Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu cố định Enzyme Lipase Porcine Pancreas trên chất mang Hydrotalcite Mg

Trong nghiên cứu này, enzyme lipase Porcine Pancreas được nghiên cứu céđịnh lên chat mang hydrotalcites Mg/AI-CO3” được nung ở 450°C và khảo sátcác yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính của hệ

UNG PHẠM TƯỜNG THỤY

NGHIÊN CỨU CÓ ĐỊNH ENZYME LIPASEPORCINE PANCREAS TREN CHAT MANG

HYDROTALCITE Mg/AI CO; ?

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm va Đồ uốngMã số: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHÍ MINH, tháng 12 năm 2013

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Phan Ngoc Hòa

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Lê Văn Việt MẫnCán bộ chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Lệ Hà

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQO Tp.HCM ngày 30 tháng 12 năm 2013.

Thành phân Hội đồng đánh giá luận văn Thạc sĩ gồm:1 PGS.TS Lê Phi Nga Chủ tịch Hội đồng2.PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Phản biện 1

3.TS Nguyễn Lệ Hà Phản biện 24 TS Phan Ngọc Hòa Ủy viên5 TS Tran Thị Ngọc Yên Thư kýXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa.

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS.TS Lê Phi Nga PGS.TS Phan Thanh Sơn Nam

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: UNG PHAM TƯỜNG THUY MSHV: 11110219

Ngày, thang, năm sinh: 03/01/1987 Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm và Đồ uống Mã số: 605402I TÊN DE TÀI:

NGHIÊN CỨU CO ĐỊNH ENZYME LIPASE PORCINE PANCREAS TRENCHAT MANG HYDROTALLCITE Mg/AI 2:1 — COs

II NHIỆM VU VA NOI DUNG:— Neghién cứu tinh chất của enzym lipase và chat mang hydrotalcite Mg:Al.— C6 định enzym lipase lên chat mang hydrotalcite Mg:Al

— Thủy phân dau olive với hệ enzym cố địnhIll NGÀY GIAO NHIỆM VU: 21/1/2013

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/12/2013v CAN BO HUONG DAN: TS PHAN NGOC HOA

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Ngọc Hòa Cô đã luôntận tình hướng dẫn và theo dõi sát sao dé em có thé hoàn thành luận văn tốt đẹp.Em xin chân thành cảm ơn của ThS Châu Trần Diễm Ai Chi đã sự giúp đỡ nhiệttình, chia sẻ kinh nghiệm trong suốt quá trình em thực hiện luận văn.

Con cũng xin cảm ơn ba mẹ, đã luôn ủng hộ tinh thân cũng như vật chat đê con có

thể dành nhiều thời gian cho việc học tập và thực hiện nghiên cứu.Em xin chân thành cảm ơn quý thay cô Trường Đại Học Bách Khoa — Dai HọcQuốc Gia TP.HCM, quý thầy cô Khoa Kỹ Thuật Hóa Học và đặc biệt là các thay côBộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức hữu ích, kinhnghiệm quý báu cũng như tạo mọi điều kiện giúp em hoàn thành tốt luận văn

Luận văn sẽ không được hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ chân thành của cáccác bạn sinh viên, những người đã học tập cùng em trong suốt những năm cao học.Xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến ThS Nguyễn Quốc Cường, đã luôn ủng hộ và độngviên trong suốt thời gian làm luận văn Và cuối cùng xin gởi lời cảm ơn đến các bạnPhuong, Sang, Hà, Trâm đã ở bên cạnh tôi trong suốt thời gian này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 12 năm 2013

UNG PHAM TƯỜNG THUY

Trong nghiên cứu này, enzyme lipase Porcine Pancreas được nghiên cứu céđịnh lên chat mang hydrotalcites Mg/AI-CO3” được nung ở 450°C và khảo sátcác yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính của hệ enzyme có định Quá trình cố địnhkhảo sát ảnh hưởng của các yếu tố sau: nhiệt độ, pH, tỷ lệ kim loại của chấtmang, tỷ lệ enzyme/chat mang, vận tốc lắc, thời gian cố định Kết quả cho thayhiệu suất cố định enzyme cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 30°C: pH 7.5; tỷ lệenzyme : chất mang là 0.015:1 w/w; thời gian cố định là 6 giờ; vận tốc lắc là300v/p Thực hiện thủy phân nhũ tương dầu olive ở pH 7.5; nhiệt độ 30°C; vậntốc khuấy là 300 v/p; lượng cơ chất là 50 ml, hoạt tính của enzyme cô định datcao nhất là 361 UI/g enzyme.

This study investigated the immobilised ability of enzyme lipase Porcine

Pancreas in hydrotalcites Mg/Al-CO3* carrier (which was burned at 450°C) and

the factors affected ativity of enzymatic system In the immobilisation, therewere some factors which had the influence on immobilised performance sush astemparature, pH, Mg/AI ratio, enzyme/carrier ratio, shake velocity, immobilisedtime The result shows that immobilised performance is the highest

correspondence to temparature 30°C, pH 7.5, enzyme:carrier = 0.015:1 w/w,

immobilised time 6 hours, shake velocity 300 rpm In addition to immobilisedperformance, the activity of immobilised enzyme attained 361 UI/g enzyme

when carrying out the hydrolysis at pH 7.5, temparature 30°C, shake velocity

300 rpm, 50 ml substrate (olive oil emulsion).

Tôi xin cam đoan toàn bộ sô liệu trong luận văn đêu được tiên hành thực

nghiệm và dưới sự hướng dẫn của khoa học của TS Phan Ngọc Hòa.Các kết qua là trung thực và chưa từng được công bố trong bat kỳ nghiên cứu

nào trước đây.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm vê nghiên cứu của mình.

Học viên thực hiện

UNG PHAM TƯỜNG THUY

DANH MỤC BÁNG - G111 TT TH TT TH HT TT HT TH TH reg iDANH MỤC HINE ooo ccccccccccccccesccssscessscessscsssscscscsssscsacssvavsssavsasavsceecseeesaees iiLOT MO DAU 0 eceeceesessessessessessesnesesneesessessenecuecussncaneeeesesesseeneeueeusaneaneneeaeeneeneaeeee ivChương 1 TONG QUAN wu ccccccccccccscescscscescessscscscssvevsceccavscsesvscsavscesvavscneesvavsees 1

1.1 Porcine pancreas Lipase (PPL) cc cccccccccccesececceeneeeceeceeseeeseeeeeeeenenes |In) 6i 8 dd |

1.1.2 Câu trúc và cơ chế hoạt đỘng - - L cc ee 11.1.3 Tính chất của enzyme Porcine pancreas ÏÏpDaS€ - 55c cv csesecersesees 51.1.4 Ung dụng của enzyme Porcine pancreas |ÏDaS€ sec secsecersrseeo 11

