc cao [58] Nó thường được tìm thấy trên các cơ chất có nguồn gốc động vật hoặc thực vật mà các nguồn cacbon chính dưới dạng các ankan; lipid hoặc protein Mặt khác nó được phân lập đầu tiên trên magarine Nấm men này có thể phân lập từ các thực phẩm giàu lipid và protein [59] như phomai [60] hoặc xúc xích [61]

Y lipolytica không gây bệnh [62] Nó rất nhạy cảm với nhiệt độ cao từ 32-34°C

[61] Nhiều nguồn Y lipolytica không có khả năng phát triển ở nhiệt độ 32°C và là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Y lipolytica đã được Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ FDA (American food and drug administration) cấp chứng nhận GRAS (Generally Recognized As Safe) là sản phẩm tuyệt đối an toàn Điều này cho phép chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc dược phẩm

16

Y lipolytica có khả năng đồng hóa nhiều loại đường như glucose, galactose hoặc

manitol nhưng nó không có khả năng đồng hóa saccharose do thiếu hoạt động của enzyme invertase [63] Ngược lại, nấm men này có khả năng sử dụng các chất kỵ nước như alkan (như hexadecan, decan), các acid béo (như acid palmitic, acid

rininoleic, acid lauric), và các triglycerid (trioleine, tripalmitine) Y lipolytica cũng có thể sử dụng acetate như một nguồn cacbon duy nhất [63] Y.lipolytica cũng có thể tăng

trưởng trong môi trường có bổ sung lipid như ricinoleic (dầu thầu dầu), sử dụng lipid để tổng hợp thành lactone do hoạt động của enzyme lipase và esterase [64]

i) Khả năng tổng hợp acid hữu cơ

Nấm men Y lipolytica được xem là một tác nhân sản xuất acid citric với số lượng

lớn tiềm năng với những ưu điểm như sử dụng được nhiều loại cơ chất (đặc biệt có khả năng sử dụng cơ chất kỵ nước), tốc độ phản ứng hình thành sản phẩm cao, hiệu suất tổng hợp cao, chịu được nồng độ cơ chất cao, chịu được ion kim loại và nồng độ oxy thấp, kiểm soát quá trình dễ dàng, tối thiểu lượng chất thải và nước thải [65]

Nghiên cứu hóa sinh chỉ ra rằng sự tích tụ acid acetic trong tế bào nấm men là do hoạt tính của enzyme tham gia vào quá trình đồng hóa cơ bản giảm trong điều kiện nguồn nitơ khan hiếm [66] Trong điều kiện bình thường, enzyme ATP-citrate lyase cắt acid citric thành oxaloacetate and acetyl-CoA [66] Tuy nhiên, khi nguồn nitơ cạn kiệt sẽ kích hoạt enzyme adenosine monophosphate deaminase chuyển hóa AMP Kết quả là giảm cofactor cần thiết cho enzyme ATP-citrate lyase, dẫn đến đứt đoạn chu trình Krebs và sự tích tụ của các sản phẩm trao đổi chất trong giai đoạn đầu chu trình, như là acid citric [7] Sau đó, acid citric trong ti thể đi ra tế bào chất do trao đổi với oxaloacetate trong tế bào chất trước khi tiết ra canh trường thông qua chất vận chuyển đặc hiệu Yhm2p [7] Quá trình tổng hợp và tiết acid citric diễn ra nhanh hơn ở pH trung tính do ở pH này, gen điều hòa tăng tổng hợp chất vận chuyển Yhm2p hoạt động [7] Thêm vào đó, tính toán động học và đề xuất rằng quá trình tiết acid citric có nhiều mặt lợi về năng lượng [7]

Ngoài acid citric và acid isocitric, nấm men Y lipolytica còn có khả năng sinh

tổng hợp và tiết ra canh trường những acid hữu cơ khác có thể kể đến như: acid isocitric, acid succinic, α -ketoglutaric acid, itaconic acid … [65]

