Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sử dụng Enzyme Lipase CANADIDA RUGOSA xúc tác cho phản ứng Transester hóa dầu cá tra

NHIEM VU VA NOI DUNG: — Đánh giá nguyên liệu mỡ cá tra va enzyme lipase— Khảo sát quá trình transester hóa mỡ cá tra với methanol sử dụng enzyme lipase Candida rugosa làm xúc tác — Đánh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

s8

NGUYEN THỊ TUYẾT NHƯ

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME LIPASE CANDIDARUGOSA XÚC TAC CHO PHAN UNG TRANSESTER

HOA MO CA TRAChuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm — Đồ UốngMã số: 60540101

TP HO CHÍ MINH, tháng 12 năm 2014

TRUONG ĐẠI HỌC BACH KHOA - DHQG-HCMCán bộ hướng dẫn khoa học: TS PHAN NGỌC HÒA

Cán bộ nhận xét 1: TS NGUYEN THẢO TRANG

Cán bộ nhận xét 2: TS PHAN TẠI HUẦN

Luan văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại học Bách Khoa, DHQG Tp.HCMngày 14 tháng 01 năm 2015

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:I _ PGS.TS LE VĂN VIỆT MAN

2 T§.NGUYÊN THẢO TRANG3 T§.PHAN TAI HUAN

4 TS.TRINH KHANH SƠN5 TS VÕ ĐÌNH LE TAMXác nhận cua Chu tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập — Tự do — Hanh phúc

oOo oOo

NHIEM VU LUẬN VAN THẠC SĨ

Ho tên hoc viên: NGUYEN THỊ TUYẾT NHƯ MSHV: 12110210Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm & Đồ uống

I TÊN DE TÀI:NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME LIPASE CANDIDA RUGOSA XÚCTAC CHO PHAN UNG TRANSESTER HOA MO CÁ TRA

I] NHIEM VU VA NOI DUNG:

— Đánh giá nguyên liệu mỡ cá tra va enzyme lipase— Khảo sát quá trình transester hóa mỡ cá tra với methanol sử dụng enzyme

lipase Candida rugosa làm xúc tác

— Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm biodiesel thu đượcII NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 24/06/2013

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14/11/2014V CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: TS PHAN NGỌC HÒA

Tp Hô Chí Minh, ngày tháng năm 2014CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

PHAN NGỌC HÒA LE VĂN VIỆT MAN

TRƯỞNG KHOA

(Họ tên và chữ ký)

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, bên cạnh sự nô lực hết mình củachính bản thân, tôi còn nhận được những ý kiến đóng góp hết sức quý báu và sựgiúp đỡ, động viên nhiệt tình của Quý Thay/Cé, gia dinh cung cac ban Tuy nhién,với kién thức có giới han nên tôi không thé tránh khỏi những sai sót Kính mongQuý Thây/Cô góp ý và sửa chữa dé luận văn được hoàn thiện hon.

Với tam lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:Cô Phan Ngọc Hòa, giảng viên trường Đại học Bách Khoa, đã hướng dẫn vàtruyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn từ lý thuyết đến thực nghiệm và theosát tôi trong suốt thời gian dài thực hiện luận văn, đồng thời hỗ trợ một phân kinhphí để tôi hoàn thành luận văn nảy

Cô Nguyễn Thị Nguyên, giảng viên trường Đại học Bách Khoa, đã giúp đỡ vàtạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tại phòng thí

nghiệm.

Quý Thầy Cô đang công tác tại Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa KỹThuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa đã tạo điều kiện tốt để tôi hoàn thành

luận văn.Cac bạn sinh viên, học viên cao học cùng phòng thí nghiệm Cong nghệ thực

phẩm 1, trường Đại học Bách Khoa đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình làm

luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Mẹ, người thân trong gia đình và bạnbè đã động viên, cô vũ tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập

và thực hiện luận văn.

TP Hô Chí Minh, ngày 29 tháng12 năm 2014

Người viét

NGUYÊN THỊ TUYẾT NHƯ

Enzyme lipase Candida rugosa được thu nhận từ nam Candida rugosa Lipasegiữ vai trò quan trọng trong quá trình phân giải chat béo thành các acid béo tự do,diacylglycerol, monoacylglycerol và glycerol khi tham gia vào sự chuyền hóa chấtbéo trong tế bào và chức năng của màng sinh học Không chỉ làm xúc tác cho phảnứng thủy phân, lipase còn xúc tác cho các quá trình chuyển hóa chất béo khác như

transester hóa, ester hóa và amine hóa Do đó, trong 10 năm qua các nhà nghiên cứu

trên thế giới quan tâm nhiều vào việc sử dụng các lipase như xúc tác sinh học để sảnxuất diesel sinh học

M6 cá tra là nguồn nguyên liệu lipid déi dào ở Việt Nam Với hàm lượng acidbéo không no cao, mỡ cá tra rất thích hợp để tổng hợp biodiesel Đã có nhiềunghiên cứu tổng hợp biodiesel từ mỡ cá tra sử dụng xúc tác hóa học: acid, base,oxide kết hợp sóng siêu âm Tuy nhiên chưa có công trình nghiên cứu nào sửdụng enzyme lipase làm chất xúc tác cho quá trình transester hóa mỡ cá tra

Trong luận van nay, chúng tôi tập trung nghiên cứu những van dé sau:1 Xác định một số tính chất hóa lý của nguyên liệu mỡ cá tra và hoạt tính của

enzyme Candida rugosa

- Mỡ cá tra có chứa 62% acid béo không bão hòa, chi số acid là 2,2 mg

KOH/g.

- Enzyme Candida rugosa có hàm lượng protein theo khối lượng của enzymelà 38,25%, hoạt tính và hoạt tính riêng lần lượt là 1064 U/mg enzyme và 2782 U/mg

protein.

2 Khao sát quá trình transeter hod mỡ cá tra bang methanol với xúc tác

enzyme lipase Candida rugosa

- Các yếu tố anh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa thành methyl ester của cácacid béo được khảo sát bao gom: ty lệ mol methanol : mỡ cá, tỷ lệ enzyme cỗđịnh/mỡ cá, nhiệt độ phản ứng, pH tối ưu của enzyme, hàm lượng đệm pH và thời

gian phản ứng.

tối uu là 2%, nhiệt độ phản ứng tối ưu ở 40°C, pH tối ưu là 7 với hàm lượng bổsung vào phan ứng là 10% Hiệu suất thu biodiesel sau 96 giờ tiến hành phản ứng

đạt 92,65%.

3 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm biodiesel thu được- Sản phẩm biodiesel thu được có thành phan FAME chiếm 98,94%; tỷ trong ở15°C là 0.8816 g/ml: không có nước và glycerine tự do, phù hợp với tiêu chuẩnbiodiesel sốc (BI00)(TCVN 7717:2007)

- Chỉ số acid của sản phẩm là 1,7 mg KOH/g cao hơn giá trị cho phép của tiêuchuẩn là 0,5 mg KOH/g

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sô liệu, kêt

quả nêu trong luận văn này đều là trung thực

Học viên thực hiện Luận văn tốt nghiệp

NGUYEN THỊ TUYET NHƯ

MUC LUC

Trang

MỤC LLỤC G S00 Họ re i

DANH MỤC BẢNG 6 c1 11 112v 911191111 5111110111 1111111 11v 1g net VDANH MỤC HÌNH G- E11 SE 91919191 3 5111919119 0 0111010111 11g11 cv viDANH MỤC TU VIET TAT 6 E1 E 9E E312 E1 ve reeredvii0909100007 |Chương 1 TONG QUANN 5-5222 S333 1 111115151515 51511 111515111101 T1 11111111 31.1 So loc vé enzyme 0) 8 3

LTD Dinh nghia 'Ỷ 3

1.1.2 Khối lượng phân tử và cau trúc không gian -. 55552 s+s+scscs+2 31.1.3 Cơ chất, chất hoạt hóa và chất ức c hỄ - ¿+ +6 k+sE5ESE2E2EEeEsEsEekekrersesed 5

1.1.4 Hoạt tinh ÏIDAS€ - - cọ nọ 6

1.1.5 Các nguồn thu nhận enzyme lipase - + - 2 2252 S2+£+S£s+E+Eezezeersred 8

LDS Từ động vậtL - - - cọ n re 8[.1.5.2 Từ thực VẬT HH re 91.1.5.3 TU Vi SIMD Val ad ẻ 9

