Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu phương pháp trích ly các hoạt chất từ nấm linh chi

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi bằng CO2 siêu tới hạn.. TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong những năm gần đầy, kỹ thuật trích ly dưới sự hỗ trợ của

TỔNG QUAN

Nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) là một loài nấm thường được tìm thấy ở các nước Á Đông Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh Chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ Đây là một loại nấm lớn Tai nấm có dạng hình quạt hoặc thận Mặt trên mũ có vân đồng tâm và trơn bóng Mặt dưới phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti Cuống nấm đặc và cứng, cũng trơn bóng và sậm màu (Sissi và cộng sự, 2011)

Linh Chi từ xƣa đƣợc xem nhƣ thần dƣợc, có khả năng làm trẻ hóa, kéo dài tuổi thọ, trị bá bệnh nên còn có các tên gọi Linh Chi thảo, bất lão thảo, tiên thảo, thần thảo, vạn niên nhung,… (Wasser và cộng sự, 2005)

Ngày nay, theo phân loại nấm Linh Chi của Trung Quốc, các nhà nghiên cứu đã chia nấm Linh Chi ra làm 6 loại theo màu sắc: Xanh, đỏ, vàng, trắng, đen và tím

(Upton 2000; Woo và cộng sự 1999, Zhao và Zhang 1994)

Hình 1.1 Nấm Linh Chi đỏ

Bảng 1.1 Đặc điểm của các loại nấm Linh Chi (Thần nông bản thảo, đời nhà Châu 25 – 22 TCN)

Tên gọi Màu sắc Đặc tính

Thanh chi hay Long chi Xanh Vị chua, tính bình, không độc Chủ trị sáng mắt, bổ gan khí, an thần, tăng trí nhớ

Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc Tăng trí nhớ, dƣỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực

Hoàng chi hay Kim chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc An thần, ích tì khí

Bạch chi hay ngọc chi Trắng Vị cay, tính bình, không độc Ích phổi, thông mũi, cường ý chí, an thần, chữa ho nghịch hơi

Hắc chi hay Huyền chi Đen Vị mặn, tính bình, không độc Trị chứng bí tiểu, ích thận khí

Tử chi hay Mộc chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc Trị đau nhức khớp xương, gân cốt

1.1.2 Thành phần hóa học của nấm Linh Chi

Theo Borchers và cộng sự (1999) trong nấm Linh Chi tươi, nước là thành phần chủ yếu chiếm 90% khối lƣợng Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lƣợng tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác nhƣ kali, can-xi, phốt pho, ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất

Trong một nghiên cứu khác về những thành phần các hợp chất không bay hơi của nấm Linh Chi, Mau và cộng sự (2001) đã xác định đƣợc tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm Linh Chi gồm: tro (1,8%), carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%) Đặc biệt thành phần protein của nấm Linh Chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine Hàm lƣợng chất béo thấp nhƣng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang và cộng sự, 1996; Borchers và cộng sự, 1999; Sanodiya và cộng sự, 2009) Bên cạnh đó, nấm Linh Chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính

3 sinh học nhƣ các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng Hoạt tính sinh học của nấm Linh Chi có đƣợc chủ yếu là do các polysaccharides, peptidoglycan và các triterpenes mang lại (Boh và cộng sự, 2007;

Theo nghiên cứu của Chang và Buswell (2008) thì điều kiện môi trường, giống loài của nấm Linh Chi được xem là yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh Chi

Bảng 1.2 Hàm lƣợng triterpen và polysacharide của 11 loại nấm Linh Chi thương mại ở Hồng Kông (Chang và Buswell, 2008)

Sản phẩm thương mại Triterpen (%) Polysacharide (%)

1.1.2.1 Các polysaccharides và các peptidoglycan

Hàm lƣợng carbonhydrate và hàm lƣợng chất xơ có trong nấm Linh Chi đƣợc xác định lần lƣợt từ 26- 28% và 59% (Mau và cộng sự, 2001) Nấm Linh Chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lƣợng phân tử lớn, các hợp chất này mang hoạt tính sinh học và đƣợc tìm thấy ở tất cả các bộ phận của nấm Linh Chi Nhiều nhóm polysaccharides có thể đƣợc chiết xuất từ thân nấm, bào tử và khuẩn ty Các polysaccharides của nấm Linh Chi có tác dụng sinh học như chống viêm, hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng miễn dịch

(Wachtel-Galor và cộng sự , 2004)

Theo kết quả phân tích, thành phần đường chủ yếu trong polysaccharides của nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum-polysaccharides: GL-PSs) là đường glucose

(Bao và cộng sự, 2001) Ngoài ra, GL-PSs cũng có cấu trúc polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí liên kết β hoặc α khác nhau nhƣ 1-3, 1-4 và 1-6 với các dạng đồng phân -D hay -L (Bao và cộng sự,

2002) Khả năng chống lại sự hình thành khối u của GL-PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng nhƣ tính tan của polysaccharide này (Bao và cộng sự, 2001)

Ngoài ra, nấm Linh Chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm Linh Chi (Upton và cộng sự, 2000)

Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm Linh Chi đã đƣợc phân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus, tăng cường miễn dịch (Ji và cộng sự, 2007) và F3 là một glycoprotein trong cấu trúc có chứa fucose

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội số của 5, ví dụ nhƣ menthol (monoterpene) và β-carotene (tetraterpene) Phần lớn các terpenoid thuộc nhóm alkene, một số có chứa những nhóm chức năng, đa phần các terpenoid có cấu trúc mạch vòng Những hợp chất này đƣợc tìm thấy trên rất nhiều loài thực

5 vật Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lƣợng chất béo Terpenoid đƣợc tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví dụ như hương thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng tăng cường sức khỏe (Haralampidis và cộng sự,

Triterpen là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30 Khối lƣợng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpen có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato và cộng sự, 1997; Zhou và cộng sự, 2007) Trong nấm Linh Chi, cấu trúc hóa học của triterpenes có dạng lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis và cộng sự, 2002) Có hơn 50 triterpenes đƣợc tìm thấy trong nấm Linh Chi Đa số các triterpenes là các acid ganoderic và lucidenic, nhƣng cũng có một số loại khác nhƣ là acid ganoderal, ganoderiol và ganodermic (Chen và cộng sự, 2010)

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của một số triterpen trong nấm Linh Chi (Kubota và cộng sự, 1982; Nishitoba và cộng sự, 1984;Sato và cộng sự, 1986;

Nấm Linh Chi rất giàu hàm lƣợng các triterpen, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm Linh Chi Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, nhƣ khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lƣợng chất béo trong cơ thể

Một số phương pháp trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi

Hemicellulase là nhóm enzyme thủy phân hemicellulose ở thành tế bào thực vật Chúng xúc tác phản ứng cắt mạch các phân tử hemicellulose thành những mạch ogliosaccharide ngắn hơn, sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân là glucose

Hemicellulose là polimer của xylose, galactose, mannose, arabinose, các đường khác và các acid chứa nitrogen của chúng Hemicellulose thường được phân loại theo gốc đường như D-xylan, D-galactan, D-mannan, L-arabinan,… Sau cellulose, hemicellulose là loại carbohydrate polymer tự nhiên phổ biến thứ hai trên trái đất

