Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu trích ly enzyme từ dịch trích gừng

TỔNG QUAN

Tổng quan về enzyme proteolytic

Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, do có kích thước lớn nên enzyme không đi qua các màng bán thấm Enzym là những chất xúc tác hữu cơ có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất do tế bào sống tổng hợp nên, xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định [1]

Nhiều loại enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật có thể được tách khỏi tế bào hoặc tự di chuyển ra môi trường ngoài Sau khi tách chiết, các enzyme vẫn duy trì tính chất và khả năng xúc tác của chúng, ngay cả ở dạng chế phẩm khô Các nguồn nguyên liệu enzyme chính bao gồm mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, và tế bào vi sinh vật [1].

1.1.2 Sơ lược về enzyme proteolytic

Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L- acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton Và chúng thường tác động lên các liên kết ester đơn giản

2 Hình 1 1 Công thức cấu tạo protease

 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm:

 Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất:

- Endopeptidase: enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch

- Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch

 Dựa vào pH hoạt động:

 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:

 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

- Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombin…

- Thiol protease (SH): papain, bromeline…

- Aspartic protease (COOH): pepsin, renin…

- Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là Zn2+ hoặc Mg2+)

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu protease trong nước Ở nước ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm, dược phẩm

Trần Thanh Trúc và cộng sự (2014), Nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon) Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông của thịt đầu tôm sú đến quá trình trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon) và các điều kiện tối ưu trích ly enzyme protease Kết quả khảo sát cho thấy, việc trữ đông nguyên liệu đến 8 tuần vẫn giúp duy trì ổn định hoạt tính enzyme protease có trong thịt đầu tôm Dịch chiết protease kiềm thu được từ thịt đầu tôm sú có tổng hoạt tính cao nhất là 13,48 U/g chất khô nguyên liệu với tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 4 (w/v); pH 9,0; nhiệt độ 50°C; thời gian trích ly 40 phút

Hà Thị Thụy Vy và các cộng sự (2016) Ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hiệu quả tinh sạch enzyme protease trong dịch trích ly từ 2 loại thịt đầu tôm (sú và thẻ chân trắng) Tỷ lệ giữa dịch trích protease thô và dung môi (ethanol, acetone, iso-propanol) được thay đổi từ 1: 1 đến 1: 6 (v/v), tương tựnồng độ ammonium sulfate trong dịch trích cũng dao động từ 35% đến 85% Xác định thời gian kết tủa thích hợp từ tác nhân được lựa chọn cũng được khảo sát Kết quả cho thấy, ethanol đạt hiệu quả kết tủa protease cao cho cả hai dịch trích Đối với dịch trích tôm sú, tỷ lệ mẫu: ethanol là 1: 4 (v/v) và thời gian kết tủa là 45 phút cho hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch đạt tương ứng 3,49 U/mg protein, 87,46% và 3,78 lần Đối với tôm thẻ, tỷ lệ mẫu với ethanol là 1: 3 (v/v), thời gian kết tủa

30 phút cho giá trị lần lượt là 2,04 U/mg protein, 85,66% và 3,23 lần Cả hai loại protease được xác định bằng điện di SDS-PAGE có trọng lượng phân tử là 35,8 ÷ 40,5 kDa

Võ Văn Quốc Bảo và các cộng sự (2018), thu nhận và khảo sát một số tính chất của chế phẩm Ficin từ nhựa quả vả (Ficus auriculata L.) nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa quả vả cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme này nhằm nâng cao giá trị sử dụng của quả vả tại Thừa Thiên Huế Quả vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm lượng protein và hoạt độ protease cao nhất, tương ứng là 2,212 mg/g chất khô của nguyên liệu và 1,077 Hp/ml khi tỷ lệ giữa dịch nhựa quả vả/ethanol 96 % là 1/4 và nhiệt độ chiết là 3°C Thời gian thu nhận enzyme này thích hợp nhất là 60 phút Chế phẩm protease hoạt động thích hợp ở 45 °C, pH = 6, bền nhiệt từ 35°C đến 50°C trong 1 giờ

1.1.2.4 Tình hình nghiên cứu protease ngoài nước

Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinh sạch

Năm 1862, Danivevski đã chiết tách được trypsin và amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ, mở đường cho việc nghiên cứu đặc tính enzyme và protein Sau đó, Hommarsten (1872) chiết tách thành công chymosin Wurtz (1879) là người chiết tách được papain, còn Crassman và Ambros (1926) thì chiết tách được bromelain.

Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark) Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%

Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên

5 Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác

Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao

1.1.2 Tổng quan về một số loại enzyme proteolytic thu nhận từ thực vật có sẵn trên thị trường

Các enzym phân giải protein đã được tìm thấy ở cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm Đại diện của các loài cây hai lá mầm là sung, đu đủ, bông sữa, euphorbia; cây một lá mầm là dứa và ngũ cốc [2]

Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách khuấy nhựa đu đủ một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đen sấy khô nghiền nhỏ Bromelin thu từ thân dứa, sau khi hái quả, người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzyme trong dịch ép Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus Một số thực vật như malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác cũng là nguồn enzyme có truyền thống được dùng trong công nghiệp rượu, bia, bánh kẹo Malt chủ yếu có chứa amilaza hoạt động, còn các enzyme thủy phân khác hoạt động tương đối yếu [1]

Những loại enzyme trích ly từ những loại thực vật trên thuộc nhóm Cystein- protease vì trung tâm hoạt động của nó có chứa nhóm Sulfhydryl (-SH) của Cystein, nhóm này nằm gần vòng imidazol của Histidine và nhóm -COOH của axit Aspactic Sự tổ hợp của các nhóm chức này có mặt trong trung tâm hoạt động tạo điều kiện cho hoạt động xúc tác của phân tử enzyme và có pH tối ưu vào khoảng 7 để phân giải một số loại protein như hemoglobin, casein, albumin trứng, v.v., và có khả năng làm đông tụ sữa; còn nhóm enzyme protease không chứa gốc Sulfhydryl (-SH) có pH tối ưu kiềm hơn và khả năng đông tụ sữa kém hơn Cả hai nhóm proteinase thực vật đều có khả năng chịu nhiệt, thường duy trì hoạt động ở nhiệt độ từ 60℃ đến 70℃ [2]

6 Một số proteinase thực vật có một số ứng dụng công nghệ và y tế, quan trọng nhất về mặt thương mại là làm mềm thịt điển hình là papain và bromelin Các ứng dụng công nghệ khác trong nền công nghiệp thuộc da, da giày và trong công nghiệp sản xuất bia Trong y tế, chúng được sử dụng để điều trị rối loạn tiêu hóa liên quan đến protein và điều trị vết thương bong tróc Hầu hết các protease thực vật có thể tiêu hóa các loài giun sống ký sinh, chẳng hạn như giun đũa.

Tổng quan về gừng

Từ thế kỷ thứ 4 trước Công nguyên, gừng đã trở thành một thành phần quan trọng trong y học cổ truyền Trung Hoa Trong khi đó, người Hy Lạp và La Mã cổ đại sử dụng gừng như một loại gia vị và thuốc, với các công dụng như điều trị táo bón, cảm lạnh, viêm phế quản, đục thủy tinh thể và trung hòa axit dạ dày.