1.1.6 Ung dung của enzyme lipase c.ccccscscssessssesesssesessesesessesesessssesessesesssessseeeeees 91.1.6.1 Trong tổng hợp chất hữu CO c.cecccccscscssssesssesesscsesesscsesesscsesesssseescssseeeees 91.1.6.2 Trong chuyén đổi sinh học trong môi trường nước - 91.1.6.3 Trong chuyển đổi sinh hoc ở môi trường hữu cơ -. - -: 101.1.6.4 Trong sự tong hop ester ccccccccccscssesssessssesessesesessesesessssesessesesessessseeeeees 101.1.6.5 Trong công nghiệp hóa dau cccccccccsessssssesesesessssssessesesessesssesseseseeseess 101.1.6.6 Trong công nghiệp dược và hoá Chat - + + 55+ ss+e+escscxee II1.1.6.7 Trong công nghiệp mỹ Pham - + 25552 S22E+E2£e+EvEezezxersred II

1.2 MG Ca II

1.2.1 Tình hình chế biến cá tra ở Việt Nam - «xxx kx 2x2 vEsEskekserersesed 11

Trang I

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất biodiesel hiện nay -. - +: 16

1.4 Phương pháp tong hop biodiesel c.ccccccccsessssessscsssscscssscssssescssscssesescssscesssesees 171.4.1 Phan ứng transeter hóa dầu MO cccccccsecscsessesesessesesessesssessesesesseseseeseseeeeeeees 181.4.1.1 Xúc tác hóa hỌC - 1111900310000 1111111011 111111 111v x54 181A.1.2 XUC CAC /AI 1 20

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phan ứng transeter hóa sử dung xúc tác lipase 21

1.4.2.1 Loại ancol và tỷ lệ mol ancol/dẫu mỡ -s s + s+x+£sEsEsksesersesed 221.4.2.2 Hàm lượng XÚC ta << 00.0 ke 231.4.2.3 Thời gian phan Ứng - - << 00H ng ke 231.4.2.4 Nhiệt độ phản Ứng - - c0 ng ke 231.4.2.5 Hàm lượng của đệm - - << ng ke 241.4.2.6 Hàm lượng của nước và acid béo tự đO s1 vn 241.4.2.7 Mức độ khuấy trộn - - + 25212 E2 1 1 1 1515111121 11111 131101111 xe 241.4.2.8 Ham lượng của glycerol œ5 - + 1 1001119993011 99 ng ke 25Chương 2 NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 5-2-5 5255+s+E£E+E+escsz 26DL Vat WSU oo 13 26

2.1.1 Nguyên liệu và hóa Chat ¿+2 25222223 EEEEEEEEEEEEEErkrkrrrrrrree 26;8 201157 272.2 Sơ đồ nghiên CUU - ¿+ 2S SESE9EEE E93 1231111211111 2111111111111 272.3 Bồ trí thí nghiệm ¿E52 SE 2E 1 1515 1 1 1515151111 11111 1111011111111 11 1 cy 282.3.1 Xác định tinh chất của nguyên liệu và ENZYME 2 5555252 s55+2 282.3.1.1 Xác định tính chất của mỡ cá tra ¿c s + kxxEEsESESESE£vEsEsErkeeseree 28

2.3.1.2 Xác định tính chất và hoạt tinh enzyme Candida rugosa 29

2.3.2 Khao sát quá trình transester hóa mỡ cá sử dụng xúc tac enzyme 292.3.2.1 Khao sát ảnh hưởng cua ty lệ methanol : mỡ cá -««- 292.3.2.2 Khao sát ảnh hưởng của ty lệ enzyme/mỡ cá s«« «s52 302.3.2.3 Khao sát ảnh hưởng của nhiỆt dO - 5S vn 302.3.2.4 Khao sát ảnh hưởng của pH - <5 G0 ng ke 312.3.2.5 Khao sat ảnh hưởng của ham lượng đệm pH - «<< «<< «<2 31

2.3.2.6 Khao sát hiệu suất phan ứng theo thời gian ¿255555552 322.3.3 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng sản phẩm của biodiesel 32

3.1.2.1 Hàm lượng protein của enzyme Candida rugosa 55+ 383.1.2.2 Hoạt tinh và hoạt tính riêng cua enzyme Candida rugosđ 383.2 Khao sat quá trình transester hóa mỡ cá sử dụng xúc tac enzyme 393.2.1 Khao sát ảnh hưởng cua ty lệ methanol : mỡ cá - +s««e++++s 393.2.2 Khao sat ảnh hưởng cua tỷ lệ enzyme/mỡ Ca - <5 5S ssss 40

Trang til

3.2.3 Khao sát anh hưởng của nhiỆt đỘ SH 1 ng 4I3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pHH - << 1009 nen 4]3.2.5 Khao sát ảnh hưởng của ham lượng đệm pH - «55 +5 s«<<<+++s 42

3.2.6 Khao sát hiệu suất phản ứng theo thời gian - 2 2552252 ss+xseecs2 433.3 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng sản phẩm của biodiesel - 43Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ + + 2S SE rkrkrkrkeerree 45AL KẾT luận - c1 9191919111 5 1111110111 1H11 11T T11 ng ngu rep 454.1.1 Tính chat của mỡ cá tra và enzyme lipase Candida rugosa - - 45

4.1.2 Xác định các điêu kiện tôi ưu cho phản ứng transester hóa mỡ cá tra vớienzyme lipase CANdIAA PHO S( << << 1010100010 re45

4.1.3 Chất lượng của sản phẩm biodiesel thu được từ phản ứng transester hóa mỡ

cá tra VỚI ENZYME ÏIDAS€ - - << 0 nọ nọ re 45

4.2 Kiến nghị - c1 S1 1 3 15151111 11112111111 111111110101 01 1101011111 00101111111 rkg 45TÀI LIEU THAM KHẢO G-G- S131 31198 1E 1111129 11111 g gxgvseree 47

PHU LLỤC 52522221 1915 1 1231151151111 1111111 1101111110111 15 011111011111 11 111110 y6 |

DANH MUC BANG

Trang

Bang 1.1 Khối lượng phan tử của một số lipase (Fadiloglu, 1996) [15] 3Bang 1.2 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến lipase [20] -5-555 55552 6Bảng 1.3 Một số nghiên cứu sử dụng phế liệu cá tra và cá basa 12Bảng 1.4 Thành phan các acid béo trong mỡ cá tra [ 1Ñ] -. - 2 s5555+5s552 13Bang 1.5 Cac chi tiéu chat lượng cua diesel sinh hoc sốc (B100) [II] 15Bảng 1.6 Một số nghiên cứu tong hợp biodiesel ở Việt Nam -. - l6Bảng 1.7 Hiệu suất chuyển hóa transester ứng với từng enzyme cô định 17Bang 3.1 Một số tính chất hóa lý của mỡ cá tra ¿2 + 2 s+s+sz£s+x+ezzezesrsred 37Bảng 3.2 Thanh phan acid béo trong mỡ cá tra -.- ¿5-52 2522222 s+£+£zzezxsrered 37Bang 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol methanol : mỡ cá -. - 2 2552 5s55¿ 39Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tỷ lệ enZyme ¿- - 22 S222 ‡EEeEEvterererrrrerered 40Bang 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ - + 2 555252 5s+s+sscs2 4]Bang 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của PH eeececescsssesscsesessesesesessesesscseseeseseseees 4]Bang 3.7 Kết quả khảo sát anh hưởng của ham lượng đệm pH - 42Bảng 3.8 Kết quả khảo sát hiệu suất phan ứng theo thời gian -<- 43Bang 3.9 Thanh phan methyl ester trong biodiesel từ mỡ cá . - 4Bang 3.10 Các tính chất hóa lý của biodiesel từ mỡ cá tra và biodiesel gốc 4

Trang v

DANH MUC HINH

Trang

Hình 1.1 Câu trúc không gian của lipase Candida rugosa [15] -. -5- 4

Hinh 1.2 Ca tra 6 Viet Nam ou 11

Hình 1.3 So đồ phản ứng transester hóa triglyceride và acid béo với xúc tac lipase

(An Fei Hsu và cộng sự, 2002) | Ï2 | ĂĂ S113 0111 ng và 20Hình 1.4 Phản ứng transester hóa từng giai đoạn - 5G Ă BS se esee 21Hình 2.1 Enzyme lipase Candida rugosa c5 00300811199 0 1kg và 26

Hình 2.2 Sơ đồ nội dung nghiên CUU - 22 252 2E+E+E££E£EeE£Eekererrrresererree 28Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn protein theo Bradford -2- +52 s+s+ssscs+2 38Hình 3.2 Hỗn hợp phản ứng sau khi ly tâm - - + 252525222 +e+e+e+ezerxrrrresee 39

DANH MUC TU VIET TAT

BSA Bovine serum albuminDa Dalton

kDa Kilodalton

DBSCL Dong băng sông Cửu Long

FFA Free fatty acid — acid béo tự doFAME Fatty acid methyl ester — methyl ester của các acid béo

