Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu trích ly enzyme từ dịch trích gừng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

LÊ HUỲNH ANH THƯ

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY ENZYME TỪ DỊCH TRÍCH GỪNG

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2022

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Đống Thị Anh Đào Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Lệ Hà

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Trần Thị Thu Trà

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM Ngày 12 tháng 07 năm 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1 CT: PGS.TS Mai Huỳnh Cang

2 PB1: TS Nguyễn Lệ Hà

3 PB2: PGS.TS Trần Thị Thu Trà 4 UV: GS.TS Đống Thị Anh Đào 5 UVTK: TS Nguyễn Quốc Cường

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: LÊ HUỲNH ANH THƯ MSHV: 1970573 Ngày, tháng, năm sinh: 18/05/1997 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 8540101

I TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY ENZYME TỪ DỊCH TRÍCH GỪNG

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tổng quan tài liệu về nguyên liệu gừng trâu Việt nam

- Thiết lập quy trình công nghệ thu nhận enzyme từ gừng bằng phương pháp siêu âm kết hợp kết tủa bằng dung môi hữu cơ và tinh sạch bằng màng cellophane

- Khảo sát các yếu tố của các quá trình ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi enzyme

Zingibain từ củ gừng trâu gồm: quá trình nghiền nguyên liệu với dung môi, quá trình siêu âm, quá trình kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ

- Định lượng khối lượng phân tử của enzyme bằng phương pháp lọc màng cellophane - Phân tích lượng protein tổng (mg/g chất khô nguyên liệu) và hoạt độ tổng (UI/g chất

khô nguyên liệu) của chế phẩm enzyme

- Khảo sát các điều kiện hoạt động của chế phẩm enzyme

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/09/2021

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/06/2022 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS.TS Đống Thị Anh Đào

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành đến tất cả quý thầy cô trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, đặc biệt các thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ trong suốt quá trình em học tại trường cũng như luôn tạo mọi điều kiện tốt để em có thể hoàn thành luận văn đúng tiến độ

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Nguyên – quản lý phòng thí nghiệm B10 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất trong suốt thời gian làm đề tài nghiên cứu

Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô GS TS Đống Thị Anh Đào đã tận tình hướng dẫn và có những định hướng thiết thực giúp em giải quyết các vấn đề nghiên cứu một cách hiệu quả và khoa học nhất

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và các bạn bè đã đồng hành, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em tham gia học tập và hoàn thành tốt công trình nghiên cứu này

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến gia đình, thầy cô và bạn bè Trân trọng cảm ơn!

TP HCM, tháng 07 năm 2022 Học viên thực hiện

Lê Huỳnh Anh Thư

TÓM TẮT

Protease được chiết xuất từ củ gừng chứa chủ yếu là enzyme protease hay còn gọi là enzyme zingibain Trong công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá tính tinh chế và thu nhận dịch enzyme zingibain từ dịch trích củ gừng cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme Zingibain nhắm nâng cao giá trị sử dụng của củ gừng được trồng tại các tỉnh vùng Tây Nguyên để từ đó nghiên cứu bước đầu về khả năng làm mềm thịt và đông tụ sữa của chế phẩm enzyme Zingibain

Để tách chế phẩm enzyme có kết quả tốt cần tiến hành thí nghiệm để lựa chọn các thông số kỹ thuật thích hợp Kết quả cho thấy, thí nghiệm đã xác định được tỉ lệ thích hợp giữa dung dịch đệm và nguyên liệu để quá trình đồng hóa diễn ra hiệu quả nhất là 1:5 trong thời gian 1phút 30 giây và khuấy đảo trên thiết bị khuấy từ trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 40℃

Đối với thí nghiệm sử dụng siêu âm ở 40℃ cho hàm lượng protein và hoạt độ cao nhất với công suất siêu âm ở mức 25W/g trong 10 phút là vừa đủ để quá trình trích ly được diễn ra tối ưu mà không làm thất thoát hay biến tính protein và enzyme

Quá trình kết tủa protein trong thời gian 60 phút với tỉ lệ cồn là 80 (%(v/v)) và tỉ lệ dịch trích với cồn là 1:5, chúng tôi nhận thấy giá trị pro tổng và hoạt tính enzyme là cao nhất Đồng thời, qua nghiên cứu này, chúng tôi cũng xác định được nhiệt độ và pH để enzyme hoạt động tối ưu là 47,5℃ và pH 7,0

ABSTRACT

Protease extracted from ginger root contains mainly protease enzyme or zingibain enzyme In this work, we have studied the factors affecting the purification and obtained zingibain enzyme solution from ginger root extract as well as investigated some specific properties of Zingibain enzyme preparation to improve the price of zingibain Use value of ginger root grown in the Central Highlands provinces from which to initially study the ability to tenderize meat and coagulate milk of Zingibain enzyme preparations

To isolate enzyme products with good results, it is necessary to conduct experiments to select appropriate technical parameters The results show that, the experiment has determined the appropriate ratio between the buffer solution and the raw materials for the most effective homogenization process, which is 1:5 in 1 minute 30 seconds and stirred on the magnetic stirrer within 30 minutes at 40℃

For the experiment, using ultrasound at 40℃ for the highest protein content and activity with the ultrasonic power at 25W/g for 10 minutes is just enough for the extraction process to take place optimally without loss or denature proteins and enzymes

Protein precipitation in 60 minutes with alcohol ratio of 80 (%(v/v)), we found the total pro value and enzyme activity to be high At the same time, through this study, we also determined the optimal temperature and pH for the enzyme to work at 47.5℃ and pH 7.0

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Đống Thị Anh Đào Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn hoàn toàn trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Học viên