Gừng có tên thường gọi ở một số quốc gia là: Ginger [tiếng anh], Jiang [tiếng Trung], Gingembre [tiếng Pháp], Ingwer [tiếng Đức], Zenzero [tiếng Ý], Shoga [tiếng Nhật], Gengibre [tiếng Bồ Đào Nha], Jengibre [tiếng Tây Ban Nha] [4]

Tên khoa học: Zingiber officinale Roscoe

Hình 1 2 Phân loại một số loại enzyme thực vật [32]

Loài: Officinale Đặc điểm vật lý: Loại thảo mộc sống lâu năm, có hình dáng mảnh mai, thân thẳng đứng và lá màu xanh lục trung bình hẹp xếp thành hai hàng trên mỗi thân Cây gừng cao tới 1,5 m với những chiếc lá rộng khoảng 2 cm và dài 20 cm Loại cây này mọc từ một thân ngầm dày, có mùi thơm (thân rễ), có bề mặt phân nhánh, không đồng đều Hoa gừng phát triển tạo thành một cành dày đặc cao tới 8 cm trên một thân khác với các lá [5]

Phân bố và sinh thái: Gừng là loài thực vật sống được chủ yếu ở các vùng nhiệt đới ấm, ẩm, râm mát của miền nam châu Á, nhưng hiện nay loại cây này được trồng phổ biến phụ vụ cho mục đích thương mại ở Jamaica, Tây Ấn, Haiti, Trung Quốc và Nigeria Gừng thường được thu hoạch vào khoảng 5 - 6 tháng sau khi trồng từ củ gừng tươi Các nhà sản xuất gừng khô chính bao gồm Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan, Sierra Leone, Nigeria, Jamaica, Fiji và Australia [6]

Gừng là một loại gia vị, chất tạo hương và được xem như một loại thảo dược được sử dụng dưới dạng chế phẩm cả tươi và khô [7] Các bộ phận của gừng thường được tận dụng nhiều nhất là rễ và thân rễ Gừng và các chất chiết xuất từ gừng là thành phần phổ biến của thực phẩm và đồ uống bao gồm tương ớt, dưa chua, rượu và các sản phẩm bánh mì Các dạng thuốc phổ biến của gừng bao gồm củ tươi, củ khô, viên nén, viên nang (50 -

550 mg), dịch chiết, cồn và trà Tinh dầu gừng là sản phẩm chưng cất bằng hơi nước của thân rễ gừng tươi hoặc bột gừng có thành phần chủ yếu là hydrocacbon sesquiterpene (ví dụ: zingiberene) [6] Thân rễ còn là nguồn cung cấp tinh dầu tốt nhất vì có chứa một

8 lượng đáng kể tinh dầu trong vỏ Gừng khô toàn bộ có lớp vỏ sần sùi; Gừng gọt vỏ có đường bó sợi lộ ra ngoài bằng cách cạo bỏ lớp bần Mặc dù không có tiêu chuẩn chung, các sản phẩm gừng thường được tiêu chuẩn hóa về hàm lượng gingerol

Tinh dầu gừng chứa khoảng 1 - 3,5% tinh dầu sau khi chưng cất bằng hơi nước, với nồng độ cao các hydrocacbon sesquiterpene như zingiberene, và một lượng nhỏ hydrocacbon monoterpene và hợp chất oxy hóa Tùy thuộc vào quy trình chiết xuất, chủng loại và nguồn gốc (khô hoặc tươi), tinh dầu gừng có thể chứa nhiều hợp chất khác nhau, chẳng hạn như camphene, β - phellandrene, β - bisabolene và α - farnesene Các hydrocacbon sesquiterpene chính trong dầu gừng được chế biến từ thân rễ gừng tươi bao gồm α-zingiberene (27 - 30%), α-curcumene (8-9%), β- sesquiphellandrene (4,8%) và bisabolene (3,2%).

Tổng quan về Ginger rhizome proteolytic enzyme trích ly từ củ gừng

Proteolytic enzyme đôi khi được sử dụng trong nấu và ninh thịt, và đã được chứng minh là làm tăng độ mềm của thịt do quá trình phân giải protein của các phần protein thịt khác nhau [9] Trong số các enzym phân giải protein có nguồn gốc thực vật, papain, ficin và bromelain đã được nghiên cứu rộng rãi nhất [10] và thường được sử dụng để làm mềm thịt Nghiên cứu này với thân rễ gừng đã góp phần tạo ra một nguồn enzyme mới có ứng dụng trong phân giải protein và có tầm quan trọng đối với các sản phẩm thực phẩm

1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Ginger rhizome là một nguồn enzyme proteolytic, thể hiện hoạt tính tối ưu ở 60℃ và nhanh chóng bị thoái hóa khi tăng nhiệt độ lên 70℃ Ginger proteolytic enzyme phân giải collagen tốt hơn là actomyosin [9] [11] Theo một số tác giả như Lee và cộng sự (1986), Kim và Lee (1995); Mendiratta và cộng sự (2000) [12] [13] đã nghiên cứu được một số tính chất kháng khuẩn cũng như chống oxy hóa và làm mềm thịt của dịch trích gừng Gừng cho thấy tác dụng làm mềm, nhưng hàm lượng gừng cao hơn dẫn đến các vấn đề về hương vị Naveena và Mendiratta (2001) đã thử nghiệm cách chiết gừng nấu với thịt

9 gà mái và nhận thấy rằng miếng thịt mềm hơn khi các mẫu được xử lý ở giai đoạn sau làm lạnh (ở 4℃ ± 1℃ trong 24 giờ)

Naveena và cộng sự (2004) đã tiến hành một nghiên cứu để so sánh hai enzym phân giải protein thực vật từ Cucumis trigonus Roxb (Kachri) và Zingiber officinale roscoe (Thân rễ gừng) với papain về tác dụng làm mềm và thu được kết quả tất cả các mẫu được xử lý bằng enzyme đã cải thiện hương vị, độ ngon, độ mềm và điểm chấp nhận tổng thể Tuy nhiên, các mẫu được xử lý bằng dịch trích gừng nhận được điểm số tốt hơn trong khi các mẫu được xử lý papain và cucumis nhận được điểm số gần như bằng nhau

Tsai và cộng sự (2012) chỉ ra rằng bên cạnh tác dụng chống oxy hóa, ginger proteolytic enzyme còn có tác dụng lớn đối với sự thoái hóa của một số tế bào protein myofibrillar chính (titin, mạch myosin phức tạp, troponin -T, desmin và a-actinin)

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên các loại cây họ gừng nói chung và loại gừng trâu nói riêng phát triển rất thích hợp Tuy nhiên, sản phẩm từ gừng trâu chỉ được biết đến qua các món thực phẩm được dùng hằng ngày mà chưa có nhiều nghiên cứu về enzyme protease trên loại cây này Củ gừng là nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme do chứa một lượng lớn protease gọi là zingibain Bên cạnh hai loại enzyme từ thực vật đã được nghiên cứu tương đối rõ ràng và có nhiều ứng dụng cụ thể là bromelain và papain, việc nghiên cứu khảo sát các điều kiện tách chiết protease từ củ gừng sẽ có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong tương lai.

