Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu điều kiện tối ưu trích ly các hợp chất chống oxy hóa từ lá vối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2022

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA-ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Đống Thị Anh Đào

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Mai Huỳnh Cang

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Quốc Cường

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Chí Thành MSHV: 1970572 Ngày, tháng, năm sinh: 09/01/1994 Nơi sinh: Tây Ninh Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60540101

CHỐNG OXY HÓA TỪ LÁ VỐI

- Khảo sát quá trình trích ly với các thông số: nhiệt độ, thời gian, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu, pH Tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình

trích ly flavonoid

- Ứng dụng bột sấy phun lá vối vào quá trình bảo quản, tạo màu và chống oxy

hóa cho nước cam theo công thức

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/09/2021

GS.TS Lê Văn Việt Mẫn

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ công nhân viên chức Khoa Công nghệ thực phẩm, Phòng đào tạo sau đại học, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Nhân dịp này, tôi cũng bày tỏ lòng cảm ơn tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ động viên và khuyến khích tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

TP.Hồ Chí Minh, Ngày 12 Tháng 07 Năm 2022

Tác giả luận văn

Nguyễn Chí Thành

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài luận văn: “Nghiên cứu điều kiện tối ưu trích ly các hợp chất chống oxy hóa từ lá vối”

Nghiên cứu này nhằm xác định các điều kiện trích ly tối ưu để thu nhận hàm

lượng flavonoid từ lá vối tươi (Cleistocalyx operculatus) Quá trình trích ly được

tiến hành bằng cách sử dụng hệ dung môi ethanol-nước Quá trình trích ly được tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology – RSM) với dung môi ethanol nhằm thu được hàm lượng flavonoid cao nhất Cả bốn yếu tố: nhiệt độ (0C), thời gian (phút), tỷ lệ DM/NL (ml/g),hàm lượng ethanol (%) đều ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid tổng và khả năng kháng oxy hóa từ dịch chiết lá vối Bằng việc áp dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology) bố trí 27 thí nghiệm theo thiết kế cấu trúc có tâm (Central Composite Design) với 3 lần lặp lại tại giá trị trung tâm, tôi xây dựng được mô hình mô tả việc tách chiết các hợp chất flavonoid hàm mục tiêu là flavonoid tổng của dịch chiết (Y), 4 yếu tố ảnh hưởng là nhiệt độ trích ly (A), thời gian trích ly (B), tỷ lệ DM/NL (C), nồng độ ethanol (D) như sau: Y = 53,73 – 4,77 A2 – 4,00 B2 – 2,53 C2 – 5,71 D2 Mô hình thu được tương thích khá cao với kết quả thu được thực nghiệm (R2= 0,9503) Theo mô hình, điều kiện tối ưu hóa cho dịch chiết có hàm lượng flavonoid tổng cao nhất là dung môi ethanol 60 (%v/v), nhiệt độ trích ly 71oC, thời gian trích ly 59 (phút), tỷ lê DM/NL 8/1 Dịch trích ly sau đó có hàm lượng flavonoid 53,73±0,045 (mg RE/g chất khô) và hoạt tính chống oxy hóa thông qua hàm lượng DPPH là 922,86 (µmol TE/g chất khô) Sau khi bổ sung maltodextrin để có hàm lượng chất khô đạt 15oBrix, dịch được sấy phun với điều kiện nhiệt độ 150oC, tốc độ dòng 50 ml/phút, áp lực đầu phun 1 bar, tốc độ gió 0,3 m3/phút Bột sấy phun được cho vào nước giải khát công thức và bảo quản trong vòng 30 ngày ở nhiệt độ 5-10oC, sau khi bảo quản dịch trích có khả năng kháng oxy hóa thông qua hàm lượng DPPH 84,4(µmol TE/g chất khô nguyên liệu)

ABSTRACT

This study aimed to determine the extraction conditions to obtain the content

of flavonoid from Cleistocalyx operculatus leaf extracts The extraction process was

carried out using solvent system ethanol – water The extraction was optimized by the response surface methodology (RSM) with ethanol as a solvent for extraction to obtain the highest flavonoid content Four factors: temperature (0C), time (minute), ratio of material/solvent (g/ml), ethanol concentration (%) are both affect directly to total flavonoid concentration and anti-oxidization ability of solution extracted from

Cleistocalyx operculatus leaf extracts By using response surface methodology,

design 27 experiments follow central composite design with 3 repeatation at central value, I built the model to describe extraction process of polyphenol compounds and their anti-oxidization ability In this model, total flavonoid concentration (Y) are assigned as objective functions and four factors affect to them are extraction temperature (A), extraction time (B), rate DM/NL (C), ethanol concentration (D): Y = 53,73 – 4,77 A2 – 4,00 B2 – 2,53 C2 – 5,71 D2 Model obtained the results that is high capatiple with experiment results (R2= 0,9503)

Base on the model, the optimal conditions to extract maximum total flavonoid concentration are: 710C, 59 minutes, ratio of material/solvent 1:8 (g/ml) and ethanol concentration 60% In this condition, The extract then had a flavonoid content of 53,73±0,045 (mg RE/g dry material) and antioxidant activity through DPPH content of 922,86 (µmol RE/g dry material) After adding maltodextrin to have a dry matter content of 15oBrix, the solution was spray-dried with temperature of 150oC, flow rate 50 ml/min, nozzle pressure 1 bar, wind speed 0,3 m3/min The spray-dried powder is added to beverage and stored for 30 days at 5-10oC After storage, the extract has antioxidant capacity through DPPH content 84,4(µmol TE/g dry material)

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài này được hướng dẫn bởi GS TS Đống Thị Anh Đào, bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Khoa Kỹ thuật Hóa học Trường Đại học Bách khoa TP HCM Đề tài do chính tôi thực hiện nghiên cứu tại Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường Đại học Bách khoa TP HCM Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực chưa được công bố trong bất kỳ công trình khác Mọi trích dẫn trong luận văn được chỉ rõ nguồn gốc