1.2 Hydrotalcite (LDHS) 0.0.0 14I0) hoi aỪỪadttatỶ3ẦẦẦ ốc 14

1.2.2 Tih 151.2.3 Phương pháp chế ta0 cccscccsessecsccssesscescescssscescsvsceeesvecscessevseseeeeesvasseeevaves 161.2.4 Ứng dụng cư 1S 11 v1 1T TT TT TT TH HT HT ru 181.3 Enzyme cố dimh.i cccccccccccccssccsscscsccscsccecsccecscecscescsccaeesvscsvscesvscessaseeeaes 19

1.3.0 Dinh nghia oiđad dt a 19

1.3.2 Các phương pháp cố định c- «6t St SE E1 cv ng ru 191.3.3 Các kỹ thuật cô định enzyme Porcine pancreas ÌÏpaS€ -.- sec: 211.3.4 Tính chất của enzyme cố định - + + xxx SE SE E1 cv reo 231.3.5 Các yếu t6 ảnh hưởng tới quá trình có định enzyme - s ss+sszxe: 24

Chương 2 NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - - sex: 30

QL N@uyer 8ì) 0 '+5ồŸ ổ.ổ ae 30

2.1.1 Chất mang Al/Mg CO3* đã nung ở 450ÖC 6 Gskx cv EEvgxcevseeevee 30

2.1.2 Enzyme Porcine Pancreas ÌÏIDaS€ -c c Sn 11.11 11x vo 31

2.1.3 Dầu thực Vat o.ccccccescscscscecscscscsssscssssssscscscscscscscecscscssssssessssvesessvevecscecenanes 312.2 Thiết bị và hóa chất -G- G kh SE TH TH HT HT HH TH TH rớt 32

2.3 Nội dung thí nghiệm - Q c0 S1 11110 11111111 111v sờ 33

2.3.1 Khảo sát tính chất của nguyên liệu - 6 + xxx EsEE vs cxcerseexcee 342.3.2 Khao sát khả năng cô định enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL) lên chất mang

2.3.3 Khảo sát hoạt tính của enzyme CO định ác co cccst SE 1S sec: 382.3.4 Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định - - sec se xxx £sesesecse 40

2.4 Các phương pháp phân tích - - - -c 0001110110101 1 1111111111111 11 1k sse 41

2.4 Phương pháp xử lý số liệu -G-G E Sk S1 KTS net 42

Chương 3 KET QUA VÀ BAN LUẬN G G s vn vn ng 433.1 Tính chất nguyên liệu - - - SE SE SE HT HT HT ngàn ng rớt 43

3.1.1 Enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL) 5cc << << <<<<<+sssss 43

3.1.2 Chat mang hydrotalcite Al/Mg- CO3* đã nung ở 450°C 555: 46

3.2.1 Anh hưởng của ty lệ Mg/AIL - St x1 vn HH rrrkg 523.2.2 Anh hưởng của nông độ enzy1me - + skxx xxx se cv reg 543.2.3 Ảnh hưởng của pH ou ececccessecscessssscesceceecsvscescscscsscevscecsavscacseeesavsceavacsenees 553.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt đỘ - + xxx 1S S9 E11 ng Hưng ng 573.2.5 Anh hưởng của thời gian cố dinh wo ccccecccsccscsscescsccssssscsscscscrecevsceeevanes 583.2.6 Ảnh hưởng của vận tỐc 1ac ccecescesecescssssesesescsssscesssvscsecevscscessavscsveceavsesees 603.3 Khảo sát các yếu tô ảnh hưởng đến hoạt tinh enzyme cố định 623.3.1 Ảnh hưởng của pH -G- < -EkxSxE E11 1S 1c 1n ng ng cg 623.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt đỘ - -:- «+ xxx 1S S9 11v vn Hàng ng 643.3.3 Anh hưởng của vận tốc khuấy c- tk SE 3S E1 SH ng cv ri 653.3.4 Ảnh hưởng của ty lệ enzyme/cơ chất - ¿sex EsE+E£eEsEskekeeseeerke 673.4 Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định 2 - sex se seseeecee 69

Chương 4 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, -G- 52s SE SE EsEskeceeeeeree 71TÀI LIEU THAM KHẢO G SE 1 E38 SE SE TT cv ng re 73

PHU LỤC 552252221 2 2E12EE2251211211221122121121E1E27T2EE2EEEE.EEEE.rrrrrrrerrrei 76

Bang 1.1.Bang 1.2.Bang 1.3.Bang 1 4.Bang 1.5.Bang 1.6.Bang 1.7.Bang 2.1.Bang 2.2.Bang 2.3.Bang 2 4.Bang 2.5.Bang 2.6.Bang 2.7.Bang 2 6.Bang 2.9.Bang 3.1.Bang 3.2.Bang 3 3.Bảng 3 4.Bang 3 5.

Hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ các nguồn khác nhau - 5Ảnh hưởng pH lên hoạt tính của enzyme lipase -22 522525252 8Nhiệt độ tối ưu của enzyme lipase thu nhận từ các nguồn khác nhau 9Ảnh hưởng các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme . -‹ - 10So sánh các phương pháp cố định - ¿25s S2+++Ese£Eevrevrxerrerreee 20Các kỹ thuật cố định enzyme -¿- ¿+ ©5+©+2+EE2EE£SEE£EEEEEEEErEerrkrrkerred 21Hiệu suất cố định từ các chất mang có nguồn gốc khác nhau 24Thành phần hóa học của dau oli ve +2 ©<©5£©£+£++£+zvrsvrsrrecred 3lCác thiết bị sử dụng cho thí nghiệm 2- 2 2© 2 S2+E££ES£E£EE£EEeEErrxrrxee 32Hóa chất sử dụng :- 2-52 S22 EEE112E111121111102121.11111 1111111 crk 32Các phương pháp xác định tính chất của chất mang LDHs 34Các phương pháp xác định tính chất e nzyme .2- 5-5252 s2 +2£+zccs2 34Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu suất cô định CTZYME «5 c< << c2 36Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính của enzyme cố định -s scc«: 38Bố trí thí nghiệm tái sử dụng của hệ enzyme cố định scsccscxsesred 40

Các phương pháp phân tích đánh giá - 5 <5 5< + £sseseeeeeeseeee 41Hàm lượng protein trong enzyme PPL - 5< << £+s + Exeseeeeees 44

Kết quả đo độ hap thu PPL ở bước sóng 620 nm -. .2- 2: 525252 45

Hoạt tính riêng của enzyme tỰ O - - 5 5< s1 ng ke 46

Kết quả đo diện tích bé mặt riêng trước và sau khi C6 định -. : 51Ảnh hưởng của ty lệ mol Mg/AI lên hiệu suất cố định 52

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất cố định -+ 2s s2 z+zs+zszcsze 55