Chúng có trong tất cả các lớp của thành tế bào thực vật, tập trung chủ yếu ở lớp thứ nhất và lớp thứ hai, nơi có nhiều celllulose và lignin Hemicellulose tạo liên kết ngang giữa các thành phần của tế bào làm cho thành tế bào cứng chắc

Hemicellulose là tác nhân tạo liên kết ngang và nối liền các vi sợi celllulose Chúng cũng có thể liên kết cellulose và các thành phần khác của tế bào (Overend và cộng sự 1985)

Chế phẩm Hemicellulase sử dụng trong nghiên cứu này là Viscozyme L Chế phẩm này bao gồm hỗn hợp các enzyme: arabanase, cellulase, hemicellulase và xylanase (Product sheet of viscozyme L , 2010)

 Arabanase: Enzyme này thủy phân liên kết α-1,5- glucoside trong phân tử arabinogalactan và arabinan (Pastor và cộng sự, 2007)

 Cellulase: Enzyme này tham gia thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, lignin và β-D-glucan (Xu và cộng sự, 2007)

 Hemicellulase: Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucoside trong phân tử galactomannan, glucomannan (Pastor và cộng sự, 2007)

 Xylanase: Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-xylopyranosyl trong phân tử xylan (Pastor và cộng sự, 2007)

1.2.1.2 Ứng dụng chế phẩm hemicellulase trong quá trình trích ly

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng chế phẩm hemicellulase trong quá trình trích ly chất chiết từ thực vật

Guan và Yao (2007) đã sử dụng chế phẩm Viscozyme L để xử lý cám yến mạch nhằm làm tăng hàm lƣợng protein trong dịch trích Chế phẩm đƣợc xử lý tại pH 4.6, thời gian xử lý 2.8 giờ và nhiệt độ là 44 o C Kết quả thu đƣợc là hàm lƣợng protein đạt 56.2%, cao hơn rất nhiều so với phương pháp xử lý bằng kiềm (14.76%)

Puri và cộng sự (2011) sử dụng enzyme hemicellulase hỗ trợ trích ly stevioside từ lá Stevia rebaudiana Với điều kiện xử lý của enzyme hemicellulase (nồng độ:

3% w/w, nhiệt độ xử lý: 60 o C, thời gian: 1h) thì hàm lƣợng stevioside đạt đƣợc là cao nhất (369.23 ± 0.11 μg) Mẫu tiền xử lý với enzyme cho hiệu quả gấp 35 lần so với mẫu không xử lý enzyme

Bih-King Chen và cộng sự (2003) đã sử dụng chế phẩm Gamanase (thành phần chính là endo-hemicellulase) để thủy phân liên kết -1,4-glucoside trong mannan, galactomannan và glucomannan trong cơm dừa Kết quả là hiệu suất thu hồi chất béo đạt 84% Tương tự, Beatriz và cộng sự (2003) đã xử lý cơm dừa với chế phẩm Viscozyme L tại nồng độ 0.6% (w/w), thời gian xử lý là 30 phút thì hiệu suất thu hồi chất chiết đạt 83%

1.2.2 Trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn

Mỗi một chất, trong một điều kiện nhất định, đều tồn tại ở một trạng thái nào đó trong ba trạng thái rắn, lỏng, khí Khi nén một chất khí bằng một áp suất đủ lớn, chất khí đó sẽ hoá lỏng Tuy nhiên tại một giá trị áp suất mà ở đó nếu tăng nhiệt độ,

9 chất lỏng không chuyển về trạng thái khí mà rơi vào một trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn Trạng thái này đạt đƣợc khi nhiệt độ và áp suất của chất đó tăng đến giá trị tới hạn Ở trạng thái này, không có sự phân biệt giữa trạng thái lỏng và khí Chất đó không bị chuyển sang trạng thái lỏng khi tăng áp suất và không bị chuyển sang trạng thái khí khi tăng nhiệt độ (Sihvonen và cộng sự, 1999) Đối với khí CO 2 , trạng thái siêu tới hạn đạt đƣợc ở nhiệt độ 31.1 o C và áp suất 73,7 bar

Bảng 1.3 Nhiệt độ tới hạn và áp suất tới hạn của một số lưu chất thông dụng

Lưu chất Nhiệt độ tới hạn T c ( o C) Áp suất tới hạn P c (×10 5 Pa)

Hình 1.3 Giản đồ pha của lưu chất siêu tới hạn (Sihvonen và cộng sự, 1999)

Hình 1.4 Mặt phân chia pha thể lỏng và thể khí biến mất khi đến điểm tới hạn

1.2.2.2 Tính chất của lưu chất siêu tới hạn

Một lưu chất tồn tại ở trạng thái siêu tới hạn sẽ có khả năng khuếch tán cao giống chất khí do động năng của các phân tử lớn hơn lực hút giữa các phân tử với nhau Mặt khác, chất này cũng sẽ có khả năng hoà tan các chất gần nhƣ một dung môi lỏng do mật độ phân tử lớn (Rozzi và cộng sự, 2002) Ở trạng thái siêu tới hạn của CO 2 , các tính chất hoá lý của dung môi thay đổi

 Hệ số khuếch tán cao hơn chất lỏng

 Độ nhớt và sức căng bề mặt giảm so với chất lỏng

 Tỷ trọng xấp xỉ chất lỏng

 Có thể điều chỉnh khả năng hòa tan bằng cách thay đổi nhiệt độ và áp suất

Vùng siêu tới hạn Điểm tới hạn (P c , T c ) Điểm ba Áp suất

Bảng 1.4 Bảng so sánh đặc tính vật lý của chất lỏng, chất khí và chất lỏng siêu tới hạn (Bork và Korner, 1991)

Tính chất vật lý Chất khí

Chất lỏng siêu tới hạn Chất lỏng

(cm 2 /s) 0.1–0.4 0.7×10 -3 0.2×10 -3 (0.2–2)×10 -5 Độ nhớt (g/cm.s) (1–3)×10 -4 (1–3)×10 -4 (3–9)×10 -4 (0.2–3)×10 -2 Tỷ trọng (g/mL) (0.6–2)×10 -3 0.2–0.5 0.4–0.9 0.6–1.6

CO 2 là dung môi đƣợc lựa chọn ƣu tiên trong công nghệ chiết tách các hợp chất thiên nhiên vì theo Sihvonen và cộng sự (1999), Modey và cộng sự (1996), Henning và cộng sự (1994), Stashenko và cộng sự (1996) CO 2 các ƣu điểm sau:

 Khả năng truyền khối rất nhanh

 Tính chọn lọc cao đối với các cấu tử trích ly

 Là chất trơ về mặt hoá học cho nên phản ứng phụ đƣợc hạn chế

 Không độc đối với cơ thể, không ăn mòn thiết bị

 Điểm tới hạn của CO2 (P c = 73 atm; T c = 30,9 o C) là một điểm có giá trị nhiệt độ, áp suất không cao lắm cho nên sẽ tốn ít năng lƣợng để đƣa CO 2 vào vùng siêu tới hạn

 Độ tinh sạch cao do đó cũng tiết kiệm chi phí cho quá trình tinh sạch

 Có thể tự động hóa Bên cạnh đó, để tăng hiệu quả của quá trình trích ly một nhóm cấu tử có tính chất khác nhau, người ta có thể bổ sung thêm dung môi phụ đóng vai trò là đồng dung môi trong quá trình trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn Trong đó methanol, ethanol và propanol là những lưu chất thường được sử dụng như đồng dung môi