Lê Huỳnh Anh Thư

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về enzyme proteolytic 1

1.1.1 Sơ lược về enzyme 1

1.1.2 Sơ lược về enzyme proteolytic 1

1.1.3 Tổng quan về một số loại enzyme proteolytic thu nhận từ thực vật có sẵn trên thị trường 5

1.2 Tổng quan về gừng 6

1.3 Tổng quan về Ginger rhizome proteolytic enzyme trích ly từ củ gừng 8

1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước 8

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước 9

1.4 Tổng quan về phương pháp thu nhận Ginger rhizome proteolytic enzyme 9

1.4.1 Sự ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly Ginger rhizome proteolytic enzyme 9

1.4.2 Tác động của sóng siêu âm đến quá trình thu nhận Ginger rhizome proteolytic enzyme 10

1.5 Tổng quan về phương pháp tinh sạch Ginger rhizome proteolytic enzyme 13

1.5.1 Phương pháp kết tủa 13

1.5.2 Phương pháp thẩm tích qua màng cellophane 14

1.6 Tổng quan về phương pháp điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE) 15

1.6.1 Nguyên tắc 15

1.6.2 Sắc ký điện di 15

1.6.3 Xác định trọng lượng phân tử của protein 16

1.7 Phân tích tính chất của chế phẩm enzyme 16

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 18

2.3.4.4 Khảo sát phạm vi hoạt động của enzyme Ginger proteolytic 29

2.3.4.5 Định tính và định lượng enzyme proteolytic bằng phương pháp điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE) 29

3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu 32

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian khuấy đảo 33

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy đảo 35

3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protease khi có sự hỗ trợ của siêu âm 37

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm 37

3.3.2 Ảnh hưởng của công suất siêu âm 39

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm 41

3.4 Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình kết tủa protein 43

3.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol (%(v/v)) 43

3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa 45

3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến phạm vi hoạt động của enzyme Ginger proteolytic 47

3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 47

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 3 1 Thành phần hóa học trong củ gừng tươi 31

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1 1 Công thức cấu tạo protease 2

Hình 1 2 Phân loại một số loại enzyme thực vật 6

Hình 1 3 Các khoản tần số âm thanh 10

Hình 1 4 Nguyên lý hình thành và vỡ bọt khí 11

Hình 3 1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu 32

Hình 3 2 Ảnh hưởng của thời gian khuấy đảo 34

Hình 3 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy đảo 36

Hình 3 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm 38

Hình 3 5 Ảnh hưởng của công suất siêu âm 40

Hình 3 6 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm 42

Hình 3 7 Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol (% (v/v)) 44

Hình 3 9 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa 46

Hình 3 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ 47

Hình 3 11 Ảnh hưởng của pH 49

Hình 3 12 Khối lượng phân tử của enzyme proteolytic bằng phương pháp điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE) 50

Nhiều enzyme chứa trong mô và cơ quan động, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật đều có thể tách ra khỏi tế bào hoặc tự chúng chuyển từ tế bào ra môi trường bên ngoài; các enzyme vẫn tồn tại tính chất và khả năng xúc tác của mình khi tách chiết ra ở dạng chế phẩm khô Có ba nguồn nguyên liệu enzyme cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật [1]

1.1.2 Sơ lược về enzyme proteolytic 1.1.2.1 Định nghĩa enyme proteolytic

Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L-acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton Và chúng thường tác động lên các liên kết ester đơn giản

Hình 1 1 Công thức cấu tạo protease

1.1.2.2 Phân loại enzyme proteolytic

 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm: - Protease nội bào

- Protease ngoại bào

 Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất:

- Endopeptidase: enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch

- Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch  Dựa vào pH hoạt động:

- Protease acid tính - Protease kiềm tính - Protease trung tính

 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme: - Protease động vật

- Protease thực vật - Protease vi sinh vật

 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

- Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombin…

- Thiol protease (SH): papain, bromeline… - Aspartic protease (COOH): pepsin, renin…

- Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là Zn2+ hoặc Mg2+)

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu protease trong nước

Ở nước ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm, dược phẩm

Trần Thanh Trúc và cộng sự (2014), Nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon) Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông của thịt đầu tôm sú đến quá trình trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon) và các điều kiện tối ưu trích ly enzyme protease Kết quả khảo sát cho thấy, việc trữ đông nguyên liệu đến 8 tuần vẫn giúp duy trì ổn định hoạt tính enzyme protease có trong thịt đầu tôm Dịch chiết protease kiềm thu được từ thịt đầu tôm sú có tổng hoạt tính cao nhất là 13,48 U/g chất khô nguyên liệu với tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 4 (w/v); pH 9,0; nhiệt độ 50°C; thời gian trích ly 40 phút

Hà Thị Thụy Vy và các cộng sự (2016) Ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hiệu quả tinh sạch enzyme protease trong dịch trích ly từ 2 loại thịt đầu tôm (sú và thẻ chân trắng) Tỷ lệ giữa dịch trích protease thô và dung môi (ethanol, acetone, iso-propanol) được thay đổi từ 1: 1 đến 1: 6 (v/v), tương tựnồng độ ammonium sulfate trong dịch trích cũng dao động từ 35% đến 85% Xác định thời gian kết tủa thích hợp từ tác nhân được lựa chọn cũng được khảo sát Kết quả cho thấy, ethanol đạt hiệu quả kết tủa protease cao cho cả hai dịch trích Đối với dịch trích tôm sú, tỷ lệ mẫu: ethanol là 1: 4 (v/v) và thời gian kết tủa là 45 phút cho hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch đạt tương ứng 3,49 U/mg protein, 87,46% và 3,78 lần Đối với tôm thẻ, tỷ lệ mẫu với ethanol là 1: 3 (v/v), thời gian kết tủa 30 phút cho giá trị lần lượt là 2,04 U/mg protein, 85,66% và 3,23 lần Cả hai loại protease được xác định bằng điện di SDS-PAGE có trọng lượng phân tử là 35,8 ÷ 40,5 kDa