TP.Hồ Chí Minh, Ngày 12 Tháng 07 Năm 2022

Tác giả luận văn

Nguyễn Chí Thành

Mục Lục

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 10

DANH MỤC CÁC BẢNG 11

DANH MỤC CÁC HÌNH 12

CHƯƠNG I: LỜI MỞ ĐẦU 13

Các nội dung của đề tài gồm có: 14

Phạm vi nghiên cứu: 15

Nội dung nghiên cứu gồm : 15

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 16

2.1 Tổng quan về cây vối 16

2.1.1 Giới thiệu 16

2.1.2 Phân loại khoa học 16

2.1.3 Khái quát về họ Sim Myrtaceae 16

2.1.4 Tổng quan về chi Cleistocalyx 17

2.2 Tìm hiểu chung về cây vối 19

2.2.1 Mô tả thực vật 19

2.2.2 Phân bố sinh thái 19

2.2.3 Ứng dụng của cây vối 20

2.2.4 Thành phần hóa học của cây vối 21

2.2.5 Hoạt tính sinh học của lá và nụ vối 25

2.2.6 Giới thiệu về polyphenol 27

2.3 Những công trình nghiên cứu về cây vối 33

2.4 Những sản phẩm từ cây vối hiện đang có trên thị trường 34

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1 Nguyên liệu 35

3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi 35

3.2.1 Thiết bị 35

3.2.2 Dụng cụ 36

3.2.3 Hóa chất, dung môi 36

3.3 Phương pháp nghiên cứu 37

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 37

3.3.2 Quy trình trích ly dịch lá vối 38

3.3.3 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 39

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình chần 40

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chần 40

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần 40

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi 41

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 41

3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly 42

3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 42

3.4.7 Khảo sát ảnh hưởng của pH 43

3.5 Khảo sát điều kiện tối ưu hóa quá trình trích ly Flavonoid trong lá vối 43

3.6 Ứng dụng Bột sấy phun dịch trích để bổ sung hoạt chất cho nước giải khát hương cam 45 3.6.1 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của nước giải khát hương cam 45

3.6.2 Theo dõi sự biến đổi hàm lượng TFC và hoạt tính chống oxy hóa theo thời gian bảo quản 46 3.7 Các phương pháp phân tích 46

3.7.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu 46

3.7.2 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng 46

3.7.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 46

3.8 Phương pháp xử lí số liệu: 46

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

4.1 Kết quả đo một số thành phần trong nguyên liệu lá vối 47

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của các thông số của các quá trình đến hàm lượng flavonoid và khả năng kháng oxy hóa của dịch trích ly 47

4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần 47

4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần 50

4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol 53

4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 56

4.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly 59

4.2.6 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi và nguyên liệu 61

4.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của pH 63

4.3 Tối ưu hóa điều kiện trích ly 64

4.3.1 Kết quả bố trí quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quá trình trích ly Flavonoid từ lá vối 66 4.3.2 Mô hình hóa 67

4.3.3 Tối ưu hóa điều kiện trích ly và xác định mô hình thực nghiệm 73

4.3.4 Kiểm tra sự tương thích giữa mô hình và thực nghiệm 74

4.4 Sấy phun thu được bột lá vối 74

4.4.1 Kết quả kiểm nghiệm an toàn thực phẩm 76

4.4.2 Ứng dụng chất màu vàng thực phẩm từ lá vối trong sản nước giải khát hương cam 77 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

5.1 Kết luận 78

DM: Dung môi NL: Nguyên liệu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3 1 Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập 45

Bảng 3 2 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hàm lượng Flavonoids được trích ly 94

Bảng 3 3 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 94

Bảng 3 4 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của thời gian chần đến hàm lượng Flavonoids được trích ly 95

Bảng 3 5 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của thời gian chần đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 95

Bảng 3 6 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng Flavonoids được trích ly 96

Bảng 3 7 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 96

Bảng 3 8 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng Favonoids được trích ly 97

Bảng 3 9 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 97

Bảng 3 10 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng Favonoids được trích ly 98

Bảng 3 11 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 99

Bảng 3 12 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng Favonoids được trích ly 99

Bảng 3 13 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 100

Bảng 3 14 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Favonoids được trích ly 101

Bảng 3 15 Bảng kết quả so sánh ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 101

Bảng 4 1 Các mức của yếu tố thí nghiệm tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol 65

Bảng 4 2 Kết quả bố trí thí nghiệm đầy đủ theo qui hoạch trực tâm quay (CCRD) 66

Bảng 4 3 Phân tích phương sai mô hình hồi quy (ANOVA) 67

Bảng 4 4 Kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy 67

Bảng 4 5 Bảng phân tích ANOVA các biến số 68

Bảng 4 6 Quyết định 46/2007/QĐ-BYT: Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm áp dụng cho thực phẩm dạng bột hoặc ngũ cốc: 76

Bảng 4 7 Kết quả kiểm tra dư lượng thuốc bảo vệ thực vật theo thông tư 50/2016/TT-BYT Quy định mức tối đa tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm 76

Bảng 4 8 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng kháng oxy hóa của dịch nước giải khát sau khi được bổ sung bột sấy phun từ dịch trích ly lá vối 102

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Lá vối sau sơ chế và dịch lá vối trích ly 87

Hình 1 2 Máy sấy phun và bột sấy phun từ dịch trích ly 87

Hình 2 1 Hình cây, lá và nụ vối 19

Hình 3 1 Lá vối nguyên liệu 35

Hình 3 2 Sơ đồ nghiên cứu 37

Hình 3 3 Quy trình trích ly dịch lá vối 38

Hình 4 1 Ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hàm lượng flavonoid 48

Hình 4 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 48

Hình 4 3 Ảnh hưởng của thời gian chần đến hàm lượng Flavonoid được trích ly 51

Hình 4 4 Ảnh hưởng của thời gian chần đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 51

Hình 4 5 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng Flavonoid được trích ly 54

Hình 4 6 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 54

Hình 4 7 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng Favonoids được trích ly 56

Hình 4 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 57

Hình 4 9 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng Favonoid được trích ly 59

Hình 4 10 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 59

Hình 4 11 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng Flavonoid được trích ly 61

Hình 4 12 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 61

Hình 4 13 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Favonoid được trích ly 63

Hình 4 14 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH 63

Hình 4 15 Bề mặt đáp ứng và hình chiếu 2D của sự ảnh hưởng giữa nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly đến hàm lượng Flavonoid tổng 70