17

ii) Khả năng tổng hợp protease

Nấm men Y lipolytica được chứng minh có khả năng tổng hợp alkaline

extracellular protease, chiếm 1-2% tổng lượng protein của tế bào [67] Hơn 99% enzyme tổng hợp được tiết ra môi trường nuôi cấy và chỉ 1% enzyme được giữ lại bên

trong tế bào [67] Ngoài alkaline extracellular protease, nấm men Y lipolytica còn có

tiết ra môi trường ngoài ít nhất 3 loại acid protease và một ribonuclease [68]

Sinh tổng hợp protease ở nấm men Y lipolytica bị ảnh hưởng mạnh bởi pH môi

trường Ở pH acid (pH < 6,8), phần lớn acid protease được tiết ra môi trường, ngược lại, ở pH kiềm (pH 9-10), alkaline extracellular protease được tổng hợp [68]

iii) Khả năng tổng hợp lipase

Sinh tổng hợp lipase của nấm men Y lipolytica tăng cao khi môi trường nuôi cấy có chứa cơ chất kỵ nước như acid béo, triglyceride, methyl ester [69] Y lipolytica

không chỉ sản sinh enzyme lipase ngoại bào mà còn còn sinh tổng hợp enzyme lipase liên kết với tế bào Trong điều kiện nguồn carbon trở nên khan hiếm và nấm men trong pha cân bằng của quá trình sinh trưởng, cả hai loại enzyme lipase trên đều được tiết ra môi trường ngoài [69]

Điều kiện môi trường khan hiếm nguồn carbon hoặc nguồn nitơ ở dạng phức tạp

sẽ thúc đẩy nấm men Y lipolytica tạo ra lipase [70]

iv) Một số ứng dụng Y lipolytica trong xử lý phụ phẩm thực phẩm

Trong công nghiệp chế biến cá, chỉ hơn nửa lượng nguyên liệu được chế biến thành sản phẩm cho người Phần còn lại sinh ra lượng phụ phẩm, phụ phẩm khổng lồ thường được chế biến thành bột cá [67] Phụ phẩm từ cá thường có hàm lượng lipid cao, điều này làm giảm giá trị thương phẩm của bột cá Trong báo cáo của mình, Yano

và cộng sự (2008) đã chỉ ra khả năng sử dụng Y lipolytica để xử lý hoặc nâng cao giá trị cho phụ phẩm từ cá [71] Tiến hành lên men ở trạng thái rắn cho cá xay nhỏ với Y

lipolytica giúp giảm bớt hàm lượng chất béo trong phụ phẩm từ cá Sau khi ủ 96 giờ

kết hợp với đảo trộn gián đoạn, lượng chất béo thô đã giảm tới 46% trong khi lượng protein hao hụt không đến 1% Với cùng thời gian lên men như vậy, sử dụng hỗn hợp vi khuẩn chỉ làm giảm được 28,3% lượng chất béo thô trong phụ phẩm từ cá [72].

18

Y lipolytica cũng được sử dụng để xử lý nước thải từ nhà máy sản xuất oliu, dầu

cọ, bã dứa đề tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng cao như protein đơn bào, lipase, acid citric (Bảng 1.5).

Bảng 1.5 Ví dụ sử dụng Y lipolytica để xử lý hay nâng cao giá trị cho phụ phẩm

ATCC 20255 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu Lipase, protein đơn bào

ACA-DC 50109 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu Acid citric

UCP 0988 Phụ phẩm từ nhà máy tinh chế dầu thực vật Chất nhũ hóaNguồn: Bankar và cộng sự, 2009 [73]

19

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên vật liệu, chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy

Phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) thu được từ quá trình sản

xuất tôm xuất khẩu tại nhà máy Nha Trang Seafood F17, Khánh Hòa, được cấp đông và vận chuyển đến phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh trong ngày Phụ phẩm tôm được rửa sạch, xay bằng máy xay trục vít tới kích thước 3mm, sau đó được chia nhỏ vào các túi sạch có khối lượng 100g và bảo quản lạnh đông ở nhiệt độ -20°C