Võ Văn Quốc Bảo và các cộng sự (2018), thu nhận và khảo sát một số tính chất của chế phẩm Ficin từ nhựa quả vả (Ficus auriculata L.) nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa quả vả cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme này nhằm nâng cao giá trị sử dụng của quả vả tại Thừa Thiên Huế Quả vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm lượng protein và hoạt độ protease cao nhất, tương ứng là 2,212 mg/g chất khô của nguyên liệu và 1,077 Hp/ml khi tỷ lệ giữa dịch nhựa quả vả/ethanol 96 % là 1/4 và nhiệt độ chiết là 3°C Thời gian thu nhận enzyme này thích hợp nhất là 60 phút Chế phẩm protease hoạt động thích hợp ở 45 °C, pH = 6, bền nhiệt từ 35°C đến 50°C trong 1 giờ

1.1.2.4 Tình hình nghiên cứu protease ngoài nước

Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinh sạch

Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách được Chymosin Wurtz (1879) chiết tách được papain, Crassman và Ambros (1926) chiết tách được bromelain…

Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark) Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%

Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên

Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác

Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao

1.1.2 Tổng quan về một số loại enzyme proteolytic thu nhận từ thực vật có sẵn trên thị trường

Các enzym phân giải protein đã được tìm thấy ở cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm Đại diện của các loài cây hai lá mầm là sung, đu đủ, bông sữa, euphorbia; cây một lá mầm là dứa và ngũ cốc [2]

Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách khuấy nhựa đu đủ một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đen sấy khô nghiền nhỏ Bromelin thu từ thân dứa, sau khi hái quả, người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzyme trong dịch ép Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus Một số thực vật như malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác cũng là nguồn enzyme có truyền thống được dùng trong công nghiệp rượu, bia, bánh kẹo Malt chủ yếu có chứa amilaza hoạt động, còn các enzyme thủy phân khác hoạt động tương đối yếu [1]

Những loại enzyme trích ly từ những loại thực vật trên thuộc nhóm protease vì trung tâm hoạt động của nó có chứa nhóm Sulfhydryl (-SH) của Cystein, nhóm này nằm gần vòng imidazol của Histidine và nhóm -COOH của axit Aspactic Sự tổ hợp của các nhóm chức này có mặt trong trung tâm hoạt động tạo điều kiện cho hoạt động xúc tác của phân tử enzyme và có pH tối ưu vào khoảng 7 để phân giải một số loại protein như hemoglobin, casein, albumin trứng, v.v., và có khả năng làm đông tụ sữa; còn nhóm enzyme protease không chứa gốc Sulfhydryl (-SH) có pH tối ưu kiềm hơn và khả năng đông tụ sữa kém hơn Cả hai nhóm proteinase thực vật đều có khả năng chịu nhiệt, thường duy trì hoạt động ở nhiệt độ từ 60℃ đến 70℃ [2]

Cystein-Một số proteinase thực vật có một số ứng dụng công nghệ và y tế, quan trọng nhất về mặt thương mại là làm mềm thịt điển hình là papain và bromelin Các ứng dụng công nghệ khác trong nền công nghiệp thuộc da, da giày và trong công nghiệp sản xuất bia Trong y tế, chúng được sử dụng để điều trị rối loạn tiêu hóa liên quan đến protein và điều trị vết thương bong tróc Hầu hết các protease thực vật có thể tiêu hóa các loài giun sống ký sinh, chẳng hạn như giun đũa

1.2 Tổng quan về gừng

Từ thế kỷ thứ 4 trước Công nguyên, gừng đã trở thành một phần của y học cổ truyền Trung Quốc [3] Người Hy Lạp và La Mã cổ đại sử dụng gừng như một loại gia vị cũng như thuốc dùng để điều trị táo bón, cảm lạnh, viêm phế quản, đục thủy tinh thể, và trung hòa axit dạ dày

Gừng có tên thường gọi ở một số quốc gia là: Ginger [tiếng anh], Jiang [tiếng Trung], Gingembre [tiếng Pháp], Ingwer [tiếng Đức], Zenzero [tiếng Ý], Shoga [tiếng Nhật], Gengibre [tiếng Bồ Đào Nha], Jengibre [tiếng Tây Ban Nha] [4]

Tên khoa học: Zingiber officinale Roscoe

Hình 1 2 Phân loại một số loại enzyme thực vật [32]

Giới: Thực vật

Ngành: Angiosperma Lớp: Monocotyledoneae Bộ: Scitaminaea

Họ: Zingiberaceae Chi: Zingiber

Loài: Officinale

Đặc điểm vật lý: Loại thảo mộc sống lâu năm, có hình dáng mảnh mai, thân thẳng đứng và lá màu xanh lục trung bình hẹp xếp thành hai hàng trên mỗi thân Cây gừng cao tới 1,5 m với những chiếc lá rộng khoảng 2 cm và dài 20 cm Loại cây này mọc từ một thân ngầm dày, có mùi thơm (thân rễ), có bề mặt phân nhánh, không đồng đều Hoa gừng phát triển tạo thành một cành dày đặc cao tới 8 cm trên một thân khác với các lá [5]

Phân bố và sinh thái: Gừng là loài thực vật sống được chủ yếu ở các vùng nhiệt đới ấm, ẩm, râm mát của miền nam châu Á, nhưng hiện nay loại cây này được trồng phổ biến phụ vụ cho mục đích thương mại ở Jamaica, Tây Ấn, Haiti, Trung Quốc và Nigeria Gừng thường được thu hoạch vào khoảng 5 - 6 tháng sau khi trồng từ củ gừng tươi Các nhà sản xuất gừng khô chính bao gồm Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan, Sierra Leone, Nigeria, Jamaica, Fiji và Australia [6]