Tổng quan về phương pháp thu nhận Ginger rhizome proteolytic enzyme

1.4.1 Sự ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly Ginger rhizome proteolytic enzyme Độ pH và sự có mặt hoặc không có các chất ổn định đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất protease từ thân rễ gừng Hoạt tính của enzyme cao hơn đáng kể (p ≤ 0,05) khi chiết xuất ở pH trung tính so với pH axit hoặc kiềm [14] Một số nghiên

10 cứu trước đây đã sản xuất thành công protease từ gừng bằng cách sử dụng đệm phosphat ở pH 7 [15] [5]

Ngoài ra, sự có mặt của Cysteine là một chất chống tự phân có hiệu quả để bảo vệ sự ổn định của protease trong quá trình chiết xuất [16] EDTA cải thiện tính ổn định của hoạt động protease [14] Trong dung dịch, EDTA che đi các ion kim loại có thể dẫn đến việc bất hoạt enzyme bằng cách tấn công nhóm sulfhydryl trong vị trí của cysteine protease EDTA cũng có thể bảo vệ enzyme khỏi quá trình oxy hóa xảy ra trong quá trình chiết xuất [17] Nếu không có bất kỳ chất ổn định nào, hoạt động của protease trong gừng thô sẽ giảm mạnh trong suốt quá trình chiết xuất và bảo quản

1.4.2 Tác động của sóng siêu âm đến quá trình thu nhận Ginger rhizome proteolytic enzyme Để việc phá vỡ cấu trúc tế bào có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu hoặc đồng hóa bằng các xay cơ học Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat và chất tẩy (detergent)

Sóng siêu âm là sóng cơ học, tức là lan truyền nhờ dao động của các phần tử trong môi trường Đặc điểm nổi bật của sóng siêu âm là có tần số lớn hơn ngưỡng nghe của người bình thường (thường từ 20 - 20.000 Hz), nên tai người không thể nghe được Sóng siêu âm có nhiều ứng dụng quan trọng trong các lĩnh vực như y tế, công nghiệp và nghiên cứu khoa học.

20000 Hz) Do trong trường siêu âm, các phần tử dao động cùng phương với phương truyền sóng nên sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc [18]

Hình 1 3 Các khoản tần số âm thanh

Trong môi trường chất lỏng, sóng siêu âm tạo ra các chu kỳ kéo và nén liên tục, dẫn đến xâm thực khí Đồng thời, tại ranh giới giữa hai pha lỏng và rắn, các vi xoáy được tạo ra gây ra sự hỗn loạn, tăng cường truyền khối đối lưu và khuếch tán.

11 Sóng siêu âm ứng dụng trong công nghệ thực phẩm thường sử dụng sóng có tần số thấp, năng lượng cao (20 – 100kHz) Do các mẫu thực phẩm thường có độ nhớt cao làm giảm sự lan truyền của các phần tử trong trường siêu âm, khi đó các sóng có năng lượng cao sẽ dễ đi xuyên vào thực phẩm hơn [19]

Tác động sinh học của sóng siêu âm

Sóng siêu âm sử dụng trong quá trình trích ly rắn - lỏng có 3 tác động sinh học chính lên nguyên liệu như sau:

- Chuyển động của sóng siêu âm rất nhanh, làm lỏng các liên kết trong mô

- Sự tạo và vỡ bọt: chuyển động của sóng siêu âm qua môi trường lỏng tạo ra một chu trình dãn nở, tạo vùng áp suất chân không trong Hiện tượng tạo và vỡ bọt xảy ra khi áp suất chân không vượt quá so với độ bền kéo của chất lỏng

Hình 1 4 Nguyên lý hình thành và vỡ bọt khí

Hình 1.4 minh họa cơ chế hình thành, phát triển và vỡ các bong bóng khí trong chất lỏng: Khi sóng âm truyền qua chất lỏng, nó tạo ra các chu kỳ gồm hai giai đoạn giãn nở và nén liên tục, dẫn đến sự xuất hiện của các bong bóng khí trong chất lỏng [20].

- Trong pha giãn: khí bên ngoài bong bóng được khuếch tán vào bên trong

- Trong pha nén: bong bóng co lại và khí bị hấp thụ ngược trở lại

Mặt khác các phân tử khí lại tiếp tục bị hấp thụ vào chất lỏng nên kích thước của bong bóng lớn dần qua các chu kì giãn và nén Khi đạt kích thước tối đa, bong bóng nổ vỡ, nhiệt độ có thể đạt 5000℃ và áp suất 2000ats

Hiện tượng tạo bọt gia tăng truyền nhiệt, truyền khối trong pha lỏng do tăng tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi Sự khuếch tán chất hòa tan vào dung môi cũng tăng lên, cải thiện hiệu quả trích ly Bên cạnh đó, sủi bọt khí ở bề mặt pha lỏng-rắn tạo ra các vi tia lỏng Nếu hướng đến bề mặt nguyên liệu, các vi tia này có thể gây nứt và vỡ nguyên liệu, hỗ trợ quá trình trích ly vật lý.

Tóm lại, quá trình siêu âm gây ra hiện tượng xâm thực khí, sẽ làm cho nguyên liệu bị rạn nứt hoặc giảm kích thước, gia tăng sự tiếp xúc nguyên liệu với dung môi, tăng khuếch tán các chất hòa tan dẫn đến tăng động lực của quá trình trích ly

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành và vỡ bóng

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và hiệu quả trích ly bằng sóng siêu âm Chúng bao gồm các thông số liên quan đến:

- Âm trường: tần số sóng âm, cường độ âm, mật độ năng lượng âm, …

- Nguyên liệu thô: cấu trúc, mức phá vỡ, loại và số lượng các chất trích ly

- Đặc tính vật lý dung môi cũng như điều kiện khảo sát các yếu tố: thời gian, nhiệt độ, áp suất Ứng dụng của sóng siêu âm trong ngành công nghệ thực phẩm

Siêu âm hiện nay cũng là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong ngành công nghệ thực phẩm Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thường được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Có 2 lĩnh vực được ứng dụng chính trong công nghiệp thực phẩm:

- Tần số cao và năng lượng thấp: Siêu âm chuẩn đoán Trong khoảng tần số MHz Phần này được sử dụng như một kỹ thuật phân tích đảm bảo chất lượng, qui trình điều khiển và kiểm tra không làm phá hủy cấu trúc, điều này được ứng dụng trong xác định tính chất thực phẩm, đo tốc độ dòng chảy, bao gói thực phẩm

- Tần số thấp và siêu âm năng lượng cao: Phần này được ứng dụng rộng rãi như một quy trình hỗ trợ trong hàng loạt các lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí, trích ly, lọc, đồng hóa, làm mềm thịt, quá trình oxi hóa, quá trình tiệt trùng, …

Tổng quan về phương pháp tinh sạch Ginger rhizome proteolytic enzyme

Sau khi nhận được dịch chiết enzyme thô, các phương pháp khác nhau đã được sử dụng để tinh sạch enzyme Kết tủa là một kỹ thuật tinh chế phổ biến được sử dụng để cô đặc và tinh sạch protein Kết tủa protein là quá trình tách protein khỏi dung dịch và thu nhận dưới dạng chất rắn bằng cách thay đổi độ hòa tan của dung dịch Quá trình kết tủa thường không tốn kém và dễ áp dụng trên quy mô lớn Có một số phương pháp hoặc hệ thống để thực hiện quá trình kết tủa nhưng quan trọng là xác định phương pháp nào phù hợp nhất để đạt được các mục đích mong muốn sau quá quá trình

Các phương pháp kết tủa truyền thống sử dụng tác nhân khác nhau như dung môi hữu cơ, muối trung tính, polymer, chất đa điện phân và ion kim loại Những phương pháp này dễ thực hiện và các tác nhân tủa dễ kiếm, phổ biến.