Hình 1.5 Sơ đồ mô hình hệ thống thiết bị trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn

1.2.2.3 Ảnh hưởng của các thông số công nghệ đến quá trình trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn

Theo nghiên cứu của Dunford và List (2003), Fu và cộng sự (2009) các thông số kỹ thuật ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn, cụ thể:

 Nhiệt độ và áp suất xử lý ảnh hưởng đến trạng thái, khả năng khuếch tán của các chất Ngoài ra áp suất cao còn có tác dụng phá vỡ các bào tử góp phần giải phóng các chất (hình 1.6)

 Lưu lượng dòng lưu chất ảnh hưởng đến tỷ lệ dung môi và nguyên liệu, từ đó tác động đến khả năng trích ly

 Thời gian trích ly càng dài thì tác động của lưu chất đến nguyên liệu càng sâu sắc

 Tỷ lệ đồng dung môi ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các cấu tử có các tính chất khác nhau

Bình CO 2 Đồng dung môi

Thiết bị gia nhiệt Lớp hạt thủy tinh

Bể nước lạnh Van hạ áp Đồng hồ lưu lƣợng dòng

Hình 1.6 Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) bào tử nấm Linh Chi (a) Không xử lý; (b) 35 MPa, 2 giờ; (c) 35 MPa, 3 giờ; (d) 30 MPa, 4 giờ;

1.2.2.4 Ứng dụng kỹ thuật trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn

Tình hình sản xuất, chế biến nấm Linh Chi trên thế giới

Một thập kỷ trước, hơn 90 loại sản phẩm từ nấm Linh Chi đã được đăng ký nhãn hiệu và giao thương trên thị trường quốc tế (Lin và cộng sự, 2000) Sản lượng tiêu thụ trên toàn thế giới hiện nay vào khoảng vài ngàn tấn/năm và ngày càng tăng nhanh Trong năm 1995, tổng giá trị thương mại của các sản phẩm từ Linh Chi mang lại vào khoảng 1628 triệu đô la Mỹ (Chang và Buswell, 1999) Các sản phẩm Linh Chi trên thị trường rất đa dạng và được chế biến từ nhiều bộ phận khác nhau của nấm Linh chi nhƣ tai, cuống, bào tử nấm,… Các sản phẩm đơn giản có thể là tai nấm còn nguyên, xắt lát, thái sợi; hoặc nghiền mịn để tạo thành các viên nén, viên nang Một số sản phẩm dạng cao đƣợc sản xuất bằng cách ngâm Linh Chi trong nước nóng hoặc rượu sau đó bốc hơi để thu chất rắn, sau cùng là đóng gói thành phẩm (Chang và Buswell, 2008) Ngày nay, việc áp dụng công nghệ trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn đã giúp gia tăng số lƣợng các thành phần chiết đƣợc từ Linh Chi do nhiệt độ xử lý thấp Nhiều sản phẩm cao Linh Chi thương mại là hỗn hợp

15 của nhiều loại hoạt chất từ Linh Chi và các loại nấm khác như nấm hương, nấm thái dương, nấm kim châm,… Ở Việt Nam, từ hàng ngàn năm nay nhân dân ta đã biết thu hái nấm tự nhiên như nấm hương, mộc nhĩ để làm thức ăn Nấm Linh chi từ thời Lê Hữu Trác và Lê Quý Đôn cũng đã nói đến nhƣ là “Nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam”, đƣợc sử dụng làm một vị thuốc quý Khu hệ nấm của Việt Nam đã xác định có khoảng 1.200 loài nấm ăn và nấm dược liệu Các loại nấm ăn quý như: nấm hương, mộc nhĩ, nấm rơm, nấm thông, nấm mối,…; nấm dƣợc liệu nhƣ: linh chi, vân chi, đầu khỉ, phục linh, đông trùng hạ thảo, phân bổ ở hầu hết các khu vực Bắc, Trung, Nam Việt Nam Các loại nấm ăn cao cấp và nấm dƣợc liệu đang đƣợc nuôi trồng hiện nay: nấm mỡ (Agaricus bisporus), nấm rơm (Volvariella volvaceae), nấm sò (Pleurotus florida), nấm hương (Lentinula edodes), mộc nhĩ (Auricularia polytrycha), nấm linh chi (Ganoderma lucidum)… phần lớn đều đã đƣợc nghiên cứu và nuôi trồng phổ biến ở nước ta Các vùng có nhiều rơm rạ trồng nấm mỡ, nấm rơm, nấm sò trắng; vùng có nhiều mùn cƣa, lõi ngô trồng mộc nhĩ, linh chi với số lƣợng hàng vạn tấn nguyên liệu tạo ra hàng nghìn tấn sản phẩm nấm hàng hóa nội tiêu và xuất khẩu Tổng sản lƣợng các loại nấm ăn và nấm dƣợc liệu của Việt

Nam hiện nay đạt khoảng 250.000 tấn/năm Kim ngạch xuất khẩu khoảng 60 triệu USD/năm Ở Đông Nam bộ và Tây nguyên, nhiều địa phương đang thực hiện dự án trồng và chế biến nấm Kết quả đến nay cho thấy sự phát triển của ngành nấm ở khu vực này là rất khả quan, cả về chỉ tiêu kỹ thuật và chỉ tiêu kinh tế (Mai Liên, 2014)

16 Sau khi tìm hiểu tổng quan tài liệu liên quan đến các vấn đề trong luận văn, chúng tôi nhận thấy rằng:

 Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng chế phẩm hemicellulase để tăng hiệu quả trích ly chất chiết và kết quả đạt đƣợc khá triển vọng Trong đó một vài nghiên cứu đã sử dụng chế phẩm Viscozyme L trong quá trình xử lý nguyên liệu

Tuy nhiên, chúng tôi vẫn chƣa tìm thấy công bố khoa học nào cả trong và ngoài nước sử dụng chế phẩm Viscozyme L để hỗ trợ trích ly trên nguyên liệu nấm Linh Chi

 Các nghiên cứu khoa học ứng dụng CO2 siêu tới hạn trong quá trinh trích ly đƣợc công bố khá nhiều Chúng tôi cũng đã tìm hiểu một vài nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trên nấm Linh Chi cho hiệu quả trích ly tốt hơn phương pháp truyền thống Trong những nghiên cứu này, một số tác giả đã sử dụng ethanol là đồng dung môi để tăng hiệu quả trích ly Tuy nhiên, chúng tôi vẫn chƣa tìm thấy nghiên cứu nào khảo sát cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố kỹ thuật của quá trình trích ly bằng CO2 siêu tới hạn đến hiệu suất trích ly các chất

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề ra những nội dung nghiên cứu nhƣ sau:

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi hỗ trợ bằng chế phẩm Viscozyme L

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi bằng CO 2 siêu tới hạn có sử dụng ethanol là đồng dung môi.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

Trong nghiên cứ ngày, chúng tôi sử dụng nấm Linh Chi đỏ (Ganoderma lucidum) có xuất xứ từ Đà Lạt Tai nấm được sấy khô và nghiền mịn (kích thước hạt cỡ 1×1 mm) bằng máy nghiền trước khi tiến hành thí nghiệm

Chế phẩm enzyme sử dụng là Viscozyme L Viscozyme L là tên thương mại của một tổ hợp các carbohydrase bao gồm: arabanase, cellulase, hemicellulase và xylanase đƣợc cung cấp bởi Novozyme Corp Chế phẩm có xuất xứ từ Đan Mạch