Gừng là một loại gia vị, chất tạo hương và được xem như một loại thảo dược được sử dụng dưới dạng chế phẩm cả tươi và khô [7] Các bộ phận của gừng thường được tận dụng nhiều nhất là rễ và thân rễ Gừng và các chất chiết xuất từ gừng là thành phần phổ biến của thực phẩm và đồ uống bao gồm tương ớt, dưa chua, rượu và các sản phẩm bánh mì Các dạng thuốc phổ biến của gừng bao gồm củ tươi, củ khô, viên nén, viên nang (50 - 550 mg), dịch chiết, cồn và trà Tinh dầu gừng là sản phẩm chưng cất bằng hơi nước của thân rễ gừng tươi hoặc bột gừng có thành phần chủ yếu là hydrocacbon sesquiterpene (ví dụ: zingiberene) [6] Thân rễ còn là nguồn cung cấp tinh dầu tốt nhất vì có chứa một

lượng đáng kể tinh dầu trong vỏ Gừng khô toàn bộ có lớp vỏ sần sùi; Gừng gọt vỏ có đường bó sợi lộ ra ngoài bằng cách cạo bỏ lớp bần Mặc dù không có tiêu chuẩn chung, các sản phẩm gừng thường được tiêu chuẩn hóa về hàm lượng gingerol

Gừng chứa khoảng 1 - 3,5% tinh dầu sau khi chưng cất bằng hơi nước [6] Sản phẩm này chứa nồng độ tương đối cao các hydrocacbon sesquiterpene (ví dụ: zingiberene), một lượng tương đối nhỏ hydrocacbon monoterpene và các hợp chất oxy hóa so với gừng khô Có nhiều loại hợp chất (ví dụ, camphene, β - phellandrene, β - bisabolene, α - farnesene) trong tinh dầu tùy thuộc vào quy trình chiết xuất, chủng loại và nguồn gốc (khô, tươi) Các hydrocacbon sesquiterpene chính trong dầu gừng được chế biến từ thân rễ gừng tươi là α-zingiberene (27 - 30%), α-curcumene (8-9%), β-sesquiphellandrene (4,8%), và bisabolene (3,2%) [8]

1.3 Tổng quan về Ginger rhizome proteolytic enzyme trích ly từ củ gừng

Proteolytic enzyme đôi khi được sử dụng trong nấu và ninh thịt, và đã được chứng minh là làm tăng độ mềm của thịt do quá trình phân giải protein của các phần protein thịt khác nhau [9] Trong số các enzym phân giải protein có nguồn gốc thực vật, papain, ficin và bromelain đã được nghiên cứu rộng rãi nhất [10] và thường được sử dụng để làm mềm thịt Nghiên cứu này với thân rễ gừng đã góp phần tạo ra một nguồn enzyme mới có ứng dụng trong phân giải protein và có tầm quan trọng đối với các sản phẩm thực phẩm

1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Ginger rhizome là một nguồn enzyme proteolytic, thể hiện hoạt tính tối ưu ở 60℃ và nhanh chóng bị thoái hóa khi tăng nhiệt độ lên 70℃ Ginger proteolytic enzyme phân giải collagen tốt hơn là actomyosin [9] [11] Theo một số tác giả như Lee và cộng sự (1986), Kim và Lee (1995); Mendiratta và cộng sự (2000) [12] [13] đã nghiên cứu được một số tính chất kháng khuẩn cũng như chống oxy hóa và làm mềm thịt của dịch trích gừng Gừng cho thấy tác dụng làm mềm, nhưng hàm lượng gừng cao hơn dẫn đến các vấn đề về hương vị Naveena và Mendiratta (2001) đã thử nghiệm cách chiết gừng nấu với thịt

gà mái và nhận thấy rằng miếng thịt mềm hơn khi các mẫu được xử lý ở giai đoạn sau làm lạnh (ở 4℃ ± 1℃ trong 24 giờ)

Naveena và cộng sự (2004) đã tiến hành một nghiên cứu để so sánh hai enzym phân giải protein thực vật từ Cucumis trigonus Roxb (Kachri) và Zingiber officinale roscoe (Thân rễ gừng) với papain về tác dụng làm mềm và thu được kết quả tất cả các mẫu được xử lý bằng enzyme đã cải thiện hương vị, độ ngon, độ mềm và điểm chấp nhận tổng thể Tuy nhiên, các mẫu được xử lý bằng dịch trích gừng nhận được điểm số tốt hơn trong khi các mẫu được xử lý papain và cucumis nhận được điểm số gần như bằng nhau

Tsai và cộng sự (2012) chỉ ra rằng bên cạnh tác dụng chống oxy hóa, ginger proteolytic enzyme còn có tác dụng lớn đối với sự thoái hóa của một số tế bào protein myofibrillar chính (titin, mạch myosin phức tạp, troponin -T, desmin và a-actinin)

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên các loại cây họ gừng nói chung và loại gừng trâu nói riêng phát triển rất thích hợp Tuy nhiên, sản phẩm từ gừng trâu chỉ được biết đến qua các món thực phẩm được dùng hằng ngày mà chưa có nhiều nghiên cứu về enzyme protease trên loại cây này Củ gừng là nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme do chứa một lượng lớn protease gọi là zingibain Bên cạnh hai loại enzyme từ thực vật đã được nghiên cứu tương đối rõ ràng và có nhiều ứng dụng cụ thể là bromelain và papain, việc nghiên cứu khảo sát các điều kiện tách chiết protease từ củ gừng sẽ có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong tương lai

1.4 Tổng quan về phương pháp thu nhận Ginger rhizome proteolytic enzyme

1.4.1 Sự ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly Ginger rhizome proteolytic enzyme

Độ pH và sự có mặt hoặc không có các chất ổn định đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất protease từ thân rễ gừng Hoạt tính của enzyme cao hơn đáng kể (p ≤ 0,05) khi chiết xuất ở pH trung tính so với pH axit hoặc kiềm [14] Một số nghiên

cứu trước đây đã sản xuất thành công protease từ gừng bằng cách sử dụng đệm phosphat ở pH 7 [15] [5]