Bảng 3 8 Anh hưởng cua nhiệt độ lên hiệu suất cố định CNZYMEC -<c<«- 57

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian cố định lên hiệu suất cô định của enzyme 58Bang 3.10 Anh hưởng của van tốc lắc đến hiệu suất có định enzyme 60

Hình 1.1 Cau trúc phân tử Porcine Pancreas lipase (PPL) - c5 c5<ccs¿ 2

Hình 1.2 Hoạt động xúc tác của enzyme thông qua co-ÏIpaSe « «5s «<<s<2 2

Hình 1.3 Cau trúc đóng mở của enzyme lipase -+- 2 2 52 5£+£+£x£vzvrsecsecsed 3Hình 1.4 Cau trúc LDHs Mg/Al C32” - 2222 5<2S2SEE2EEEEEE112211212 1112123 xe 14

Hình 3.1 Bản điện di trên gel của enzyme lipase thu nhận từ Candida rugosa va Porcine

7/1527 00ẼẼẺ8e.h 43

Hình 3.2 Giản đồ XRD mẫu LDHs tỷ lệ Mg/AL 2:1 trước khi nung 47

Hình 3.3 Giản đồ XRD mẫu LDHs tỷ lệ Mg/AL 2:1 sau khi nung ở 4509C 47

Hình 3.4 Giản đồ XRD mẫu LDHs ty lệ Al/Mg 2:1 sau khi b6 sung đệm và enzymePorcine PanCr€@s ÌIDAS© _ s0 HH TH nh ng 48Hình 3.5 Ảnh chụp SEM mẫu LDHs tỷ lệ AL/Mg 2: l - 5252 ©5<ccsecceeẻ49Hình 3.6 Ảnh chụp SEM mẫu LDHs tỷ lệ AL/Mg 3: - 52 ©5<5c<+©5<e:49Hình 3.7 Ảnh chụp SEM mẫu LDHs tỷ lệ AL/Mg 4: 1 - 52 ©5<ccs+c5<ee 50Hình 3.8 Phân bố kích thước hạt của vật liệu LDHs tỷ lệ kim loại Mg/AI 2:1 51

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của hệ enzyme - . - 62

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên ho ạt tính của hệ enzyme cố định 64

Hình 3.11 Ảnh hưởng của vận tốc khuấy lên hoạt tính của hệ enzyme có định 65

Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chat/enzyme lên hoạt tính của hệ enzyme 67Hình 3.13 Số lần tái sử dụng của enzyme cố định -2scs+cczcrssrsscseee 69

LỜI MỞ ĐẦUXúc tác sinh học ngày càng phố biến trong công nghệ thực phẩm, sinh học và yduoc với các ưu điểm vượt trội như: thân thiện với môi trường, an toàn cho sức khỏe của

con người, có tính xúc tác đặc hiệu cao nên sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao hon

so voi việc sử dụng chất xúc tác hóa học Tuy nhiên, việc sử dụng chất xúc tác sinh họcvan còn tôn tại một số hạn chế như: enzyme tự do khó tách ra khỏi sản phẩm, khó ngừngphản ứng và phải sử dụng các tách nhân biến tính protein để bất hoạt enzyme, không thuhồi và tái chế được Để khắc phục nhược điểm này, người ta tiến hành cố định enzymelên chất mang để dễ dàng tách enzyme ra khỏi cơ chất khi muốn ngừng quá trình phản

ứng và có thê tái sử dụng enzyme cho những lân sau.

Trong sản xuất công nghiệp, enzyme lipase là một trong số những enzym có tính

ứng dụng cao, đặc biệt là lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm dé thu được những sản phẩm

có lợi cho sức khỏe con người Enzyme lipase có bản chất là protein, hoạt động xúc táctại bề mặt liên pha dầu — nước, tan trong nước cho nên khi ở trạng thái tự do, rất khó détách enzyme lipase ra khỏi môi trường phản ứng Dé góp phan tìm hiểu, cải tiến và tăngkhả năng ứng dụng enzyme lipase trong sản xuất thực phẩm nói riêng và các ngành côngnghiệp khác, chúng tôi tiễn hành nghiên cứu cô định enzyme Porcine Pancreas trên chấtmang hydrotalcite Mg/Al- CO3? đã nung 6 450°C dé làm xúc tác trong phản ứng thủyphân dầu béo

1.1 Enzyme Porcine pancreas lipase (PPL) [1]1.1.1 Dinh nghia

Porcine pancreas lipase là phan tử protein hình cầu bao gồm mach don chứa449 amino acid Khối lượng phan tử khoảng 50-52 kDa Thể tích mỗi phân tử 4.6

Vùng C có cấu trúc kẹp, bao gồm từ 337-449 aminoacid thực hiện những phản

ứng xúc tác chuyền biệt nhờ hoạt động của colipase Colipase là một phân tử protein

nhỏ có khối lượng phân tử khoảng 10 kDa [1]

C-Terminal ree}Domain S `

Cơ chất

Phức hợp cơ chất- colipase-enzyme hoạt hóa

trung tâm hoạt động Khi có mặt nhiều nước trong cơ chất, phản ứng thủy phân đượcưu tiên Hoạt tính của lipase đạt cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặtphân pha dầu nước Quá trình đó được gọi là quá trình hoạt hoá phân pha.

Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phan ứng ester hoa

được ưu tiền Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặchiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất (Woolley P và S

B Petersen, 1992).

tác sẽ thực hiện phản ứng thủy phân Bộ ba được định hướng khi một trong số cácnguyên tử oxygen ở phan cuối của Asp176 liên kết với một nguyên tử nitrogen trongvòng histidine bằng liên kết hydro, giúp cho His263 được định vị để nguyên tửnitrogen khác tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser152 Liên kết hydro thứhai này kéo hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxygen một cách tương đối, vớiđịnh vị nay thi enzyme san sang dé hoạt động.