Tủa bằng dung môi hữu cơ có mặt trong nhiều quy trình sản xuất Tuy nhiên, dung môi hữu cơ có khả năng làm biến tính protein ngay cả ở nhiệt độ thường Do vậy, quá trình tủa protein bằng dung môi hữu cơ phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp 0-5℃ và chọn lựa dung môi thích hợp [21]

Các dung môi tan trong nước như methanol, ethanol, n-butanol đã được nghiên cứu để kết tủa whey protein và sấy khô để thu protein concentrate Ethanol là dung môi an toàn hơn hai dung môi còn lại Methanol và n-propanol cho whey protein concentrate ít tan hơn so với protein concentrate kết tủa từ ethanol trong khi n-butanol cho whey protein concentrate chứa nhiều béo và lactose nên gần như không tan trong nước

Các yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến độ hòa tan của protein là cấu trúc, kích thước, điện tích và dung môi Sau khi protein được kết tủa, nó có thể được tách ra khỏi dung dịch bằng cách ly tâm hoặc lọc Sau đó, kết tủa có thể được hòa tan trở lại trong một thể tích nhỏ hơn để cô đặc hoặc rửa và phân giải trong một dung dịch khác để thay đổi điều kiện dung dịch

1.5.2 Phương pháp thẩm tích qua màng cellophane

Thẩm tích là quá trình khuếch tán của các phân tử từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp thông qua một màng bán thấm (không thấm đối với những chất keo hòa tan như protein và một số các polysaccharide nhưng thấm đối với các dạng dung dịch của các tinh thể) [22]

Khi đạt trạng thái cân bằng, các phân tử di chuyển ra và vào lỗ màng đạt cùng tốc độ Ngược lại, các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ màng sẽ không thể đi qua màng bán thấm và được giữ lại tại một phía, nồng độ của các phân tử này không có sự thay đổi giữa hai bên màng Khi thay dung dịch thẩm tích bên ngoài màng bán thấm sẽ tạo ra một gradient nồng độ mới [23]

Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại bỏ muối ra khỏi dung dịch protein, thường cho dung dịch protein vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm (thường dùng là màng cellophane) Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy khuấy cơ học hay máy khuấy từ hoặc là quay chậm túi nhờ dao động cơ không lớn

1.5.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích gồm: thể tích, thành phần và số lần thay đổi dung dịch ngoài màng bán thấm, thời gian, nhiệt độ thẩm tích và kích thước các phân tử so với kích thước lỗ màng [23] Các phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ màng nhiều lần sẽ nhanh đạt được sự cân bằng nồng độ hơn các phân tử có kích thước gần với kích thước lỗ màng Màng cellophane sử dụng trong thí nghiệm có cấu trúc các lỗ rỗng xoắn, do đó các phân tử nhỏ có thể đi xuyên qua dễ dàng hơn [23][24]

Trong quá trình thẩm tích, các phân tử đi qua màng bán thấm và đạt trạng thái cân bằng riêng, độc lập với các chất khác dẫn đến mẫu có thể bị pha loãng [23] Khi thẩm tích

15 các protein thường người ta tiến hành tất cả ở môi trường lạnh ở 4 – 5 o C, trong khoảng 6 – 8 giờ và thể tích dung dịch ngoài màng bán thấm gấp 200 – 500 lần thể tích dung dịch trong túi thẩm tích [23][24] Ngoài ra, một số phân tử có thể bám lên màng bán thấm dẫn đến mất mẫu Sự mất mẫu do bám màng là không đáng kể với mẫu có nồng độ > 0,5mg/ml nhưng có khác biệt lớn với mẫu có nồng độ < 0,1mg/ml Có thể bổ sung chất mang vào mẫu thẩm tích để ngăn ngừa sự mất mẫu do bám màng [23].

Tổng quan về phương pháp điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE)

SDS - PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính các phân tử protein Trong kỹ thuật này protein được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Để xác định khối lượng phân tử của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có khối lượng phân tử khác nhau đã biết [25] [26]

Khi tiến hành điện di, cần sử dụng mẫu có thể tích 20 µl và đặt vào các giếng chứa gel Quá trình điện di sẽ được thực hiện với hiệu điện thế ổn định ở mức 100V Điện di sẽ kết thúc khi vạch màu xanh bromophenol di chuyển đến vị trí cách đáy gel khoảng 1 cm.

Sau công đoạn điện di, gel được nhuộm trong dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 trong 30 phút Để làm sáng màu, gel được ngâm trong dung dịch tẩy màu (hỗn hợp methanol, axit axetic và nước) Các protein sẽ được phát hiện dưới dạng các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.

1.6.3 Xác định trọng lượng phân tử của protein Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối cùng)

Tính giá trị Rf = Khoảng cách di chuyển của protein

Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol)

Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf trên, nhờ phương pháp nội suy theo đồ thị Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein.

Phân tích tính chất của chế phẩm enzyme

Khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt tính hoạt động của enzyme Một số phương pháp xác định hàm lượng protein trong dung dịch với độ nhạy của chúng khác nhau, hoặc do dựa vào sự có mặt của một số amino acid, do thành phần amino acid của protein khác nhau, nên kết quả phân tích sẽ bị ảnh hưởng

Phản ứng Biuret cho phép định lượng lượng peptide và protein có từ 2 liên kết peptide trở lên dựa vào khả năng tạo phức màu mận chín với CuSO4 trong dịch kiềm Nồng độ peptide và protein tỷ lệ thuận với độ đậm màu Phép đo hấp thụ được thực hiện ở bước sóng 540 nm, đối chứng là dịch Biuret, đệm hoặc nước Tuy nhiên, một số tác nhân như đệm chuẩn bị từ amino acid, đệm Good's và đệm Tris có thể gây cản trở phản ứng Ưu điểm của phương pháp Biuret là cho kết quả ổn định với các loại protein khác nhau và dễ thực hiện, nhưng hạn chế là độ nhạy kém (khoảng 1 mg).