Nấm men Y lipolytica VTCC 0544 từ bộ sưu tập giống của Trung tâm giống

Quốc gia, được cung cấp bởi Viện Công nghiệp Thực phẩm, Hà Nội Nấm men này được giữ giống trong glycerol 20% ở -20°C trước khi thí nghiệm

Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật được sử dụng bao gồm: • YP: cao nấm men 10 g/L, peptone 20 g/L

• YPD: cao nấm men 10 g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L • PDA: peptone 20 g/L, glucose 20 g/L, agar 2 g/L

• YPDA: cao nấm men 10 g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L, agar 2 g/L • Môi trường Skim Milk (thạch sữa gầy): hòa tan 15g agar trong 400ml nước

cất và trộn với 600ml sữa tách béo

• Môi trường lên men M10: Peptone: 10,0 g/L, đường (glucose, fructose, saccharose, lactose): 5,0 g/L, cao nấm men: 5,0 g/L, Dung dịch bromothymol blue trong ethanol: 2,0 ml/L, pH cuối 7,0 ± 0,2

• Môi trường Tweens 80: Peptone: 10,0 g/L; NaCl: 5,0 g/L; CaCl2.H2O: 0,1 g/L; Tweens 80: 10,0 ml/L; pH cuối 7,0-7,4

2.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 2.2.1 Hóa chất

Chế phẩm protease thương mại Alcalase 2.5L PF, chiết xuất từ Bacillus

licheniformis (pH tối ưu 7-10, nhiệt độ tối ưu 30-65°C), cung cấp bởi Novozymes,

Đan Mạch

Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê ở bảng 2.1

20

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

D-Glucose Xilong, TQ Methylene blue Xilong, TQ Cao nấm men AngleYeast, TQ Axit trichloroacetic Xilong, TQ

Bromothymol blue Xilong, TQ KH2PO4 Xilong, TQ

CaCl2.H2O Xilong, TQ H2SO4 đậm đặc Xilong, TQ

Phenolphthalein MERCK, Đức Na2HPO4.12H2O, Xilong, TQ

2.2.2 Thiết bị sử dụng

Sử dụng các thiết bị chủ yếu có trong phòng thí nghiệm Vi sinh B2-307 và Hóa sinh B2-305 của trường, cụ thể ở bảng 2.2:

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng

Cân 4 số lẻ Sartorius Đức Nồi hấp tiệt trùng tự độngAutoclave Sturdy SA-300VF

Đài Loan

Kính hiển vi Olympus CX23 Trung

Máy ly tâm Tomy LC-122 Nhật Bản Cân sấy ẩm Denver IR35 ĐứcMáy đo quang phổ UV-Vis

Quốc

21

Dụng cụ: bộ soxhlet, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, buồng đếm hồng cầu, nhiệt kế, micropipet, pipet 10ml, pipet 1 ml, bóp cao su …

2.3 Bố trí thí nghiệm tổng quát

Bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện ở hình 2.1 Đầu tiên, thành phần hóa học của phụ phẩm tôm gồm hàm lượng ẩm, protein, béo và tro được xác định Song song đó, nấm men trên phụ phẩm tôm và nem chua Nha Trang được phân lập và định danh Đồng thời, hiệu quả khử protein, hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử lipid của

nấm men Y lipolytica được so sánh với vi khuẩn B subtilis và chế phẩm Alcalase

nhằm đánh giá tiềm năng xử lý phụ phẩm tôm của nấm men Tiếp theo, đặc điểm hình thái, nhiệt độ sinh trưởng, đặc tính sinh hóa (khả năng sinh urease, khả năng sinh

protease, hoạt tính protease và khả năng sinh acid) của nấm men Y lipolytica và nấm

men phân lập được đánh giá Song song, các nấm men phân lập được định danh Cuối cùng, hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử protein của chúng trên phụ phẩm tôm được khảo sát