GC Gas chromatography — sac ky khi

MG MonoglycerideDG DiglycerideTG TriglycerideSFA Saturated fatty acid — acid béo bao hoaMUFA Monounsaterated fatty acid — acid béo khong bao hoa donPUFA Polyunsaterated fatty acid — acid béo khéng bao hoa da

Trang vil

MO DAUTrong bỗi cảnh ngu6n năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt cũng như cácmối lo ngại về môi trường (đặc biệt là hiệu ứng nhà kính) do các loại động cơ sửdụng các nhiên liệu từ các nguồn năng lượng này gây nên, nhiên liệu sinh học đangngay cảng thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Biodiesel được điềuchế từ dẫn xuất từ một số loại dầu mỡ sinh học (dầu thực vật, mỡ động vật) thôngqua quá trình transester hóa băng cách cho phản ứng với các loại rượu mạch ngắn,ví dụ: methanol, ethanol Đề tăng vận tốc phản ứng, dẫn tới tăng hiệu quả quá trình,người ta sử dụng các loại xúc tác đồng thé, dị thé hoặc các loại xúc tác sinh học.Xúc tác hóa học sử dụng kiểm cần nhiều giai đoạn xử lý mới thu được dầu dieselsinh học như: xử lý bọt, tách glycerol, loại bỏ chất xúc tác và lượng nước thải kiềmkhá lớn Vì vậy, trên quan điểm vẻ tiêu thu năng lượng va bảo vệ môi trường, việcsử dụng xúc tác hóa học có những hạn chế Trái lại, enzyme không tạo bọt và có thể

ester hóa cả acid béo tự do và triglyceride trong một giai đoạn Xúc tác sinh học, cụ

thé là enzyme lipase có được các ưu điểm nhất định là điều kiện tiễn hành phản ứngôn hòa hơn, thân thiện với môi trường, giảm lượng chất thải độc hại ra môi trườngbên ngoài Vì vậy, các enzyme chính là xúc tác tiềm năng cho sản xuất quy mô công

nghiệp.

Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng enzyme lipase để xúc tác cho phản ứngtransester hóa các loại dầu mỡ khác nhau Zaks và Klibanov (1988) đã sử dụngenzyme lipase từ Candida rugosa dé thực hiện phan ứng transester hóa dầu đậunành, mức độ chuyên hóa cao nhất là 58,12% [49] Kaieda và cộng sự (2001) sử

dung lipase tự do từ Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Candida

rugosa xúc tac cho phan ứng transester hóa trên dau đậu nành ở 35°C, ty lệ mol 3:1,90 h, 150 rpm, hiệu suất đạt được 80% - 90% [25] Nie K.L và cộng sự (2006) sửdụng lipase từ Rhizopus arrhizus trong phản ứng chuyển ester dầu cọ với nồng độcơ chất khảo sát từ 3-50 g/l, tốc độ chuyển hóa ester đạt được cao nhất là 3,2mol/phút tại nồng độ cơ chất 25 g/l [38]

Hiện nay, nghề nuôi cá tra và công nghiệp chế biến cá tra đang là một ngànhchủ lực của Đông bang sông Cửu Long Mỡ cá là loại phụ phẩm của ngành công

nghiệp này và vân chưa được quan tâm sử dụng một cách hiệu quả Quá trình

transester hóa mỡ cá đã được khảo sát trong một số công trình nghiên cứu với cácchất xúc tác hóa học Nguyễn Hồng Thanh và cộng sự (2009) đã điều chế đượcbiodiesel từ mỡ cá basa bằng phương pháp transester hóa với methanol và xúc táckiềm kết hợp siêu âm ở tần số 35 kHz, hiệu suất phản ứng trên 90% [3] Lê Thi

Thanh Huong và cộng sự (2011) sử dụng xúc tác p-toluensulfonicacid trong phản

ứng methanol phân mỡ cá tra thì hiệu suất thu biodiesel đạt trên 98% [2].Nhằm tìm ra công nghệ tong hop biodiesel từ mỡ cá tra băng xúc tác sinh họcthân thiện với môi trường, ít tốn năng lượng mà vẫn bảo dam day đủ tiêu chuẩn củasản phẩm biodiesel gốc sinh học, chúng tôi sử dụng xúc tác là enzyme lipaseCandida rugosa làm xúc tac cho phan ứng transester hóa mỡ cá tra bang methanolvà khảo sát các yéu tố ảnh hưởng đến quá trình phản ứng

Trang 2

Chương 1 TONG QUAN1.1 So lược về enzyme lipase

1.1.1 Dinh nghiaEnzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) la enzyme xúc tac

thủy phân và tong hop các ester được hình thành từ triglycerol và các acid béo.Chúng có bản chất là protein Đặc tính kỹ thuật của lipase là hoạt động tại liên phadầu — nước [11]

1.1.2 Khối lượng phân tử và cấu trúc không gianKhối lượng phân tử:

Bang 1.1 Khối lượng phân tử của một số lipase (Fadiloglu, 1996) [15]

Vị sinh vật MW (kDa) Phuong phapP fluorescens 32.0 Gel filtrationBacillus spp 22.0 Gel filtration

SDS-PAGEA japonicus 155.0 Gel filtration

G candidum 53.0 Gel filtration

61.6 SDS-PAGEH lanuginosa 39.0 Gel filtration

SDS-PAGEP nitens 26.5 Gel filtration

SDS-PAGEC deformans 207.0 PAGES faecalis 20.9 Gel filtrationC cylindracea 67.0 SDS-PAGE

50.0 Gel filtration

Nhu các loại enzyme khác, các lipase đều có những tinh chất chung, songchúng cũng khác nhau về một số tính chất như: tính đặc hiệu cơ chất, mức độ phângiải cơ chất, khối lượng phân tử, thành phần acid amin và điều kiện hoạt động Sự

khác nhau này không những giữa các loài mà ngay cả giữa các chủng trong cùngmột loài.

Khối lượng phân tử của lipase dao động khá nhiều giữa các chủng vi sinh vậtphụ thuộc vào nguồn gốc sinh tổng hop ra chúng, khối lượng phân tử của chúngphân bố từ khoảng 12 đến hơn 1.000 kDa: lipase từ Bacillus Subtilis có khôi lượngphân tử khá thấp 19.348 Da (18 amino acid) [39], lipase từ Geotrichum candidumcó khối lượng phân tử khoảng 60 kDa, Aspergillus niger 97 kDa, Candida rugosasinh tong hợp ra 2 đồng phân là LipA (58 kDa) và LipB (62 kDa); lipase từ

Penicillium crustosum 29.300 Da, từ C.Paralipolytica 55.900 Da Bang sau cho

biết sự khác biệt về khối lượng phân tử của lipase có nguồn gốc khác nhau được xácđịnh bằng các phương pháp cụ thê

Cấu trúc không gian:

Hình 1.1 Cau trúc không gian của lipase Candida rugosa [15]Cũng như các loại enzyme khác, lipase cũng là một lưỡng cau tử bao gồm haithành phan: protein (apoenzyme), phi protein (coenzyme, ion kim loại, vitamine)được gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic khi nó liên kết chặt chẽ với phanprotein của enzyme bằng liên kết đồng hóa trị

Theo hình 1.1 Lipase Candida rugosa là một enzyme có cau trúc không gian

bậc ba với phan nap có khả năng đóng mo Dai L ở trung tâm có màu xanh nhạt va

Trang 4

phân cuối của dải L có kích thước nhỏ hơn là dai N mau xanh đậm Chuỗi xoắn ốcđậm tựa vào dải L có màu xanh lá đậm Cấu trúc đóng của nắp có màu vàng và cầu

tric mở có màu đỏ [15].

Trung tâm hoạt động của hau hết lipase bao gồm serine, một phân tử histidineva một amino acid (Asp hoặc Glu) Serine đóng vai trò như nhân cua lipase, namgiữa một dai B và một xoắn a Trong khi đó histidine và acid amine nằm ở bề mặtcủa serine Liên kết giữa ba cau tử trên có tính bền vững cao trong suốt quá trìnhlipase tham gia xúc tác kế cá sự có mặt của protease phân giải serine Hoạt động củalipase thủy phân triglyceride chủ yếu tập trung vào vị trí hoạt động của serine Oxycó trong nhân của serine kết hợp với triglyceride tạo thành khối tứ diện hemiacetal

ở trạng thái trung gian Khung ester của hemiacetal bị thủy phân và giải phóng

diglyceride Phần còn lại của cấu trúc trung gian, serine acyl ester phản ứng với

nước va tạo thành acid béo tự do (Petersen và cộng sự, 2001) [15].