Bước đầu tiên của phan ứng xảy ra dựa trên phản ứng thé ái nhân của serine vacủa carbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser152 Tác nhân ái nhân lànhóm OH của serine mang điện tích âm tan công vào trung tâm tích điện dương củacarbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa carbon glycerol thứ nhất và oxygencủa este yếu đi Oxygen trong liên kết este trở thành nhóm linh động (leaving group)và được thêm một proton H” vào từ nhóm OH’ của Ser152 để trung hòa điện tíchâm Khi oxygen nhận được H”, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thànhvà hoàn toản tự do Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxygencủa Ser152, tuy nhiên liên kết này phải bị phá vỡ dé enzyme duy trì chức năng

Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyểncủa diglyceride từ nửa đang chứa glycerol Dé giải phóng ra phân tử glycerol, cầnmột nhóm hydroxyl để liên kết với carbon đầu tiên của glycerol và một ion H* để

thêm một proton trở lại vào oxy của Ser152 Một phân tử nước ở môi trường ngoài

cung cấp các thành phân cần thiết này Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bịphân ly thành H* và OH’ Do sự hình thành cau nối hydro giữa H* với OH’ của hai

phân tử nước khác nhau, ion hydronium (H30") được hình thành lon hydronium có

một momen lưỡng cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhần lên carbonglycerol đầu tiên Thời điểm nay, oxygen của Ser152 rời khỏi nhóm Chuỗi bên cạnh

tích điện âm của Ser152 nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H” từ nước Lúc

này, sản phẩm diglyceride được hình thành Liên kết hydro giữa nitrogen thom của

Phản ứng thủy phân tiếp theo xảy ra để xúc tác diglyceride vừa mới hình thànhthành một acid béo và một monoglyceride Cơ chế trong trường hợp này giống haibước như với thủy phân triglyceride, ngoại trừ các tan công ái nhân lên carbon thứba của glycerol Cơ chế này cho ra một monoglyceride và acid béo mới từ trung tâmhoạt động và enzyme chuẩn bị tiến đến triglyceride khác [3]

1.1.3 Tinh chất của enzyme Porcine pancreas lipaseKhối lượng phân tử va điểm dang điện

Porcine pancreas lipase là phân tử protein hình cầu Khối lượng phân tử

khoảng 50-52 kDa [4|Điêm đăng điện của enzyme là điêm pH mà tại đó enzyme trung hòa về điện.

Đối với PPL thì điểm đăng điện ở pH 6.5

Hoạt tính của enzyme Porcine pancreas lipase

So với lipase thu nhận từ các nguồn như từ vi sinh vat, PPL ít pho biến hơn.Tuy nhiên, PPL lại có hoạt tính và độ ôn định cao trong môi trường ky nước để thực

hiện các phản ứng thủy phân và ester hóa |4]

Bảng 1.1 Hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ các nguồn khác nhauNguồn thu nhận enzyme Hoạt tính enzyme/ cơ chất ( U/mg)

Aspergillus niger 0.2 /trioleinAspergillus oryzae ~50 /triolein

Aspergillus sp ~0.2a /triacetin

Chromobacterium 2000-8000 b/olive oilHuman pancreatic >250 b/1.2 diglyceride

Mucor miehei >4000 a /olive oiMucor javanicus >300a /olive oilPenicillium camembertii >50a /vinyl laurate

Porci ti `gang 100-400 b/triacetin hay dâu olive(Type I)

Pseudomonas cepacia >30 a/triolein

Pseudomonas >160 a/trioleinfluorescens

Pseudomonas sp >15a /triglycerideRhizopus arrhizus ~10a /tributyrin hay triolein

Rhizopus niveus >1.5 / dau olive

Hoạt tinh cua enzyme Porcine pancreas lipase nói riêng va enzyme lipase

được xác định thong qua hoạt độ (độ hoạt động) cua enzyme, bang cach xac dinhlượng co chat bi mat đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng

Hoạt độ cua enzyme được định nghĩa như sau: một đơn vi hoạt độ cua enzymelà lượng enzyme chuyên hóa một micromol co chat hoặc một micromol sản pham

Tính đặc hiệu cơ chất [1]

Lipase (EC.3.1.1.3) là enzyme xúc tác trong quá trình thuỷ phân các triglyceride

không lẫn nước ở mặt phân cách dầu — nước Các chất tạo thành của quá trình thuỷ

phân là 1,2- hoặc 2,3- diglycerit; 2-monoglycerit; 1- hoặc 3- monoglycerit va

glycerol Lipase là chất xúc tác thuỷ phân chuỗi triglyceride dai hoặc các este metyl

alcohol của một chuối dai các acid béo.Các yêu tô ảnh hướng lên tính chat cua Porcine pancreas lipaseAnh hưởng của chát nhũ hóa

Mục đích chính của việc sử dụng tác nhân nhũ hóa là để làm tăng vùng phânpha dau — nước nhằm làm tăng hiệu quả thủy phân của enzyme Hau hết chất nhũ

hóa không ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme PPL Trong nghiên cứu này chúng

tôi sử dụng gum arabic làm chất nhũ hóa.Gum Arabic được sử dụng pho biến nhất trong quá trình thủy phântriacylglycerol, cung cấp hệ nhũ có thé bao quản vài tuần Gum Arabic tạo hệ nhũbền ma không gây trở ngại cho hoạt động của enzyme Tuy nhiên, nồng độ gum caocó thé làm giảm nghiêm trọng hoạt tính của PPL Gum Arabic có thành phan chínhlà các chuỗi polysaccharide, bao gôm các glucuronic acid O trang thái ion hóathông thường với pH trung tính, nhóm carboxyl của acid uronic có thé phóng thíchH” và tạo môi trường nhũ tích điện âm trên bề mặt

Anh hưởng của pHpH của môi trường ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme do ảnh hưởng tới

mức độ ion hóa của co chat và độ bên protein của enzyme PPL biêu hiện hoạt tính

Bảng 1.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính của enzyme lipase thu nhận từ các nguồn

khác nhau

Vi khuẩn PHopt Nam moc va nam men PHopt

Bacillus sp FH5 8.0 Penicillium candidum 9.0Bacillus coagulans BTS-3 8.5 Candida rugosa 6.5Salinivibrio sp.SA-2 7.5 Aspergillus oryzae RIBI2S 5.5Lactobacilli 6.0 Rhizopus oryzae 7.5Acinetobacter radioresistens 8.0 Cryptococcus sp S2 7.0

Enterobacter agglomerans 8.0Pseudomonas sp 7323 9.0Aeromonas sobria LP004 6.5Acinetobacter sp CR9 5.5Enterococcus 7.5

Anh hưởng cua nhiệt độPPL hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-45°C Hoạt tính đạt tối đa khi thủyphân triaglycerols với khoảng nhiệt độ 35 và 40°C, pH 6.7 -7.5 Ở nhiệt độ trung

bình PPL có khả năng làm việc trong môi trường ky nước.

Ở 35°C PPL vẫn duy trì hoạt tính sau 2 ngày ủ trong đệm phosphate Sau 1 giờ,

duy trì được 85% hoạt tính ở 30°C và 50% hoạt tinh ở 50°C.

Hoạt tính và độ ôn định của PPL trong môi trường ky nước có gia tri rất lớntrong ứng dụng tổng hợp chất hữu cơ Zaks và Klibanov (1985) chứng minh rằngPPL mất hoàn toàn hoạt tinh ở 100°C trong thời gian vài giây ở môi trường ưa nước

Bảng 1.3 Nhiệt độ tối ưu của enzyme lipase thu nhận từ các nguồn khác nhau

¬ Aspergillus

Salinivib »4-2 50 40alinivibrio sp oryzae RIB128

Lactobacilli 30 Rhizopus oryzae 35Acinetobacter Cryptococcus Sp.

