Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sử dụng Enzyme Lipase cố định trên vật liệu Hydrotalcite để thủy phân dầu hạt bụp giấm

- _ Vấn dé 2: Khao sát các yếu tô anh hưởng đến diéu kiện cô định phù hopenzyme Porcine pancreas trên chất mang hydrotalcite Mg:Al — acetate chưanung, đã nung và hoạt tính enzyme cô định

Cán bộ nhận xét 1: TS NGUYEN THẢO TRANGCán bộ nhận xét 2: TS TRỊNH KHÁNH SƠN

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại học Bach Khoa, DHQG Tp.HCMngày

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:1 PGS TS LE VĂN VIET MAN

2.TS NGUYEN THAO TRANG3 TS TRINH KHANH SON4.TS PHAN TAI HUAN5 TS VÕ DINH LỆ TAM

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quan lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Bộ môn quản lý chuyên ngành

oOo oOo

NHIEM VU LUAN VAN THAC SI

Ho tén hoc vién: VO THI HONG LINH MSHV: 13110564

Ngày, thang, năm sinh: 01/12/1989 Noi sinh: Phu Y én

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm — Đồ uống1 TEN DE TÀI:

NGHIÊN CỨU SỬ DUNG ENZYME LIPASE CO ĐỊNH TREN VAT LIEUHYDROTALCITE DE THUY PHAN DAU HAT BUP GIAM

NHIEM VU VA NOI DUNG:- Nghién cứu tinh chat của enzyme lipase và chat mang hydrotalcite.- (C6 định enzyme lipase lên chất mang hydrotalcite Mg/AI

- _ Thủy phân dau hạt bụp giam với hệ enzyme có định.- _ Bước dau xác định khả năng chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân.- Tach phân đoạn sản phẩm thủy phân

2 NGÀY GIAO NHIỆM VU: 18/08/2014.3 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 07/12/2014.4 CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: TS PHAN NGỌC HÒA

TS TRAN THỊ NGOC YENTp Hô Chí Minh, ngày 01/12/2014CAN BO HUONG DAN CHU NHIỆM BO MÔN ĐÀO TẠO

PHAN NGỌC HÒA LE VĂN VIỆT MAN

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

oOo oOo

NHAN XET LUAN VAN THAC SI

(Nhận xét cua CB hướng dẫn L` Nhận xét cua CB phan biện LÌ )Họ và tên học viên: VÕ THỊ HÔNG LINH

Đề tài luận văn: NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME LIPASE CO ĐỊNH TRENVAT LIEU HYDROTALCITE ĐỀ THUY PHAN DAU HẠT BUP GIAM

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm — Đồ uống

Người nhận xét (họ tên, học ham , HOC VỊ) : cv ng ng.

Cơ quan công tác (nẾU CÓ): E- - + E2 5E SE EE E111 1111511131 1e 0

Ý KIÊN NHAN XÉT

1- Về nội dung & đánh giá thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài:

Hòa và cô TS Trần Thị Ngọc Yên đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em trong suốt

quá trình thực hiện luận văn này.

Ngoài ra, em cũng xin bảy tỏ lòng biết ơn đến tập thể quý thầy cô bộ mônCông nghệ thực phẩm, những người đã dẫn dắt, hỗ trợ em trong suốt quá trình thực

hiện luận văn.

Con xin cảm ơn gia đình đã hỗ trợ và động viên con trong suốt quá trình conhọc tập tại trường Dai Hoc Bach Khoa — ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh

Tp Hỗ Chí Minh, ngày 07 tháng 12 năm 2014

Người viết

Võ Thị Hồng Linh

quả nêu trong luận văn này đều là trung thực.

Học viên thực hiện

VÕ THỊ HỎNG LINH

cứu để ứng dụng vào quy mô công nghiệp, thay thế cho enzyme tự do bởi chúng cónhiều ưu điểm như: bền với pH nhiệt độ, cơ chat , dé tách ra khỏi sản phẩm để táisử dung; sản phẩm tinh khiết; giảm giá thành enzyme và có thể sử dụng cho quátrình sản xuất liên tục.

Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu những van dé sau:- Van dé 1: Khảo sát tính chất cua enzyme lipase Porcine pancreas và hai

loạt vat liệu hydrotalcite Mg:Al — acetate ty lệ mol 2:1, nong độ 0,15M,

chưa nung va đã nung.

- _ Vấn dé 2: Khao sát các yếu tô anh hưởng đến diéu kiện cô định phù hopenzyme Porcine pancreas trên chất mang hydrotalcite Mg:Al — acetate chưanung, đã nung và hoạt tính enzyme cô định trên cơ chất dau hạt bụp giấm.- _ Vấn dé 3: Nghiên cứu hoạt tính xúc tác cho phản ứng thủy phân dâu hạt bup

giấm của enzyme Porcine pancreas tự do và cô định trên hai chất mang

chưa nung và đã nung.

- _ Vấn đề 4: Sơ bộ xác định tính chất sản phẩm thủy phân dựa trên việc táchphân đoạn sản phẩm và xác định khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm

M.9/:810/9:7.9) 2 VDANH MUC HINH 2 viDANH MỤC TU VIET TẮTT 6k E111 19191 1E 111121 1 1129 vn neo viii0009.1005 |CHUONG 1 TONG QUAN 2 31.1 Thanh phan dau bụp giấm c.cccccccscsccscsessssesssssscssescsesscsesessesesessesesssesseseseesesen 3

1.1.1 Giới thiệu chung về hat bụp QiAM oo cseseeseesescetseseseseeeeeeees 31.1.2 Thành phan dau hat bụp QiAM oo cccececceceeeseesesesssesesesesseseseeseseseesesen 4

[.2 Enzyme lipase << 000 re 8

1.2.1 Định ng hĩa - - GĂ G0200 01013 19990101 ke 8

1.2.2 Nguồn thu nhan ceccccccccccccscscscsescscsssscsescscsssscscssscsssscscssscssssssssesesssesees 81.2.3 Cau trúc hĩa học của enzyme lipase Porcine Pancrease 101.2.4 Tính chat của enzyme lipase Porcine Pancrease - +: II1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzyme lipase Porcine Pancrease 131.2.6 Ứng dung của enzyme lipase .c.ccccscscssesessssesessesssessesesesseseseeseseeeesesen 151.3 Enzyme lipase cơ định cccccccescscsesscscsessesesssscsssssssesscsescssesssesscsesesessessseeseeee 17

1.3.1 Dinh nghia 0 eee ã5A.- 17

1.3.2 Tính chat enzyme lipase cố inh .c.cccccccsessssesessssessesesesesseseseseseeeeseeen 171.3.3 Cơ chế cơ định enzyme lipase lên chat mang hydrotalcite 171.3.4 Các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình cơ định enzyme LPP 18

14 Vat liệu hydrOfaÏCIt€ 00000 ke 19

1.4.1 Dinh nghia 0 eee 1ĨốÁ4.ốố.ố 19

1.4.2 Tinh chất của vật liệu hydrotaÌCI{G - << «SH 3, 17CHUONG 2 NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU 222.1 Nguyên liệu và hĩa chất - - ¿6 +52 2E+E+EEEE£ESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrrreee 22