1.1.3 Cơ chất, chất hoạt hóa và chất ức chếa) Cơ chất: Triglyceride hay mỡ động vật và dau thực vật là những nguồn cơchất chính của enzyme lipase Để phân tích hoạt tính của lipase người ta thườngdùng cơ chất là triglyceride được tinh sạch hoặc tong hợp Chang hạn như trioleintributyrin Các dạng triglyceride dễ dàng phân cắt bởi enzyme lipase hơn khi nóđược nhũ hóa kĩ và tạo thể nhũ tương với nước hoặc bơ

b) Chất hoạt hóa: Là chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme Các chấtnày có bản chất hoá học khác nhau, có thé là các anion, các ion kim loại hoặc cácchất hữu cơ có cầu tao phức tạp hơn Tuy nhiên mỗi chất hoạt hóa lại tác động hoạthóa ở từng mức độ khác nhau, có khi chất hoạt hóa cho loại lipase từ nguồn gốc nàylại không hoạt hóa lipase từ nguồn gốc khác Ví dụ như hoạt tính enzyme lipase từPseudomonas aeruginosa KKA-5 giảm 20-30% khi có sự xuất hiện của ion Na”,K*, Cu”, tuy nhiên khi có sự xuất hiện của Ca”” ủ trong 72 giờ thì hoạt tính enzyme

lipase lúc này tăng 56% [12].

c) Chất ức chế: Là chất làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme, hoặc trongmột số trường hợp nó làm ngăn chặn sự xúc tác Cơ chế hoạt động của các chất ứcchế này có thé được giải thích theo hai hướng:

(1) Chất kìm hãm protein được hấp phụ lên bề mặt và gây ra sự thay đốicác tính chất của bề mặt đó.

(2) Sự tác động qua lại trực tiếp của chất kìm hãm với lipase và cạnh tranhvới cơ chất

Các chất ức chế này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, hoặc làcác protein Khi tham gia phản ứng nó có thé làm thay đổi vi trí trung tâm hoạt độngcủa enzyme hoặc nó có thé tác động vào tính chất của bề mặt phân pha dau nước

[1].

Bang 1.2 Anh hưởng của các ion kim loại đến lipase [20]Nguồn gốc Chất hoạt hóa Chất ức chếVi khuẩn

Bacillus thermoleovorans ID-I Ca” ,Zn**Bacillus natto Na”, PO,° Ca”Staphylococcus aureus 226 Ca**,Mg* Mn**Staphylococcus aureus Ca**, Mn** Coban, Kẽm

Fe", Ni**, Cu”, HgSerratia marcescens 345 Mg” ,Zn”

Bacillus sp FHS Mg””, Ba”? Cu**, Co”*, Na*/Zn”?Acinetobacter sp CR9 Cu”,Mo”,Mg”,Zn”” Ca”

Acinetobacter baumannii BD5_ Mn**, Ca**, MgTM* Cu**, Zn**

Trang 6

định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác

định độ hoạt động (gọi là hoạt tính) cua enzyme Trong phan ứng có enzyme xúc

tác, sự hoạt động của enzyme được biéu hiện bang cach lam thay đổi các tinh chấtvật ly, hóa ly cũng như tính chất hóa hoc của hỗn hợp phản ứng Theo những biếnđôi đó có thé biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác địnhcơ chất bị mat di hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng Để xác địnhhoạt tính của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các

phương pháp vật lý hoặc hóa học Các phương pháp so màu, đo khí, đo độ phân

cực, đo độ nhớt, chuẩn độ được dùng pho bién trong nghiên cứu định lượng cácphản ứng enzyme Có thé chia ra ba nhóm phương pháp sau:

1) Do lượng cơ chất bị mat đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong mộtthời gian nhất định ứng với một nông độ enzyme xác định

2) Do thời gian cần thiết dé thu được một lượng biến thiên nhất định của cơchất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định

3) Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thuđược sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

s*_ Đơn vị hoạt tinh enzymeHội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốctế (hoặc đơn vi enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961 Don vi hoạt tính enzyme (U) làlượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mieromole (1mmol) cơ chấtsau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 U= Iumol sản phẩm = Iumol co chất (10° mol)/ phút

Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat) Katal là lượng

enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiệntiêu chuẩn

1 Kat = 6x10”U Và 1U=1/60x 10° Kat = 16,67 nKat (nanokatal)Don vị tự đặt: đơn vi hoạt tinh dựa vào su thay đối đặc tính hỗn hợp phan ứng,ví dụ sự thay đôi độ đục, độ nhớt, điều kiện phan ứng frong một đơn vi thời gian.Trường hop cơ chất và sản phâm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt

tính này.

Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động cần phảiđánh giá độ sạch của nó Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là

hoạt tính riêng.

- Hoạt tính riêng: của một ché pham enzyme là số đơn vị enzyme/ Img protein(U/mg) cũng có thé 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dich enzyme Thông thường hamlượng protein được xác định băng phương pháp Lowry Khi biết khối lượng phân tửcủa enzyme thì có thể tính hoạt tính phân tử

- Hoạt tinh phân tử: là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử

enzyme trong một đơn vị thời gian Hoạt tính phân tử lớn có nghĩa là phản ứng

được xúc tác xảy ra rất nhanh Như vậy, hoạt tính phân tử chính là khả năng xúc

tác: hoạt tính phân tử càng cao thi khả năng xúc tác càng lớn Vi dụ người ta xác

định được hoạt tính phân tử cao của một sỐ enzyme tinh khiét nhu catalase 5,6 x10°,acetyl - cholinesterase 3,0 x 10°, B-amylase 1,2 x 10°

Xác định hoạt tinh enzyme lipase: Enzyme lipase có thé được xác định hoạttinh thông qua phương pháp chuẩn độ, quang học, hoặc dùng bộ Kit

1.1.5 Các nguồn thu nhận enzyme lipase

1.1.5.1 Từ động vật

Ở người và động vật có xương sống, nhiều lipase kiểm soát sự thuỷ phân, sựhấp thụ, sự tạo thành chất béo và chuyển hoá lipoprotein Ngay từ năm 1923,Willstatter và Klemmen đã thu nhận enzyme từ tụy tạng heo nhưng đến 1996

Vergen mới tinh sạch hoàn toàn enzyme lipase nay Enzyme lipase từ tụy tạng là

enzyme lipase tốt nhất từ nguồn động vat Enzyme này hiện diện trong tụy tạngvà dịch tụy tạng Enzyme thu được khối lượng phân tử là 45 - 50 kDa KhoảngpH tối ưu cho enzyme nay là 7,0 - 9,3 Enzyme lipase nay hoạt động mạnh hơn khicó sự hiện diện của muối canxi Các acid mật và muối mật cũng có tác dụng làm

tăng hoạt tính cua enzyme lipase từ tụy tang do vay mà nó có khả năng nhũ hoa cơ

chất Nhờ đó tăng cơ hội tương tác giữa enzyme và cơ chất [1]

Lipase từ động vật ưu tiên xúc tác thủy phân tạo ra các acid béo với hơn 12

nguyên tử carbon và chủ yếu tan công vao vi trí C-1 của glycerol Lipase từ lợn baogồm một chuỗi duy nhất 449 acid amin và trọng lượng phân tử của protein là vaokhoảng 50 kDa Một loại khác của lipase từ động vật là lipase chiết từ dạ dày của

Trang Š

dé, cừu Những enzyme này ưu tiên xúc tác thủy phân acid béo chuỗi ngắn trongchất béo từ sữa, và đặc biệt được sử dụng trong việc tạo thành hương thơm của

phomat [15].1.1.5.2 Từ thực vat

O thuc vat, lipase được tim thay ở mô dự trữ của hat có dau, hạt ngũ cốc trongquá trình nảy mầm của hạt Hầu hết các lipase không hoạt động trong thời kỳ ngủdong, ngoại trừ lipase tìm thấy ở hạt đậu caston [1]

Enzyme lipase từ nguồn thực vật có nhiều trong các hạt dầu bao gồm: hạt đậunành, đậu phong, ngô, thầu dầu và hạt của các cây như cây mù tạt, cây cải dau, caybông, cây anh túc có thé được trích ly bang dung dịch aceton hoặc đệm thích hop[15] Trong những năm gân đây lipase còn có thể được chiết xuất từ gạo, một trongnhững loại thực phẩm quan trọng nhất cho con người (Prabhu va cộng sự, 1999)

1.1.5.3 Từ vi sinh vật

Một lượng lớn lipase trong công nghiệp được sản xuất từ các loại vi sinh vật:vi khuẩn, nam mốc, nam men Nói chung lipase từ vi khuẩn đều là nhữngglycoproteins, nhưng một số lipase vi khuẩn ngoại bao là lipoprotein Enzymelipase từ giống Rhizopus va Aspergillus Các loài vi nam có khả năng tao enzymelipase cao bao gồm: Aspergillus niger, A terreus, A oryzae, A fumigatus,

Penicilium chysogenum, P funiculosum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme,Fusarium vasinfectum va Alternaria alternata, Staphylococcus spp., Pseudomonasspp.,Chromobacterium spp., Achromobacter spp., Alcaligenes [41].