; 30 37

radioresistens S2Enterobacter 30

agglomeransPseudomonas sp 30

7323Aeromonas sobria 45

LP004Acinetobacter sp 40

CR9Enterococcus 60

Anh hưởng của các ion kim loạilon kim loại và muôi đóng vai trò quan trọng lên hoạt tính xúc tác của enzyme,

giúp liên kết bé mặt phân tử và hình thành cau trúc Một vai ion nhu Ca?" và Na* cóthể làm tăng hoạt tính của PPL lên 5-10% Muối Ca có thể hòa tan acid béo được

giải phóng trong quá trình thủy phân.Anh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme được chia làm hai

loại chính là hoạt hóa (chất hoạt hóa) và kìm hãm (chất kiểm hãm).s* Chất hoạt hóa

Chat này làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme Các chat nay có bản chat hoá

học khác nhau có thê là các anion, các ion kim loại hoặc các chat hữu cơ có câutạo phức tạp hơn.

s* Chat kìm hãm [6]Các chat làm giảm hoạt độ của enzym gọi là chất kìm hãm (ức ché-Inhibitor),

kí hiệu là I Cac chat này có thê là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kê ca

các protein Các hop chất nay làm giảm hoạt tính lipase bằng cách thay đổi cautrúc lipase hoặc các tính chất bề mặt

Bảng 1.4 Ảnh hưởng các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme

Bacillus thermoleovorans ID-1 Ca**,Zn?* :

Bacillus natto Na”, PO4*> Ca?* Staphylococcus aureus 226 Ca”',Mg”” Mn?*

-Staphylococcus aureus Ca”',Mn”” Coban, KẽmSerratia marcescens 345 Mg”” Fe**,Ni?*, Cu”, He? , Zn?"

Bacillus sp FH5Fe**,Mn?*, Ca?*, Hg”,

Mg””, Ba” Cu”', Co**, Na',Zn””

Acinetobacter sp CR9 Cu?", Mo”', Mg?*, Zn?* Ca?"Acinetobacter baumannii BD5 Mn?*, Ca”', Mg?* Cu*, Zn?*

Rhizopus oryzae - Fe?*, Cu?*, Hg?"Aspergillus terreus Ca”',Mg”” Fe7',N', Cu**, Co**

1.1.4 Ung dung của enzyme Porcine pancreas lipaseỨng dung trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, lipase được sử dụng để cải biến cáctriaglycerol, nâng cao chất lượng của dau thực vật chất lượng thấp khi thay thé các

acid béo no băng các acid béo không no.

Đối với các thực phẩm chế biến từ sữa, lipase được sử dụng để tăng mui vi,tăng độ chín của phomat (Bech, 1992) Nhiều hợp chất hương (Yadav vờ cs., 2008),chất hoạt động bé mặt phi ion (Yu vờ cộng sự., 2008) chất nhũ hoá đã được tong hợp

nhờ xúc tác cua lipase Ricinoleic acid estolide (Bódalo và cộng sự., 2008),monoacylglycerol (Esmelindro và cộng sự., 2008; Kittikun và cộng sự., 2008) da

được tông hợp dé điều chỉnh độ nhớt của chocolate và nhũ hoá cho magarine Xin vàcộng sự (2009) đã dùng lipase xúc tác cho phan ứng tong hợp olein ferulyl — mộtchất có tác dụng như là chất chống oxi hoá trong thực phẩm đồng thời có tác dụngngăn ngừa các bệnh tim mạch, chống viêm và chống ung thư Các polymer sinh họcđã được tổng hợp nhờ xúc tác lipase Các polymer này được ứng dụng trong côngnghệ thực phẩm làm các màng bao ky nước [1]

Ứng dụng trong hóa sinh dược và y téDo khả năng chọn lọc phản ứng trên nhiều dung môi hữu cơ khác nhau với sựđặc hiệu cơ chất đa dạng, nên lipase có vai trò rất quan trọng trong y dược Akita vàcộng sự (1997) đã tong hop kháng sinh (-) indolmycin từ lipase Jimenez và cộng

Ứng dụng trong mỹ phẩm và nước hoa [8]Monoacylglycerol va diacylglycerol là chất được tong hợp bởi quá trình esterhóa glycerol bằng lipase, chúng là chất hoạt động bề mặt hiệu quả được ứng dụngtrong mỹ phẩm (Pandey va cộng sự., 1999: Kirk vờ cộng sự., 2002) Ester của acidbéo và các đường (lauryl manose) là những chất hoạt động bề mặt được sử dụng đểnhũ hoá trong thực phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp dược (Wenbin và cộng

Ứng dụng trong ngành thuộc daQuá trrình thuộc da là quá trình khá phức tạp bao gồm việc loại bỏ các chấtbéo, rũ lông va làm mềm Quá trình thuộc da thường sử dụng môi trường kiềm, vìthế qua quá trình khảo sát, người ta nhận thấy việc sử dụng lipase đem lại hiệu quảrất cao Một số sản phẩm lipase đã được thương mại hóa sử dụng cho công nghệthuộc da: Greasex®, NovoCor® ADL; dét: Novozym® 735; giấy: Resinase® Lợi thécủa việc sử dụng lipase là màu sắc được giữ nguyên và sạch Lipase cũng cải thiệntính không thấm nước của da va da không bị vết hoen 6 như sử dụng dung môi vachất hoạt động bề mặt [6]

1.2 Hydrotalcite (LDHs)1.2.1 Dinh nghia

Hydrotalcite là hỗn hop hydrocide của kim loại hoá trị II và kim loại hoá tri IIL,tạo thành các lớp bát diện mang điện tích dương Dé cấu trúc trung hoa về điện tích,các anion bị hydrate hoá được xen vào khoảng trống giữa hai lớp bát diện [4]

Công thức tổng quát của Hydrotalcite có dạng:

Đề cau trúc được trung hoả về điện tích, các anion X có điện tích m bị hydrate

hoa được định vi ở lớp trung gian, X là các anion vô cơ hay hữu cơ như:- Anion halogen: F°, Cl, Br

- Oxo anion: NOs, SOa7, CO3”

1.2.2 Tinh chatTrong cầu trúc của LDHs, các kim loại hóa trị II va III nằm trong các bát diệnvà liên kết với nhau bằng gốc hydroxyl nằm tại đỉnh các bát diện tạo thành các lớphydrocides Các lớp hydrocides xếp chồng lên nhau và liên kết với nhau bang liênkết hydro, hình thành nhiều lớp hydrocides.