Hình 4 16 Bề mặt đáp ứng và hình chiếu 2D của sự ảnh hưởng giữa nhiệt độ trích ly và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng Flavonoid tổng 70

Hình 4 17 Bề mặt đáp ứng và hình chiếu 2D của sự ảnh hưởng giữa nhiệt độ trích ly và nồng độ dung môi đến hàm lượng Flavonoid tổng 71

Hình 4 18 Bề mặt đáp ứng và hình chiếu 2D của sự ảnh hưởng giữa thời gian trích ly và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng Flavonoid tổng 71

Hình 4 19 Bề mặt đáp ứng và hình chiếu 2D của sự ảnh hưởng giữa thời gian trích ly và nồng độ dung môi đến hàm lượng Flavonoid tổng 72

Hình 4 20 Bề mặt đáp ứng và hình chiếu 2D của sự ảnh hưởng giữa tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ dung môi đến hàm lượng Flavonoid tổng 72

Hình 4 21 Sự ảnh hưởng của các điều kiện xử lý đến hàm lượng flavonoid tổng 73

Hình 4 22 Mối tương quan giữa mô hình lý thuyết và thực nghiệm mô tả ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình trích ly Flavonoid từ lá vối 74

CHƯƠNG I: LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu cũng như nhà sản xuất thực phẩm đang tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao Họ thấy rằng, các hợp chất này thường có nguồn gốc từ thiên nhiên như: carotenoid, tocopherol, acid ascorbic và polyphenol có trong rau, củ, quả rất có lợi cho sức khoẻ cho con người, làm giảm khả năng mắc các bệnh hiểm nghèo

Theo các nghiên cứu, nguyên nhân sâu xa dẫn đến các bệnh nguy hiểm là từ sự stress oxi hoá Stress ôxi hoá là sự mất cân bằng trong việc tạo các gốc tự do và sự hoạt động của các chất chống oxi hóa trong cơ thể Gốc tự do dư thừa có tác dụng không tốt cho cơ thể vì nó rất dễ dàng phản ứng với các đại phân tử sinh học của tế bào như ADN, lipid, protein và gây ra hàng loạt các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí nhớ, thoái hóa cơ quan bộ phận người cao tuổi

Các gốc tự do còn tấn công phá hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào Để hạn chế tác dụng không tốt của các gốc tự do, cách duy nhất có thể dùng là tăng cường hoạt động của hệ thống bảo vệ chống oxi hóa trong cơ thể Hệ thống này bao gồm 2 nhóm chất chống oxi hóa: Các chất oxi hóa nội sinh (Bao gồm enzym chống oxi hóa) và các chất chống oxi hóa được cung cấp từ bên ngoài vào qua con đường thức ăn (Polyphenol, carotenoid, vitamin C & E ) Việc cung cấp các chất chống oxi hóa tự nhiên qua con đường thức ăn là đơn giản hơn cả

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên rất phổ biến trong thực vật flavonoid có trong lá, thân, quả của nhiều loại thực vật như: Cây chè, ca cao, sim, ổi… với hàm lượng cao Hiện nay flavonoid được quan tâm nhiều do chúng có đặc tính chống oxy hoá và khả năng kháng khuẩn mạnh có thể ứng dụng nhiều trong dược phẩm cũng như thực phẩm Hiệu quả của quá trình tách trích ly flavonoid cũng như chất lượng dịch trích ly phụ thuộc trực tiếp vào nhiều yếu tố công nghệ: Loại dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, pH dịch trích ly, nhiệt độ trích ly, thời

gian trích ly Các yếu tố này còn làm ảnh hưởng tới phương pháp làm sạch dịch và giá thành của dịch giàu flavonoid

Thấy rõ được vai trò tác dụng của flavonoid như là một chất chống oxy hoá đối với sức khoẻ con người và trong bảo quản thực phẩm, việc tìm các điều kiện thích hợp cho tách trích ly flavonoid từ các nguyên liệu tiềm năng là cần thiết Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu điều kiện tối ưu trích ly các hợp chất chống oxy hóa từ lá vối”

Cây vối, một loại cây thân quen với người dân vùng quê các tỉnh Bắc Bộ, tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) Từ lâu dân ta sử dụng lá vối để làm trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực

Thành phần chính trong nụ vối là flavonoid, với hơn 20 flavonoid khác nhau Các flavonoid có các tác dụng sinh học quý như chống ung thư, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm… Trong Dược Điển Việt Nam V đã có chuyên luận về lá và nụ vối Tuy nhiên chưa đi sâu về định lượng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng sinh học quan trọng

Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Tối ưu hóa điều kiện trích ly Flavonoid trong lá vối” Kết quả đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng phương pháp trích ly để thu nhận được Flavonoid nhiều nhất từ lá vối phục vụ cho việc nghiên cứu và bào chế thuốc chữa bệnh

Các nội dung của đề tài gồm có:

- Xác định được điều kiện trích ly tối ưu để thu nhận được tối đa hàm lượng flavonoid có trong lá vối bao gồm nhiệt độ chần, thời gian chần, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ dung môi, pH Chúng tôi lựa chọn điều kiện xử lý phù hợp nhất cho quá trình trích ly để thu được hàm lượng flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất, và ứng dụng bổ sung hoạt chất

flavonoid vào nước giải khát đóng chai như một “phụ gia” có công dụng bảo quản và tạo màu tự nhiên, thay thế cho phụ gia tổng hợp

Phạm vi nghiên cứu:

- Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

- Đối tượng nghiên cứu là lá vối tươi trồng tại cái vườn ở Thủ Đức

Nội dung nghiên cứu gồm :

- Khảo sát thông số quá trình chần để bất hoạt enzyme có trong lá vối bao

gồm: nhiệt độ, thời gian

- Khảo sát điều kiện của quá trình trích ly flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa từ nguyên liệu lá vối bằng dung môi ethanol bao gồm: nhiệt độ, thời

gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ dung môi, pH

- Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa các thông số đã khảo sát đơn yếu tố để tìm ra được thông số tối ưu của quy trình trích ly flavonoid từ lá vối

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về cây vối

2.1.1 Giới thiệu

- Tên tiếng việt: Cây vối, vối nhà

- Tên nước ngoài: Lid eugenia (Anh)