Bảng 2.1 Đặc tính kỹ thuật của chế phẩm Viscozyme L Đặc tính kỹ thuật Thông số

Nhiệt độ xúc tác tối ƣu ( o C) 50 pH xúc tác tối ƣu 4.5-5.5

Chú thích: 1 FBG là lƣợng enzyme cần sử dụng ở điều kiện chuẩn (30 o C, pH 5.0, thời gian xử lý 30 phút) để thủy phân -glucan tạo ra 1 mol glucose/phút

 Hóa chất dùng cho quá trình trích ly

 Ethanol, dạng lỏng 96%, xuất xứ Trung Quốc

 Ethanol, dạng lỏng 99.9%, xuất xứ Tây Ban Nha

 Nước thủy cục đã qua xử lý trao đổi ion và vi lọc

 Hóa chất dùng cho phân tích

 Acetonitrile (loại tinh khiết dùng cho HPLC), xuất xứ Merck

 Acid phosphoric (loại tinh khiết dùng cho HPLC), xuất xứ Merck

 Nước cất (loại tinh khiết dùng cho HPLC), xuất xứ Merck

 Acid Ursolic, dạng tinh thể 99%, xuất xứ Sigma

 Acid Garnoderic A, dạng tinh thể 98%, xuất xứ viện kiểm nghiệm thuốc Việt Nam

 Acid sunfuric, dạng lỏng 98%, xuất xứ Trung Quốc

 Acid percloric, dạng lỏng 99%, xuất xứ Trung Quốc

 Acid chlohidric, dạng lỏng 95% Xuất xứ Trung Quốc

 Acid acetic (độ tinh khiết 99%), dạng lỏng, xuất xứ từ Trung Quốc

 Vanillin, dạng tinh thể 98%, xuất xứ Ấn độ

 Phenol, dạng tinh thể 98%, xuất xứ Trung Quốc

 Glucose, dạng tinh thể 99%, xuất xứ Trung Quốc

Thiết bị trích ly siêu tới hạn của hãng Thar Technologies, thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm, bộ môn Quá Trình Thiết Bị và Dầu Khí, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường ĐH Bách Khoa TP.HCM

Hình 2.1 Thiết bị trích ly siêu tới hạn của hãng Thar Technologies

Thiết bị phân tích HPLC của hãng Aligent Technologies, thuộc phòng thí nghiệm biomass, trường ĐH Bách Khoa TP.HCM

Hình 2.2 Thiết bị phân tích HPLC của hãng Aligent Technologies

Nội dung nghiên cứu

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi hỗ trợ bằng chế phẩm Viscozyme L Đồng thời chúng tôi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hoạt chất từ nấm Linh Chi bằng CO 2 siêu tới hạn Nội dung nghiêm cứu đƣợc trình bày trên hình 2.3

Trích ly với chế phẩm

Viscozyme L Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm Ảnh hưởng của thời gian xử lý Ảnh hưởng của thời gian trích ly

Quy hoạch thực nghiệm, tối ƣu hóa Ảnh hưởng của tỷ lệ đồng dung môi

Trích ly bằng CO2 siêu tới hạn Ảnh hưởng của lưu lượng dòng Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý Ảnh hưởng của áp suất xử lý Ảnh hưởng của thời gian xử lý

Quy hoạch thực nghiệm, tối ƣu hóa

Hàm lƣợng polysaccharides triterpen, chất khô hòa tan

Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu

Trong nghiên cứu trước đây, tác giả Hồ Thị Thu Trang đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly triterpen và hiệu suất thu hồi chất khô hòa tan từ nấm Linh Chi Điều kiện tối ƣu để thu đƣợc hiệu suất thu hồi cao nhất là nồng độ ethanol 60%, nhiệt độ trích ly 70 o C, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 35/1 Một vài thông số thí nghiệm dưới đây dựa theo kết quả của nghiên cứu này

Mục đích của thí nghiệm này nhằm xác định hàm lƣợng triterpen, polysacharide, tổng chất khô hòa tan có trong nấm Linh Chi Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau:

 Độ ẩm: Xác định theo TCVN 4326 – 2001

 Hàm lƣợng triterpen tổng: Cân 5g nấm Linh Chi và bổ sung cồn 96%

(Chen và cộng sự, 2007) theo tỷ lệ 1:35 (w/w) Trích ly ở nhiệt độ 70 o C trong 30 phút, sau đó lọc lấy dung dịch Tiếp tục bổ sung cồn 96% theo tỷ lệ nhƣ trên vào bã rồi tiến hành trích ly tiếp, cứ sau 30 phút đem lọc và bổ sung cồn trích đến kiệt Lấy dịch phân tích hàm lƣợng triterpen

 Hàm lượng polysacharide tổng: Cân 5g nấm Linh Chi và bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1:35 (w/w) Trích ly ở nhiệt độ 90 o C (Huang và Ning, 2010) trong 30 phút, sau đó lọc lấy dung dịch Tiếp tục bổ sung nước theo tỷ lệ như trên vào bã rồi tiến hành trích ly tiếp, cứ sau 30 phút đem lọc và bổ sung nước trích đến kiệt Lấy dịch phân tích hàm lƣợng polysacharide

 Hàm lượng tổng chất khô hòa tan trong nước và trong cồn: Đầu tiên cân

5g nấm Linh Chi và trích bằng ethanol 96% tỷ lệ 1:35 (w/w) và lặp lại nhiều lần tương tự như trích kiệt triterpen Sau đó tiếp tục bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1:35 (w/w) vào trong phần bã Tiến hành trích ly ở nhiệt độ 90 o C trong 30 phút và lặp lại nhiều lần giống nhƣ trích kiệt polysacharide Cuối cùng lấy dịch thu đƣợc đem bốc hơi đến khan để thu hàm lƣợng tổng chất khô hòa tan

2.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hoạt chất từ Linh Chi có xử lý Viscozyme L

Mẫu xử lý với enzyme đƣợc trích ly hai giai đoạn Giai đoạn đầu, Cân 5g nấm

Linh Chi, bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1:35 Chỉnh pH về 5.0 bằng HCl 0.1N và bổ sung enzyme Để mẫu trong bể điều nhiệt tại 50 o C trong 30 phút để enzyme hoạt động Sau đó bổ sung thêm ethanol 96% vào để đạt nồng độ ethanol 60% và đem trích ly ở 70 o C trong 30 phút Tiến hành lọc bằng lọc hút chân không Giai đoạn sau, phần bã bổ sung thêm 35ml nước cất và trích ly ở 90 o C trong 30 phút để trích ly polysacharide Các thông số của giai đoạn sau và thông số trích ly bằng cồn đƣợc cố định Các thông số thay đổi là trong quá trình xử lý với enzyme trước khi tiến hành trích ly

Mẫu đối chứng cũng đƣợc chuẩn bị giống nhƣ trên nhƣng không qua gia đoạn xử lý enzyme

2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm đến hiệu quả trích ly

 Thời gian xử lý: 30 phút

 Thời gian trích ly: 30 phút

2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả trích ly

 Nồng độ chế phẩm: Kết quả thí nghiệm 1

 Thời gian trích ly: 30 phút

Thời gian xử lý: 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90 phút

2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly

 Nồng độ chế phẩm: Kết quả thí nghiệm 1

 Thời gian xử lý: Kết quả thí nghiệm 2

Thời gian trích ly: 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 (phút)