Tính chất trao đối ionTính chất đặc biệt của LDHs là các anion xen giữa hai lớp hydrocides có khanăng trao đối với các anion vô cơ hoặc hữu cơ khác Độ dày của lớp anion giữa hailớp hydrocides được quyết định bởi kích thước của anion Tùy theo điều kiện điềuchế, có thé thay đôi được lớp điện tích dương của lớp mang và pH của LDHs bằng

cách lựa chọn tỷ lệ kim loại hóa tri II / hóa tri HI thích hop, hoặc sử dụng các kim

loại khác nhau trong thành phần vật liệu LDHs có điện tích bề mặt lớn, khả năng

trao đôi anion cao và ôn định đôi với nhiệt độ.

Tính hấp phụ - hiệu ứng trí nhớLDHs đã được xử lý nhiệt có một tinh chất đặc biệt là khả năng tái cầu trúc trởlại — hiệu ứng “trí nhớ” Ở điều kiện bình thường, LDHs là những lớp hydrocidessong song xếp chồng lên nhau Khi được nung ở nhiệt độ dưới 200°C, chỉ có nướctrên bề mặt và nước xen giữa của LDHs bị mất đi; ở nhiệt độ giữa 250 và 450°C, cảCO? và nước bị tách ra khỏi vật liệu Tại 450 — 500°C, cau trúc lớp của LDHs bi matđi và tạo nên các hỗn hợp oxide kim loại hoạt động cao với sự ôn định nhiệt độ, diệntích bề mặt lớn, câu trúc tỉnh thể nhỏ, có tính ốn định cao đối với các điều kiện khắcnghiệt Các sản phẩm đã nung này có thé được tái cau trúc lớp trở lại như ban đầubằng cách hút nước trở lại và hấp phụ các anion khác nhau Tuy nhiên, nhiệt độnung không được quá 800°C, vì nếu nung LDHs quá 800°C thi LDHs sẽ không táicau trúc trở lại được Nhiệt độ nung LDHs phải đủ cao để đây nước va CO? ra khỏi

vật liệu, nhưng đủ thap cho việc tái cau trúc trở lại.

Nhu vậy, LDHs đã nung có các đặc điểm tốt hơn LDHs chưa nung là: (1) điệntích bề mặt tang, do đó độ xốp tăng: (2) nước và các anion ở lớp xen giữa ít hơn, taođiều kiện thuận lợi cho quá trình cô định của enzyme cũng như các anion khác thévào dé dang hon Day cũng là một cơ chế cố định của enzyme lên LDHs.

1.2.3 Phương pháp chế tạo

Có ba phương pháp điều chế LDHsPhương pháp đồng kết tủa

Đây là phương pháp đơn giản và thông dụng nhất Trong phương pháp nảy,người ta sử dụng các ion kim loại hóa tri II và HI cùng anion xen cài như tiền chất,trong đó Mg và AI được sử dụng phố biến nhất Có hai phương pháp đồng kết tủa làđồng kết tủa tại nồng độ quá bão hòa thấp và kết tủa tại nồng độ quá bão hòa cao

= Dong kết tủa ở nồng độ quá bão hòa thấp (low supersaturation): được thựchiện bang cách bố sung chậm hỗn hợp của các muối kim loại hóa tri H và hóa trị IIvới tỷ lệ thích hop, tiến hành phản ứng trong dung dịch chứa anion xen cai

= Dong kết tủa ở nông độ quá bão hòa cao (high supersaturation): Điều chỉnhpH ở mức mong muốn để tránh hiện tượng ngưng kết các kim loại, tiễn hành phanứng trong môi trường có ion kim loại hóa trị II, III và ion xen cai mà không cần bố

sung từ từ như ở phương pháp trên So với phương pháp low supersaturation thì

phương pháp nảy ít tốn nguyên liệu hơn, cho lượng sản phẩm nhiều hơn.Sau khi kết tủa, hỗn hợp phản ứng sẽ được gia nhiệt để tăng năng suất kết tinhcác vật liệu, tiếp theo là thực hiện quá trình lão hóa trong vòng vai gid đến vài ngày.Đề đảm bảo độ tinh khiết cho vật liệu trong quá trình tong hop, sử dụng nước tinh

khiết khử carbonate, khuấy đảo mạnh kết hợp với việc su dụng nito để làm sạch

Dé rút ngăn thời gian phản ứng, tăng lượng tinh thé tạo thành va cho kíchthước tinh thé nhỏ hon, Zhao và các cộng sự (2002) đã sử dụng biện pháp tạo mamtinh thé sau đó tiễn hành các bước còn lại như trên.

Phương pháp trao đổi ionTiến hành khi phương pháp đồng kết tủa bị hạn chế và không thể tiến hành docác cation hóa trị II và III không 6n định trong môi trường kiềm, hay khi sự kết hợpgiữa hai cation này với anion xen cài không thuận lợi Người ta sẽ tiễn hành chế tạohydrotalcite với các cation mong muốn và một loại anion xen cải có tính tương thích

với các cation được chon tot hon.

Dua vào “hiệu ứng trí nhớ” của chat mang hydrotalcite Dé thay doi anion xencài trong LDHs, người ta tién hanh nung ở nhiệt độ cao, khi đó LDHs sẽ loại bỏnước, anion xen cài, nhóm hydroxit để trở thành một hỗn hợp oxit kim loại Sau khinung hydrotalcite có khả năng tái cau trúc khi tiếp xúc với nước hoặc anion xen cài(không bắt buộc phải là anion xen cài ban đầu) Do đó, trong phương pháp nàyngười ta thường chế tạo chất mang hydrotalcite với anion xen cài tương thích, sauđó nung ở nhiệt độ cao để đuôi nước và anion nay ra khỏi chất mang Dé đưa anionxen cải mong muốn vào hydrotalcite vừa chế tạo, tiến hành ngâm hydrotalcite vừanung trong dung dịch chứa anion xen cải mong muốn, anion này có thể là anion hữu

cơ hoặc vô cơ.Phương pháp thủy nhiệt

Được sử dụng khi anion xen cài là 1 anion hữu cơ có ái lực liên kết với chấtmang hydrotalcite thấp và hai phương pháp đồng kết tủa và trao đổi ion không thé

thực hiện được.

Đề tiễn hành theo phương pháp nay, các cation kim loại va anion xen cài đượcđồng nhất trong hỗn hợp methanol-toluen, kiểm soát thủy phân, sự đông lai, xử lý

thủy nhiệt, và cuôi cùng khô siêu tới hạn cua dung môi Dé thu được chat mang

hydrotalcite có kích thước nhỏ và bề mặt lớn hơn [7]

1.2.4 Ứng dụng

Trong y dược

Ung dụng của Mg/Al — COs” trong y dược là dé điều trị loét bao tử nhờ vào

việc kích thích hoạt động của acid clohydric và pepsin có san trong dich dạ dày

Anion trao doi trong hap phuHydrotalcite có thé được sử dung như một chất trao đổi ion trong những điềukiện khắc nghiệt như làm lạnh nước trong lò phản ứng hạt nhân

Ngoài ra, hydrotalcite còn vai trò có định các ion trong chất thải trong nghiệp

đề làm sạch nước thải ra môi trường.