1.1.6 Ung dụng của enzyme lipase1.1.6.1 Trong tổng hop chat hữu cơ

Đây là một ứng dụng có ý nghĩa rất lớn trong ngành hoá học nói chung vàtong hợp chất hữu cơ nói riêng Enzyme lipase được dùng để xúc tác nhiều loạiphản ứng chuyển đôi hoá học, đặc hiệu vùng và đặc hiệu không gian

1.1.6.2 Trong chuyển đổi sinh học trong môi trường nướcEnzyme lipase chuyển hoá acyl thu từ loài Candida parapsilosis có thé dùngxúc tác sự tong hợp sinh học các acid béo trong môi trường hai pha nước va chatbéo Những cơ chất trong phản ứng này là những chất acyl (acid béo hoặc ester giữa

acid béo với gốc methyl) va hydroxylamine Sự chuyén hoá từ chat cho là ester chođến hydroxylamine (aminolysis) được xúc tác chon lọc hon khi so sánh với co chấtlà acid béo tự do Chính đặc điểm này làm cho enzyme lipase từ loài C parapsilosisxúc tac chon lọc có định hướng quá trình chuyển đổi sinh học trong môi trường

nước.

1.1.6.3 Trong chuyển đổi sinh học ở môi trường hữu coNgoài việc xúc tác ester hoá, các lipase còn xúc tác chuyên đổi ester hoá vàester hoá tương tác trong các dung môi hữu cơ với lượng nước thấp (Kazlaus kas va

Bornscheuer, 1998; Godberg va cộng sự, 1989), ứng dụng chính của các lipase

trong hoá hữu cơ là sự phân giải các hỗn hợp enantiomeric Có một vài nhóm phântử liên quan đến sự truyền tính trang dau hiệu làm gia tăng những căn bệnh di ứng,viêm là những lipid hay lipid analogues Sự truyền tín hiệu ở giữa và trong nội baoở sinh vật liên quan gần gũi với những loại lipid đơn lẻ như phosphateidylinositol,lipase cũng như photpholipase đều có thể được sử dụng để tổng hợp trên phạm vi

lớn.

Enzyme lipase hoạt động trong môi trường hữu co không có thành phan nướctự do đã thé hiện một số đặc tính đáng chú ý Với những đặc tính nay người ta đãthiết lập nên một hệ thống enzyme không cần dùng nước cho sự tổng hợp và biếnđối sinh học (Klibanoz, 1997)

1.1.6.4 Trong sự tổng hợp esterEnzyme lipase đã mang lại những thành công trong việc xúc tác để tổng hợpnên những ester mới Những ester được tạo bởi chuỗi acid béo ngắn được dùng làmtăng hương vị trong công nghiệp thực phẩm Những ester giữa chuỗi acid béo dàivới gốc methyl hoặc gốc ethyl thì được dùng dé làm giàu nhiên liệu diesel (Vulfson,

1994).

1.1.6.5 Trong công nghiệp hóa dauViệc ứng dụng enzyme lipase trong công nghiệp hóa dau đã tiết kiệm nănglượng va giảm nhiệt độ xuống thấp nhất trong quá trình rượu hóa, acid hóa, thuỷ

giải và tao glycerol (Vulfson, 1994).

Trang 10

1.1.6.6 Trong công nghiệp dược và hoa chấtTrong dược phẩm lipase được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuấtthuốc chữa bệnh cho người và các loại hoá chất bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, trừcỏ) [13] Gần đây hơn, trong lĩnh vực hoá học tỉnh khiết, người ta đã dùng lipase đểtạo các chất trung gian tong hợp qua quá trình thuỷ phân lập thé chon lọc, ứng dụngtrong sản xuất thuốc trừ sâu Pyretinoidic Ngoài ra trong phòng thí nghiệm cáclipase cũng được nhà hoá học hữu cơ dùng làm công cụ tổng hợp một số chất khác

như phan giải Raxemic epoxiester nhờ lipase cua Rhizopus arhisus (J.A Laitte

(Pháp) Với mong muốn có thé sản xuất một loại thuốc làm giãn động mạch vành,người ta dựa vào tinh chất chọn lọc thuỷ phân của lipase trong môi trường dung môi

hữu cơ.

Gan đây hon, trong lĩnh vực hoá học tinh khiết, người ta đã dùng lipase dé tạocác chất trung gian tong hợp qua quá trình thuỷ phân lập thé chon lọc, ứng dụngtrong sản xuất thuốc trừ sâu Pyretinoidic [1]

1.1.6.7 Trong công nghiệp mỹ phẩmLipase được ứng dụng nhiều trong công nghiệp mỹ phẩm để sản xuất các chấthoạt động bề mặt và các hợp chất thơm Những thành phần chủ yếu trong mỹ phẩmvà nước hoa được điều chế băng phản ứng ester hoá glycerol được xúc tác bởilipase Việc chuyển ester hoá của 3,7- dimethyl 4,7- octadien- 1- ol bởi lipase từnhiều nguồn vi sinh vật khác nhau dé điều chế oxide hoa héng là một hương liệuquan trọng trong sản xuất nước hoa

1.2 Mỡ cá tra

1.2.1 Tình hình chế biến cá tra 6 Việt Nam

Hình 1.2 Cá tra 6 Việt Nam

Cá tra là loài cá da trơn thuộc ho Pangasiidae, giỗng Pangasius, loài P.hypophthalmus Cá tra được nuôi pho biến ở vùng ĐBSCL và là loài cá kinh tế chủlực Theo Tổng Cục Thống Kê, năm 2013, tong sản lượng ca tra Việt Nam là 1,15triệu tan Hiện nay, ĐBSCL có hon 70 nhà máy chế biến mặt hang fillet cá tra vớikhả năng tiêu thụ khoảng 40.000 tan nguyên liệu/ngày Mỗi ngày các nhà máy chếbiến tung ra thị trường hơn 20.000 tan xương, đầu, mỡ, da cá

Năm 2006, với 800.000 tấn cá nguyên liệu được đưa vào chế biến, các nhàmay chỉ thu được chưa day 300.000 tan fillet va thải bỏ hơn 500.000 tan phụ phẩm(Hiệp Hội Chế Biến Và Xuất Khẩu Thuy Sản Việt Nam) Theo ty lệ nay, với 1,15triệu tấn cá nguyên liệu thì các nhà máy chế biến phải thải ra thị trường hơn750.000 tan phụ phẩm cá tra Nếu không có biện pháp xử lý phù hợp số lượng phụphẩm không 16 của các doanh nghiệp chế biến thì chăng mấy chốc cả ĐBSCL sẽ bịô nhiễm nghiêm trọng

Bang 1.3 Một số nghiên cứu sử dụng phế liệu cá tra và ca basaPhé liệu Ứng dụng Tác giả Tài liệu

tham khảoDa Trích ly collagen Lé Thi Thu Huong va cong su, 2010 [28]

Mo Điều chế biodiesel Nguyễn Hồng Thanh va cộng sự, 2009 [3]

Lé Thi Thanh Huong va cong su, 2011 [2]Gan vatuy Thu nhận lipase Vuong Bao Thy va cong su, 2011 [10]

Hỗn hop Bố sung vào thức Nguyen Thi Thuy và cộng sự, 2010 [37]phế liệu ăn cho heo

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành với mục đích tận thu phế liệu ca tranham sản xuất ra các sản phẩm có giá trị kinh tế cao, được trình bày trong bảng 1.3.Lượng phụ phẩm này được dùng để chế biến ra bột cá tra, và trong qui trình chếbiến, lượng mỡ được chiết ra chiếm khoảng 34% (Thuy và Loc, 2007) [47] Trongqui trình sản xuất bột cá tra tại các xí nghiệp sản xuất nhỏ lẻ thì một lượng lớn mỡcá tra được chiết tách ra mỗi ngày Mỡ này không được sử dụng, tạo thành một

Trang 12

lượng rác thai gây 6 nhiễm môi trường Trong khi đó đây sẽ là nguồn nguyên liệuphù hợp để sản xuất biodiesel.

Tính chất vật lý: không tan trong nước, trên nhiệt độ tan chảy nó có thể trộnlẫn hoàn toàn với các dung môi không phân cực như benzen, ete, dầu mỏ nhe, Onđịnh trong môi trường khí quyền, khó bị oxy hóa trong điều kiện không khí bìnhthường như những loại dầu mỡ khác vì mỡ cá có tỷ lệ cao glyceride của các acid

béo bão hòa (47,62%).

Tính chất hóa học: Cũng như tất cả các triglyceride khác, mỡ cá có tất cả cáctính chất hóa học đặc trưng của một lipid: phản ứng hydrogen hoá, halogen hoá,

thuỷ phân, phản ứng oxi hóa.