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly hoạt chất từ Linh Chi bằng CO 2 siêu tới hạn Mô tả thí nghiệm

Cân 5g nấm Linh Chi và trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn Sau đó lấy dịch trích đi phân tích

Mẫu đối chứng đƣợc chuẩn bị giống nhƣ giống nhƣ mẫu đối chứng của enzyme

2.3.3.1 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tỷ lệ đồng dung môi đến hiệu quả trích ly

 Lưu lượng dòng tổng: 10g/phút

 Thời gian xử lý: 30 phút

 Áp suất xử lý: 100 bar

2.3.3.2 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của lưu lượng dòng tổng đến hiệu quả trích ly

 Tỷ lệ ethanol: Kết quả thí nghiệm 4

 Thời gian xử lý: 30 phút

 Áp suất xử lý: 100 bar

Lưu lượng dòng tổng: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 g/phút

2.3.3.3 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả trích ly

 Tỷ lệ ethanol: Kết quả thí nghiệm 4

 Lưu lượng dòng tổng: Kết quả thí nghiệm 5

 Thời gian xử lý: 30 phút

 Áp suất xử lý: 100 bar

2.3.3.4 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của áp suất xử lý đến hiệu quả trích ly

 Tỷ lệ ethanol: Kết quả thí nghiệm 4

 Lưu lượng dòng tổng: Kết quả thí nghiệm 5

 Thời gian xử lý: 30 phút

 Nhiệt độ xử lý: Kết quả thí nghiệm 6

 Thông số khảo sát: Áp suất xử lý: 100, 125, 150, 175, 200, 225 bar

2.3.3.5 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả trích ly

 Tỷ lệ ethanol: Kết quả thí nghiệm 4

 Lưu lượng dòng tổng: Kết quả thí nghiệm 5

 Áp suất xử lý: Kết quả thí nghiệm 7

 Nhiệt độ xử lý: Kết quả thí nghiệm 6

Thời gian xử lý: 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 phút

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

2.4.1.1 Định lượng polysacharide bằng phương pháp hấp thu phân tử UV-Vis

 Phương pháp xây dựng đường chuẩn (Lu và cộng sự, 2012; Dubois và cộng sự, 1956):

 Nguyên lý: Dựa trên phản ứng Molisch Các polysacharide và dẫn suất của chúng trong môi trường axit vô cơ đặc bị thủy phân thành đường đơn và tiếp tục bị khử nước tạo thành furfural và hydroxymethylfurfural có khả năng tạo phức màu từ vàng đến cam khi cho phản ứng với phenol Sản phẩm hấp thu cực đại ở bước sóng 483nm

 Tiến hành: Cân chính xác 0,1000 gam D-Glucose cho vào bình định mức

100 ml rồi định mức bằng nước cất, nồng độ D-Glucose là 1 mg/ml (1000 μg/ml)

Lấy 50 ml dung dịch trên pha thành 500 ml, nồng độ D-Glucose là 100 μg/ml Lần lƣợt lấy 0; 25; 50; 75; 100 ml dung dịch Glucose trên pha thành 100 ml, thu đƣợc dãy dung dịch D-Glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 μg/ml

Mỗi mẫu lấy 1 ml cho vào ống nghiệm có nút đậy, thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch phenol 5%, 5 ml H 2 SO 4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi 2 phút rồi làm lạnh ở nhiệt độ phòng 30 phút Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch này ở bước sóng 483 nm, ta thu được các giá trị A1, A2, A3, A4, A5.Từ kết quả thu được, ta xây dựng đường chuẩn

 Phương pháp xác định polysaccharide trong dịch trích nấm Linh Chi (Zhao và cộng sự, 2010)

Dịch trích đƣợc loại protein bằng chloroform Sau khi loại protein, cô đặc dịch trích và bổ sung ethanol 80% với tỷ lệ 1 : 4 giữ trong 24h ở 4 0 C để tủa polysaccharides Tiến hành ly tâm ở 4000 vòng/phút trong vòng 15 phút Sau đó rửa bằng ethanol khan để thu polysaccharide Tiếp tục tiến hành các bước tiếp theo tương tự như phương pháp dựng đường chuẩn

Hàm lƣợng polysacharide trong mẫu thí nghiệm đƣợc xác định theo công thức: y = 121.6x – 1.2882 Trong đó: y: Hàm lƣợng polysacharide (ppm) x: Độ hấp thu quang y = 121.6x - 1.2882 R² = 0.9945

2.4.1.2 Định lượng triterpen bằng phương pháp hấp thu phân tử

 Phương pháp xây dựng đường chuẩn (Lu và cộng sự, 2012)

 Nguyên lý: Nhóm –OH tại vị trí C-3 của phân tử triterpen phản ứng với vanillin trong môi trường acid tạo phức màu tím có độ hấp thu cực đại tại 548.1 nm

 Tiến hành: Cân chính xác 1.15 mg acid ursolic rồi hòa tan vào 10 ml ethyl acetate Lấy 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1; 1.2 ml dung dịch trên rồi đặt vào bồn nước nóng ở 100 0 C để bốc hơi đến khan Bổ sung 0.4 ml dung dich vanillin-acetic acid 5% và 1 ml perchloric acid, đặt trong bồn nước 60 0 C trong vòng 15 phút Sau đó làm lạnh nhanh, và thêm 5 ml acetic acid rồi đặt ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 548.1 nm

Hàm lƣợng acid ursolic (mg) Độ hấp thu quang

 Phương pháp xác định hàm lượng triterpene trong mẫu nguyên liệu (Lu và cộng sự, 2012)

Lấy 10 ml dịch trích Linh Chi hòa tan vào 10 ml ethyl acetate và xác định độ hấp thụ ở bước sóng 548.1 nm giống như phương pháp xây dựng đường chuẩn

Hàm lƣợng triterpen trong mẫu thí nghiệm đƣợc xác định theo công thức: y = 0.1381x + 0.0048 Trong đó: y: Hàm lƣợng triterpen (mg) x: Độ hấp thu quang

2.4.1.3 Xác định triterpen bằng phương pháp HPLC

Theo nghiên cứu của Wang và cộng sự (2006), triterpen đƣợc phân tích bằng

HPLC với đầu dũ UV-Vis, cột Eclipse XDB-C18 (5 àm, 4.6x150 mm) với chế độ vận hành nhƣ sau:

 Lưu lượng dòng: 1ml/phút

 Thành phần pha động: (A) acetonitrile và (B) acid phosphoric 0.03% với tỷ lệ 30% A :70% B

 Đo độ hấp thu ở bước sóng 270 nm

2.4.2 Phương pháp xử lý số liệu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành lập lại ba lần đối với mỗi thí nghiệm Kết quả đƣợc trình bày trong luận văn là giá trị trung bình của ba lần lặp lại và đƣợc tính trên 100g nguyên liệu Để đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu thí nghiệm, chúng tôi xử lý các kết quả thí nghiệm bằng phương pháp thống kê ANOVA (α = 5%) Các phép tính toán đƣợc tiến hành trên phần mềm Statgraphics Centurion XVI

30 Để xác định được các yếu tố và các mức ảnh hưởng của chúng đến hiệu suất thu hồi các chất Thí nghiệm đƣợc thiết kế theo ma trận Plackett-Burman với các yếu tố tương ứng để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thu hồi các chất