Hydrotalcite có khả năng tách stero nhờ phản ứng trao đối ion Các stero nayhấp phụ lên đồng phân L hay D phụ thuộc vào tính chất của lớp xen cài

Ứng dụng trong công nghiệpHydrotalcite ứng dụng làm vật liệu dẫn điện Một ứng dụng khác trong côngnghiệp là làm vật liệu chống cháy nhờ bổ sung một số hóa chất có tính năng dẫn lửachậm hay không bắt lửa

Hydrotalcite còn ứng dụng trong việc nén khuôn nhờ tinh chất đặc biệt

1.3 Enzyme cố định

1.3.1 Dinh nghia

Enzym cố định là những enzyme được gan lên trên những chất mang khônghoà tan trong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được khả năng xúc tác, có thể sửdụng lặp lại nhiều lần (Jegannathan vờ cộng sự, 2008) [8]

1.3.2 Các phương pháp có định [8] [9]Có 4 nhóm phương pháp có định enzyme lên chất mang:Phương pháp hấp phụ

Phương pháp cô định enzyme được sử dụng pho biến nhất là phương pháp hấpphụ vật lý không thông qua liên kết hoá trị Quá trình thực hiện hấp phụ khá đơngiản: chất hap phụ va enzyme được trộn lan với nhau trong một khoảng thời giancho phép sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác của các liên kết ion, ky nước, hydrogen và

lực Van der Wals (Jegannathan và công sự, 2008) [8]

Phương pháp bẫy

Nguyên tắc của phương pháp này là gói enzyme vào trong khuôn gel bangcách trùng hợp hoá gel khi có mặt đồng thời gel và enzyme Sau khi kết thúc quá

trình trùng hợp của gel thì enzyme được gói trong các khuôn gel đó.

Phương pháp cô định enzyme liên kết cộng hóa triCố định enzyme bằng liên kết đồng hoá trị với các polymer đã được hoạt hoálà một trong những phương pháp có định enzyme phố biến nhất, đảm bảo liên kếtvững chắc của enzyme với chất mang Bản chất của phương pháp này là enzymeđược gan với chất mang thông qua cầu nối Cau nối có kích thước không lớn và có

hai dau, một đâu noi với chat mang polymer, dau còn lại nôi với enzyme.

Phương pháp cố định bang liên kết chéoPhương pháp này hoàn toàn không dùng chất mang mà dùng các nhóm chức

kép có hai nhóm chức ở hai dau hoàn toàn giông nhau, phan ứng với các phan tử

enzyme khác nhau tạo thành liên kết chéo của chúng, liên kết các phân tử enzymelại thành những phân tử lớn hơn, không tan, có thể tách bằng phương pháp lọc hoặc

Tương tác giữa enzyme lipase và

chất mang yếu vì vậy enzymeđã có định nhạy với pH, lực ionvà nhiệt độ Khả năng hấp phụlà nhỏ và protein có thể bị tách

ra khỏi chất mang

Liên kết cộng

hóa trỊ

Enzyme đã có định ônđịnh hơn vì lực liên kếtgiữa protein và chất mang

vi rộng của chất mang và

enzyme.

Các enzyme đã cô định luôn cósự chuyển khối bị giới hạn trong

suốt quá trình xúc tác, vì vậy

enzyme lipase chỉ xúc tác hiệu

quả đối với các cơ chất có khốilượng phân tử thấp

1.3.3 Các kỹ thuật cô định enzyme Porcine pancreas lipaseHiện nay, Porcine pancreas lipase đã được cô định bằng nhiều kỹ thuật khácnhau như hấp phụ vật lý, liên kết cộng hóa trị, hấp phụ vật lý và liên kết cộng hóatrị, bay

Bang 1.6 Các kỹ thuật cô định enzyme

hoa hướng dương va các rượu mach

ngănSilica xốp Thủy phân triacetinHạt nano từ tính Thủy phân dầu oliuChitosan (dạng phiến mỏng và

dạng bột)

Ester hóa tach butanol và acid

butyric, thủy phân dau oliu

Amberlite IRA-938 Tổng hợp các isovalerate pentyl

Zeolit MCM 22 với các ty lệSi/ Al khác nhauEster hóa acid oleic va ethanolCac hat nano tu tính có phủ

Alkyl benzenesulfonate Thuy phan dau oliuNhựa thông có lỗ xốp lớn San xuât dau diesel sinh học băng

việc rượu phân dâu hướng dương

Liên kết

cộng hóa trỊ

Hạt poly acryamide(Akrilex C 100) Thuy phan dau oliu

Ma trận của hỗn hop silica va

polyvinyl acohol

Tông hợp dau diesel sinh học từ daucọ ba-ba-su và các rượu mạch ngănHạt chitosan Tổng hợp dầu diesel sinh học từ dầu

cây ngón biên và các methanolAIPOx vô định hìnhThủy phan ethyl acetate

Hỗn hợp poly urethane ưa nước Thuy phân các triacylglycerol

Liên kết

cộng hóa trỊ

Các hạt vi cầu từ tính đượctổng hợp bởi phương pháp

trùng hợp glycidylmethacrylate, acid methacrylic

và divinylbenzene, có sự hiệnđiện của acid oleic đã phủ các

hat nano FezOa

Thủy phân dầu oliu và tổng hợp

hexyl acetate

Polyvinyl alcohol Thủy phân tributyrin va este hóa

n-butanol và acid octanoicThuy phan tributyrin

Hap phu vat lyva lién két Cac hat agarose phu Thuy phan enantioselective cua

cộng hóa tri polyethyleneimine glycidyl butyrate

Tong hop dau diesel sinh hoc bangSepiolite quá trình chuyền ester hóa dau hướng

dương với ethanolSilica aerogelEster hóa acid butyric với oleyl và

1soamyl alcoholsCac gel vi nhũ tương của

isooctane—water—AOT [sodium

bis-(2-ethylhexyl)sulphosuccinate |

Thuy phan regioselectivity cua cacpolyphenolic perpropanoate

Cac hat silica x6p Thuy phan triacetyl va dau oliu

1.3.4 Tinh chất của enzyme có địnhEnzyme cố định thường có hoạt tính thấp hơn enzyme tự do Tuy nhiên,enzyme có định thé hiện ưu thé vượt trội so với enzyme tự do ở biên độ hoạt độngrộng trong môi trường khắc nghiệt.