Ngoài ra, sự có mặt của Cysteine là một chất chống tự phân có hiệu quả để bảo vệ sự ổn định của protease trong quá trình chiết xuất [16] EDTA cải thiện tính ổn định của hoạt động protease [14] Trong dung dịch, EDTA che đi các ion kim loại có thể dẫn đến việc bất hoạt enzyme bằng cách tấn công nhóm sulfhydryl trong vị trí của cysteine protease EDTA cũng có thể bảo vệ enzyme khỏi quá trình oxy hóa xảy ra trong quá trình chiết xuất [17] Nếu không có bất kỳ chất ổn định nào, hoạt động của protease trong gừng thô sẽ giảm mạnh trong suốt quá trình chiết xuất và bảo quản

1.4.2 Tác động của sóng siêu âm đến quá trình thu nhận Ginger rhizome proteolytic enzyme

Để việc phá vỡ cấu trúc tế bào có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu hoặc đồng hóa bằng các xay cơ học Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat và chất tẩy (detergent)

Sóng siêu âm là sóng cơ học được tạo nên từ sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian và có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (20 – 20000 Hz) Do trong trường siêu âm, các phần tử dao động cùng phương với phương truyền sóng nên sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc [18]

Hình 1 3 Các khoản tần số âm thanh

Trong môi trường chất lỏng, sóng siêu âm tạo ra các chu trình kéo và nén liên tục gây ra hiện tượng xâm thực khí Đồng thời tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha lỏng/rắn có sự hỗn loạn do tạo ra các vi xoáy, tăng cường sự truyền khối đối lưu và sự khuếch tán [26]

Sóng siêu âm ứng dụng trong công nghệ thực phẩm thường sử dụng sóng có tần số thấp, năng lượng cao (20 – 100kHz) Do các mẫu thực phẩm thường có độ nhớt cao làm giảm sự lan truyền của các phần tử trong trường siêu âm, khi đó các sóng có năng lượng cao sẽ dễ đi xuyên vào thực phẩm hơn [19]

Tác động sinh học của sóng siêu âm

Sóng siêu âm sử dụng trong quá trình trích ly rắn - lỏng có 3 tác động sinh học chính lên nguyên liệu như sau:

- Chuyển động của sóng siêu âm rất nhanh, làm lỏng các liên kết trong mô - Sinh nhiệt

- Sự tạo và vỡ bọt: chuyển động của sóng siêu âm qua môi trường lỏng tạo ra một chu trình dãn nở, tạo vùng áp suất chân không trong Hiện tượng tạo và vỡ bọt xảy ra khi áp suất chân không vượt quá so với độ bền kéo của chất lỏng

Hình 1 4 Nguyên lý hình thành và vỡ bọt khí

Hình 1.4 cho thấy cơ chế sự hình thành, lớn lên và nổ vỡ các bong bóng khí trong pha lỏng: Khi sóng âm gặp chất lỏng, sẽ tạo ra những chu kì gồm 2 pha giãn và nén liên tục, làm xuất hiện bong bóng khí trong pha lỏng [20]

- Trong pha giãn: khí bên ngoài bong bóng được khuếch tán vào bên trong - Trong pha nén: bong bóng co lại và khí bị hấp thụ ngược trở lại

Mặt khác các phân tử khí lại tiếp tục bị hấp thụ vào chất lỏng nên kích thước của bong bóng lớn dần qua các chu kì giãn và nén Khi đạt kích thước tối đa, bong bóng nổ vỡ, nhiệt độ có thể đạt 5000℃ và áp suất 2000ats

Hiện tượng tạo bong bóng làm tăng quá trình truyền nhiệt và truyền khối trong pha lỏng, tăng cường sự tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, đồng thời tăng sự khuếch tán các chất hòa tan từ nguyên liệu vào dung môi, làm gia tăng hiệu quả trích ly Mặt khác ở bề mặt pha lỏng – rắn xuất hiện sủi bọt khí, tạo ra các vi tia chất lỏng; nếu các vi tia này hướng đến bề mặt nguyên liệu rắn, có thể tạo ra vết rạn nứt và vỡ nguyên liệu

Tóm lại, quá trình siêu âm gây ra hiện tượng xâm thực khí, sẽ làm cho nguyên liệu bị rạn nứt hoặc giảm kích thước, gia tăng sự tiếp xúc nguyên liệu với dung môi, tăng khuếch tán các chất hòa tan dẫn đến tăng động lực của quá trình trích ly

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành và vỡ bóng

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và hiệu quả trích ly bằng sóng siêu âm Chúng bao gồm các thông số liên quan đến:

- Âm trường: tần số sóng âm, cường độ âm, mật độ năng lượng âm, … - Nguyên liệu thô: cấu trúc, mức phá vỡ, loại và số lượng các chất trích ly

- Đặc tính vật lý dung môi cũng như điều kiện khảo sát các yếu tố: thời gian, nhiệt độ, áp suất

Ứng dụng của sóng siêu âm trong ngành công nghệ thực phẩm

Siêu âm hiện nay cũng là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong ngành công nghệ thực phẩm Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thường được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Có 2 lĩnh vực được ứng dụng chính trong công nghiệp thực phẩm:

- Tần số cao và năng lượng thấp: Siêu âm chuẩn đoán Trong khoảng tần số MHz Phần này được sử dụng như một kỹ thuật phân tích đảm bảo chất lượng, qui trình điều khiển và kiểm tra không làm phá hủy cấu trúc, điều này được ứng dụng trong xác định tính chất thực phẩm, đo tốc độ dòng chảy, bao gói thực phẩm

- Tần số thấp và siêu âm năng lượng cao: Phần này được ứng dụng rộng rãi như một quy trình hỗ trợ trong hàng loạt các lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí, trích ly, lọc, đồng hóa, làm mềm thịt, quá trình oxi hóa, quá trình tiệt trùng, …