Hai yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất được xác định giá trị tối ưu hóa và được nghiên cứu với mô hình CCC (quy hoạch thực nghiệm đƣợc giới hạn quanh tâm) ở 5 mức (-α, -1, 0, +1, +α) Mô hình toán học được biểu diễn bằng phương trình bậc hai:

- : Hệ số tự do - : Hệ số bậc 1 - : Hệ số bậc 2 - : Các yếu tố ảnh hưởng - Y: Hàm mục tiêu Áp dụng công thức: để chuyển đổi biến ảo thành biến thực Số liệu tối ƣu hóa đƣợc xử lý bằng phần mềm Mode 5.0

Bảng 2.2 Thiết kế ma trận Plackett-Burman

Các biến Nồng độ Thời gian xử lý Thời gian trích ly

Bảng 2.3 Thiết kế ma trận quy hoạch thực nghiệm

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát nguyên liệu

Kết quả khảo sát tỷ lệ một số thành phần trong nguyên liệu đƣợc trình bày trong bảng 3.1 Thành phần triterpen, polysacharide và chất khô hòa tan trong mẫu Linh

Chi nghiên cứu lần lượt là 1.603%, 3.340% và 9.074% Trước đây Chang và cộng sự (2008) đã phân tích thành phần triterpen và polysacharide trong 11 loại Linh Chi thương mại ở Hồng Kông, kết quả hàm lượng hai chất này chiếm 0 – 7.82% đối với triterpen và 1.1 – 15.8% đối với polysacharide Tiếp sau đó, Poomsing và cộng sự

(2013) nghiên cứu trên một số loại Linh Chi từ Thái Lan và Trung Quốc thì thấy hàm lƣợng triterpen từ 1.32 đến 3.69% và polysacharide từ 2.92 đến 4.77% tùy loại

Linh Chi Nhƣ vậy kết quả khảo sát nguyên liệu trong nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu trước đó

Bảng 3.1 Tỷ lệ một số thành phần trong nấm Linh Chi

Thành phần Tỷ lệ (%) Độ ẩm 13.221  2.363

Triterpen 1.603 ± 0.015 Polysacharide 3.340 ± 0.010Chất khô hòa tan 9.074 ± 0.065

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly hỗ trợ bằng chế phẩm

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu quả trích ly

Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện trên hình 3.1 Kết quả cho thấy, hàm lƣợng triterpen, polysacchrides và tổng chất khô hòa tan qua xử lý enzyme cao hơn mẫu đối chứng không xử lý enzyme Hàm lƣợng triterpen biến thiên từ 0.053g đến

33 0.667g khi nồng độ chế phẩm Viscozyme L thay đổi từ 0 đến 0.1% (v/w) Hàm lƣợng triterpen không tăng thêm nữa nếu tiếp tục gia tăng thêm nồng độ chế phẩm

So với mẫu đối chứng không qua xử lý enzyme, hàm lƣợng triterpen cao hơn 20.5% ứng với nồng độ chế phẩm 0.1% (v/w)

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Viscozyme L đến hàm lượng triterpen

Tương tự như vậy, hàm lượng polysacharide và chất khô hòa tan tăng thêm khi nồng độ thay đổi từ 0 đến 0.1% (v/w) (hình 3.2, hình 3.3), hàm lƣợng hai hàm mục tiêu này cũng không thay đổi khi nồng độ chế phẩm gia tăng thêm nữa So với mẫu không qua xử lý enzyme thì hàm lƣợng polysacharide tăng lên 15.0% và chất khô hòa tan tăng thêm 20.0% khi nồng độ chế phẩm 0.1% (v/w) Nguyên nhân của sự thay đổi hàm lƣợng các chất là do các enzyme có trong chế phẩm xúc tác phản ứng thủy phân cellulose, hemicellulose trong mạng lưới thành tế bào nguyên liệu, góp phần giải phóng các thành phần chất tan bên trong tế bào chất, từ đó làm tăng khả năng trích ly chất chiết

Nồng độ chế phẩm Viscozyme L (v/v)

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ Viscozyme L đến hàm lượng polysacharide

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Viscozyme L đến hàm lượng chất khô hòa tan

Nồng độ chế phẩm Viscozyme L (v/v)

Nồng độ chế phẩm Viscozyme (v/v)

35 Trước đây, Jing Liu và cộng sự (2008) đã xử lý cám yến mạch bằng chế phẩm viscozyme L ở 44 o C, pH = 4.5 trong thời gian 2.5 giờ, với nồng độ chế phẩm thay đổi từ 6 FBG đến 30 FBG để trích ly protein (1 FBG là lƣợng enzyme cần sử dụng ở điều kiện 30 o C, pH 5.0, thời gian xử lý 30 phút để thủy phân -glucan tạo ra 1

mol glucose/phút) Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nồng độ chế phẩm Viscozyme

L thay đổi từ 6 FBG/10g cám đến 18 FBG/10g cám thì hiệu suất thu hồi protein tăng từ 43.1% lên 50.4%, tức là tăng thêm 11.7% Trong một nghiên cứu của

Sowbhagya và cộng sự (2010), chế phẩm Viscozyme L đƣợc sử dụng để trích ly các hợp chất dễ bay hơi có trong hạt thì là Ai Cập Khi tăng nồng độ Viscozyme L từ 0% lên 0.5% (v/w) thì hiệu suất thu hồi chất chiết tăng từ 2.7% lên 3.3%, tức là tăng thêm 22.2% Nếu tiếp tục tăng nồng độ Viscozyme L lên nữa thì hiệu suất thu hồi không tăng thêm

Nhƣ vậy, nồng độ chế phẩm Viscozyme L thích hợp để xử lý nấm Linh Chi là

0.1% (w/w) Với nồng độ này, hiệu suất thu hồi triterpen là 41.6%, polysacharide là 65.7% và ứng với chất khô hòa tan là 57.6%

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu quả trích ly

Nhìn chung, hàm lƣợng triterpen, polysacharide và chất khô hòa tan trong mẫu xử lý với enzyme đều cao hơn mẫu không xử lý enzyme (hình 3.4, 3.5, 3.6)

Trong đó, hàm lƣợng triterpen tăng dần từ 0.541g đến 0.751g khi thời gian xử lý từ 0 đến 60 phút, tuy nhiên hàm lƣợng này không thay đổi nếu tiếp tục thay đổi thời gian xử lý chế phẩm thêm nữa Với thời gian xử lý enzyme 60 phút thì hàm lƣợng triterpen ở mẫu xử lý cao hơn mẫu không xử lý enzyme 38.9%

Hàm lƣợng polysacharide và chất khô hòa tan biến đổi cùng một quy luật Ban đầu, khi thời gian xử lý tăng dần từ 0 đến 45 phút thì hàm lƣợng hai hàm mục tiêu này cũng tăng tỷ lệ thuận theo thời gian Khi thời gian xử lý kéo dài hơn 45 phút thì hàm lượng polysacharide và chất khô hòa tan có xu hướng giảm là do một số polysacharide có trong dịch trích đã bị thủy phân bởi các enzyme có trong chế

36 phẩm Ứng với thời điểm 45 phút, hàm lƣợng polysacharide và chất khô cao hơn mẫu đối chứng lần lƣợt là 24.9% và 25.2%

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng triterpen

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng polysacharide

Thời gian xử lý với Viscozyme L (phút)

Thời gian xử lý với Viscozyme L (phút)