Phương pháp Lowry, là phương pháp khá nhạy so với phương pháp biuret do bổ sung thêm chất Folin-ciocalten làm tăng độ màu của dung dịch, dịch màu xanh dương xuất hiện là do:

- Liên kết càng cua giữa N tạo liên kết peptide với Cu+2

- Sự khử chất Folin-ciocalten do tyrosine và tryptophan trong phân tử protein tạo ra

17 Các bước thực hiện giống như phương pháp biuret, độ nhạy cao hơn 100 lần Tuy nhiên nó bị ảnh hưởng rất mạnh bởi đệm Good’s, NH4)2SO4 (nồng độ >15%), glycine (nồng độ >0,5%) và mercaptan Ngoài ra protein có hàm lượng tysosine và tryptophan khác nhau do vậy kết quả không mấy ổn định [27] [20] Định lượng protein bằng phương pháp Bradford loại bỏ hầu hết các vấn đề liên quan đến quy trình được mô tả ở trên và dễ dàng sử dụng để xử lý số lượng lớn mẫu, cũng như có thể tự động hóa Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein dẫn đến sự tồn tại ở hai dạng màu khác nhau của thuốc thử Coomassie Brilliant Blue G-250 là đỏ và xanh lam [28].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu

Củ gừng tươi được mua từ hệ thống siêu thị Sài Gòn Co op thuộc giống gừng trâu – Zingiber oficinale Rosc có xuất xứ từ Đăk Lăk (Việt Nam) Gừng được thu hoạch trong độ tuổi khoảng 9 đến 12 tháng tuổi, khối lượng từ 200g – 500g tùy củ Gừng sau khi mua về được sử dụng ngay hoặc dùng dần trong tuần và bảo quản ở nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp

Gừng khi sử dụng làm thí nghiệm sẽ được rửa sạch, để ráo và gọt vỏ

2.1.2 Hóa chất trong nghiên cứu

Folin-Ciocalteu’s phenol; casein; HCl; Ethanol; Na2HPO4.12H20, NaH2PO4.7H2O; Trichloroacetic acid (TCA); NaOH; Cysteine; Tyrosine; Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); Dithiothreitol (DTT); đệm Tris-HCl pH 6,8; nước cất 2 lần; dung dịch acrylamide 30%; dung dịch SDS 10%; APS 10%; TEMED.

Dụng cụ và thiết bị

Bình định mức 50ml, 100ml, 1000ml; erlen 250ml; micropipet (20 – 200μl, 100 - 1000 μl,

1 – 5 ml), phểu thủy tinh, đũa thủy tinh, nhiệt kế, thau, rổ, dao, thớt, bình hút chân không, ống nghiệm, cuvet

Thiết bị khuấy từ, pH kế, máy quang phổ UV-VIS, máy ly tâm, cân điện tử 2 và 4 số lẻ, tủ đông, tủ mát, máy siêu âm, tủ sấy, …

Phương pháp nghiên cứu

Phân tích thành phần của củ gừng tươi

Trích ly protease bằng môi trường nước

- Tỷ lệ gừng: dung môi (1:5-1:25; ∆ 1:5)

- Thời gian trích ly (30-150 phút; ∆ 30 phút)

Trích ly protease bằng môi trường nước kết hợp siêu âm

- Hàm lượng protein tổng (mg/g chất khô của nguyên liệu)

- Hoạt tính ginger rhizome proteolytic enzyme (UI/g chất khô của nguyên liệu)

Kiểm tra chất lượng chế phẩm enzym

- Phân tử lượng bằng sắc ký điện di SDS Page

- Nhiệt độ và pH hoạt động thích hợp

Thu nhận protease bằng phương pháp kết tủa bởi ethanol và thẩm tích qua màng cellophan có

- Hàm lượng ethanol trong dung môi

Trích ly có khuấy đảo

Lọc Trích ly có khuấy đảo

Thẩm tích Gừng đã gọt vỏ Đệm Phosphat (pH 7.0)

2.3.3.1 Lựa chọn nguyên liệu gừng

Mục đích: Đảm bảo đồng nhất chất lượng enzyme tạo ra sử dụng cho mỗi thí nghiệm

Thực hiện: Chọn củ gừng còn nguyên vẹn; lành lặn, không bị thối hỏng hoặc dập nát hay bị hư hỏng bởi sinh vật hại hoặc bị thấm nước gây ẩm bất thường ở ngoài vỏ củ; không có mùi và/hoặc vị lạ; rắn chắc; không bị trầy vỏ; đủ khô để sử dụng; vỏ, cuống và vết cắt khi thu hoạch phải khô hoàn toàn sạch, không có tạp chất lạ nhìn thấy bằng mắt thường,

Gừng sau khi mua về được sử dụng ngay hoặc dùng dần trong tuần và bảo quản ở nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp

Mục đích: Loại sạch đất cát, bụi bẩn, hạn chế làm nhiễm tạp chất vào dung dịch trích ly Thực hiện: Gừng khi sử dụng làm thí nghiệm sẽ được rửa sạch, để ráo và gọt vỏ

Mục đích: Giảm kích thước và làm đồng đều kích thước nguyên liệu, hỗ trợ quá trình nghiền

Thực hiện: Gừng sau khi để ráo và gọt vỏ sẽ được cắt nhỏ ra thành từng lát nhỏ với kích thước độ dày x rộng x cao tương đương 1 x 2 x 2 (mm)

Mục đích: Giảm kích thước nguyên liệu, tăng diện tích tiếp xúc giữa dung môi với nguyên liệu, trích ly một phần enzyme có trong nguyên liệu

Thực hiện: Lấy 15g gừng tươi đã gọt vỏ cho vào máy xay sinh tố cùng với một lượng dung môi bao gồm đệm phosphat (pH 7,0), EDTA (pH 7,0) và cystein xay đều trong vòng

1 phút 30 giây (30 giây xay – nghỉ 30 giây)

23 Mục đích: Trong quá trình tách chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm giúp đẩy nhanh quá trình truyền khối dẫn đến việc giải phóng các protein và polyphenol từ thành tế bào, nhu mô thông qua hiệu ứng xâm thực (cavitation)

Thực hiện: Sử dụng thiết bị siêu âm dạng đầu dò Các điều kiện khảo sát: nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm

2.3.3.4 Trích ly có khuấy đảo

Mục đích: Tạo dòng lưu chất chuyển động liên tục để dung môi tiếp xúc được với nguyên liệu

Thực hiện: Nguyên liệu sau khi được đồng hóa với kích thước nhỏ tiếp tục được khuấy đảo với cá từ ở mức 5 trên thiết bị khuấy từ

Mục đích: Loại bỏ bã gừng là các xơ không tan

Thực hiện: Dùng giấy lọc Whatman cho vào thiết bị lọc chân không, tiến hành lọc lấy dịch trích và bỏ bã Dịch trích sau đó được đưa đi làm lạnh để hạ nhiệt độ xuống 4℃

Mục đích: Tách một phần tinh bột và bã không tan còn sót lại của quá trình lọc thô

Thực hiện: Dịch trích sau khi được làm lạnh ở 4℃ sẽ được cho vào ống ly tâm (50ml) quay ly tâm 5000 vòng trong 30 phút

Mục đích: Bước đầu thu nhận và tinh sạch ginger rhizome proteolytic enzyme

Thực hiện: Dùng dung môi hữu cơ ethanol ở các nồng độ khác nhau cho vào dịch lỏng để dung dịch ở 0-5 o C cho quá trình kết tủa diễn ra Các điều kiện khảo sát: hàm lượng ethanol, tỉ lệ ethanol và dịch trích, thời gian kết tủa

24 Mục đích: Loại bỏ phần dịch lỏng để thu nhận phần ginger rhizome proteolytic enzyme kết tủa

Thực hiện: Cho dịch lỏng vào ống ly tâm (50ml) quay ly tâm 3600 vòng trong 30 phút

Mục đích: Tăng độ tinh sạch cho chế phẩm ginger rhizome proteolytic enzyme, loại bỏ các chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa như acid amin, chất khoáng, muối, …có trong mẫu ra ngoài