2.1.1 Dầu hạt bụp giẫm ¿: S2 SE 1 11151111 2111111111 1111111111 te 22

"No ái 0n -s3 ố 232.2 Dung cụ Và thiẾt bị - + S211 1E 1 111115131111 11 0111715110111 11 011111 re 23

2.2.1 DUNG 23

2.2.2 Thidt Đị T11 1211 91119151111 1101010111 H112 TT HT ng net 23

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên CỨU 5E S111 ESSsssseeeeerse 25

2.3.1 Nội dung nghiÊn CỨU «G000 ng 25

2.3.2 Bồ trí thí nghiệm . - + S2 SE SEEE£E2EE E21 12152515 1212111 ck 26CHUONG 3 KET QUA VA BAN LUẬN c6 s + 2S sEsESESESEEEsEseeeseseree 513.1 Tính chất dầu hạt bụp giẫm wee cccsecesescscscscescscscscssssescseecssssssessesseeeees 51

3.1.1 Hiệu suất trích ly dau eccccccccccscssesesesesssssesssessscssssesessssseseseeseen 513.1.2 Chi số acid va hàm lượng acid béo tự docủa dau hat bup giam 523.1.3 Chỉ số peroxyd của dau hat bụp giấm -¿-+-5+c+5scs+cccsceee 533.1.4 Hàm lượng chất khơ của dau hạt bụp giấm - 5-5: 533.1.5 Hàm lượng lipid tong của dau hạt bụp giấm -. - 2555: 533.1.6 Độ tro của dầu hạt DUP giẫm - +: - SE SE EEEErkrkrrrree, 543.2 Tính chất của enzyme LPP và vật liệu hydrotalcite - +55 2555: 54

3.2.1 Vật liệu hydrOfiaÏCI€ - S999 9300001101 ke 523.2.2 pHpzc của vật liệu hydrOtaÌCI(G - - - << s9 ng ke 53

3.3 Điều kiện tối ưu cho quá trình cố định enzyme lên chất mang hydrotalcite 54

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme / chất mang . 25- 2 s+s+scs+s+¿ 543.3.2 Anh hưởng của pH oeceeeccccsesccsssessesessssssesscsssesscsesesscsesessesesesscscsesesssseeeeees 573.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt đỘ - ¿5+ S2 S213 3 2E E211 E1 cErrrreee 603.3.4 Ảnh hưởng của thời gian cố định - - + + s+c+ce+x+eersrerrererree 623.4 Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân dau hạt bụp giẫm - 63

3.4.1 Độ bên pH và thời gian bán hủy của enzyme lipase cơ định 643.4.2 Độ bên nhiệt độ và thời gian bán hủy của enzyme lipase cố dinh 663.4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu / đệm ¿-¿- - +2 2 2 +E+E+E+EzErkrkrrereee 69

3.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ - ¿5 +5 252212323 2E EEE AE EcErkrrrreee 743.4.7 Anh hưởng của thời gian thủy phân +2 + + ++s+s+ss+s+xeeszseẻ 763.4.8 Số lần tái sử dụng ¿-¿- + + 2 E21 1 15111111 111115 1111011111111 11111 ty 783.5 Khảo sát tính chất của sản phẩm thủy phân 255552 scs+eccecxee 80

3.5.1 Kết qua tach phân đoạn ceccccccccsccscssesesssssscsessssesesscsesessesesessesssesssseeeeees 303.5.2 Khả năng hang oxy hóa theo cơ chế bắt gốc tự do -. - S3CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, ¿55 sE+E+E+E+E£EsEsEsezeseree 844.1 KẾtluận SG C1 119191 11 911111 511111111110 110111011 g1 ren 844.2 Kiến nghị - 5< S211 E11 1 151311111111 11111111 1111111111111 01111 re 85

Bang 1.2 Thanh phan các phenolic acid trong dau hạt bụp giẫm .- 5Bang 1.3 Thanh phan sterol thực vật có trong dau hạt bụp giấm - 7Bang 1.4 Thành phan tocopherols trong dau hạt bụp giẫm -: 7Bảng 1.5 Các yếu tô ảnh hưởng đến hoạt tính của lipase từ các nguồn khác nhau 12

Bang 1.6 Các lĩnh vực ứng dung cua enzyme lipase 5-5 5s es+ 16

Bảng 2.1 Thanh phan dau hạt bụp SiaM ceccccsecesessesesesesseseseesesesesseseseeseseseesesen 22Bang 3.1 Thanh phan acid béo trong các giống hat DUP giấm - 51Bang 3.2 Kết quả phân tích acid béo trong dau hạt bụp giâm - 52Bang 3.3 Chỉ số acid và ham lượng acid béo tự do của dau hạt bụp giam 53Bảng 3.4 Hệ số ức chế và thời gian bán hủy của enzyme lipase tự do và enzymelipase cô định tại các pH khác nhau - 2 - +22 252 +E+E+E££E£E+EE£E+EeEe£xrxerererreei 69Bảng 3.5 Hệ số ức chế và thời gian bán hủy của enzyme lipase tự do và enzymelipase cô định tại các nhiệt độ khác nhau - - - 6 SE EeEsEsE+E+ESEEsEseexseseree 69Bang 3.6 Thanh phan acid béo dịch thủy phân dau bụp giam (enzyme LPP tự do) 82Bang 3.7 Thanh phan acid béo dịch thủy phân dau bụp giảm (enzyme LPP cỗ địnhtrên chất mang chưa NUN - - + 2 6E SE EESE£E£ESEEEEEEEEEEEEE315 2121111521 x xe, 53Bang 3.8 Thành phan acid béo dịch thủy phân dau bụp giam (enzyme LPP cỗ địnhtrên chất mang đã NUN - ¿+ ©- ©5266 E* 9E E23 151515112111 11 111515111111 11 11x 53Bảng 3.9 Khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân hạt bụp giẫm sử dụng

enzyme LPP tự do, cô định trên LDHs chưa nung và đã nung - -: 53

Hình 1.2 Cấu trúc lipase và mô hình trung tâm xúc tác của chúng 10Hình 1.3 Mô hình đóng va mở của nắp trong lipaSe ¿5 + + scs+c+cscx+see 11Hình 1.4 Co chế thủy phân dau của enzyme lipase cccecescsccsessssesesseseseseeseseseesesen 13

Hình 1.5 Cac bước xúc tác cho phản ứng thủy phan cua enzyme lipase 15

Hình 1.6 Cấu trúc hydrotalcite và một đơn vi bát diện của vat liệu 20Hình 1.7: Sơ d6 tái cau trúc hydrotal€ite ¿5-5 5+ +s+x+E+£x+xezzxrxerererreee 21Hình 2.1 Quy trình công nghệ trích ly dầu hạt bụp giắm - 25-52: 26Hình 2.2 Quy trình cô định enzyme lipase trên chất mang hydrotalcite 37Hình 2.3 Quy trình thủy phân dau hat bụp giam sử dụng enzyme lipase tự do và cô