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng chất khô hòa tan

Một quy luật tương tự đã được kết luận trong nghiên cứu của Jing Liu và cộng sự (2008) Cám yến mạch đƣợc xử lý với chế phẩm Viscozyme L lần lƣợt với thời gian từ 30 phút đến 150 phút ở 44 o C, nồng độ chế phẩm 18 FBG để trích ly protein

Kết quả là khi thời gian thay đổi từ 30 phút đến 90 phút thì hiệu suất trích ly tăng từ 42.9% lên 50.5%, tức tăng thêm 17.8% so với mẫu xử lý 30 phút Nếu thời gian xử lý kéo dài hơn 90 phút thì hiệu suất trích ly không tăng thêm nữa

Tương tự, Puri và cộng sự (2011) sử dụng enzyme hemicellulase để hỗ trợ quá trình trích ly stevioside từ lá stevia rebaudiana Thời gian xử lý enzyme đƣợc thay đổi từ 15 đến 60 phút ở nồng độ enzyme là 0.1% (v/w) Kết quả cho thấy sau 45 phút ủ thì hàm lƣợng stevioside trích đƣợc là 152μg, tăng 72% so với mẫu ủ 15 phút Nếu tăng thời gian ủ lên 60 phút thì hàm lƣợng stevioside không tăng nữa

Như vậy, hiệu suất thu hồi triterpen, polysacharide và chất khô hòa tan tương ứng với thời gian xử lý enzyme 45 phút lần lƣợt là 44.9%, 71.4% và 60.0% Đây cũng chính là khoảng thời gian thích hợp để xử lý Linh Chi với chế phẩm

Thời gian trích ly (phút)

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly

Theo kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trên hình 3.7, 3.8, 3.9 ,nhìn chung trong thời gian đầu, khi hàm lƣợng các chất trong nguyên liệu còn nhiều thì mẫu xử lý enzyme có hàm lƣợng các chất trích ly cao hơn mẫu đối chứng không qua xử lý enzyme Thời gian trích ly càng kéo dài thì độ chênh lệch này càng giảm, nguyên nhân là do hàm lƣợng các chất trong nguyên liệu lúc này không còn nhiều, quá trình khuếch tán diễn ra chậm cho nên tốc độ trích ly giảm Đối với mẫu có qua xử lý enzyme, hàm lƣợng triterpen tăng nhanh đến 1.254g cao hơn 11.6% so với mẫu đối chứng tại thời điểm 150 phút Khi kéo dài thời gian trích ly hơn 150 phút hàm lƣợng triterpen tiếp tục tăng nhƣng tốc độ giảm rõ rệt Trong khi đó, hàm lƣợng polysacharide và hàm lƣợng chất khô hòa tan đạt đƣợc tại thời điểm 90 phút lần lượt là 2.955g , 8.456g cao hơn mẫu đối chứng tương ứng là 5.4% và 15.6% Tiếp tục kéo dài thời gian trích ly hơn 90 phút hàm lƣợng polysacharide và chất khô có tốc độ gia tăng giảm dần Vì vậy thời gian trích ly thích hợp là 150 phút Lúc này, hiệu suất thu hồi đạt được là 78.2%, 94.4%, 94.4% tương ứng với hàm lượng triterpen, polysacharide và chất khô hòa tan

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng triterpen

Thời gian trích ly (phút)

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng polysacharide

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng chất khô hòa tan

Trong nghiên cứu trước của Ths Hồ Thị Thu Trang, khi trích ly trong điều kiện tối ưu với dung môi trích ly là ethanol tương ứng thời gian trích ly 275 phút thì hàm lƣợng triterpen thu đƣợc 1.312g (hiệu suất thu hồi 81.8%), hiệu suất thu hồi chất khô là 9.8% (tính trên chất khô tổng) tương ứng với hiệu suất đạt 93.6% (tính

Thời gian trích ly (phút)

Thời gian trích ly (phút)

40 trên chất khô hòa tan) Nhƣ vậy chúng ta có thể thấy rõ ràng, mẫu có qua xử lý với chế phẩm Viscozyme L giúp rút ngắn thời gian trích ly một cách đáng kể

3.2.4 Tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Đầu tiên, chúng tôi chọn hai yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến hiệu quả trích ly trong ba yếu tố là nồng độ chế phẩm, thời gian xử lý với chế phẩm và thời gian trích ly Để xác định được mức ảnh hưởng của các yếu tố, chúng tôi thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman (phụ lục 2) bằng phần mềm Mode 5.0 Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy nồng độ Viscozyme L và thời gian xử lý có mức ảnh hưởng cao hơn thời gian trích ly (p < 0.05) Chẳng hạn như đối với hàm lượng triterpen thì nồng độ chế phẩm và thời gian xử lý có mức ảnh hưởng lần lượt là 0.161 và 0.137 cao hơn mức ảnh hưởng 0.106 của thời gian trích ly Do đó chúng tôi chọn hai thông số nồng độ chế phẩm và thời gian xử lý cho thiết kế ma trận thực nghiệm để tìm ra giá trị tối ƣu của hai thông số này

Bảng 3.2 Mức ảnh hưởng của các thông số xử lý enzyme đến hiệu quả trích ly các chất

Tên yếu tố Mức ảnh hưởng

Nồng độ Viscozyme L (v/w) 0.161 a 0.292 a 0.965 b Thời gian xử lý (phút) 0.137 a 0.282 a 0.402 b Thời gian trích ly (phút) 0.106 a 0.188 b 0.016 b a Có ý nghĩa ở độ tin cậy α = 0,95; b Không có ý nghĩa ở độ tin cậy α = 0,95

Sau đó, chúng tôi chọn tâm cho hai yếu tố: Nồng độ chế phẩm Viscozyme L X 1 (0.1% v/w) và thời gian xử lý enzyme X2 (45 phút), thời gian trích ly cố định 150 phút; với ba hàm mục tiêu là Y 1 (hàm lƣợng triterpen), Y 2 (hàm lƣợng polysacharide), Y 3 (hàm lƣợng chất khô hòa tan) Thiết kế ma trận thực nghiệm sử dụng mô hình CCC Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả quy hoạch thực nghiệm xử lý với enzyme

Giá trị thực Giá trị mã hóa

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn45 1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đồng dung môi đến hiệu quả trích ly

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đồng dung môi đến hiệu quả trích ly

Sự thay đổi hàm lƣợng các chất theo tỷ lệ đồng dung môi đƣợc thể hiện trên hình 3.13, 3.14 Đối với triterpen, hàm lƣợng của mẫu CO 2 siêu tới hạn (SC-CO 2 ) thấp hơn mẫu đối chứng trích ly bằng ethanol 60% nếu tỷ lệ đồng dung môi nhỏ hơn 10% Nhƣng khi chúng tôi tăng tỷ lệ đồng dung môi hơn 10% thì hàm lƣợng triterpen có xu hướng tăng nhanh và cao hơn mẫu đối chứng Tuy nhiên, tốc độ tăng này không thay đổi đáng kể khi tỷ lệ đồng dung môi cao hơn 14% ethanol Theo