Thực hiện: Sử dụng màn thẩm tích cellophane, kích thước ∅35mm Cho mẫu vào túi cellophane và hòa loãng với đệm phosphat (pH 7,0), đặt túi vào trong cốc nước cất và đặt lên thiết bị khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ ≈ 3 -5 ℃

2.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly enzyme trước khi có sự hỗ trợ của siêu âm

 Thí nghiệm 1 : Khảo sát tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến hiệu suất trích ly

Các yếu tố cố định:

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 1 phút 30 giây

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: 30 phút

- Nhiệt độ khuấy đảo: nhiệt độ phòng (~30℃)

- Thời gian ly tâm: 20 phút

Các yếu tố thay đổi:

- Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

 Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khuấy đảo đến hiệu suất trích ly

- Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo kết quả thí nghiệm 1

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ (phút): 0; 10; 20; 30; 40

 Thí nghiệm 3 : Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy đảo đến hiệu suất trích ly

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 30 phút

- Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo thí nghiệm 1

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: theo thí ngiệm 2

2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly enzyme khi có sự hỗ trợ của siêu âm

 Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hiệu suất quá trình trích ly

- Thời gian siêu âm (phút): 5

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: theo thí nghiệm 2

- Nhiệt độ khuấy đảo: theo thí nghiệm 3

26 Các yếu tố thay đổi:

 Thí nghiệm 5 : Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hiệu suất quá trình trích ly

- Nhiệt độ siêu âm: theo thí nghiệm 4

 Thí nghiệm 6 : Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất quá trình trích ly

- Công suất siêu âm: theo thí nghiệm 5

- Thời gian siêu âm (phút): 0; 5; 10; 15; 20

2.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình kết tủa protein

 Thí nghiệm 7 : Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến hiệu suất quá trình kết tủa protein

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 1 phút 30 giây, nghỉ 30 giây giữa mỗi 30 giây đồng hóa

- Thời gian siêu âm: theo thí nghiệm 6

- Tỉ lệ dịch trích: cồn: 1:1

- Thời gian kết tủa: 10 phút

 Thí nghiệm 8 : Khảo sát ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu suất quá trình kết tủa

- Thời gian siêu âm: theo thí nghiệm 6

- Nồng độ cồn: theo thí nghiệm 7

- Tỉ lệ dịch trích: cồn: theo thí nghiệm 8

- Thời gian kết tủa (phút): 10; 20; 30; 40; 50; 60; 1h10; 1h20; 1h30

2.3.4.4 Xác định hoạt độ enzyme

Hoạt tính enzyme Ginger proteolytic được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Ginger proteolytic có trong dịch nghiên cứu, sau đó vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic (TCA) Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên

Một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,5 o C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước súng 660nm tương ứng với 1àM Tyrosin trong đường chuẩn

𝑡∗𝑚∗𝑣 (𝑈𝐼/𝑔) V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g)

29 L: độ pha loãng enzym àM Tyrosin: lượng àM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

2.3.4.4 Khảo sát phạm vi hoạt động của enzyme Ginger proteolytic

 Xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme

Cho 0,1mL dịch trích vào 0,6mL đệm phosphate (pH 7,0) 100mM và 1,0mL dung dịch casein 1%, sau đó ủ hỗn hợp trên lần lượt ở 4, 7, 10, 30, 40, 50, 60, 70 và 80 o C trong

20 phút trong bể nước và đo hoạt tính bằng phương pháp Anson cải tiến

 Xác định pH hoạt động tối ưu của enzyme Để xác hiệu chỉnh pH khảo sát về mức mong muốn cần dùng một số đệm sau: đệm citrate 100mM để chỉnh pH dung dịch về 5,5; đệm potassium phosphate 100mM để chỉnh dung dịch về pH 6,0; 6,5; 7,0 và tris-HCl 100mM để đưa pH về 7,5 và 8,0 Cho vào mỗi thí nghiệm dung dịch casein 1% ủ ở 60 o C trong 20 phút và đo hoạt tính bằng phương pháp anson cải tiến

2.3.4.5 Định tính và định lượng enzyme proteolytic bằng phương pháp điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE)

SDS-PAGE là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrymide với SDS là tác nhân làm biến tính và tích điện âm các phân tử, phương pháp này xác định trọng lượng phân tử protein, thành phần và độ sạch chế phẩm protein trong quá trình tinh chế [30]

Trong kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfit là mercaptoethanol hoặc DDT làm cấu trúc bậc 2,3,4 của protein bị biến đổi thành bậc 1 và tích điện âm Do đó khi điện di, các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước khi di chuyển trong gel: những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ [30]

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần đảm bảo độ tin cậy cho kết quả Phân tích phương sai (ANOVA) với mức ý nghĩa 5% được thực hiện bằng phần mềm Minitab Statistical để xác định sự khác biệt giữa các biến số.

2.5 Các phương pháp phân tích

- Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford

- Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp của Anson cải tiến

- Xác định hàm lượng nitơ tổng (AOAC 2000)

- Xác định hàm lượng béo bằng phương pháp Soxhlet (AOAC 2000)

- Xác định ẩm, hàm lượng tro (AOAC 2000).

Các phương pháp phân tích

- Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford

- Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp của Anson cải tiến

- Xác định hàm lượng nitơ tổng (AOAC 2000)

- Xác định hàm lượng béo bằng phương pháp Soxhlet (AOAC 2000)

- Xác định ẩm, hàm lượng tro (AOAC 2000)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thành phần cơ bản của củ gừng

Củ gừng sau khi rửa sạch, để ráo rồi đem phân tích về thành phần hóa học cơ bản:

Bảng 3 1 Thành phần hóa học trong củ gừng tươi

Tên chỉ tiêu Hàm lượng (%) Ẩm 85,85

Kết quả của bảng 3.1 cho thấy nguyên liệu nghiên cứu có hàm ẩm chiến 85,85% và hàm lượng chất khô chiếm 14,15% gồm 1,09% protein; 0,35% lipid; 0,71% tro; 12,0% carbohydrate Qua đó ta có hàm lượng protein tính theo chất khô trong nguyên liệu chiếm khoảng 7,7%

Kết quả này cho thấy điểm tương đồng với kết quả phân tích của Srinivasan và cộng sự (2017) với 60-70% carbohydrates; 3-8% xơ thô; 9% protein; 8% tro; 3-6% lipid

Sự khác biệt về các hợp chất trong củ gừng có thể là do có sự khác biệt về giống gùng, thổ nhưỡng, thời gian thu hoạch, thời tiết, khí hậu và một số yếu tố khách quan khác

Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly enzyme protease trước khi có sự hỗ trợ của siêu âm

sự hỗ trợ của siêu âm

3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu Điều kiện cố định:

Hình 3 1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu

Lưu ý: Giá trị thể hiện là trung bình lặp lại 3 lần lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Các giá trị nghiệm thức có các ký tự giống nhau không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p< 0,05 Căn cứ đánh giá sự khác biệt được dựa vào bảng phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.1.