3001000 — a-£ăă 43

Hình 2.4 Quy trình tách phân đoạn sản phẩm thủy phân - + 55-52: 46Hình 2.5 Phản ứng trung hòa gốc DPPH ¿2-5 52 S2+E+EE£E+EvEcEvEererrrreei 49Hình 3.1 Bề mặt chất mang LDHs Mg/ AI — acetate 2:1 .- 55552555: 57Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn điểm đăng điện của chất mang chưa nung và đã nung 58Hình 3.3 Anh hưởng của tỷ lệ enzyme / chất mang +5 + + s+s+s+cs+xzsee: 60Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH -¿ ¿525695221239 2323221232121 211 112111 cxee 62Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ -. - + 2 25626 E232 E83 1 E211 2121 E121 21 E xe, 64Hình 3.6 Anh hưởng của thời gian cỗ định ¿5 + +52 +s+x+S++x+xerecxererererreee 66Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn độ bền pH 5-2 2 252 SE2E+E2E2EE£E£E£EzEcrzrxrerree 84Hình 3.8 Đồ thị biễu diễn độ bền nhiệt độ, - 6 xxx EsEsESEeEEEeEseseexei 85Hình 3.9 Anh hưởng của tỷ lệ dầu / nƯỚC - - 2 2 252 +E+E+E+ESEE£E£ErEeErrersrkrree 73Hình 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lên enzyme / CO chất + + +5 s+s+s+c£z£szszceẻ 74Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH đến tốc độ thủy phân - 25 2 +55: 76Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối của enzyme - 76Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ thủy phân 2 5+: 77Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính tương đối của enzyme 78

LDHs: hydrotalcite (layer double hydroxyts)LPP: lipase Porcine pancreas

MCT: acid béo mach trung binh

pH;;.: pH đăng điệnPZC: điểm đăng điện

SEM: Scanning Electron MicroscopeXRD: X-Ray Diffraction.

MỞ ĐẦUNgày nay, việc sử dụng enzyme làm xúc tác cho phản ứng thủy phân chất béo đangngày càng được quan tâm nghiên cứu do những ưu việt về công nghệ và tính thân thiệnvới môi trường của chúng so với các xúc tác hóa hoc Là thành phan cau tạo của mangtế bào và có hoạt tính sinh học cao, tính kháng khuẩn, các acid béo thu được sau quátrình thủy phân là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho công nghệ thực phẩm va dượcphẩm đặc biệt là nhóm sản phẩm thực phẩm chức năng Nhược điểm của thủy phânchất béo băng phương pháp hóa học là có lẫn các sản phẩm phụ trong quá trình phảnứng nên độ tinh khiết của sản phẩm không cao Ngoài ra, quy trình này tốn nhiều nănglượng và đòi hỏi phải có lò phản ứng rất tốn kém Thủy phân chất béo với xúc tácenzyme lipase khắc phục những nhược điểm trên, đó là phản ứng xảy ra ở áp suất khíquyền và nhiệt độ tương đối thấp, vi enzyme có tính đặc hiệu cao đối với co chất trongđiều kiện nhiệt độ, pH nhất định, nên sản phẩm thu được đạt độ tinh sạch cao, hamlượng tạp chất chiếm tỷ lệ rất nhỏ.

Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) la enzyme đóng vai trò xúc tácsinh học cho phan ứng thủy phân triglyceride tao thành các tri-, di-, monoglyceride,

glycerol và các acid béo tự do Đây là enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiềungành công nghiệp như : thực phẩm, hóa học, mỹ phâm nhờ khả năng xúc tác phảnứng thủy phân triglyceride hoạt động trên bề mặt phân cách pha dầu — nước Lipase

được thu nhận từ nhiều nguon: động vat, thực vật, vi sinh vật, trong đó, enzyme

Porcine pancreas là enzyme lipase được thu nhận từ tuyến tụy của lợn Theo một sốnghiên cứu, enzyme này có tính 6n định cao Bất lợi chính cho việc sử dung lipasetrong sản xuất công nghiệp là giá của enzyme quá cao, enzyme hòa tan lẫn trong sản

phẩm, gây khó khăn trong việc tinh sạch, do đó không mang lại hiệu qua về mặt kinh

té.Việc sử dung enzyme cố định trên các loại chất mang đã khắc phục được những

điềm trên nhờ các ưu điêm vượt trội sau:

- Tai sử dụng nhiều lần.- Tang độ tinh khiết sản phẩm.- Dé điều khiến thành phan.- _ Có thé ngưng phản ứng tại mọi thời điểm.- Dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm sau khi phan ứng kết thúc.

- Git hoạt tính trong thời gian lâu hơn.

- (C6 định nhiều enzyme thực hiện một chuỗi phản ứng liên tục.- C6 thé tiêu thụ lượng cơ chất lớn

- Su dụng cho các đầu đò sinh học

- Ngan cản hiện tượng rửa trôi.

- On định và bén hơn với các yếu tố môi trường (pH, nhiệt độ, dung môi, )Các chất mang thường dùng để có định lipase là các polyme như: agaroza, chitin,collagen, keratin, polyurethan, các dẫn xuất N-vinylpyrolidin, celite, kaolin, oxit kimloại, silica gel, chitosan, các hydrotalcide, Trong số các vật liệu dùng dé cố định trên,thì hydrotalcite là chat mang có các tính chất rat phù hợp để làm chất mang cho cácenzyme có pH tối thích trong khoảng bazơ như lipase

Các phương pháp chính được sử dụng để có định enzyme là: khâu mạch thànhchuỗi enzyme, nhốt enzyme vào trong khuôn gel, gắn enzyme trên chất mang khôngtan và kết hợp các phương pháp lại với nhau

Mục đích chính của nghiên cứu này là sử dụng enzyme lipase từ Porcine pancreas

cô định lên vật liệu hydrotalcite của Mg / AI - acetate băng phương pháp hấp phụ traođổi ion, tìm hiểu sơ lược động học về quy luật ảnh hưởng và tác động của các yếu tốnhư pH, nhiệt do, độ bền pH, độ bên nhiệt độ năng lượng hoạt hóa, của phản ứngthủy phân dau hat bụp giấm đông thời đánh giá khả năng tái sử dung của hệ enzyme cố

định này.

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN1.1 Thanh phan dau hạt bụp giam

1.1.1 Giới thiệu chung về hạt bụp giamCây bụp giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L., còn gọi là cây giamhay bụp giấm, thuộc họ bông Malvaceae, cùng họ với cây bông but Tên tiếng anh phobiến của loại cây thực vật này là Roselle, ngoài ra một số tên địa phương khác cũng

được sử dụng như Karkade, Mesta, Sorrel,

Cay but giấm được trồng khá rộng rãi ở nước ta và được đánh giá như là câythuốc của Châu Á, hầu như các thành phần của cây được tận dụng khá triệt dé Tuynhién hat bup giam chứa dầu béo với ham lượng khá cao vẫn chưa được chú trọngnhiều Nguồn dau béo này chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có tính khángkhuẩn, là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho thực phẩm

oe

Hình 1.1 Cây bụp giấm và hạt bup giấmHạt bụp giảm là phế phẩm sau khi thu hoạch đài hoa Hạt bụp giảm là mộtnguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng và năng lượng, bao gồm các thành phan protein,chất béo, carbohydrate và chất xơ

Dau hạt bụp giấm chứa khoảng 18,8 — 22,3% protein, 39,5 — 42,6% chất xo,19,1 — 22,8% chất béo, đặc biệt hàm lượng acid béo không bão hòa chiếm đến 70%,trong đó acid linoleic chiếm tỷ lệ 44% Ngoài ra hạt bup giẫm còn là một nguồn giàucác loại khoáng chất như phosphorus, magnesium, calcium và nhiều hợp chất có lợi

khác (Gummadi và cộng sự, 2009)

1.12 Thành phan dau hat bụp giam1.1.2.1 Thành phan acid béo

Hạt bụp giam là nguồn nguyên liệu giàu hàm lượng các acid béo, đặc biệt hàmlượng các acid béo không no chiếm tý lệ khá cao (74,33%) với các acid béo quan trọng

như acid linoleic (35,55%), acid oleic (36,64%), acid palmitic (19,34%), acid stearic(4,86%) (Juana Sanchez và cộng sự, 2008).