1.2.2.2 Một số ứng dụng thực tế của mỡ cá tra

Vùng ĐBSCL mỗi năm cung cấp ra thị trường sản lượng mỡ cá tra khôngdưới 140.000 tan nhưng được dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thứcăn gia súc, sản xuất dầu biodiesel và xuất khẩu thô với giá bán thấp

1.3 Biodiesel1.3.1 Định nghĩa

Theo tiêu chuẩn ASTM D 6751 của Mỹ, biodiesel là các mono alkyl ester dẫnxuất từ acid béo mạch dài của dầu mỡ động thực vật được sử dụng cho động cơdiesel Biodiesel tinh khiết gọi là B100 được dùng trộn với nhiên liệu diesel theo

các ty lệ khác nhau [46].

1.3.2 Tính chấtTính chất nhiên liệu của biodiesel phụ thuộc vào thành phân hóa học của dầu

mỡ nguyên liệu Acid béo no như C14:0, C16:0, C18:0 sẽ lam cho biodiesel có chỉ

số cetane, độ bền oxy hóa, điểm đục, điểm chảy và độ nhớt cao do đó dễ bị kết tinh,không phù hợp trong môi trường khí hậu lạnh Acid béo không no dễ bị oxy hóanhưng lại sử dụng tốt trong môi trường này Chiều dài mạch hydrocarboncủa biodiesel tăng và thăng thì chỉ số cetane tăng Độ nhớt tăng theo chiềudài mạch hydrocarbon và mức độ no nhưng số nối đôi trong mạch hydrocarbontăng thì độ nhớt lại giảm Biodiesel có thể bị oxy hóa khi tiếp xúc với khôngkhí, do đó, biodiesel có nguồn sốc từ dầu mỡ động vật bền hơn từ thực vật Trongdầu mỡ động thực vật thường có sẵn một số chất chống oxy hóa như vitamin E(tocopherol) Nếu lượng các chất này ít đi thì quá trình oxy hóa sẽ xảy ra rất nhanh[171.126] Knothe cho rằng việc chưng cất lại biodiesel sẽ làm tăng chỉ số peroxidedo các chất chồng oxy hóa này bị mat đi [37]

1.3.3 Đánh giá chất lượng biodieselNgoài FAME biodiesel có thé còn các thành phần như MG, DG, TG, vàglycerine Tống các TG, DG, MG va glycerine tự do gọi là glycerine tong Hamlượng FAME, glycerine tự do va glycerine tong những chi tiêu quan trọng đánh giáchất lượng biodiesel vì nó có thé gây ra một số khó khăn khi sử dụng như ăn mònđộng cơ, tạo nhiều khói xả, tắc bít đầu phun, tạo cặn va làm cho biodiesel có độ

nhot cao.

Trang 14

Việt Nam đã ban hành tiêu chuẩn TCVN 7717:2007 về biodiesel gốc(B100) năm 2007 của Tổng cục Tiêu chuẩn Do lường Chất lượng, bang 1.5.

Bang 1.5 Các chỉ tiêu chất lượng của diesel sinh học gốc (B100) [11]

Chỉ tiêu Phương pháp thử Giới hạn Đơn vị

Hàm lượng ester EN 14103 96,5 min % khối lượngKhối lượng riêng tại 15°C ASTM D 1298 860 — 900 kg/mĐiểm chớp cháy cốc kín ASTM D 93 130 min °CNước va cặn ASTM D2709 0.05 max % thể tíchĐộ nhớt động học ở 40°C ASTM D 445 19-60 mm /sTro sunphat ASTM D 874 0,02 max % khối lượngLưu huỳnh ASTM D5453 005max % khối lượngĂn mòn đồng ASTM D 130 N°I

Trị số cetane ASTM D 613 47 minDiém van duc ASTM D 2500 Báo cáo °CCan carbon ASTM D 4530 0,05 max % khối lượngTrị số acid ASTM D 661 0,5 max mg KOH/gChỉ số iod EN 14111 120 max ø Iod/100 gĐộ ồn định oxy hóa tai 110°C EN 14112 6 min 210Glycerine tu do ASTM D 6854 0,02 max % khối luongGlycerine tong ASTM D 6854 024max % khối lượngPhospho ASTM D 4951 0,001 max % khối lượngNhiệt độ cất, 90% thu hồi ASTM D 1160 360 max °C

Na và K EN 11406,EN 14109 5,0 max mg/kg

Ngoai quan Không có nước tự do, can va tap chat

lo lung

1.3.4 Tinh hình nghiên cứu va san xuất biodiesel hiện nayTình hình nghiên cứu trong mước: nghiên cứu trên các nguyên liệu béo rẻ tiên cósăn trong nước như mỡ cá tra, bã cà phê, dâu hạt cao su; chủ yêu sử dụng xúc táchóa học (bảng 1.6).

Bảng 1.6 Một số nghiên cứu tổng hợp biodiesel ở Việt Nam

Chat béo Rượu Xúc tác m„ Tác giảsuât %

M6 cá tra Methanol Kiểm, siêu âm 90% Nguyễn Hồng Thanh

và cộng sự, 2009 [3]Mỡ cá tra Methanol Base, acid, CaO, 98% Lé Thi Thanh Hương

KOH/y-Al,03, siêu âm và cộng su, 2011 [2]

Ba cà phê Methanol KOH 74,5% Nguyễn Van Dat va

cong su, 2011 [4]

Dau hat cao su Methanol KOH 75% Nguyễn Văn Dat và

cộng sự, 2012 [5]

Dâu dừa Ethanol Candida rugosa Tran Thi Bé Lan va

Porcine pancreas cong su, 2012 [15]Dau thai Methanol Mesoporous calcium 938% Trần Mai Khôi va

Dầu hat cao su silicate 945% cộng sự, 2013 [7]Tình hình nghiên cứu ngoài nước: nghiên cứu su dụng xúc tac enzyme lipase

khá nhiều nhưng chưa có nghiên cứu sử dụng nguyên liệu mỡ cá tra, là nguồnnguyên liệu déi dào và rẻ ở Việt Nam Một số nghiên cứu sử dụng enzyme lipaselàm xúc tác cho phản ứng transerter hóa dầu mỡ động thực vật trên thế giới:

An-Fei Hsu và cộng sự (2002) [12] nghiên cứu san phẩm alkyl ester của dầu đãqua sử dung bang enzyme Thermomyces lanuginosa, Candida antarctica vàPseudomonas cepacia, cô định trên hat silica, nhựa acrylic và hệ gel phyllosilicate.Nghiên cứu đã khảo sát một số ancol bậc l và bậc 2 gôm: methanol, ethanol,ethanol (95%), propanol, isopropanol, butanol, isobutanol ở điều kiện phản ứng: ty

Trang 16

lệ mol methanol : dau là 4:1, 10% enzyme (theo khối lượng dau), nhiệt độ 40°Ctrong 24 giờ Hiệu suất transester hóa định được trình bay trong bảng 1.7.

Bang 1.7 Hiệu suất chuyển hóa transester ứng với từng enzyme co địnhEnzyme Vật liệu cô định Ancol % alkyl ester

T lanuginosa Granulated silica [sobutanol 97%

C antarctica Granulated silica [sobutanol 89%

C antarcica Macroporous acrylic resin Isobutanol 94%P cepacia Phyllosilicate solgel matrix Butanol 97%

Wei Du va cong su (2004) [48] su dung lipase xtic tac cho su chuyén hóa cuadau đậu nành thành san phẩm biodiesel với tác nhân acyl thay vi sử dung ancol Kếtqua methyl acetate cho hiệu suất 92% với ty lệ methyl acetate : dầu là 12:1 màkhông gây tác động tiêu cực nảo đối với enzyme Còn methanol thì lại gây tác độngtiêu cực đến hoạt tính của lipase ở tỷ lệ mol methanol : dầu là 1:1

Funda Yagiz và cộng sự (2007) [21] nghiên cứu dùng lipase Lipozyme-TL IM tự

do xúc tác cho phản ứng transester hóa dầu ăn đã qua sử dụng với methanol, ở nhiệtđộ phòng Sau 105 giờ phản ứng, hiệu suất chuyển hóa ester đạt được là 95%

Hong-yan Zeng và cộng sự (2009) [22] đã cố định lipase Saccharomycescerevisiae lên hydrotalcite dé tong hop biodiesel từ dầu hat cải Hiệu suất transesterhóa cao nhất là 96,5% khi tiễn hành phản ứng với tỷ lệ mol methanol : dầu là 4:1,bố sung 1,5% enzyme (theo khối lượng dau) ở nhiệt độ 45°C trong 4,5 giờ

M.Nasratun và cộng sự (2009) [35] nghiên cứu sử dụng enzyme lipase Candida

rugosa tự do và cố định trên vật liệu chitosan để transester hóa dầu ăn Với cùng tỷlệ mol methanol : dau là 4:1, sử dụng dung môi n-hexane, phản ứng tiễn hành ở40°C trong 48 giờ thì hiệu suất chuyển hóa ester tuong ứng của enzyme tự do và cô

định là 72,25% và 76,5%.