Nồng độ protein tổng (mg/g)

Tỉ lệ nguyên liệu: đệm

Từ kết quả đồ thị 3.1 cho ta thấy rằng tỉ lệ nguyên liệu và đệm có ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ protein (mg/g chất khô của nguyên liệu) và hoạt độ (UI/g chất khô của nguyên liệu) Khi tỉ lệ nguyên liệu và đệm là 1/5 thì nồng độ protein tổng đạt giá trị cao nhất là 24,76± 0,06 mg/g chất khô của nguyên liệu và hoạt độ đạt 127,47±1,48 UI/g chất khô của nguyên liệu Tuy nhiên khi tiếp tục tăng tỷ lệ nguyên liệu: đệm lên 1/8 thì nồng độ protein và hoạt độ cũng có giá trị thấp hơn so với tỉ lệ 1/6 và 1/7, giá trị lần lượt là 24,21±0.13 mg/g chất khô của nguyên liệu và 24,08±0.13UI/g chất khô của nguyên liệu; 22,16±0.27 mg/g chất khô của nguyên liệu và 126,82±0.97 UI/g chất khô của nguyên liệu; 118,75±2,24 mg/g chất khô của nguyên liệu và 73,90±0.56 UI/g chất khô của nguyên liệu

Về nguyên tắc, với cùng một khối lượng nguyên liệu, khi tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly tăng do tăng sự chênh lệch gradient nồng độ của cấu tử cần trích ly giữa nguyên liệu và dung môi Tuy nhiên, nếu sử dụng lượng dung môi quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích, đồng thời cũng không gia tăng đáng kể Theo kết quả ở bảng 1.1, hiệu suất trích ly protein và hoạt độ protein thu được cao nhất ở tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:5

Thí nghiệm đã xác định được tỉ lệ thích hợp giữa dung dịch đệm và nguyên liệu để quá trình đồng hóa diễn ra hiệu quả nhất là 1:5 trong thời gian 1phút 30 giây, do đó chúng tôi quyết định chọn giá trị này để tiếp tục qui trình

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian khuấy đảo Điều kiện cố định:

- Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: 1/5

Hình 3 2 Ảnh hưởng của thời gian khuấy đảo

Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình lặp lại 3 lần lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Những giá trị nghiệm thức có các ký tự giống nhau không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p< 0,05 Cở sở đánh giá sự khác biệt được dựa vào bản phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.1

Từ kết quả đồ thị 3.2 cho ta thấy khi không khuấy đảo, hàm lượng protein và hoạt độ đạt giá trị thấp nhất là 21,65±0.10 mg/g chất khô của nguyên liệu và 66,15±1,48 UI/g chất khô của nguyên liệu, tuy nhiên khi có sử dụng máy khuấy từ để khuấy đảo dung dịch thì hai giá trị này tăng lên đáng kể và đạt giá trị cao nhất là 27,25±0.06 mg/g chất khô của nguyên liệu và 194,59±0.97 UI/g chất khô của nguyên liệu với thời gian khuấy đảo là 30 phút nếu tiếp tục khuấy đảo hỗn hợp này thêm 10 phút thì hai giá trị này sau đó giảm nhẹ xuống còn 25,99±0.04 mg/g chất khô của nguyên liệu và 149,73±2,44 UI/g chất khô của nguyên liệu

0 phút 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút

35 Khuấy đảo giúp các cấu tử trong hỗn hợp chất lỏng chuyển động hỗn loạn, tăng khả năng tiếp xúc giữa các cấu tử cần trích ly và dung môi làm tăng hiệu suất trích ly Tuy nhiên nếu khuấy đảo trong một thời gian dài cũng sẽ làm tăng sự tiếp xúc giữa không khí và các gốc kim loại sẵn cótừ nguyên liệu làm xảy ra các phản ứng không mong muốn do phân tử protein và pectin có thể liên kết nhau tạo thành khối lớn bị cặn lại ở trên giấy lọc

Thử nghiệm đã chỉ ra rằng thời gian khuấy tối ưu để quá trình chiết xuất diễn ra hiệu quả là trong vòng 30 phút Do đó, chúng tôi quyết định sử dụng thời gian khuấy là 30 phút cho những thí nghiệm tiếp theo.

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy đảo Điều kiện cố định:

Hình 3 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy đảo

Từ kết quả đồ thị 3.3 cho ta thấy khi nhiệt độ tăng làm tăng hiệu quả trích ly cụ thể qua giá trị nồng độ protein tổng và hoạt độ protein, khi tăng nhiệt độ từ 30 lên 40, hàm lượng protein tổng tăng 2,11 mg/g chất khô của nguyên liệu đồng thời hoạt độ enzyme cũng tăng 0,09 UI/g chất khô của nguyên liệu đạt mức giá trị là 30,40±0.18 mg/g chất khô của nguyên liệu và 268,16±1,68 UI/g chất khô của nguyên liệu Tuy nhiên, khi tăng dần nhiệt độ từ 40 lên 50, 60, và 70℃, nồng độ protein và hoạt độ có xu hướng giảm và đạt giá trị thấp nhất khi nâng mức nhiệt quá trình khuấy đảo lên 70℃ trong vòng 30 phút với các giá trị lần lượt là 27,80±0.04 mg/g chất khô của nguyên liệu và 218,79±0.97 UI/g chất khô của nguyên liệu

30 độ 40 độ 50 độ 60 độ 70 độ

Khi tăng nhiệt độ dung dịch lên cao thì độ nhớt sẽ giảm, đồng thời các cấu tử cần trích ly sẽ chuyển động hỗn loạn hỗ trợ cho quá trình trích ly Tuy nhiên nếu tăng nhiệt độ lên quá cao thì protein bị thoái hóa, hoạt độ enzym từ đó cũng giảm Theo kết quả ở bảng 1.3, hiệu suất trích ly protein và hoạt độ protein thu được cao nhất khi nhiệt độ khuấy đảo trong quá trình trích ly đạt 40℃

Từ kết quả thể hiện thông qua đồ thị 3.3, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ thích hợp để quá trình trích ly diễn ra tối ưu nhất mà không làm ảnh hưởng đến nồng độ cũng như hoạt độ enzyme là 40℃.

Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protease khi có sự hỗ trợ của siêu âm

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm Điều kiện cố định:

Hình 3 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm

Từ kết quả đồ thị 3.4 cho thấy khi tăng nhiệt độ siêu âm từ 20℃ lên 40℃ thì nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme đạt giá trị cao nhất lần lượt là 31,95±0.29 mg/g chất khô của nguyên liệu và 282,72±3,66 UI/g chất khô của nguyên liệu nhưng khi nhiệt độ tiếp tục tăng lên đến 60℃ thì 2 giá trị này lần lượt giảm một khoảng là 0,45 mg/g chất khô của nguyên liệu và 30,334 UI/g chất khô của nguyên liệu

Nhiệt độ ảnh hưởng đến hiện tượng xâm thực khí vào bên trong nội bào, nhiệt độ trong nội bào tăng cao nhanh hơn gây nên sự lỏng lẻo của các liên kết xenlullose Sự gia tăng nhiệt độ làm giảm độ nhớt của hệ, gia tăng số lượng bong bóng khí tạo thành, giúp

20 ºC 30 ºC 40 ºC 50 ºC 60 ºC

39 hiện tượng xâm thực khí diễn ra nhanh hơn Tuy nhiên, nếu càng tăng nhiệt độ, áp suất xâm thực của bong bóng khí càng cao, khó làm vỡ cấu trúc bong bóng, thậm chí gây thoái hóa protein do đứt gãy các liên kết và làm cấu trúc protein bị chuyển sang bậc 1, bậc 2

Nhiệt độ siêu âm tối ưu cho hoạt động trích ly protein là 40°C, thể hiện ở hàm lượng protein và hoạt tính cao nhất Mặc dù nhiệt độ 50°C cũng ghi nhận sự gia tăng đáng kể các thông số này, tuy nhiên sự gia tăng này không có ý nghĩa thống kê Do đó, nhiệt độ siêu âm 40°C được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.2 Ảnh hưởng của công suất siêu âm Điều kiện cố định:

- Thời gian siêu âm (phút): 5 phút

Hình 3 5 Ảnh hưởng của công suất siêu âm

Giá trị biểu diễn được tính từ 3 lần lặp lại của phép đo, lấy đến 2 chữ số thập phân cùng độ lệch chuẩn Các giá trị khác biệt có ký tự giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt này được đánh giá dựa trên phân tích ANOVA và LSD theo phụ lục C.