Hình 2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát

2.4.2 Phương pháp phân lập và định danh nấm men

Cấy dịch chứa vi sinh vật đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng

(YPDA và PDA có bổ sung kháng sinh chloramphenicol với nồng độ 0,0001%) Nuôi vi sinh vật đã cấy trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi sinh vật thuần khiết

Giải trình tự Sanger: Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một dideoxynucleotide (ddNTP) được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene

Trình tự DNA được so sánh với dữ liệu thư viện phổ chuẩn vi sinh vật GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy, xác định đặc điểm hình thái của tế bào sinh dưỡng các chủng nấm men

23

i) Phương pháp hoạt hóa giống

Nấm men Y lipolytica VTCC 0544 và các nấm men phân lập được hoạt hóa

trên môi trường thạch YPDA

Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A

ii) Phương pháp tiền tăng sinh

Nấm men Y lipolytica VTCC 0544 và các nấm men phân lập được tiền tăng

sinh trên môi trường YPD (môi trường cấp 1) Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A

Sau khi tiền tăng sinh trong môi trường YPD 24 giờ, các nấm men tiếp tục được tăng sinh trên môi trường YPD (môi trường cấp 2)

iv) Phương pháp xác định mật độ tế bào

Mật độ tế bào nấm men trong môi trường lỏng được xác định bằng phương pháp đếm số tế bào trong buồng đếm Malassez [74]

Quy trình thực hiện được trình bày ở Phụ lục A

Các chủng nấm men được cấy trên môi trường thạch YPDA và PDA trên đĩa petri, ống thạch nghiêng và lam ở 30⁰C Sau 2 ngày, quan sát hình thái khuẩn lạc và ghi nhận màu sắc, hình dạng và tình chất bề mặt Đồng thời, đặc điểm tế bào được quan sát dưới kính hiển vi

vi) Phương pháp xác định nhiệt độ sinh trưởng tối đa

Các chủng nấm men được cấy zigzag trên môi trường thạch nghiêng YPDA và YPA, nuôi cấy ở các nhiệt độ 30⁰C, 37⁰C và 42⁰C Kiểm tra khả năng sinh trưởng sau 3 ngày

2.4.4 Phương pháp khảo sát các tính chất sinh hóa của vi sinh vật

i) Khảo sát khả năng sử dụng các loại đường

Sản phẩm của quá trình chuyển hóa các loại đường có thể là các loại acid hữu cơ, các loại rượu hay một số các hợp chất khác không có tính acid Quá trình chuyển hóa có thể tạo ra khí, cũng có thể không tạo ra khí cacbonic Môi trường M10 dùng để xác định khả năng chuyển hóa các loại đường khác nhau của vi sinh vật và đánh giá khả

24

năng tạo thành một số sản phẩm của quá trình như acid và khí cacbonic Acid tạo ra trong môi trường sẽ làm bromothymol blue có màu vàng Nếu môi trường không có acid, dung dịch sẽ có màu xanh Khí cacbonic được tạo ra sẽ bị giữ lại trong ống Durham [74]

ii) Khảo sát khả năng sinh urease

Cấy nấm men (1-2 vòng que cấy) vào dung dịch 10 mM đệm kali phosphate (pH 6,0, chứa Phenol Red (20–50 mg/L) và urea (20 g/L)) và nuôi cấy ở 37⁰C trong 5 giờ Nấm men có khả năng sinh urease sẽ chuyển màu môi trường thành màu đỏ đậm [75]

iii) Khảo sát khả năng sinh protease ngoại bào

Các chủng nấm men được kiểm tra khả năng sản xuất protease ngoại bào trên đĩa thạch sữa gầy [75] Nấm men được cấy trong đĩa thạch sữa gầy và ủ ở 30°C trong 3 ngày Các vùng trong suốt (vùng thủy phân) được phát hiện xung quanh các khuẩn lạc nấm men nếu nó có khả năng sinh protease ngoại bào