1.4 Phương pháp tổng hợp biodiesel

Dau mỡ động thực vật có độ nhớt va ty trong cao vì vậy chúng không đượcsử dụng trực tiếp cho các động co diesel mà cần phải được chuyền hóa thành nhiên

liệu sinh hoc Hai phương pháp quan trong dé chuyén hóa dau mỡ thành nhiên liệusinh học là craking ở nhiệt độ cao hoặc tiến hành phản ứng ancol phân (transesterhóa) triglyceride Phan ứng cracking sẽ tạo thành những chuỗi hydrocarbon giốngvới diesel Ở phương pháp còn lại, sản phẩm thu được là những mono-ancol fattyacid ester (biodiesel) Mặc dù cả hai phương pháp đều là những phản ứng hóa họcđơn giản nhưng chúng cũng có những mặc hạn chế, chủ yếu liên quan đến hiệu suấtphản ứng, sự tiêu hao nước và năng lượng Nhiều công trình nghiên cứu gần đây sửdụng các chất xúc tác: acid, base và xúc tác sinh học (enzyme) cho quá trìnhtransester hóa chất béo nhăm khắc phục những nhược điểm trên [23].

1.4.1 Phản ứng transeter hóa dầu mỡPhản ứng transester hóa là phản ứng giữa triglyceride và ancol Sản phẩmbiodiesel thu được là hỗn hợp mono-alkyl ester Các chất xúc tác thường sử dụngcho phản ứng transester hóa chất béo là: xúc tác hóa học và xúc tác sinh học

1.4.1.1 Xúc tác hóa họcXúc tác base

Được sử dụng trong quá trình chuyển hoá ester dâu thực vật là xúc tác đồngthé pha lỏng như KOH, NaOH, K;CO;, CH3ONa hoặc xúc tác dị thể như MgO,nhựa trao đối cation Amberlyst 15, titanium silicat TIS Xúc tác đồng théCHONa cho độ chuyển hoá cao, thời gian phản ứng ngắn nhất nhưng với yêu cầukhông được có mặt của nước nên không thích hợp với điều kiên công nghiệp Xúctác dị thể NaOH/MgO có hoạt tính rất cao nhưng còn đang trong quá trình nghiên

cứu hoàn thiện.

Encinar đã báo cáo ảnh hưởng các yếu tố của phản ứng tong hop biodiesel từdầu mỡ đã qua sử dụng với methanol sử dụng bốn loại xúc tác NaOH, KOH,CH3ONa và CH3OK [20] Các nguyên liệu dầu mỡ thải rẻ tiền khác cũng được décập trong các nghiên cứu của Paola (dau thải từ nhà máy sản xuất dau olive) [40],

Tashtoush (mỡ động vat đã qua sử dụng của các nhà hàng), Bhatti (mỡ bò thải),

Maceiras và Tomasevic (dầu đã chiên nấu) Trong phản ứng methanol phân mỡ cá tra sử dụng xúc tác base ran KOH/y-

Al,O3 ở tỷ lệ mol 8,26/1 của methanol/mỡ, 5,79 % xúc tác, thời gian phan ứng 96

Trang 18

phút, nhiệt độ phan ứng 59,6°C thì hiệu suất biodiesel đạt 92,8 % (Lê Thị Thanh

Hương và cộng sự, 2011) [2].Xúc tác acid

Chủ yếu là các acid Bronsted như H;SO¿x, HCl được sử dụng đồng thé trongpha lỏng Phương pháp xúc tác đồng thé đòi hỏi ty lệ mol của methanol/mỡ cao hơnnhiều so với xúc tác kiềm và nhiều năng lượng cho tinh chế sản phẩm Điều kiệnnày hạn chế khả năng sử dụng thực tế xúc tác acid trong sản xuất biodiesel

Lê Thị Thanh Hương và cộng sự (2011) tiễn hành phản ứng methanol phân

mỡ cá tra sử dụng xúc tác p-toluensulfonicacid ở tỷ lệ mol 22/1 của methanol/mỡ, 3

% xúc tác, thời gian phản ứng 25 phút, nhiệt độ phản ứng 65°C; hiệu suất biodiesel

đạt được là 98,9 % [2].

Kết hợp acid và base

M Canakci và J Van Gerpen (2001) đã nghiên cứu phương pháp transester

hóa 2 giai đoạn đối với dau đậu nành có hàm lượng acid palmitic 20 + 40 % Giaiđoạn 1 thực hiện phản ứng ester hóa sử dụng xúc tác H;SOx dé làm giảm hàm lượngFFA xuống 1% Giai đoạn 2 thực hiện phan ứng trao đối ester với xúc tác kiềm.Phương pháp này thích hợp dé tong hop biodiesel từ các nguồn dầu mỡ rẻ tiền, chấtlượng thấp nên được tập trung nghiên cứu khá nhiều với các nguồn dau thải khácnhau [33] Nghiên cứu phản ứng methanol phân dầu hoa hướng dương thải sửdụng xúc tác KOH của Zlatica J Predojevic (2008) cho thay tinh chế biodiesel băngphương pháp hấp phụ silicagel hoặc trung hòa bằng acid phosphoric (hiệu suất92%) tốt hơn rửa với nước nóng (hiệu suất 89%) [50]

Xúc tác hóa học cần nhiều giai đoạn xử lý mới thu được dầu diesel sinh họcnhư: xử lý bọt, tách glycerol, loại chất xúc tác và lượng nước thải kiềm khá lớn Vìvậy, van đề nước thai và nhu cau để tái sử dụng nước là một yêu cầu nghiêm ngặt

cho quan điềm về tiêu thụ năng lượng và môi trường.

R“~~SO > xxx ~R' + H;Oi ie Lipase R O

Acid béo Alkyl EsterHình 1.3 So đồ phản ứng transester hóa triglyceride và acid béo với xúc tac

lipase (An Fei Hsu và cong sự, 2002) [12]R,, Ro, Rg là gốc hydrocarbon của acid béo Phan ứng ancol phân là phan ứngthuận nghịch Xúc tác thường được sử dụng để làm tăng vận tốc của phản ứng.Ancol được dùng dư dé cân bang lệch về phía tạo ra nhiều sản phẩm biodiesel

Ngoài chất béo bị ancol giải thì các các acid béo tự do có mặt cũng bi ester hóakhi xúc tác băng enzyme lipase

So với xúc tác hóa hoc, lipase có điều kiện phản ứng nhẹ nhàng hơn (nhiệt độ35 + 40°C), tỷ lệ ancol/dầu thấp hơn, không có sản phẩm phụ, việc tách pha và thuhỏi glycerine dé dàng, xúc tác có thé tái sử dụng nhiều lần, hiệu suất phản ứng cao.Lipase không bi ảnh hưởng bởi hàm lượng FFA va nước có trong dầu mỡ vì nó xúctac cho cả phan ứng ester hóa và trao đối ester do đó thuận lợi cho việc sản xuấtbăng nguồn nguyên liệu dầu thải hoặc đã qua sử dụng [42]

Hiệu suất biodiesel phụ thuộc vào loại lipase và hàm lượng sử dụng,ancol và tỷ lệ ancol/dau, nhiệt độ va dung môi Mỗi loại lipase có ảnh hưởng khácnhau đối với các ancol bậc nhất và bậc hai Mặc dù có tác dụng làm giảm hoạt tínhcủa xúc tác enzyme, methanol va ethanol vẫn được dùng phổ biến do giá rẻ Ngoàicác chất mang nhựa hữu cơ đắt tiền, lipase còn được nghiên cứu cố định trên chấtmang rẻ tiền khác như cao lanh, sợi cotton, hydrotalcite, silicagel [21]

Trang 20

Các yếu tổ ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa là tỷ lệ mol ancol/dầu và điềukiện của phản ứng (nhiệt độ, áp suất) Xúc tác ezyme được thêm vào dé làm phản

ứng xảy ra và làm tăng hiệu suât chuyên hóa.