1.5 Tổng quan về phương pháp tinh sạch Ginger rhizome proteolytic enzyme 1.5.1 Phương pháp kết tủa

Sau khi nhận được dịch chiết enzyme thô, các phương pháp khác nhau đã được sử dụng để tinh sạch enzyme Kết tủa là một kỹ thuật tinh chế phổ biến được sử dụng để cô đặc và tinh sạch protein Kết tủa protein là quá trình tách protein khỏi dung dịch và thu nhận dưới dạng chất rắn bằng cách thay đổi độ hòa tan của dung dịch Quá trình kết tủa thường không tốn kém và dễ áp dụng trên quy mô lớn Có một số phương pháp hoặc hệ thống để thực hiện quá trình kết tủa nhưng quan trọng là xác định phương pháp nào phù hợp nhất để đạt được các mục đích mong muốn sau quá quá trình

Trong nhóm các phương pháp truyền thống có phương pháp kết tủa bằng các tác nhân khác nhau như dung môi hữu cơ, muối trung tính, polymer, chất đa điện phân, kết tủa tại điểm đẳng điện, kết tủa bằng ion kim loại Nhóm phương pháp này có đặc điểm dễ thực hiện, tác nhân tủa dễ kiếm, phổ biến

Tủa bằng dung môi hữu cơ có mặt trong nhiều quy trình sản xuất Tuy nhiên, dung môi hữu cơ có khả năng làm biến tính protein ngay cả ở nhiệt độ thường Do vậy, quá trình tủa protein bằng dung môi hữu cơ phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp 0-5℃ và chọn lựa dung môi thích hợp [21]

Các dung môi tan trong nước như methanol, ethanol, n-butanol đã được nghiên cứu để kết tủa whey protein và sấy khô để thu protein concentrate Ethanol là dung môi an toàn hơn hai dung môi còn lại Methanol và n-propanol cho whey protein concentrate ít tan hơn so với protein concentrate kết tủa từ ethanol trong khi n-butanol cho whey protein concentrate chứa nhiều béo và lactose nên gần như không tan trong nước

Các yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến độ hòa tan của protein là cấu trúc, kích thước, điện tích và dung môi Sau khi protein được kết tủa, nó có thể được tách ra khỏi dung dịch bằng cách ly tâm hoặc lọc Sau đó, kết tủa có thể được hòa tan trở lại trong một thể tích nhỏ hơn để cô đặc hoặc rửa và phân giải trong một dung dịch khác để thay đổi điều kiện dung dịch

1.5.2 Phương pháp thẩm tích qua màng cellophane 1.5.2.1 Giới thiệu chung

Thẩm tích là quá trình khuếch tán của các phân tử từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp thông qua một màng bán thấm (không thấm đối với những chất keo hòa tan như protein và một số các polysaccharide nhưng thấm đối với các dạng dung dịch của các tinh thể) [22]

Khi đạt trạng thái cân bằng, các phân tử di chuyển ra và vào lỗ màng đạt cùng tốc độ Ngược lại, các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ màng sẽ không thể đi qua màng bán thấm và được giữ lại tại một phía, nồng độ của các phân tử này không có sự thay đổi giữa hai bên màng Khi thay dung dịch thẩm tích bên ngoài màng bán thấm sẽ tạo ra một gradient nồng độ mới [23]

Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại bỏ muối ra khỏi dung dịch protein, thường cho dung dịch protein vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm (thường dùng là màng cellophane) Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy khuấy cơ học hay máy khuấy từ hoặc là quay chậm túi nhờ dao động cơ không lớn

1.5.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích gồm: thể tích, thành phần và số lần thay đổi dung dịch ngoài màng bán thấm, thời gian, nhiệt độ thẩm tích và kích thước các phân tử so với kích thước lỗ màng [23] Các phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ màng nhiều lần sẽ nhanh đạt được sự cân bằng nồng độ hơn các phân tử có kích thước gần với kích thước lỗ màng Màng cellophane sử dụng trong thí nghiệm có cấu trúc các lỗ rỗng xoắn, do đó các phân tử nhỏ có thể đi xuyên qua dễ dàng hơn [23][24]

Trong quá trình thẩm tích, các phân tử đi qua màng bán thấm và đạt trạng thái cân bằng riêng, độc lập với các chất khác dẫn đến mẫu có thể bị pha loãng [23] Khi thẩm tích

các protein thường người ta tiến hành tất cả ở môi trường lạnh ở 4 – 5oC, trong khoảng 6 – 8 giờ và thể tích dung dịch ngoài màng bán thấm gấp 200 – 500 lần thể tích dung dịch trong túi thẩm tích [23][24] Ngoài ra, một số phân tử có thể bám lên màng bán thấm dẫn đến mất mẫu Sự mất mẫu do bám màng là không đáng kể với mẫu có nồng độ > 0,5mg/ml nhưng có khác biệt lớn với mẫu có nồng độ < 0,1mg/ml Có thể bổ sung chất mang vào mẫu thẩm tích để ngăn ngừa sự mất mẫu do bám màng [23]

1.6 Tổng quan về phương pháp điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE) 1.6.1 Nguyên tắc

SDS - PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính các phân tử protein Trong kỹ thuật này protein được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Để xác định khối lượng phân tử của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng

chuẩn, là một hỗn hợp các protein có khối lượng phân tử khác nhau đã biết [25] [26]

1.6.2 Sắc ký điện di

Cho 20µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng Thực hiện điện di với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự dịch chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm

Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250, trong 30 phút Sau đó cho tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước) Protein sẽ được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt

1.6.3 Xác định trọng lượng phân tử của protein

Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối cùng) Tính giá trị Rf = Khoảng cách di chuyển của protein

Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol)

Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf trên, nhờ phương pháp nội suy theo đồ thị Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein

1.7 Phân tích tính chất của chế phẩm enzyme

Khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt tính hoạt động của enzyme Một số phương pháp xác định hàm lượng protein trong dung dịch với độ nhạy của chúng khác nhau, hoặc do dựa vào sự có mặt của một số amino acid, do thành phần amino acid của protein khác nhau, nên kết quả phân tích sẽ bị ảnh hưởng