iv) Xác định hoạt độ enzyme trong dịch nuôi tăng sinh

Cấy 1 vòng que cấy vào các bình tam giác chứa 50mL môi trường nuôi cấy lỏng YPD Các bình tam giác được lắc ở tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau thời gian ủ, ly tâm tách sinh khối, lấy phần dịch nuôi cấy để xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến [76]

v) Khảo sát khả năng sinh lipase

Các chủng nấm men được kiểm tra khả năng sản xuất lipase trên đĩa thạch môi trường Tweens 80 Các nấm men được cấy riêng biệt trong đĩa thạch Tweens 80 và ủ ở 30°C trong 3 ngày Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành quan sát đĩa thạch và đồng thời soi dưới kính hiển vi Nếu nấm men có hoạt tính phân giải lipid thì có thể dễ dàng quan sát thấy quầng mờ đục xung quanh các khuẩn lạc Khi quan sát bằng kính hiển vi, những quầng mờ đục này bao gồm các tinh thể của muối canxi không hòa tan của axit béo vừa được hình thành [77]

vi) Khảo sát khả năng sinh acid

Nuôi cấy nấm men trong đĩa petri chứa môi trường YPDA có bổ sung CaCO3 5 g/L Vi sinh vật có khả năng sinh acid sẽ hòa tan CaCO3 hình thành vùng trong suốt gần khuẩn lạc

25

Nuôi cấy nấm men trên môi trường lỏng YPD hoặc YP trong 2 ngày, ly tâm loại sinh khối và xác định pH của dịch canh trường

2.4.5 Quy trình cấy giống trên phụ phẩm tôm

Phụ phẩm tôm xay sau khi rã đông được cân chính xác khoảng 10g cho vào erlen có chứa 20ml nước cất Các erlen tôm được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút

Sinh khối vi sinh vật sau khi nuôi tăng sinh được ly tâm tách sinh khối với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút, rửa lại bằng đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH 5,6) 3 lần

Cấy chính xác lượng dịch treo tế bào cần vào erlen tôm đã tiệt trùng sao cho đạt mật độ 106, 107 hoặc 108 cfu/g tôm Lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-5 ngày

Kết thúc quá trình nuôi cấy, mẫu tôm được rây qua rây 140 mesh để tách ra phần vỏ tôm còn dư Phần rắn gồm vỏ tôm còn sót lại được rửa sạch với nước và sấy đến khối lượng không đổi và xác định hàm lượng protein, lipid và tro

Đối với vi khuẩn B subtilis, thực hiện tương tự như trên với mật độ 108 cfu/g tôm

2.4.6 Quy trình sử dụng enzyme alcalase xử lý phế liệu tôm

Quy trình xử lý vỏ tôm bằng enzyme Alcalase được tham khảo từ công bố của Dan và cộng sự (2017) [78] Cụ thể, phụ phẩm tôm xay sau khi rã đông được cân chính xác khoảng 10g cho vào erlen có chứa 20ml nước cất Các erlen tôm được hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút Thêm 0,3% (v/w) chế phẩm enzyme alcalase vào mẫu tôm đã tiệt trùng trong điều kiện vô trùng Mẫu được ủ trong bể điều nhiệt có lắc đảo ở nhiệt độ 50°C trong 6 giờ Kết thúc quá trình thủy phân, mẫu tôm được rây qua rây 140 mesh để tách ra phần vỏ tôm còn dư Phần rắn gồm vỏ tôm còn sót lại được rửa sạch với nước và sấy ở 90⁰C đến khối lượng không đổi để trước khi xác định hàm lượng protein, lipid và tro

2.5 Phương pháp phân tích

2.5.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học

Thành phần hóa học của nguyên liệu và chất rắn thu được sau quá trình xử lý với vi sinh vật hoặc chế phẩm enzyme được xác định theo TCVN (Bảng 2.3)