Từ đồ thị 3.6 cho thấy khi siêu âm ở công suất siêu âm là 25W/g thì hàm lượng protein và hoạt độ enzyme đạt giá trị cao nhất là 35,70±0.27 mg/g chất khô của nguyên liệu đồng thời hoạt độ enzyme đạt giá trị cao nhất là 441,78±5,9 UI/g chất khô của nguyên

Nguyên nhân có thể do sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây nên sự kích thích mãnh liệt, gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy Siêu âm làm giảm ranh giới giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuyếch tán ở một vài trường hợp mà khuấy trộn thông thường không đạt

41 được [29] Dưới tác dụng của sóng siêu âm càng tăng, các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí bị vỡ, làm tăng sự thoát ra của các nội bào trong dung dịch

Công suất siêu âm càng lớn thì hiện tượng xâm thực khí càng mạnh, do đó cấu trúc thành tế bào bị phá vỡ nhiều hơn và hiệu quả trích ly chất chiết tăng lên Nhưng protein là chất không bền nhiệt nên nếu công suất siêu âm quá cao tức nhiệt độ tâm nguyên liệu cũng tăng sẽ gây biến tính protein do đó làm giảm hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch

Chúng tôi quyết định chọn công suất siêu âm ở mức 25W để thực hiện những thí nghiệm tiếp theo

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm Điều kiện cố định:

Hình 3 6 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm

Từ đồ thị hình 3.6 cho thấy khi tăng thời gian siêu âm lên 10 phút thì nồng độ protein tổng và hoạt tính enzyme ( tính theo chất khô nguy6enliệu) tăng lên 1,1 lần và đạt giá trị cao nhất lần lượt là 38,93±0.06 mg/g và 494.05±1,48 UI/g nhưng khi thời gian siêu âm tăng lên 20 phút thì nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme lại giảm xuống 1,2 lần so với giá trị ở 10 phút và đạt giá trị thấp nhất lần lượt là 31,82±0.07 mg/g và 381,432±2,56 UI/g

Trong quá trình chiết xuất hỗ trợ siêu âm, chất hòa tan tiếp xúc với dung môi Thời gian tương tác giữa hai pha là yếu tố quan trọng quyết định hiệu suất chiết xuất.

43 (Ni và các cộng sự, 2002) Thời gian siêu âm càng dài, các biến đổi của nguyên liệu do sóng siêu âm gây ra càng sâu sắc Nhưng khi đã đạt ngưỡng tới hạn thì thời gian dài quá mức sẽ làm phân hủy các phân tử protein và càng trích ly ra các hợp chất không mong muốn khác như pectin, hydratcarbon có thể liên kết với protein tạo thành khối lơn không thể qua màng lọc dẫn đến hàm lượng protein giảm dần

Khi tăng thời gian xử lí siêu âm, mức độ phá vỡ cấu trúc nguyên liệu càng tăng, đồng thời dung môi khuếch tán vào bên trong nguyên liệu càng nhiều, hiệu suất trích ly protein càng tăng Tuy nhiên, thời gian siêu âm lâu làm cắt mạch protein, không thể kết tủa trong ethanol, càng không thu được gây thất thoát

Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình kết tủa protein

3.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol (%(v/v)) Điều kiện cố định:

- Thời gian siêu âm: 10 phút

- Thời gian kết tủa: 10 phút

Hình 3 7 Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol (% (v/v))

Theo kết quả thu được từ đồ thị hình 3.8 cho thấy nồng độ protein tổng và hàm lượng protein tăng khi tăng nồng độ cồn cụ thể là khi tăng nồng độ cồn từ 50 (% (v/v)) lên

80 (% (v/v)) thì hai giá trị này tăng lần lượt là 1 và 1,5 lần, đạt giá trị cao nhất là 138,80±0,32 mg/g chất khô của nguyên liệu và 1110,09±7,39 UI/g chất khô của nguyên liệu Nhưng khi tăng nồng độ cồn lên đến 90 (% (v/v)) thì nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

45 Khi hàm lượng ethanol tăng thì hoạt tính enzyme sau tủa cũng tăng, nhưng khi hàm lượng ethanol vượt quá cao thì hoạt tính lại giảm

Khi hàm lượng ethanol quá cao thì lực tương tác tĩnh điện tăng lên, kết quả làm cho các phân tử enzyme bị biến tính không thuận nghịch và không thể hòa tan trở lại trong nước hay dung dịch đệm sau khi kết tủa

Chúng tôi chọn hàm lượng ethanol (% (v/v)) là 80 (%(v/v)) để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa Điều kiện cố định:

- Thời gian siêu âm: 10 phút

- Hàm lượng cồn dùng để kết tủa: 80 %(v/v)

Hình 3 8 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa

Từ đồ thị hình 3.9 cho thấy khi thời gian kết tủa tăng từ 10 phút lên 60 phút thì nồng độ protein cũng tăng 1,6 lần và hoạt độ enzyme tăng 5,4 lần và đạt giá trị cao nhất lần lượt là 174,54±0.32 mg/g chất khô của nguyên liệu và 2007,20±5,59 UI/g chất khô của nguyên liệu, nhưng khi kéo dài thời gian kết tủa thì mức độ tăng của hai giá trị này không có ý nghĩa về mặt thống kê

Khi tăng thời gian kết tủa, lượng enzyme thu nhận được càng nhiều, tuy nhiên khi thời gian kết tủa kéo dài lại làm tăng khả năng mất lớp nước liên kết với protein, gây biến tính của protein bởi dung môi nên hiệu quả tinh sạch giảm (Polaina and MacCabe, 2007)

Chúng tôi nhận thấy, 60 phút là thời gian phù hợp để quá trình kết tủa diễn ra hoàn toàn, khi so sánh với thời gian kết tủa dài hơn, chúng tôi không nhận thấy sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê p

Tiêu đề	Nghiên cứu trích ly enzyme từ dịch trích gừng
Tác giả	Lê Huỳnh Anh Thư
Người hướng dẫn	GS.TS. Đống Thị Anh Đào
Trường học	Đại học Quốc gia Tp. HCM
Chuyên ngành	Công nghệ Thực phẩm
Thể loại	Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2022
Thành phố	Tp. HCM

Định dạng
Số trang	95
Dung lượng	1,51 MB