Bang 1.1 Thành phan các acid béo có trong dau hạt bup giấm (Hainida và

cộng sự, 2006)

Hàm lượng acid béo (3%) Hạt bụp giấm Hạt bup giam đã luộc

Acid béo noMyristoleic acid (C14:0) 0,21 0,23Palmetic acid (C16:0) 19,21 19,34Stearic acid (C18:0) 5,13 4.86Arachidic acid (C20:0) 0.67 0.64

Total 25.22 25 07Acid béo khéng no

Palmitoleic acid (C16:1) 0.36 0.36Oleic acid (C18: ]) 36,9 36.64Linoleic acid (C18:2) 35.02 35,55Alpha-linolenic acid (C18:3) 1,85 1,78

Total 74,13 7433

Chất béo có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các loại vitamin tantrong dầu mỡ như Vitamin A, D, E, K, các acid béo không no có vai trò quan trọngtrong sự phát triển bình thường của cơ thé, tăng sức dé kháng và có hoạt tính sinh học

cao.

Acid oleic là thành phan chính của chat myelin bao quanh sợi trục tế bào thankinh, giúp dẫn truyền tín hiệu thần kinh Acid linoleic (omega - 6) là tiền chất của ARAthành phan quan trọng của màng tế bào (kế cả tế bào não), là tiên chất của nhiều chatkháng viêm giúp tăng cường sức dé kháng Hàm lượng linoleic là tiêu chuẩn quantrọng để đánh giá giá tri sinh học của chất béo Acid linolenic (omega - 3) là tiên chấtcủa DHA, là acid béo quan trọng trọng việc việc phát triển não bộ, mắt và hệ thần kinh(DHA chiếm 1⁄4 não bộ người lớn) Các acid béo chưa no kết hợp với các cholesteroltạo thành các ester co động, không bền vững và dễ bài tiết ra khỏi cơ thể, giúp ngănngừa xơ vữa động mạch và có tác dụng cao trong quá trình điều hòa thành mạch máu,nâng cao tính đàn hồi và hạ thấp khả năng thấm thấu của thành mạch máu, giúp hạnchế nghẽn động mạch vành tim Ngoài ra các acid béo còn có mối quan hệ mật thiết

với các vitamin nhóm B và khả năng hợp mỡ của Cholin (Nzikou và cộng sự, 2011)

1.1.2.2 Phenolic acid

Thanh phan dau hạt bụp giấm chứa một lượng lớn hàm lượng hợp chấtpolyphenol khá cao (1,95mg / 100g dau), đặc biệt là các phenolic acid, bao gồm cáchợp chất ở dạng hydroxybenzoic và hydroxycinnamic: gallic, protocatechuic, p —

hydroxybenzolIc, caffeic, vanillic, syringic, p — coumaric và ferulic acid, K L Nyam

và cộng su, 2009 đã nghiên cứu và so sánh thành phan hợp chất phenolic acid trongdầu các hạt thực vật, kết quả cho thấy hàm lượng ferulic acid chiếm hàm lượng caonhất trong dau hạt bụp giam (0,25mg / 100g dau) (Nyam và cộng sự, 2009)

Bang 1.2 Thành phan các phenolic acid trong dau hạt bup giấm (Nyam và cộng

su, 2009)

Phenolic acid Hàm lượng (mg / 100g dau)

Vanillic acid 0,55 + 0,01Caffeic acid 0.41+0,01Gallic acid 0,29 + 0,02Ferulic acid 0,25 +001p —hydroxybenzoic acid 0,21 +0,03p —coumaric acid 0,18 + 0,03Protocatechuic acid 0,06 + 0,02

Các hop chat phenolic acid được đánh giá cao dựa trên tinh chong oxi hóa,

caffeic acid, chlogennic acid, ferulic acid, sinapic acid và p — coumaric acid có hoạt

tinh chéng oxi hóa cao hơn han so với benzoic acid, p — hydroxybenzoic acid, vanillic

acid va syringic.

Bên cạnh tác dụng chống oxi hóa cao, hop chat phenolic acid là những thànhphân có hoạt tính sinh học quan trọng như tính kháng khuẩn, tính kháng nắm, kháng tếbảo ung thư, chống viêm nhiễm và tác động giãn mach của cơ thể, các hợp chatphenolic acid tự nhiên được đánh giá là một phương pháp điều trị bệnh tim hiệu quả

acid (Neha Babbar và cộng sự, 2013)

1.1.2.3 Sterol và Squalene

Theo Y B Che Man va cong su, 2009, hoat tinh chồng oxy hóa cao nhất đượcbiết đến là ở hợp chat phenol va tocopherol Squalene được xếp hạng thứ hai với tácdụng chồng oxy hóa các hợp chất lipid trong cơ thé người, bao gôm các acid béo khôngbão hòa nhiều nối đôi và các thành phan lipid trong tế bào và màng bào quan

Squalene là một hydrocarbon có chứa nhiều nối đôi với nhiều hoạt tính sinh họcquan trọng Squalene là tiền chất để tổng hợp nên cholesterol, nó cũng được dé cập làmột trong những hợp chất có tác dụng kháng các loại tế bào ung thư

Hợp chất sterol có tác dụng cao trong việc làm giảm cholesterol và những tácđộng tốt đến sức khỏe Hàm lượng sterol có trong dau hat bụp giấm như là chất chi thị

để xác định dầu, các dẫn xuất của dầu và chất lượng của dầu (Nyam và cộng sự,2009).

Các hợp chất phytosterol trong dầu hạt bụp giam chiếm tỷ lệ rat cao (772,06 mg/ 100g dau), bao gồm squalene, cholesterol, ergosterol, campesterol, sitosterol , trongđó sitosterol chiếm hàm lượng cao nhất với 602 42 mg / 100g dau

Bang 1.3 Thanh phan sterol thực vật có trong dau hạt bụp giấm (Che Man và cộng

su, 2009)

Sterol Hàm lượng (mg / 100g dầu)

Sitosterol 602 42 + 1,32Campesterol 102,35 + 3,94

Stigmasterol 38,53 + 2.43

Squalene 14,51 + 6,79Cholesterol 14,25 + 0,75

Trong thanh phan cac hop chat sterol từ thực vật, sitosterol được nghiên cứu sâuhơn cả vì các đặc tính đặc biệt của nó, sitosterol có tác dung điều hòa chuyển hóa mỡvà cholesterol Sitosterol sẽ kết hợp với cholesterol thành những hợp chất không tankhông bị hap thu, giúp ngăn ngừa tăng cholesterol trong máu

1.1.2.4 Tocopherols

Tocopherols là hợp chất sinh hoc có khả năng chống oxy hóa rat mạnh a —tocopherols, còn gọi là vitamin E, có hoạt tính chỗng oxy hóa mạnh Vitamin E có tácdụng bảo vệ chất béo, đặc biệt là các acid béo chưa no nhiều nhánh (polyunsaturatesfatty acid — PUFAs), các thành phần khác ở màng tế bào và các low — densitylipoproteins chống lại các gốc tự do (FAO / WHO, 2002), sản phẩm sinh ra trong quátrình chuyển hóa của cơ thé - hay có thé nói vitamin E là một trong những chat chống

oxi hóa chủ yếu, bảo vệ co thé Dau hạt bụp giấm chứa nhiều đồng phân tocopherols

với hàm lượng kha cao (82,12mg/100g).