Năm 2009, Hong-yan Zeng và cộng sự nghiên cứu cố định lipase thu nhận từ

Saccharomyces cerevisae lên Al-Mg hydrotalcite [10]

e Enzyme cô định duy trì hoạt tính ở khoảng nhiệt độ và pH rộng hơn so với

Li Yanjing và cộng sự (2009) đã có định enzyme Porcine pancreas lipase lênvật liệu xốp SBA — 15 dạng sợi để thủy phân triacetin Kết quả cho thay hoạt tínhcủa lipase có định giam nhiều, chi đạt được 40% so với hoạt tinh của lipase tự do.Nhìn chung, enzyme khi gan trên bề mặt chất mang thì diện tích tiếp xúc với co chatkhông hoàn toàn như enzyme tự do dẫn đến hoạt tính của enzyme cố định giảm.Ngoài ra, khi enzyme được gan lên chất mang cấu trúc của enzyme bị thay đổi,trung tâm hoạt động của enzyme bị che khuất nên hoạt tính của enzyme cố địnhthường thấp hơn so với enzyme tự đo

Trong một số phương pháp cô định như liên kết cộng hóa trị, enzyme thường bị biéntính do có sự xuất hiện của một số chất lạ trong quá trình cố định

Mặc dù vậy, cũng có một sỐ nghiên cứu cho thấy hoạt tính của enzyme cô địnhcao hon enzyme tự do như Lee Dong-Geun vờ cộng sự (2008) cố định Porcinepancreas lipase lên các hat nano từ tính ky nước để thủy phân dầu oliu Hoạt tinhriêng của enzyme có định đạt 9.87 U/mg protein ở tại nồng độ enzyme lipase ban

dau là 0.8 mg/ml, trong khi đó hoạt tính riêng của lipse tự do chỉ đạt 6.37 U/mgprotein [3] Nhu vậy, hoạt tính của enzyme lipase cô định cao hơn so với hoạt tính

của enzyme tự đo.

Othman S.S vờ cộng sự (2001) cô định lipase từ Candida rugosa lên LDHs của

Mg — AI — CO: đã nung ở 200°C và Mg/Al — CO: chưa nung Hoạt tính riêng của

lipase cố định trên Mg/Al — CO3 đã nung, Mg/Al — CO: chưa nung va lipase tự dolần lượt là: 14, 12, 3 mol/phút/mg protein [11] Rõ ràng, hoạt tính của lipase trongtrường hợp cô định cao hơn nhiều so với lipase tự do

Nguyên nhân của hiện tượng nay có thé là do cau trúc chat mang phù hợp vớicầu trúc của enzyme hoặc trong chất mang có ion đóng vai trò là chất hoạt hóa tácđộng lên trung tâm hoạt động của enzyme dẫn đến hoạt tính của enzyme cô định cao

hơn hoạt tính của enzyme tự do.

1.3.5 Các yếu tô ảnh hưởng tới quá trình cô định enzymeẢnh hưởng của chất mang [10]

Theo nghiên cứu của Hong-Yan Yeng (2008) và cộng sự khi sử dụng phương

pháp hấp phụ lượng chất mang thường tất giới hạn vì các lỗ xốp trên bề mặt chấtmang sẽ trở nên bão hòa Khi đó, protein của enzyme không thé hấp phụ lên bề mat

chât mang được nữa.

Bang 1.7 Hiệu suất có định từ các chất mang có nguồn gốc khác nhau [10]

Hoạt tínhLượng protein | Hoạt tính : ` LO;

của enzyme | Hiệu suat côChat mang cm ie ma lo cố định định enzyme

(U/g)

Silicagel 9.3 14 1.5 53Polypropylene 8.1 333 41.1 61Polyethylene 1.5 n.d - 88

Si02 15.7 95 61 76Influsorial earth 20 17 0.9 89

Anh hưởng của pHKhi pH của môi trường chứa enzyme cô định lớn hon pHpzc của LDHs, bề mặt

của LDHs sé mang điện tích âm, lúc này, enzyme và LDHs có cùng điện tích âm Vi

vay, trong khoảng pH cao hon, enzyme sẽ bị đây ra khỏi bé mặt LDHs.Khi pH của môi trường chứa enzyme cố định nhỏ hơn pHpz của LDHs, bề mặt

của LDHs sẽ mang điện tích dương, lúc này, enzyme và LDHs mang điện tích trái

dau, tạo điều kiện cho enzyme hấp phụ trên bề mặt LDHs và enzyme trao đổi với

các anion của LDHs.

Ảnh hưởng của nhiệt độNhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme nhiều hơn là hiệu suất cố địnhenzyme Funda Y và cộng sự (2007) cô định enzyme lipase (Lipozyme-TL IM) lên

hydrotalcite của Mg /AI -CO3? Kết quả cho thay nhiệt độ không ảnh hưởng đếnhiệu suất có định của enzyme.

Ảnh hưởng của tỷ lệ Mg/AI [12]Các nghiên cứu cho thay tỷ lệ Al/Mg ảnh hưởng đến quá trình cỗ định củaenzyme cũng như sự hap phụ của các anion lên LDHs

Ren Lingling và cộng sự (2001) cố định enzyme Penicillin G acylase lênLDHs Zn/AI với các ty lệ 2.0, 3.0, 4.0 Kết quả cho thấy hiệu suất cô định giảm dankhi tăng ty lệ Zn/Al, cụ thé: hiệu suất có định đối với tỷ lệ 2.0, 3.0, 4.0 lần lượt là:

99.4%, 96.7% và 88.2%

Ảnh hưởng của kích thước hạt [4]

Funda Yagiz và cộng sự nghiên cứu sự ảnh hưởng của kích thước hạt trên hiệu

quả có định Kết quả cho thấy kích thước hạt càng min nhỏ thì hiệu suất cố định

càng cao do quá trình hâp phụ của các anion lên chât mang càng lớn.

1.3.7 Khả năng tái sử dụng của enzyme cô địnhKhả năng tái sử dụng là một trong những yếu t6 quan trọng đánh giá tính chấtcủa enzyme cô định vi nó quyết định khả năng ứng dụng trong công nghiệp Theonhiều kết quả nghiên cứu cho thay LPP khi cô định có kha năng tái sử dụng nhiềulần với hoạt tính tương đối 6n định

Kuo Chia-Hung và cộng sự (2011) đã cố định enzyme lipase từ Candidarugosa lên chitosan có phủ các hat nano từ tính Fe:Oa, kết quả sau 20 lần tái sử

dung, enzyme cô định vẫn giữ được 83% hoạt tính so với enzyme ban đầu

Nam 2009, Dong-Geun Lee, Kanagasabai M Ponvel, Mir Kim, Sangpill

Hwang, Ik-Sung Ahn, Chang-Ha Lee cô định porcine pancreas lipase (PPL) lênnhững hat khoáng kích thước nano không thấm nước bang phương pháp hấp phụ