- Tên khoa học: Cleistocalyx operaculatus (Roxb.) Merr et Perry

- Tên đồng nghĩa: Eugenia operaculata Roxb., Syzygium nervossum DC., Syzygium operaculatum (Roxb.) Nied

- Họ: Sim (Myrtaceae)

2.1.2 Phân loại khoa học

- Trong hệ thống phân loại của A L Takhtajan (2009) [11], vị trí phân loại

của loài Cleistocalyxoperculatus như sau:

Giới: Thực vật (Plantea)

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ: Sim (Myrtales)

2.1.3 Khái quát về họ Sim Myrtaceae

Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus Roxb, thuộc chi Cleistocalyx, họ Sim Mytaceae Các cây thuộc họ Sim thường mọc xen lẫn với các cây gỗ khác thành đai rừng nhiệt đới, ít khi mọc thuần loại

Họ Sim phân bố ở các vùng rừng nhiệt đới và Á nhiệt đới, chủ yếu ở châu Mỹ và châu Úc Họ Sim là một họ lớn gồm 90 chi và 3000 loài, cây thuộc họ Sim có đặc điểm thực vật như sau:

Cây gỗ lớn, cây nhỡ hoặc cây bụi Lá đơn, hoặc mép có khía răng, lá thường mọc đối nhau và có tuyến mỡ Hoa mọc thành cụm ở nách hay ở đầu cành, có hình xim hoặc hình chùm Hoa đều lưỡng tính Đài hình ống dính hoàn toàn vào bầu hay chỉ dính một ít Lá đài gồm 4-5 cánh xếp lợp vào nhau, ít có ống dài nguyên Nhị xếp thành một hay nhiều dãy rời nhau hoàn toàn hoặc dính ở gốc thành ống ngăn, bao phấn đính ở lưng hay gốc Đĩa mật không có hay nếu có thì hình vành khăn, che kín ở phía gốc vòi Bầu hoàn toàn hạ hay hạ một phần, có 4-5 ô hay nhiều hơn; vòi đơn kéo dài, đầu tròn, rất ít khi chia 3-4 thuỳ; trong bầu thì noãn xếp thành hai hay nhiều dãy Quả nang hoặc thịt, có sợi và thường được bọc kín bởi ống đài Trong quả thường có 1 hạt, hạt có nội nhũ, phôi thẳng hay cong, đôi khi nạc với hai lá mầm không xa nhau

2.1.4 Tổng quan về chi Cleistocalyx

Chi Cleistocalyx là một chi tương đối lớn của họ Sim Ngoài đặc điểm chung của họ sim, các loài cây thuộc chi Cleistocalyx còn có đặc điểm thực vật riêng: Quả nạc, khi chín không nở Vòi không có lông, ô quả không có vách ngang chia thành ô nhỏ, ống đài nguyên hay rách bất định, đài nguyên thành mũ, quả mập có một hạt Cụm hoa xim hay chùy

Sau đây là phần giới thiệu sơ bộ một số cây đại diện thuộc chi Cleistocalyx thường thấy ở Việt Nam

2.1.4.1 Cleistocalyx circumcissa

Tên ở Việt Nam: Trâm Ô

Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc cao 15m, nhánh mảnh, lá có phiến xoan thon, dài 4-7cm, chót có mũ, có đốm trong gân phụ, rất mảnh, nụ cao 13mm, rộng 3mm, phần của đài và cánh hoa làm thành một lớp rụng sớm với nhị, noãn gồm 3 buồng, quả mập; cây được trồng phổ biến ở rừng Biên Hòa

2.1.4.2 Cleistocalyx nigrans

Tên Việt Nam: Trâm lá đen

Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc nhỏ, nhánh vàng đỏ Lá có phiến bầu dục, màu nâu đen trên mặt lúc khô, gân phụ cách nhau 2-3mm, cuống dài 1cm Chùm tụ tán cao 6cm ở ngọn nhánh, hoa trắng, nụ dài 5mm, hoa 5 cánh rụng 1 lượt, tiểu nhị nhiều Quả mập tròn, lúc khô đen, to hơn 1cm, một hạt

Cây thường phân bố ở các vùng: Rừng Bình Dương, Thủ Đức

2.1.4.3 Cleistocalys nervosum

Tên Việt Nam: Trâm nắp vối

Đặc điểm thực vật: Vối là loại cây thân mộc cỡ vừa, chiều cao trung bình 5 – 6 m nhưng có thể cao tới 12 – 15 m Vỏ cây màu nâu đen Hoa nhỏ có màu trắng lục, họp thành cụm 3 – 5 hoa ở nách lá Nụ hoa dài, 4 cánh, nhiều nhị Cụm hoa hình tháp, trải ra ở kẽ các lá đã rụng Cây Vối ra hoa vào tháng 5 – 7 hàng năm Quả Vối hình cầu hay hình trứng, nhăn nheo, đường kính 7-12mm, nháp, có dịch, khi chín màu tím

Cây thường phân bố ở các vùng: Rừng và Bắc Trung Nam

2.1.4.4 Cleistocalyx rehnervinus

Tên Việt Nam: Vối gân mạng

Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc nhỏ, nhánh tròn xám, to 2-3mm Lá có phiến bầu dục đến trái xoan, to 9-14 x 5,5-7cm chót lá rộng, đáy tròn gân phụ mịn, cách nhau 4-8mm, gân cách bìa 2-3mm Phát hoa ở lá và ngọn Hoa như không cọng, cao 7mm, đài rụng thành chóp, tiểu nhụy nhiều Trái tròn, to 1.5mm, lùm bụi

2.1.4.5 Cleistocalyx consperipuactatus

Tên Việt Nam: Vối nước

Đặc điểm thực vật: Cây thân gỗ, cao 20-25m, vỏ dày 6- 8 mm, vỏ có màu xám trắng hay nâu đen nhạt Cành non màu nâu xám, hình vuông, lúc già hình cột tròn

Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục dạng trứng ngược dài 6-12cm, rộng 2,5-5,5cm, đầu tròn tù Hoa mọc cụm, sinh ra đầu cành Hoa lưỡng tính, đài hoa đính thành 1 thể dạng mũ, lúc nở hoa rụng dạng vòng Nhiều nhị, rời nhau, lúc chồi hoa cong vào Quả mọng hình cầu hay hình trứng, lúc chín có màu nâu tím Một năm có 2 mùa hoa nở vào tháng 3 và giữa tháng 7