Bang 1.4 Thành phan tocopherols trong dau hạt bụp giảm (Sarana Sommano và

cộng sự, 2013)

Tocopherols Hàm lượng (mg / 100g dau) | Hoạt tính sinh học (%)

a - tocopherols 3,68 + 0,23 100B - tocopherols 3,19+0,01 50y - tocopherols 70,65 + 2,98 10ò - tocopherols 4,60 + 0,50 31.2 Enzyme lipase

1.2.1) Dinh nghĩaEnzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) la enzyme xúc tac

thủy phân và tong hợp các este được hình thành từ triglycerol va các acid béo Chúngcó bản chất là protein Đặc tính kỹ thuật của lipase là hoạt động tại liên pha dầu —

nước (Mendes và cộng sự, 2012)

Lipase được tìm thay trong động vật, thực vật, nam và vi khuẩn, có ý nghĩa sinhlý và tiềm năng trong công nghiệp Chức năng sinh học của lipase là xúc tác quá trình

thủy phân cua triacylglycerol giải phóng acid béo tự do, diacylglycerols,

monoacylglycerols va glycerol Lipase thủy phân chất béo thành acid béo và glyceroltại bề mặt phân pha dau - nước và đảo chiều các phản ứng trong môi trường không cónước: tổng hợp các este từ glycerol và acid béo chuỗi dài Sản phẩm thu được bằngcách sử dụng lipase tinh khiết hơn so với sử dụng các chất xúc tác hóa học vì sử dụngchất xúc tác hóa học sinh ra nhiều sản phẩm không mong muốn và tạp chất, nhiệt độ,áp suất cao và không tái sử dụng được Như các xúc tác khác, lipase chỉ làm tăng tốcđộ phản ứng nhưng không tham gia trực tiếp vào phản ứng Tuy nhiên, do khả năngxúc tác chọn lọc, các enzyme có thể xúc tác phản ứng xảy ra ở một số liên kết nhất

định Vì vậy, môi loại enzyme khác nhau có thê xúc tác cho các phản ứng xảy ra theo

chiều hình thành một số sản phẩm nhất định Điều này khiến cho sản phẩm của cácphản ứng có xúc tác enzyme thuần nhất hon (Adriano và cộng sự, 2012)

1.2.2 Nguôn thu nhậnLipase được phân bố ở động vật, thực vật và cả vi sinh vat Tuy nhiên, nguồnthu nhận lipase lớn nhất trong công nghiệp là vi sinh vật Lipase phân lập ở các nguồnkhác nhau sẽ khác nhau vẻ cau trúc protein và cơ chế xúc tác, khác nhau về các acidbéo đặc trưng, khả năng chịu nhiệt, pH tối ưu

Ở người và động vật có xương sống, lipase kiểm soát sự thủy phân, hấp phụ,tong hợp chất béo và chuyền hóa lipoprotein Hau hết lipase trích ly từ co thé động vậtđều có nhiệt độ tối thích là 37°C Ở động vật, lipase được lẫy từ tuyến tụy và dạ dày

Lipase động vật ưu tiên xúc tác cho quá trình thủy phân tạo các acid béo mạch dài có

hơn 12 nguyên tử carbon Tốc độ phan ứng giảm đáng ké theo thứ tự tri, di vàmonoglycerides Một số loại lipase chiết xuất từ dê, cừu và bê Các enzyme này xúc táccho quá trình thủy phân tạo các acid béo ngắn mạch có tác dụng tạo hương vị cho sảnphẩm phomat (Liu Xiao và cộng sự, 2011)

Lipase được tim thay tại mô dự trữ của các loại hạt có dau, ngũ cốc trong quátrình nảy mam Chế phẩm lipase thô được lay từ mam của cây cải dau (Brassicanapus), mù tạt, cây thầu dầu và một số loại đậu Tuy nhiên, lipase thu nhận từ thực vậtchưa được đưa vào ứng dụng nhiều vi quá trình tinh sạch khó khăn và hiệu quả kinh tế

không cao.

Lipase được thu nhận trong quá trình lên men của nam va vi khuẩn:

Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Chromobacterium spp., Cadida Rugosa

- Lipase từ Aspergillus niger và Aspergillus oryzae cô khéi lượng phan tử từ200KDa đến 25KDa và pH tối ưu từ 4,5 đến 6,5 Chúng hoạt động trên dầudừa, dầu hạt lanh và dau olive với hiệu suất thủy phân từ 48-93% và được sử

dụng trong quá trình chín pho mát.

Lipase từ Candida Rugosa: khối lượng phân tử 120KDa, điểm đăng điện ởpH 4.5 và pH tối ưu 6,5-7,5 (Petersen et al., 2001) Chúng thủy phân dauolive với hiệu suất 95-97%.

Lipase từ Rhizopus: R arrhizus, R javanicus, R niveus, R delemar R.

arrhizus lipase có khối lượng phan tử 43KDa va điểm đăng điện ở pH 63,hoạt động ở pH tối ưu 5 - 7 và nhiệt độ tối ưu là 30 - 45°C

Lipase từ Pseudomonas: khỗi lượng phân tử 29KDa và điểm dang điện ở pH5.8 và pH tối ưu là 6,5 — 8,5 Chúng hoạt động và ôn định ở pH kiềm, đượcsử dụng trong chất tay rửa

Enzyme lipase Porcine Pancrease được tách ra từ tuyến tụy của lợn, đây lànguồn quan trọng để thu nhận enzyme lipase và lipase cũng là enzyme được phân lậpđàu tiên từ nguồn này (Simon và cộng sự, 1997)

1.2.3 Cấu trúc hóa học của enzyme lipase Porcine Pancrease (LPP)Cau trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định:

Vùng N — terminal là một mắt lưới của xoắn a và các sợi song song ÿ, làđoạn amino acid 1 — 336 Bộ ba xúc tac Ser, Asp va His lan lượt ở tại vị tri

N-TerminalDomainActive Site

C-TerminalDomain

Hình 1.2: Cấu trúc lipase và mô hình trung tâm xúc tác cua chúngCấu trúc tinh thé của enzyme LPP có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác.Vi trí của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác Vùng võng rộngnhất trong số các vùng võng được hình thành là do cau nỗi disulfide giữa Cys”? vàCys””” Một võng khác được hình thành bởi phần 76 — 85 (gọi là “nap”), thuộc vùng N— terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt động.Nap được mở 6n định bởi các liên kết hydro giữa nap và colipase Khi nap này mở, chophép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động (David Behnke và cộng sự, 1994)