Phương pháp Biuret, peptide và đặc biệt protein chứa từ 2 liên kết peptide trở lên đều có khả năng tạo phức cho màu mận chín với dịch kiềm chứa CuSO4 (nhờ liên kết coordinate – càng cua của N tham gia liên kết peptide với Cu+2) Hàm lượng của chúng (peptide & protein) tỷ lệ với độ đậm của màu Đo ở bước sóng 540 nm, đối chứng là dịch biuret và đệm hoặc nước Có một số tác nhân gây cản trở: đệm chuẩn bị từ amino acid, đệm Good’s, đệm Tris Phương pháp biuret có ưu điểm là cho cùng kết quả ổn định đối với các loại protein khác nhau, dễ dàng thực hiện Nhược điểm chủ yếu là độ nhạy kém (1 mg) [27]

Phương pháp Lowry, là phương pháp khá nhạy so với phương pháp biuret do bổ sung thêm chất Folin-ciocalten làm tăng độ màu của dung dịch, dịch màu xanh dương xuất hiện là do:

- Liên kết càng cua giữa N tạo liên kết peptide với Cu+2

- Sự khử chất Folin-ciocalten do tyrosine và tryptophan trong phân tử protein tạo ra

Các bước thực hiện giống như phương pháp biuret, độ nhạy cao hơn 100 lần Tuy nhiên nó bị ảnh hưởng rất mạnh bởi đệm Good’s, NH4)2SO4 (nồng độ >15%), glycine (nồng độ >0,5%) và mercaptan Ngoài ra protein có hàm lượng tysosine và tryptophan khác nhau do vậy kết quả không mấy ổn định [27] [20]

Định lượng protein bằng phương pháp Bradford loại bỏ hầu hết các vấn đề liên quan đến quy trình được mô tả ở trên và dễ dàng sử dụng để xử lý số lượng lớn mẫu, cũng như có thể tự động hóa Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein dẫn đến sự tồn tại ở hai dạng màu khác nhau của thuốc thử Coomassie Brilliant Blue G-250 là đỏ và xanh lam [28]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Gừng

Củ gừng tươi được mua từ hệ thống siêu thị Sài Gòn Co op thuộc giống gừng trâu – Zingiber oficinale Rosc có xuất xứ từ Đăk Lăk (Việt Nam) Gừng được thu hoạch trong độ tuổi khoảng 9 đến 12 tháng tuổi, khối lượng từ 200g – 500g tùy củ Gừng sau khi mua về được sử dụng ngay hoặc dùng dần trong tuần và bảo quản ở nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp

Gừng khi sử dụng làm thí nghiệm sẽ được rửa sạch, để ráo và gọt vỏ

2.1.2 Hóa chất trong nghiên cứu

Folin-Ciocalteu’s phenol; casein; HCl; Ethanol; Na2HPO4.12H20, NaH2PO4.7H2O; Trichloroacetic acid (TCA); NaOH; Cysteine; Tyrosine; Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); Dithiothreitol (DTT); đệm Tris-HCl pH 6,8; nước cất 2 lần; dung dịch acrylamide 30%; dung dịch SDS 10%; APS 10%; TEMED

2.2 Dụng cụ và thiết bị 2.2.1 Dụng cụ

Bình định mức 50ml, 100ml, 1000ml; erlen 250ml; micropipet (20 – 200μl, 100 - 1000 μl, 1 – 5 ml), phểu thủy tinh, đũa thủy tinh, nhiệt kế, thau, rổ, dao, thớt, bình hút chân không, ống nghiệm, cuvet

Phân tích thành phần của củ gừng tươi

- Hàm ẩm - Lipid - Protein - Tro

Carbohydrate tổng

Trích ly protease bằng môi trường nước

- Tỷ lệ gừng: dung môi (1:5-1:25; ∆ 1:5)

- Nhiệt độ trích ly 70oC; ∆ 10 oC)

(30 Thời gian trích ly (30-150 phút; ∆ 30 phút)

Trích ly protease bằng môi trường nước kết

hợp siêu âm

- Nhiệt độ siêu âm 70oC; ∆ 10 oC)

(30 Công suất (10W/g, 15W/g, 20W/g, 25W/g, 30W/g, ∆ 5W/g)

Thời gian (5-25, ∆ 5 phút)

- Hàm lượng protein tổng (mg/g chất khô của nguyên liệu)

- Hoạt tính ginger rhizome proteolytic enzyme (UI/g chất khô của nguyên liệu)

Kiểm tra chất lượng chế phẩm enzym

- Phân tử lượng bằng sắc ký điện di SDS Page

- Nhiệt độ và pH hoạt động thích hợp

Thu nhận protease bằng phương pháp kết tủa bởi ethanol và thẩm tích qua

màng cellophan có MWCO 12kDa

- Hàm lượng ethanol trong dung môi

- Thời gian kết tủa

2.3.2 Quy trình thí nghiệm

Nghiền

Siêu âm

Trích ly có khuấy đảo

Lọc Trích ly có khuấy đảo

Ly tâm 1

Kết tủa protein

Ly tâm 2

Thẩm tích Gừng đã gọt vỏ

Đệm Phosphat (pH 7.0) DTT (pH 7.0); Cystein

Cồn

Chế phẩm enzyme

Bã

Dịch lỏng

Muối khoáng, … Bã, tinh bột, …

2.3.3 Thuyết minh quy trình 2.3.3.1 Lựa chọn nguyên liệu gừng

Mục đích: Đảm bảo đồng nhất chất lượng enzyme tạo ra sử dụng cho mỗi thí nghiệm Thực hiện: Chọn củ gừng còn nguyên vẹn; lành lặn, không bị thối hỏng hoặc dập nát hay bị hư hỏng bởi sinh vật hại hoặc bị thấm nước gây ẩm bất thường ở ngoài vỏ củ; không có mùi và/hoặc vị lạ; rắn chắc; không bị trầy vỏ; đủ khô để sử dụng; vỏ, cuống và vết cắt khi thu hoạch phải khô hoàn toàn sạch, không có tạp chất lạ nhìn thấy bằng mắt thường, Gừng sau khi mua về được sử dụng ngay hoặc dùng dần trong tuần và bảo quản ở nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp

2.3.3.3 Siêu âm

Mục đích: Trong quá trình tách chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm giúp đẩy nhanh quá trình truyền khối dẫn đến việc giải phóng các protein và polyphenol từ thành tế bào, nhu mô thông qua hiệu ứng xâm thực (cavitation)

Thực hiện: Sử dụng thiết bị siêu âm dạng đầu dò Các điều kiện khảo sát: nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm

Mục đích: Loại bỏ bã gừng là các xơ không tan

Thực hiện: Dùng giấy lọc Whatman cho vào thiết bị lọc chân không, tiến hành lọc lấy dịch trích và bỏ bã Dịch trích sau đó được đưa đi làm lạnh để hạ nhiệt độ xuống 4℃

2.3.3.6 Ly tâm 1

Mục đích: Tách một phần tinh bột và bã không tan còn sót lại của quá trình lọc thô

Thực hiện: Dịch trích sau khi được làm lạnh ở 4℃ sẽ được cho vào ống ly tâm (50ml) quay ly tâm 5000 vòng trong 30 phút

2.3.3.7 Kết tủa protein

Mục đích: Bước đầu thu nhận và tinh sạch ginger rhizome proteolytic enzyme

Thực hiện: Dùng dung môi hữu cơ ethanol ở các nồng độ khác nhau cho vào dịch lỏng để dung dịch ở 0-5oC cho quá trình kết tủa diễn ra Các điều kiện khảo sát: hàm lượng ethanol, tỉ lệ ethanol và dịch trích, thời gian kết tủa

2.3.3.8 Ly tâm 2

Mục đích: Loại bỏ phần dịch lỏng để thu nhận phần ginger rhizome proteolytic enzyme kết tủa

Thực hiện: Cho dịch lỏng vào ống ly tâm (50ml) quay ly tâm 3600 vòng trong 30 phút

2.3.3.9 Thẩm tích

Mục đích: Tăng độ tinh sạch cho chế phẩm ginger rhizome proteolytic enzyme, loại bỏ các chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa như acid amin, chất khoáng, muối, …có trong mẫu ra ngoài

Thực hiện: Sử dụng màn thẩm tích cellophane, kích thước ∅35mm Cho mẫu vào túi cellophane và hòa loãng với đệm phosphat (pH 7,0), đặt túi vào trong cốc nước cất và đặt lên thiết bị khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ ≈ 3 -5 ℃

Các yếu tố thay đổi:

- Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khuấy đảo đến hiệu suất trích ly

Các yếu tố cố định:

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 1 phút 30 giây

- Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo kết quả thí nghiệm 1 - Nhiệt độ khuấy đảo: nhiệt độ phòng (~30℃) - Thời gian ly tâm: 20 phút

Các yếu tố thay đổi:

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ (phút): 0; 10; 20; 30; 40

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy đảo đến hiệu suất trích ly

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 30 phút - Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo thí nghiệm 1

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: theo thí ngiệm 2 - Thời gian ly tâm: 20 phút

Các yếu tố thay đổi:

- Nhiệt độ khuấy đảo (℃): 30; 40; 50; 60; 70

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly enzyme khi có sự hỗ trợ của siêu âm

 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hiệu suất quá trình

trích ly Các yếu tố cố định:

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 1 phút 30 giây - Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo thí nghiệm 1

- Công suất siêu âm (W): 15W/g - Thời gian siêu âm (phút): 5

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: theo thí nghiệm 2 - Nhiệt độ khuấy đảo: theo thí nghiệm 3

- Thời gian ly tâm: 20 phút

Các yếu tố thay đổi:

- Nhiệt độ siêu âm (℃): 20; 30; 40; 50; 60

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hiệu suất quá trình

trích ly Các yếu tố cố định:

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 1 phút 30 giây - Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo thí nghiệm 1

- Nhiệt độ siêu âm: theo thí nghiệm 4 - Thời gian siêu âm (phút): 5

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: theo thí nghiệm 2 - Nhiệt độ khuấy đảo: theo thí nghiệm 3

- Thời gian ly tâm: 20 phút Các yếu tố thay đổi:

- Công suất siêu âm (W/g): 10; 15; 20; 25; 30

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất quá trình

trích ly Các yếu tố cố định:

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 1 phút 30 giây - Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo thí nghiệm 1

- Nhiệt độ siêu âm: theo thí nghiệm 4 - Công suất siêu âm: theo thí nghiệm 5

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: theo thí nghiệm 2 - Nhiệt độ khuấy đảo: theo thí nghiệm 3

- Thời gian ly tâm: 20 phút Các yếu tố thay đổi:

- Thời gian siêu âm (phút): 0; 5; 10; 15; 20

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

2.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình kết tủa protein

 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến hiệu suất quá trình kết tủa

protein Các yếu tố cố định:

- Thời gian đồng hóa với dung dịch đệm: 1 phút 30 giây, nghỉ 30 giây giữa mỗi 30 giây đồng hóa

- Tỉ lệ nguyên liệu: đệm: theo thí nghiệm 1 - Nhiệt độ siêu âm: theo thí nghiệm 4 - Công suất siêu âm: theo thí nghiệm 5

- Thời gian siêu âm: theo thí nghiệm 6

- Thời gian khuấy đảo trên máy khuấy từ: theo thí nghiệm 2 - Nhiệt độ khuấy đảo: theo thí nghiệm 3

- Thời gian ly tâm: 20 phút - Tỉ lệ dịch trích: cồn: 1:1 - Thời gian kết tủa: 10 phút Các yếu tố thay đổi:

- Nồng độ cồn (%(v/v)): 50; 60; 70; 80; 90

- Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ protein tổng và hoạt độ enzyme

 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu suất quá trình kết