1.4.2 Các yếu tổ ảnh hưởng đến phản ứng transeter hóa sử dụng xúc tác lipase

HạC—OCOR; HạC—OH

I IHC —OCOR,> + ROH ——— HC—OCOR; + R,COOR (a)

I

H,C—OCOR; HạC—OCOR;

IHC—OCOR¿ + ROH ———— HC—OH + RạCOOR (b)

IHạC—OCOR; HạC—OCOR;

IHC—OH + ROH ———— HC—OH + R;COOR (c)

I

Hình 1.4 Phan ứng transester hóa từng giai đoạn

Phản ứng tong hop biodiesel diễn ra theo ba giai đoạn (a + c).Cơ chế phản ứng ancol phân với chất xúc tác như sau:

- Nhóm carbonyl của triglyxeride sẽ khuếch tán trên bề mặt chất xúc tác hoặcgan kết với chất xúc tác nêu là enzyme (khuếch tán ngoài)

- Nhóm carbonyl bị tan công bởi phân tử ancol (khếch tán trong) theo cơ chếái nhân tạo hợp chất trung gian

- Dung môi sẽ giúp cho quá trình dịch chuyển điện tích tạo điều kiện cho sự

1.4.2.1 Loại ancol và ty lệ mol ancol/dau mỡAncol bậc nhất như methanol, ethanol, propanol, buthanol đều có thé sử dụngdé tông hop biodiesel Các biodiesel này không khác nhau nhiều vẻ tính chất hóahọc và đều có thể đáp ứng được yêu cầu của các tiêu chuẩn nhiên liệu Bản chất hóahọc của ancol ảnh hưởng đáng kế đến phản ứng tổng hợp biodiesel Ancol có kích

thước phân tử càng lớn thì phản ứng càng khó xảy ra, do đó phản ứng thường được

tiến hành ở nhiệt độ khá cao Ancol phân nhánh phản ứng kém hơn so với ancolmạch thắng tương ứng Ancol chuỗi ngăn có thé thay doi đầu ưa nước của cácenzyme dẫn đến sự biến tính, khi ancol được thêm vào hệ thống pha hữu cơ đòi hỏitính phân cực cao hon và điều này thay đối sự phân tán nước trong pha lỏng Do đó,sự ức chế xảy ra như là kết quả của việc loại nước từ các nguyên liệu

Ancol mạch thăng và ngăn tham gia phản ứng nhanh hơn với hiệu suất chuyển

hóa cao hơn so với ancol mạch nhánh và đài [2].[31].

So với methanol, ethanol có thé tạo hỗn hợp dang phí với nước nên khó thuhồi hơn Nhũ tương được tạo thành trong quá trình phản ứng của methanol khôngbên, dé bị phá vỡ hon của ethanol nên thời gian để tách pha ngăn hơn Do đó mặcdù độc hơn ethanol, người ta vẫn thường sử dụng methanol làm nguyên liệucho sản xuất biodiesel

Một trong những thông số quan trong của phản ứng tổng hop biodiesel là ty lệmol giữa ancol và dầu mỡ Tỷ lệ này phụ thuộc vào bản chất nguyên liệu và tínhchất acid, base đông thé hay di thé của xúc tác Hiệu suất phản ứng tăng khi tỷ lệancol/dầu mỡ tăng Tuy nhiên nếu sử dụng quá nhiều ancol, độ hòa tan glycerinetrong ancol dư tăng dẫn đến việc tách rửa khó khăn làm giảm hiệu suất phản ứng.Miao và Wu đã kết luận rằng sử dụng lượng lớn methanol (ty lệ methanol/dau là70/1 và 84/1) sẽ làm giảm vận tốc tách pha giữa glycerine và FAME [34] Vớinguyên liệu dầu mỡ thực vật hoặc dầu mỡ đã qua sử dụng được xử lý hàm lượng

FFA < 1%.

Nói chung, lipase xúc tác hiệu quả cho phản ứng khi cơ chất ở trạng thái hòatan Ancol béo có số carbon lớn hơn ba tan hoàn toàn trong dau với cùng tỉ lượnghóa học nhất định, nhưng độ tan của methanol và ethanol đã được tìm thay la chỉ có1/2 và 2/3 tỉ lượng, tương ứng Tỷ lệ thấp của ancol phân do lipase bị vô hoạt không

Trang 22

thé phục hồi khi bi tủa bởi methanol (ethanol) Dé tránh sự ức chế bởi ancol thừa,có thé thêm methanol với thé tích nhỏ trong một khoảng thời gian dài hoặc thêmmethanol theo từng bước [23] Hong-yan Zeng và cộng sự (2009) dé xuất việc thêmmethanol từ từ với vận tốc 8 ml/phút trong phản ứng transester hóa dau hạt cải sửdụng lipase Saccharomyces cerevisiae cô định trén vật liệu hydrotalcite [22].

1.4.2.3 Thời gian phan ứng

Hiệu suất phản ứng trao đối ester phụ thuộc vào thời gian phản ứng.Thời gian phản ứng can thiết phụ thuộc vào bản chất nguyên liệu và xúc tác sửdụng Các nghiên cứu déu cho thấy, sau khi phan ứng đạt hiệu suất chuyển hóa caonhất thì việc tiếp tục tăng thời gian sẽ không làm tăng hiệu suất [2]

1.4.2.4 Nhiệt độ phản ứng

Vận tốc phản ứng chuyển hóa phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tang, khảnăng khuếch tán vào nhau của tác chất tăng làm cho phản ứng diễn ra nhanh hơn.Khoảng nhiệt độ của phản ứng trao đổi ester tương đối rộng thường từ nhiệt độphòng đến gần nhiệt độ sôi của ancol hoặc cao hơn nữa ở áp suất khí quyền Nhiệtđộ tối ưu của phản ứng chuyển hóa phụ thuộc vào bản chất, chất lượng của nguyênliệu dau mỡ và các điều kiện khác phan ứng [27],[31]

Phản ứng transester hóa xúc tác enzyme được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn sovới phản ứng transester hóa xúc tác hóa học để ngăn chặn sự mat hoạt tính củalipase (Watanabe và cộng sự, 2001) Nhiệt độ phản ứng thấp là một mong muốn đểgiảm chi phí về năng lượng trong sản xuất dau diesel sinh học (Jeong và cộng sự,2004) Chen và cộng sự (2006) báo cáo răng một phản ứng methanol phân dầu thải

có nhiệt độ vượt qua 40°C làm giảm hoạt tinh lipase R oryzae Jeong & Park

(2008) cũng báo cáo rang nhiệt độ phan ứng tối ưu cho Novozyme 435 là 40°C, chophép duy trì hoạt tính lipase cao và độ nhớt chất phản ứng thấp

1.4.2.5 Hàm lượng của đệmKhi thực hiện phản ứng ancol phân, việc chọn đúng hệ đệm và chỉnh pH đúng

với pH tối ưu của enzyme và lượng đệm vừa đủ để hòa tan enzyme là cần thiết đểenzyme hoạt động tôi đa [27],[31]

1.4.2.6 Hàm lượng của nước và acid béo tự do

Hàm lượng của nước và FFA đóng vai trò quan trọng trong phan ứng trao đôi

ester.

Nhiều tác giả đã chỉ ra rằng với từng loại xúc tác, hàm lượng FFA (%) cótrong dầu mỡ phải thấp hơn giá trị tương ứng thì hiệu suất phản ứng chuyển hóaester sẽ đạt cao nhất như: NaOH — methanol (FFA < 0,06%) [30], KOH (FFA <

0,5%) [36]

Lipase hoạt động trên bề mặt tiếp xúc giữa hai pha dầu và nước Khi tăng danhàm lượng nước trong hỗn hợp phản ứng thì diện tích bé mặt phản ứng (bề mặtphân pha dầu — nước) cho lipase tăng lên Tuy nhiên lipase cũng xúc tác cho phảnứng thủy phân khi có sự hiện diện của nước, nếu lượng nước được thêm quá nhiều

nó sẽ kích thích cho phản ứng thủy phân cạnh tranh với phản ứng transester hóa Vì

vậy cần tìm ra hàm lượng nước tối ưu khi đó phản ứng thủy phân xảy ra ít nhất vàenzyme xúc tác cho phản ứng chuyền hóa ester là nhiều nhất [22]

1.4.2.7 Mức độ khuấy trộnCó nhiều nghiên cứu về tác dụng khuấy trộn bằng phương pháp cơ học cổ điểnđã được báo cáo [42] Ma và cộng sự (1999) cho biết dù có xúc tác NaOH, phảnứng trao đổi ester mỡ bò với methanol vẫn không xảy ra nếu không có khuấy trộn[30] Trong những năm gần đây, nhiều báo cáo về tác dụng khuấy trộn cao, rút ngắnđáng kế thời gian phản ứng của sóng siêu âm tan số thấp Cơ chế này được giảithích bằng việc hình thành và vỡ nỗ của các bọt bong bóng dưới tác dụng của sóngsiêu âm, sinh ra nhiệt, phá vỡ bề mặt phân chia pha giữa ancol và dầu mỡ tạo nhũtương, tăng diện tích tiếp xúc và quá trình chuyển khối của các chất trong hỗn hợp

phản ứng.

Trang 24