Hình 1.3: Mô hình đóng và mở cua nắp trong lipase

1.2.4 Tính chất của enzyme lipase Porcine PancreaseEnzyme lipase LPP là một protein hình cầu bao gồm một chuỗi đơn của 449amino acid, với khối lượng phân tử khoảng 50 — 52 kDa (Munishwar và cộng sự,

2012)

Tính chất vật lý của lipase chủ yếu phụ thuộc vào các yếu tô như vị trí của cácacid béo trong mach glycerol, chiêu dài chuỗi các acid béo và mức độ bão hòa của acidbéo Những tính chất này cũng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng và cảm quan của mộttriglyceride nhất định Nhiều lipase hoạt động trong các dung môi hữu cơ, xúc tác chophản ứng este hóa Hoạt động lipase thường phụ thuộc vào diện tích bề mặt và điều

kiện phản ứng nhẹ nhàng Một cuộc khảo sát bởi Linko và Wo trên lipase thương mại

cho kết quả lipase thu nhận từ nắm mốc Aspergillus có tinh chọn lọc cao đối với cácacid béo chuỗi ngắn và rượu đối với C rugosa lipase là acid propionic, acid butyric,butanol, pentanol và hexanol, đối với M Miehei và R arrhizus lipase là các acid béo

chuỗi dài và acetate (Abdul Hameed và cộng sự, 2009)

So với các loại enzyme lipase khác, enzyme LPP có hoạt tính tương đối thấp

Hoạt tính của enzyme lipase được xác định thông qua hoạt độ (độ hoạt động) của

enzyme, bằng cách xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo

thành trong phản ứng.

Có rất nhiều định nghĩa vẻ hoạt độ của enzyme, nhưng thông thường hoạt độcủa enzyme được định nghĩa như sau: hoạt độ của enzyme là lượng enzyme chuyểnhóa một micromol cơ chất hoặc một micromol sản phẩm tạo thành sau một khoảng thời

gian phản ứng tại một nhiệt độ và pH xác định Kí hiệu: U.

pH của môi trường có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởngđến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền protein của enzyme.Enzyme LPP thể hiện hoạt tính cao nhất tại môi trường pH kiểm, trong giới hạn 73 —90 Với cơ chất là dầu oliu, pH tối ưu cho hoạt động của LPP nằm trong giới hạn là 7,5— 9,0; với ethyl acetate, pH tối ưu là 7,5

Enzyme lipase LPP cũng có một giá trị pH đăng điện nhất định pHạ;‹ củaenzyme là một thông số có ảnh hưởng đáng kế đến hiệu suất cô định của enzyme lênchất mang LDHs.

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạnxác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bên, chưa bị biến tính Nhiệt độ tối ưu cho

hoạt động của LPP là 35 — 45°C Với cơ chất là triacylglycerol, LPP thể hiện hoạt tính

cao nhất khi nhiệt độ năm trong khoảng 35 — 45°C, pH dao động từ 6.7 — 7,5

Bang 1.5 Các yếu to ảnh hưởng đến hoạt tinh của lipse từ các nguôn khác nhau

Nguồn gốc pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu (°C)Bacillus sp FHS 8,0 37

Bacillus coagulans BTS-3 8,5 55Salinivibrio sp SA-2 75 50Acinetobacter radioresistens 7,0 30Enterobacter agglomerans 7,0 30Rhizopus oryzae 75 35Aspergillus oryzae RIBI28 5.5 40Penicillium candidum 90 35Candida rugosa 6,5 30

1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzyme LPPKhi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động (vùng ky nước), nó đivào tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser152, His263 và Asp176 Lúc này, bộ ba xúc tác sẽthực hiện phản ứng thủy phân Bộ ba được định hướng khi một trong số các nguyên tửoxy ở phan cuối của Asp176 liên kết với một nguyên tử nito trong vòng Histidin bangliên kết hydro, giúp cho His263 được định vi để nguyên tử nito khác của nó tạo liên kếthydro với nhóm hydroxyl của Ser152 Liên kết hydro thứ hai này kéo hydro ra xa từliên kết cộng hóa tri với oxy của nó một cách tương đối, với định vị này thì enzyme sẵnsảng để hoạt động

co |ri ice Acyl-Enzyme8

( O—R2 4 C Intermediate

^ R—+-Ở—n:2Ot, ¬ 0 fy) 0

a Asp i ( p=! Asp

Ifis Ser lils

D CHình 1.4 Co chế thủy phân dâu của enzyme lipaseBước đầu tiên của phản ứng xảy ra dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin vàcủa cacbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser152 Tác nhân ái nhân là nhómOH của serin mang điện tích âm tấn công vào trung tâm tích điện dương của cacbonglycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa Cacbon glycerol thứ nhất và Oxy của este yếuđi Oxy trong liên kết este trở thành nhóm linh động (leaving group) và nó được thêmmột proton H” vào từ nhóm OH’ của Ser152 để trung hòa điện tích âm của nó Khi oxynhận được H”, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và hoàn toàn tự do.Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxy của Ser152, tuy nhiên liênkết này phải bị phá vỡ để enzyme duy trì chức năng của nó

Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyển củadiglyceride từ nửa đang chứa glycerol Để giải phóng ra phân tử glycerol, cần mộtnhóm hydroxyl dé liên kết với cacbon đâu tiên của glycerol và một ion H* để thêm mộtproton trở lại vào oxy của Ser152 Một phân tử nước ở môi trường ngoài cung cấp cácthành phan can thiết này Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân ly thành H*

và OH” Do sự hình thành câu nối hydro giữa H* với OH' của hai phân tử nước khác

nhau, ion hydronium (HzO”) được hình thành lon hydronium có một momen lưỡng

cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhân lên cacbon glycerol đầu tiên Thờiđiểm này, oxy của Serl52 rời khỏi nhóm Chuỗi bên cạnh tích điện âm của Ser152nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H” từ nước Lúc này, sản phẩm diglycerideđược hình thành Liên kết hydro giữa nitơ thơm của His263 và nhóm hydroxyl trênSer152 được phục hôi trở lại và trở về cau trúc ban dau của nó, sẵn sàng cho phản ứng

khác.

ụ% z-x= \°

x`⁄Z ¬"„n9 | oO #¬⁄o

=z

lintel ||lộ

lộlộ

Hình 1.5 Các bước xúc tác cho phan ứng thủy phân cua enzyme lipase

1.2.6 Ung dụng của enzyme lipaseLipase có nhiều ứng dung trong công nghiệp như: chat tay rửa, trong thực phẩm,dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy Lipase được sửdụng để tạo ra các loại hương liệu tong hợp hoặc tự nhiên từ thực vat dé làm nước hoa

thông qua phản ứng este hóa.