Cây thường phân bố ở các vùng: Thanh Hoá, Nghệ Tĩnh, Bình-Trị-Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, GiaLai, KonTum

2.2 Tìm hiểu chung về cây vối 2.2.1 Mô tả thực vật

Cây thân gỗ, cao 5-6 m có khi hơn, cành non, tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn Lá có cuống, dài 8-20 cm, hình trứng, rộng 5-10 cm Hai mặt lá có những đốm màu nâu, cuống dài 1-1,5cm Hoa gần như không có cuống, màu lục trắng nhạt hợp thành cụm hoa hình tháp toả ra ở những lá đã rụng Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12cm, xù xì Toàn lá, cành non, và nụ vối có mùi thơm đặc biệt dễ chịu của vối [9,12]

Hình 2 1 Hình cây, lá và nụ vối

2.2.2 Phân bố sinh thái

Vối là cây đặc hữu của vùng Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, vối mọc tự nhiên dọc theo các bờ suối hay ao hồ, ở vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Giang, Thông Nông, Thạch An, ); Lạng Sơn (Đồng Mô,

Hữu Lũng…), Bắc Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế…); Vĩnh Phúc (Lập Tjach, Tam Dương); Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình… cây vối còn được trồng rải rác các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ Cây được trồng ở bờ ao để chống sạt lỡ đất, vừa tận dụng khoảng không gian

Vối thuộc loại cây ưa sáng, sinh trưởng và phát triển nhanh; trong vòng 03 năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5m Cây phân cành nhiều, chồi và lá non ra nhiều trong mùa xuân hè Những cây mọc ở chỗ được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt khỏe Ngoài ra, để cho cây có nhiều cành lá người ta thường chặt bớt cành hàng năm, nhằm kích thích cho sự sinh chồi mới Chồi mới mọc ra theo kiểu lưỡng phân; những chồi phát triển thành cành có trên một năm tuổi mới ra hoa quả [12]

2.2.3 Ứng dụng của cây vối

Lá và nụ vối có vị đắng, chát, tính hàn, có tác dụng sát trùng, giải biểu, tán nhiệt, khử thấp, hóa trệ Vỏ thân cây vối có vị cay, tính ôn, có tác dụng sát trùng, chỉ dưỡng (làm hết ngứa)

Lá và nụ vối đã được nhân dân Việt Nam nấu nước uống vừa thơm, vừa có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, nhuận tràng Liều dùng hàng ngày: 10-20g Lá vối tươi hay khô sắc đặc làm thuốc sát trùng da nụ vối được dùng chữa sốt đau đầu, chữa bệnh tiêu hóa, viêm dạ dày - ruột cấp Vỏ thân sắc nước, dùng ngoài chữa viêm da [23]

Lá vối có tác dụng chữa đầy bụng, không tiêu, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giúp giảm mỡ trong máu, hỗ trợ điều trị viêm gan, vàng da, giúp ăn ngon, làm thuốc sát khuẩn ngoài da Theo đông y, lá vối có tính vị quy kinh, nụ và lá vối có tính hàn mát, vị đắng không có độc có tác dụng thanh nhiệt giải biểu (mồ hôi), kiện tỳ, tiêu thực trừ được tích trệ (ăn không tiêu); chữa được ngoại cảm phát sốt, sốt rét, đau đầu [9,12]

2.2.4 Thành phần hóa học của cây vối

2.2.4.1 Thành phần hóa học của tinh dầu nụ hoa vối

Năm 1994, Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, và Hoàng Văn Lựu đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu vối ở các địa phương khác nhau của tỉnh Nghệ An [13], thu được những kết quả như sau:

Hàm lượng tinh dầu dao động trong khoảng (0,1-0,4%) Hàm lượng tinh dầu vối ở Quế Phong (0,4%) là cao nhất Thấp nhất là tinh dầu vối ở thành phố Vinh (0,1%) Trong các bộ phận khác nhau của cây vối thì hàm lượng dầu cao nhất tập trung ở nụ hoa (0,48%), trong đó hoa đã nở lượng tinh dầu giảm dần (0,28%) và ít nhất trong hoa già (0,18%)

Bảng 2 1 Hàm lượng tinh dầu vối ở các địa phương của Nghệ An

Đối tượng nghiên cứu

Lá vối Nụ vối Hoa mới nở Nụ hoa

Hoa nở sau 2 ngày Hoa già

Thành phố Vinh Huyện Hưng Nguyên

Tây Nghi Lộc Huyện Nam Đàn Huyện Tân Kỳ Huyện Quế Phong

Thành phố Vinh Thành phố Vinh Thành phố Vinh

0,10 0,18 0,20 0,21 0,24 0,40 0,48 0,28 0,18

Bảng 2 2 Thành phần hóa học của tinh dầu vối

hoa ) (%)

Nụ vối (%)

2.2.4.2 Thành phần hóa học của nụ hoa vối

Năm 1990, nhóm tác giả Zhang, Fengxian, Liumeifang: Lu Renrong (Trung Quốc) đã phân lập một số chất trong hoa và nụ vối :

Axit xinamic (C9H8O2) (1); axit galic (C7H6O5) (2); etylgalat (C9H10O5) (3); hidroxi-5-metoxi-6,8-dimetylflavon (C18H18O4) (4); 2,4-đihidroxyl-6-metoxi-3,5-dimetylchacon (C18H18O4) (5); 5,7-đihidroxi-6,8-đimetylflavanon (C17H16O4) (6); axit oleanolic (C30H48O3) (7); axit ursolic (C30H48O3) (8); β-sitosterol (C27H40O) (9);

7-c h = 7-c h c o o h

c o o h

o hh o

c o o c2h5

o ho hh o

oc h 3

oh o

o c h3c h3

oc h3h o

3 45

1726

2.2.5 Hoạt tính sinh học của lá và nụ vối

Tác dụng ức chế tế bào ung thư phát triển của 3',5'-dimethylchalcone phân lập từ nụ vối

2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-Tác dụng ức chế maltase đường ruột làm giảm đường huyeetsgaay tiểu đường trên chuột

Tác dụng chống oxy hóa: ức chế enzyme 𝛼-glucosidase

Tác dụng chống Alzheimer: thông qua cơ chế ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase, các flavonoid được phân lập trong nụ vối như quercetin, kaempferol, tamarixetin có tác dụng chống Alzheimer

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng sinh học in vitro và in vivo của lá và nụ vối như tác động chống ung thư, hạ đường huyết và tác động tăng trương lực cũng như làm giảm nhịp tim [27] Trong nghiên cứu của Byung và cộng sự trên phân đoạn nước dịch trích ly methanol từ nụ vối, hợp chất 5,7,8,4'-tetrahydroxy-3,5-dimethoxyflavone-3-0-B-Dgalactopyranosid, gossypetin-8,3'-dimethylether-3-0-B-Dgalactosid và myricotin-3-methylether-3-O-B-D galactopyranosid được đánh giá tác động gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư Hela, HL-60 và A549 bằng phương pháp thử nghiệm MTT đã cho thấy tác động gây độc tế bào yếu trên tế bào Hela với IC50) 38.7; 42.1 và 45.5 MM, tác động gây độc tế bào trung bình trên dòng tế bào HL-60, IC50 đo được từ 13,7 đến 18.1 KM và tác động gây độc tế bào yếu trên dòng tế bào A549 với IC50) lớn hơn 100 AM [16] Byung và cộng sự cũng

nghiên cứu phân đoạn ethyl acetat từ dịch trích ly methanol của nụ vối và chứng minh được các hợp chất 3-formyl-4,4',6'-trihydroxy-2'-methoxy-5'-methylchalcon,(2S)-8-formyl-6methylnaringenin, và (2S)-8-formyl-6-methylnaringenin7-0-B-D-glucopyranosid có tác động chống oxy hóa với IC50 22.8 và 27.1 µM[17]

Tinh dầu trong cây vối ở Nepal hầu như không có tác động kháng khuẩn đối

với Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, cũng như không thể hiện tác động kháng nấm đối với Aspergillus niger và Candida albicans và không có tác động gây

độc tế bào đáng kể trên các dòng tế bào ung thư MCF-7, MDA-MB-231 và 5637 [3] Thành phần tinh dầu trong nụ vối có tác dụng ngăn ngừa thức ăn thối rữa, ức

chế mầm bệnh trên da, kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA),

Enterococci kháng vancomycin và vi khuẩn đa đề kháng (MARB) Nồng độ tối

thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) và nồng độ vi khuẩn tối thiểu bị ức chế (MBC) trong khoảng từ 1 – 20 µl/ml Dịch trích ly cần cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn gram

âm và P aeruginosa Giá trị MIC và MBC của dịch trích ly cồn trong khoảng từ

0.25 – 32 mg/ml

Flavonoid: 7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavanon, 6'methoxy-3',5'-dimethylchalcon,2',4'-dihydroxy-3'-methyl-6'-methoxychalcon và 2,2',4'-trihydroxy-6'-methoxy-3',5-dimethylchalcon có khung chalcon cho thấy khả năng ức chế trên enzyme neurominidase của virut H1N1 và H9N2 Chất 2,2',4-trihydroxy-6-methoxy-3,5'-dimethylchalcon thể hiện tác động mạnh nhất trên neurominidase H1N1 và neurominidase H1N1 kháng oseltamivir với giá trị IC50 là 8.15±1.05 và 3.31 + 1.34 µM Hợp chất 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- dimethylflavanon, 2,4'dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon;2,4'-dihydroxy-3'-methyl-6'methoxychalcon và 2,2',4'-trihydroxy-6'methoxy-3',5'-dimethylchalcon cho thấy tác động ức chế không cạnh tranh trong những nghiên cứu động học

2.4'-dihydroxy-Flavonoid methyl hóa phân lập từ C operculatus có tiềm năng phát triển thành

những chất ức chế neurominidase của H1N1 [27]

Tác động ngăn ngừa Alzheimer được đánh giá qua thử nghiệm ức chế hai enzyme acetylcholinesterase và butylrylchilineaterase, cả 5 flavonoid: myricetin-3-methylether 3-O-B-D-galactopyranosid, myricetin-3'-dimethylether 3-0-B-D-galactopyranosid, quercetin, kaempferol và tamarixetin đều thể hiện tác động ức chế enzyme acetylcholinesterase với IC50 lần lượt là 19.9; 37.8; 25.9; 30.4 và 22.3 µM, trong khi đó tác động ức chế butylrylchilineaterase chỉ thể hiện với flavonoidayricotin-3'-methylether 3-O-BD-galactopyranosid, quercetin, kaempferol và tamarixetin với giá trị IC50 lần lượt là 152.5; 177.8; 62.5 và 160.6 µM [18]

2.2.6 Giới thiệu về polyphenol 2.2.6.1 Polyphenol

Polyphenol là một nhóm hợp chất lớn trong cấu trúc có nhiều nhóm hydroxy gắn vào nhân thơm trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm Hydroxyl (OH-), dựa vào đặc trưng của cấu tạo hóa học người ta chia ra các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính:

Nhóm hợp chất phenol C6-C1

Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH

Đại diện thường gặp:

- Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết:

- Vallinin: Có mùi thơm đặc biệt, ở dạng glycoside, có nhiều trong quả và được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp xà phòng, công nghiệp thực phẩm với tư cách là chất thơm

- Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi

- Gentizic acid: Có nhiều trong cacao

Nhóm hợp chất phenol C6-C3

Gồm các hợp chất có vòng benzene kết hợp với mạch bên có 3 nguyên tử cacbon, đó là dẫn xuất phenyl propan Chúng rất phổ biến trong nhiều loại thực vật, có mùi thơm

Đại diện thường gặp: - Cynamic acid:

- Cafeic acid

Nhờ có khả năng tạo phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa nên các flavonoid có khả năng ngăn cản các phản ứng oxy hóa Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxid hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào Đưa các chất chống oxy hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, lão hóa, thoái hóa gan [22 - 26]

Flavonoid có công thức cất tạo chung dạng khung cacbon C6-C3-C6 Hơn 4000 hợp chất flavonoids đã được phân lập và phân loại dựa vào cấu trúc hóa học bao gồm:

- Flavanol: Có trong một số cây như bạch dương, thông, liễu, đặc biệt nhiều trong búp chè, trong các loại quả như táo, lê, mận, nho [54] còn được biết đến như là flavan-3-ol hay catechin và galocatechin, là cấu tử của hợp chất tanin Flavanol được tìm thấy trong nhiều loại hoa quả, trà xanh, rượu đỏ và socola Catechin và epicatechin là các flavanol chính trong hoa quả còn gallocatechin epigallocatechin và epigallocatechin gallate được tìm thấy ở các loại hạt họ đậu và chè [55]

- Flavon: Rất phổ biến trong thực vật, có nhiều trong tỏi, hành, chè, dâu tây , có màu vàng và ở dạng glycoside, thường gặp là flavonol Flavonol thường ở dạng glycoside có muôn hình muôn vẻ khác nhau, thường gặp là Kampherol và Quercetin [54] Sự tạo thành flavonols glycosides được quyết định bởi hoạt động của ánh sáng, vì thế chúng chủ yếu được tìm thấy ở lá và vỏ quả (Hermann, 1976)[55]

- Anthocyanin: Các hợp chất thuộc nhóm này đều là các sắc tố quan trọng bậc nhất của hoa quả Chúng là chất màu tan trong nước, cho màu đỏ, tím, xanh dương, vàng của hoa quả và nhiều loại thực vật khác Các anthocyan đều là các glycoside trong đó phần aglucon là anthocyanidin Các anthocyanin hòa tan trong nước còn antocyanindin thì không hòa tan trong nước Điều lưu ý là trong cấu tạo của anthocyanidin, nguyên tử oxi trong vòng pyran có hoá trị tự do Tuy nhiên đã không xác định được một cách chắc chắn rằng nguyên tư nào hoặc oxi hoặc cacbon mang điện tích dương tự do, vì thế thường biểu diễn cấu tạo của anthocyan bằng công thức trung hoà

Nhờ có điện tích dương tự do mà Anthocyanidin mang tính chất của cation trong môi trường acid và mang tính chất anion trong môi trường kiềm, nghĩa là có khả năng tạo muối với acid và base [15]

Tuỳ theo pH môi trường mà trạng thái tích điện của Antocyan thay đổi, theo đó màu sắc cũng thay đổi Các muối cation của Antocyan đều có màu đỏ với những sắc thái màu khác nhau: vàng nhạt, tím, xanh nhạt Các muối anion của Antocyan có màu xanh Nhiều hoa của thực vật màu hồng khi luộc chín chuyển thành màu xanh, điều này chứng tỏ sự thay đổi pH dịch tế bào về phía kiềm [54]

Antocyanidin

Antocyanidin được chia thành 3 nhóm nhỏ, đó là: Pelargonidin, cyanidin, delphinidin, ngoài ra còn gặp apigenidin

Hợp chất Polyphenol

❖ Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa- khử, phản ứng cộng và ngưng tụ

- Phản ứng oxy hóa-khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các polyphenol bị oxy hóa tạo thành Quinon

- Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các Quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tướng ứng

- Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này sẽ ngưng tụ với nhau để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là Flobafen

2.2.6.2 Chức năng của các polyphenol

Polyphenol được chú ý đến bởi khă năng chống oxy hóa của chúng Chúng có khă năng chuyển electron trong chuỗi hô hấp bình thường định cư trong ti thể Chúng có khẳ năng đó là do chúng có khẳ năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do đó làm mất hoạt tính xúc tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng nhận các gốc tự do tức là có khẳ năng dập tắt các quá trình tạo ra các gốc tự do

Ngoài ra polyphenol còn có khẳ năng ức chế sự phát triển của vi nấm Nhiều polyphenol có hoạt tính vitamin P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và chuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản Hiện nay có nhiều tài liệu nghiên cứu

polyphenol có khẳ năng chống và ức chế các tế bào ung thư và sư hấp thu các tia UV

2.3 Những công trình nghiên cứu về cây vối

Hoàng Văn Lựu đã xác định hàm lượng và thành phần tinh dầu lá, nụ, hoa vối ở một vùng tại Nghệ An; tách và xác định cấu trúc một số flavonoid (2' 4'-dihydroxy-6methoxy-3'5’-dimethyl chalcone, 5,7-dihydroxy-6,8-dimethyl flavanone, 7-Hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethyl flavanone, acid cinnamic, acid oleanic) từ nụ và (acid oleanic, Bsitosterol) từ vỏ vối [11]

Đào Thị Thanh Hiền đã nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của lá vối bao gồm tác dụng kháng khuẩn, tác dụng lợi mật và khả năng gây độc tế bào Kết quả

thử tác dụng kháng khuẩn cho thấy lá vối đối với E coli, loại vi khuẩn hay gây bệnh

đường ruột, hai vi khuẩn Gram dương thử nghiệm, loại vi khuẩn hay gặp ở bệnh viêm da

Nước sắc lá vối u có tác dụng lợi mật rất mạnh, tác dụng độc tế bào của 4 mẫu thử trích ly | từ lá vối bước đầu cho thấy cả tinh dầu và cao khô toàn phần đều có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (ung thư gan, ung thư màng tim, ung thư tử cung) Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới đối với dược liệu lá vối [28]

Nhóm tác giả Trong Tuan Dao, Bui Thanh Tung và các cộng sự đã cho thấy

flavonoid methyl hóa phân lập từ C.operculatus có tiềm năng phát triển thành

những chất ức chế neurominidase của virus cúm gia cầm H1N1 [28]

Nhóm tác giả Byung Sun Min và cộng sự đã đánh giá qua thử nghiệm ức chế hai enzyme acetylcholinesterase và butylrylchilineaterase (thuộc nhóm tác nhân gây bệnh Alzheimer), cả 5 flavonoid tách từ nụ vối: myricotin-3’-methylether 3-O-B-Dgalactopyranosid, myricetin-3'-dimethylether 3-0-B-D-galactopyranosid, quercetin, kaempfrol và tamarixetin đều thể hiện tác động ức chế enzyme acetylcholinesterase với IC50 lần lượt là 19.9; 37.8; 25.9; 30.4 và 22.3 µM, trong khi đó tác động ức chế butylrylchilineaterase chỉ thể hiện với flavonoid myricetin-

3'-methylether 3-O-B-Dgalactopyranosid, quercetin, kaempfrol và tamarixetin với giá trị IC50 lần lượt là 152.5; 177.8; 62,5 và 160.6 µM [18]