Do khả năng thủy phân chất béo của lipase nên ngày nay lipase được dùng trongbột giặt để thuỷ phân các vết dầu mỡ trên quan ao, chan ném trong điều kiện nhiệt độthấp và pH cao với những chất hoá học có hoạt tính bề mặt Trong công nghiệp giấy,sáp và các triglyceride gây trở ngại cho quá trình sản xuất Do vậy, việc loại bỏ các

chất này là rất cần thiết Hiện nay, lipase được coi như một tác nhân sinh thai dé loại bỏ

các tạp chất trên

Trong những năm gần đây enzym ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãitrong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh như: Metoprolol,1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy]propan-2-ol được sử dụng dé điều

tri cao huyết áp và đau thắt ngực (đau ngực), loạn nhip tim, đau nửa đầu và các rối loạn

khác liên quan đến thần kinh giao cảm

Bang 1.6 Các lĩnh vực ung dung cua enzyme lipase

Linh vuc Sự hoạt động của enzyme Sản phẩm hoặc ứng dụngChat tây rửa Thủy phân các chât béo Loại bỏ vết dâu từ vải

Sản xuất bơ sữa Thủy phân sữa, làm chín phô | Tao hương vi trong sữa, phô

mai, biến đối mỡ động vật mai và bơSản xuat bánh Cải tién hương vị và tăng han | Các sản pham bánh

Mỡ và dâu Chuyến este, thủy phân Bơ cocoa, margarine, các acid

béo, glycerol, mono- vadiglyceride

Hóa chat Lựa chọn đồng phân, tong hop | Các khôi đồng phân đôi xứng,

các hóa chấtMỹ phẩm Tổng hợp Sản phẩm thé sữa, kem bôi, tamThuộc da Thủy phân Các sản phâm thuộc da

Giây Thủy phân Giây chat lượng caoDược phâm Chuyên ester và thủy phân Các lipid đặc biệt, thuốc trợ

tiêu hóa,

Thực phẩm ăn kiêng | Chuyên ester Các thực phẩm ăn kiêngTrang trí thực phẩm | Cải tiễn chat lượng Xốt và kem trang trí,

13 Enzyme lipase cố định

1.3.1) Dinh nghĩa

Enzyme cô định (enzyme không tan) là những enzyme bị giữ hoặc được cô địnhtrong một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bìnhthường, vẫn giữ được khả năng xúc tác, có thể sử dụng lặp lại nhiều lần

1.3.2 Tính chất enzyme lipase cỗ địnhTheo kết quả nghiên cứu của các tác giả về enzyme cô định, nhìn chung enzymecô định đa số đều có hoạt tính thấp hơn so với enzyme tự do, cụ thé Li Yanjing và cộngsự (2009) đã cố định enzyme lipase Porcine pancreas lên vật liệu xốp SBA — 15 dạngsợi để thủy phân triacetin Kết quả cho thấy hoạt tính của lipase cố định giảm nhiễu,

chỉ đạt được 40% so với hoạt tính của lipase tự do.

Nguyên nhân làm cho hoạt tính của enzyme cố định giảm là do:- Khi enzyme gan lên chất mang, cau trúc của enzyme bi thay đổi, trung tâm

hoạt động của enzyme có thé bị che khuất, làm cho khả năng tiếp xúc củaenzyme và cơ chất giảm

- Enzyme bị che chăn bởi chất mang, làm cho khả năng tiếp xúc giữa enzymevà cơ chất giảm, dẫn đến hoạt tính của enzyem cô định giảm Trong phươngpháp cố định băng liên kết cộng hóa tri, thường có chất lạ sinh ra do một số

chất kết hợp với nhau, làm enzyme bị biến tính một phân, dẫn đến hoạt tính

enzyme cô định giảm.- Do sự keo tụ của protein, làm cho cầu trúc của enzyme bị thay đôi làm cho

enzyme giảm hoạt tính.

Phần lớn các nghiên cứu cho thay enzyme cô định có tính 6n định với nhiệt độva pH cao hơn so với enzyme tự do, cụ thé theo nghiên cứu của Li Yanjing và cộng sự,2009 cô định enzyme lipase Porcine pancreas lên vật liệu xốp SBA — 15 dạng sợi đểthủy phân triacetin Nhiệt độ tối ưu của enzyme tự do ở 35°C, còn với lipase cố định,

nhiệt độ tối ưu cao hơn (45°C) Tai 50°C, hoat tinh tuong đối của lipase tự do chỉ đạt

50%, trong khi đó, hoạt tính tương đối của lipase cô định là 80% Điều đó chứng tỏenzyme lipase cố định có khả năng chịu nhiệt tốt hơn so với lipase tự do.

1.3.3 Cơ chế cỗ định enzyme LPP lên chất mang LDHsEnzyme lipase cô định lên hydrotalcite thông qua ba cơ chế:- enzyme hấp phụ lên bé mặt của hydrotalcite

- enzyme trao đối với các anion xen giữa các lớp hydrotalcide- enzyme đi vào lớp xen giữa của LDHs nhờ tái cau trúc của LDHs đã được

nung bởi hiệu ứng “trí nhớ”.

Sự hấp phụ bề mặt liên quan đến tính chất bề mặt chất mang, nhờ đó enzymebám được trên bé mặt chat mang: điện tích bề mặt, độ xốp, độ thô ráp

Quá trình trao đổi anion của LDHs chủ yếu chịu ảnh hưởng bởi các anion cânbang điện tích trong lớp xen giữa và mật độ điện tích của lớp màng

1.3.4 Các yếu to ảnh hưởng đến quá trình cỗ định enzyme LPP lên LDHspH có ảnh hưởng lớn đến quá trình có định của enzyme lên LDHs Khi pH củamôi trường chứa enzyme cố định lớn hon pH,,, của LDHs, bề mặt của LDHs sẽ mang

điện tích âm, lúc này, enzyme và LDHs có cùng điện tích âm Vi vậy, trong khoảng pH

cao hon, enzyme sẽ bị day ra khỏi bề mặt LDHs Khi pH của môi trường chứa enzymecô định nhỏ hơn pH;; của LDHs, bề mặt của LDHs sẽ mang điện tích dương, lúc này,enzyme va LDHs mang điện tích trái dấu, tạo điều kiện cho enzyme hấp phụ trên bềmặt LDHs và enzyme trao đổi với các anion của LDHs (Lee Dong Geun và cộng sự,

2006.

Tuy nhiên, pH của môi trường quá thấp hoặc quá cao so với pH;; của LDHs,quá trình cỗ định của enzyme lên LDHs không hiệu quả, vì: khi pH môi trường quáthấp, cầu trúc của LDHs bị sụp đỗ, hư hỏng: khi pH môi trường quá cao, xảy ra sựcạnh tranh của OH' với enzyme, vì vậy khả năng hấp phụ và trao đối của enzyme với

LDHs giảm.

Zeng Hong-yan và cộng sự, 2009 đã cô định lipase từ Saccharomyces cerevisiaelên hydrotalcite Mg/AI cho việc sản xuất dầu diesel sinh học Nhiệt độ cố định được

khảo sát từ 25 — 80°C Kết qua cho thấy: nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự cố định củaenzym lên LDHs, nhiệt độ tối ưu cho lipase cô định lên chat mang là ở 30C, hoạt tính

tương đối của lipase có định dat giá trỊ cao nhất trong khoảng nhiệt độ từ 30 — 35°C

Điều này có thể là do: ở nhiệt độ 30 — 35°C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của

lipase.