Trà nụ vối đã được nghiên cứu cho thấy có khả năng ức chế Na+, K+, Cat - ATPase trong tim chuột làm tăng sự co bóp và giảm tần số co bóp của tim chuột Cơ chế tác động của trà nụ vối tương đối chậm hơn tuy nhiên hiệu quả ổn định hơn

Ouabain (là một glucosid trích ly xuất từ hạt cây Strophantus gratus, họ trúc đào

(Apocynaceae) có tác dụng chữa trụy tim mạch nhanh bằng cách tiêm tĩnh mạch) [29]

Tinh dầu được phân lập từ các nụ vối ức chế đáng kể sự phát triển của vi

khuẩn Gram âm (P aeruginosa) và Gram dương, methicillin-resistant

Staphylococcus aureus (MRSA), kháng Vancomycin Enterococci (VRE) Nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của tinh dầu kháng lại các vi sinh vật thử nghiệm đã được tìm thấy trong khoảng 1-20 ul /ml [30]

2.4 Những sản phẩm từ cây vối hiện đang có trên thị trường

- Hiện nay trên thị trường xuất hiện rất nhiều dạng sản phẩm có nguồn gốc từ cây vối như: lá vối sấy khô, nụ vối khô, bột lá vối Các sản phẩm đều có cách sử dụng tương tự nhau như là pha với nước nóng hoặc sử dụng như trà dùng để uống hằng ngày

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu

Lá vối được mua tại vườn trồng tại Thủ Đức, Lá được thu hoạch vào tháng 3/2022, được lựa chọn có kích thước đồng đều, kích thước lá 6-12 cm, loại bỏ các lá vàng và hư hỏng đem rửa sạch với nước, để ráo Tiếp theo lá được đóng trong túi PE bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh 5-7oC trong một ngày cho đến khi đem đi thí nghiệm Tiêu chí chọn lá đã già, một mặt lá màu xanh đậm, mặt còn lại màu vàng nhạt

3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi

Hình 3 1 Lá vối nguyên liệu

3.2.1 Thiết bị

- Máy đo quang phổ PerkinElmer - Bể điều nhiệt (Memmert)

- Máy lắc (Memmert) - Tủ sấy (Memmert) - Vortex

- Máy đo pH

- Cân điện tử 4 số lẻ, 2 số lẻ - Máy khuấy từ

- Cân sấy ẩm - Bơm chân không - Tủ đông, tủ lạnh

3.2.2 Dụng cụ

- Bình định mức 50ml, 100ml - Bình tam giác 250ml

- Cốc thủy tinh 100ml, 250ml - Phễu thủy tinh

- Đũa thủy tinh - Nhiệt kế

- Bình hút chân không - Ống nghiệm có nắp - Micropipette

- Rây - Cuvet - Cá từ

3.2.3 Hóa chất, dung môi

- Dung môi: Cồn tuyệt đối - Hóa chất:

- Trolox (Merck, Đức) - DPPH (Nhật Bản)

- Methanol (Trung Quốc) - Na2CO3 (Trung Quốc)

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 3 2 Sơ đồ nghiên cứu

3.3.2 Quy trình trích ly dịch lá vối

Hình 3 3 Quy trình trích ly dịch lá vối

Thuyết minh quy trình:

- Lá vối được thu mua và vận chuyển về phòng thí nghiệm Lá vối được tiến hành làm sạch để loại vỏ tạp chất, lá hỏng… sau đó được rửa sạch và để ráo tự nhiên

- Chần: lá vối sau khi được làm ráo tự nhiên tiến hành khảo sát nhiệt độ chần với nhiệt độ trong khoảng 70-100oC trong thời gian 5-30 giây để chọn được thông số phù hợp cho các quá trình tiếp theo Mục đích của quá trình này nhằm bất hoạt các emzyme polyphenol oxidase có trong lá vối

- Làm nguội nhanh: lá vối sau khi chần được vớt ra ngoài và được làm nguội nhanh trong 5 phút ở nhiệt độ (2-5oC) bằng nước đá lạnh rồi lấy ra ngoài để ráo Mục đích là để giảm mức độ biến đổi hóa học, hóa sinh và sinh học Khi

đó, mức độ giảm chất lượng về thành phần dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm sẽ được giảm tối thiểu

- Xay: lá vối được xay nhằm để phá vỡ cấu trúc của nguyên liệu để nâng cao hiệu quả của quá trình trích ly Kích thước của nguyên liệu càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc bề mặt nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn Lá vối sau khi chần sẽ được xay nhỏ kích thước 0,5-1 mm bằng thiết bị xay gián đoạn (Philips Blender, HR2096/00) Mỗi lần xay khoảng 100g lá trong 2 phút - Trích ly: đây là quá trình trích ly rắn – lỏng, dung môi được sử dụng trong

nghiên cứu này là nước – cồn, dung môi thẩm thấu vào trong các tế bào của lá Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát và tìm ra điều kiện tối ưu các thông số cần khảo sát như: nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, nồng độ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, pH

- Lọc: mẫu sau quá trình trích ly được tiến hành lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,25mm Mục đích của quá trình này nhằm tạo ra một hỗn hợp huyền phù đồng nhất, đồng thời đây cũng là bước chuẩn bị cho quá trình sấy phun

3.3.3 Phương pháp thiết kế thí nghiệm Thí nghiệm khảo sát sơ bộ

Mục đích của thí nghiệm khảo sát là sàng lọc các thông số (yếu tố khảo sát) ảnh hưởng có ý nghĩa lên hiệu quả thu hồi flavonoid bằng phương pháp thực nghiệm một yếu tố ở một thời gian Cụ thể các yếu tố sẽ được lần lượt khảo sát độc lập, khi một yếu tố khảo sát thì các yếu tố còn lại được cố định ở một mức được lựa chọn Phương pháp phân tích phương sai một chiều (one-way ANOVA) và LSD (Least Significant Difference) được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa các mức yếu tố với α = 0,05

Thí nghiệm tối ưu hóa

Mục đích của thí nghiệm này là xác định tối ưu hóa quá trình trích ly, để thu hồi hiệu quả flavonoid cao nhất Để tối ưu quy trình trích ly, mô hình CCRD (Central Composite Rotatable Design) với 4 yếu tố và 5 mức được sử dụng trong