Các nghiên cứu cho thấy khi thay đổi tỷ lệ MÌ/ MÌ” lớp hydroxyt đều ảnhhưởng đến quá trình cố định của enzyme cũng như sự hấp phụ của các anion lên LDHs.Khi tăng tỷ lệ M” / M'", mật độ điện tích của lớp hydroxyt thay đổi, điện tích của lớphydroxyt có xu hướng chuyên sang điện tích âm, do nồng độ MIII giảm bởi sự thay thémột MIII băng một MII, do vậy sự chênh lệch điện tích của các lớp hydroxyt vàenzyme cũng như các anion không xa, vì vậy quá trình cô định của enzyme cũng nhưsự hấp phụ của các anion giảm dần khi tăng tý lệ M 7M” (Lei Lin và cộng sự, 2010)

LDHs có hiệu ứng “trí nhớ” nên chúng có các đặc tính thuận lợi hơn cho việc cỗ

định enzyme so với LDHs chưa nung.

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của kích thước hạt đến quá trình cô định của

enzyme cũng như sự hấp phụ của các anion cho thấy: vật liệu có kích thước hạt càng

nhỏ thì sự cô định của enzyme và hấp phụ của các anion lên LDHs càng lớn, là do: hạtcó kích thước càng nhỏ thì diện tích bề mặt càng lớn, dẫn đến khả năng tiếp xúc củaenzyme và các anion với vật liệu càng lớn và yêu cầu thời gian khuếch tán ngăn hơn déđạt trạng thái cân bằng của hấp phụ (Hong — yan Zeng và cộng sự, 2009)

14 Vat liệu hydrotalcite (LDHs)

1.4.1 Dinh nghĩa

Hydrotalcite là vật liệu lớp mang kép có nguồn gốc khoáng sét thường gặp trong

tự nhiên, là vật liệu thân thiện với môi trường Chúng là hỗn hợp của các hydroxyt của

kim loại hóa tri II và kim loại hóa tri HI Các kim loại hóa tri HH, II phối hợp với các

nhóm hydroxyl tạo thành các lớp bát diện mang điện tích dương Để cấu trúc đượctrung hòa điện tích, các anion hydrat hóa được đan xen vào khoảng trống giữa hai lớp

Công thức tong quát của hydrotalcite có dạng: M cx) Nx" (OH)2Xx/m” mH,0,

trong đó M là các kim loại hóa tri II: Mg””, Ni”, Zn””, Mn**, CoTM*, Fe”; N là các kimloại hóa trị II: AI”*, Fe**, Cr*, Co” ; X là các anion vô cơ hoặc hữu cơ đan xen vàokhoảng trồng giữa hai lớp bát diện: NO, SO,”, CO3”, oxalat, phenolate, cacboxylat,

Tính chất đặc biệt của LDHs là các anion xen giữa hai lớp hydroxyt có khả năng

trao đôi với các anion vô cơ hoặc hữu cơ khác Độ dày của lớp anion giữa hai lớp

hydroxyt được quyết định bởi kích thước của anion Tùy theo điều kiện điều chế, cóthé thay đổi được lớp điện tích dương của lớp màng và pH của LDHs băng cách lựa

chọn tỷ lệ kim loại hóa tri II / hóa tri III thích hợp, hoặc sử dụng các kim loại khác

nhau trong thành phan vật liệu LDHs có diện tích bề mặt lớn, khả năng trao đối anioncao và 6n định đối với nhiệt độ

LDHs đã được nung có một tính chất đặc biệt là chúng có khả năng tái cầu trúc

trở lại, gọi là hiệu ứng “trí nhớ” Hiệu ứng “trí nhớ” có nghĩa là: bình thường LDHs là

những lớp hydroxyt song song xếp chồng lên nhau Khi LDHs được nung dưới nhiệtđộ 200°C, chỉ có nước trên bé mặt và nước xen giữa của LDHs bị mat di; gitra 250 va450°C, cả CO, và nước bị tách ra khỏi vật liệu Tai 450 — 500°C, cau trúc lop cuaLDHs bị mat di và tao nên các hỗn hợp oxide kim loại hoạt động cao với sự ồn địnhnhiệt độ, diện tích bề mặt lớn, cấu trúc tinh thể nhỏ, có tính 6n định cao đối với cácđiều kiện khắc nghiệt Các sản phẩm đã nung nay có thé được tái cau trúc lớp trở lạinhư ban dau bang cách hút nước và hấp phụ các anion khác nhau Tuy nhiên, nhiệt độnung không được quá 800°C, vì nếu nung LDHs quá 800°C thì LDHs sẽ không tái cautrúc trở lại được Nhiệt độ nung LDHs phải đủ cao dé đây nước va CO; ra khỏi vật liệu,nhưng đủ thấp cho việc tái cầu trúc trở lại

Như vậy, LDHs đã nung có các đặc điểm tốt hơn LDHs chưa nung 1a: (1) diệntích bề mặt tăng, do đó độ xốp tăng: (2) nước và các anion ở lớp xen giữa ít hơn, tạođiều kiện thuận lợi cho quá trình cô định của enzyme cũng như các anion khác thế vàodễ dàng hon Đây cũng là cơ chế cố định của enzyme lên LDHs

reconstruction — T Ly,

using memors EEE /V”mg ory we ae

effectcalcination

Hình 1.7 Sơ do tái cầu trúc hydrotalcite

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUNguyên liệu và hóa chất

2.1.1 Dau hạt bụp giấmHạt bụp giam được thu nhận từ tinh Phú Yên, được cung cấp bởi công ty Dược

1W2.

Dau hạt bụp giam được thu nhận băng phương pháp trích ly dựa trên đặc tínhhòa tan tốt của dầu thực vật trong các dung môi không phân cực như hexan, petroleumether, dicloetan, két hợp với sự chênh lệch nông độ bên trong nguyên liệu và dòng

chảy bên ngoài nguyên liệu.

Bang 2 1 Thành phan dâu hạt bụp giảmSTT CHÍ TIỂU ĐƠN VỊ | KÉT QUÁ

[_ | Hexadecanoic acid methyl ester C16:0 % 19,1]2 | Octadecanoic acid methyl ester C [8:0 % 3,653| Trans — 9 — Octadecenoic acid methyl ester C18: l % 0,924 | Cis— 9— Octadecenoic acid methyl ester C18:1 % 35,85 Cis — 9, 12 — Octadecandienoic acid methyl ester C18:2 % 39,06 | Octadecatrienoic acid methyl ester C18:3 % 0,797 | Eicosatetraenoate methyl ester C20:4 % 0,288 | Docosaenoic acid methyl ester C22:1 % 043

2.1.2 Chế phẩm enzyme lipase Porcine Pancrease (LPP)Enzyme LPP được sử dung dưới dang chế pham dạng bột, thu được từ tuyến tụylợn do hang Sigma (Mỹ) cung cấp Chế phẩm có hoạt tính riêng là 158 U/mg protein,

hàm lượng protein là 22,89% (w/w).

Một đơn vi hoạt tính riêng cua enzyme (U) được định nghĩa là lượng protein của

enzyme giải phóng ra một pmol acid béo từ sự thủy phân co chất dau bụp giấm trong

thời gian | giờ tại pH = 7,7, nhiệt độ 37°C.