Hsu và cộng sự (2001), việc khai thác bằng lưu chất siêu tới hạn không sử dụng đồng dung môi sẽ không thu đƣợc một số chất phân cực chẳng hạn nhƣ một số triterpen Đồng dung môi không những làm tăng độ hòa tan các chất chiết mà còn tăng cường sự linh động của lưu chất siêu tới hạn, từ đó thu được hàm lượng các chất nhiều hơn Điều này có nghĩa là ethanol làm tăng độ phân cực của lưu chất siêu tới hạn và giúp trích ly đƣợc nhiều triterpen phân cực hơn Ứng với tỷ lệ ethanol 14% thì hàm lƣợng triterpen đạt đƣợc 0.741g, cao hơn mẫu đối chứng 37.1%

Hàm lượng chất khô thu được có quy luật tương tự như triterpen, nghĩa là hàm lƣợng chất khô tăng nhanh với tỷ lệ đồng dung môi 14% và sau đó không có sự khác biệt nếu tiếp tục gia tăng thêm tỷ lệ ethanol Điều này có thể giải thích theo

Lopez và cộng sự (2004), nguyên nhân là do khi tỷ lệ đồng dung môi nhiều hơn thì làm cho tương tác giữa các chất tan trong đồng dung môi cao hơn dẫn đến chúng hòa tan nhiều hơn, nhưng tương tác giữa các chất tan với CO 2 lại giảm đi cho nên hàm lƣợng các chất tan không phân cực ít đi Kết quả sau cùng dẫn đến hàm lƣợng tổng chất khô hòa tan thay đổi không đáng kể thậm chí giảm đi nếu tỷ lệ đồng dung môi có tăng cao Mặt khác hàm lƣợng chất khô thu đƣợc luôn thấp hơn mẫu đối chứng xử lý bằng ethanol 60% là do trong Linh Chi còn nhiều chất tan có độ phân cực cao mà phương pháp SC-CO 2 không trích ly được Với nồng độ ethanol 14% thì hàm lƣợng chất khô thu đƣợc thấp hơn mẫu đối chứng 46.6%

46 Ngƣợc lại, đối với polysacharide thì hàm lƣợng thu đƣợc rất thấp, mẫu cao nhất là 0.013g (phụ lục 3) chỉ bằng 0.7% so với mẫu đối chứng trích ly bằng ethanol

60% Nguyên nhân là do CO 2 siêu tới hạn là dung môi có độ phân cực rất kém chỉ thích hợp để trích ly các hợp chất ít phân cực hoặc không phân cực, trong khi đó polysacharide là hợp chất phân cực cao hơn

Trước đây Chen và cộng sự (2011) cũng đã nghiên cứu trích ly Linh Chi bằng SC-CO 2 , kết quả nếu sử dụng thêm 10% đồng dung môi ethanol thì hiệu suất thu hồi chất chiết là 2.28% cao hơn mẫu không sử dụng ethanol, hiệu suất chỉ đạt 1.47% Kitzberger và cộng sự (2007) cũng nhận thấy rằng, trong nghiên cứu trích ly các chất chống oxy hóa từ nấm hương, khi xử lý bằng SC-CO2 sử dụng đồng dung môi với tỷ lệ 15% thì hiệu suất trích ly nhiều hơn 49% (nếu sử dụng dichloromethane là đồng dung môi) và nhiều hơn đến 59% (nếu đồng dung môi là ethanol) so với mẫu xử lý với SC-CO 2 tinh khiết Mặt khác nếu thay đổi tỷ lệ ethanol từ 5% đến 15% thì hiệu suất thu hồi cũng thay đổi tỷ lệ thuận theo từ 0.57% lên 3.81% Tuy nhiên, đối với dicloromethane, nếu tăng tỷ lệ lên 20% thì hiệu suất giảm đi so với tỷ lệ 15%

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ đồng dung môi đến hàm lượng triterpen

Tỷ lệ Ethanol trong dòng tổng (%)

Hình 3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ đồng dung môi đến hàm lượng chất khô

Như vậy, với tỷ lệ ethanol 14% trong lưu lượng dòng khi xử lý SC-CO 2 , hiệu suất thu hồi triterpen và chất khô hòa tan lần lƣợt là 46.2% và 25.6%, đây cũng chính là tỷ lệ đồng dung môi thích hợp để trích ly các chất từ Linh Chi

3.3.2 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng tổng đến hiệu quả trích ly

Hình 3.15, 3.16 biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng lưu chất siêu tới hạn đến hiệu quả trích ly Chúng tôi nhận thấy hàm lƣợng triterpen đạt giá trị lớn nhất là 0.794g ứng với lưu lượng dòng tổng là 14g/phút cao hơn mẫu đối chứng 46.9% Nếu tăng lưu lượng dòng lên thêm thì hàm lượng triterpen không có sự khác biệt Tương tự, hàm lượng chất khô thu được đạt cao nhất ứng với lưu lƣợng 14g/phút là 2.513g, hơn mẫu trích ly bằng ethanol 60% là 42.3% Hàm lƣợng các chất trích được nhiều hơn theo Dunford và List (2003) là do khi lưu lượng dòng tăng lên thì đồng thời tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cũng tăng theo, do đó hàm lƣợng triterpen thu đƣợc nhiều hơn Tuy nhiên hàm lƣợng cũng chỉ tăng đến một mức độ nhất định khi lưu lượng thay đổi Ngoài ra, chúng tôi cũng thấy rằng hàm lượng polysacharide có thay đổi khi tăng lưu lượng dòng nhưng không đáng kể

Hiệu suất thu hồi vẫn rất thấp chƣa tới 1% (phụ lục 3)

Tỷ lệ Ethanol trong dòng tổng (%)

48 Trong một nghiên cứu của Michielin và cộng sự (2005), khi lưu lượng dòng thay đổi từ 1.85×10 −5 lên thành 4.73×10 −5 kg CO 2 /s thì hàm lƣợng chất chiết thu được sau 720 phút được rút ngắn xuống còn 288 phút Tương tự như vậy, thời gian xử lý sẽ giảm được một nửa nếu tăng lưu lượng dòng từ 1g/phút lên thành 2g/phút trong nghiên cứu trích ly tinh dầu từ hạt quả hồng của Reverchon và cộng sự (2000).

Hình 3.15 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng SC-CO 2 đến hàm lượng triterpen

Hình 3.16 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng SC-CO 2 đến hàm lượng chất khô

49 Như vậy, sự thay đổi lưu lượng dòng sẽ giúp rút ngắn thời gian xử lý Và trong nghiên cứu này, lưu lượng dòng tổng 14g/phút là thích hợp nhất để chúng tôi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Ứng với lưu lượng này, hiệu suất thu hồi triterpen đạt đƣợc 49.5% và chất khô đạt đƣợc 27.7%

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hiệu quả trích ly

Nhìn chung, hàm lƣợng triterpen đạt đƣợc tại các nhiệt độ xử lý SC-CO 2 khác nhau đều cao hơn mẫu đối chứng (hình 3.17, 3.18) Hàm lƣợng triterpen tăng nhanh khi nhiệt độ tiến đến 60 o C và sau đó biến thiên chậm lại Ứng với nhiệt độ xử lý 60 o C, hàm lƣợng triterpen thu đƣợc 0.902g cao hơn 66.8% so với mẫu đối chứng trích ly bằng ethanol 60% Hàm lƣợng chất khô thu đƣợc cũng cùng quy luật nhƣ triterpen Tuy nhiên, hàm lƣợng chất khô hòa tan vẫn thấp hơn 32.1% so với mẫu trích ly bằng ethanol 60% ứng với nhiệt độ xứ lý 60 o C Đối với polysacharide thì hàm lƣợng trích ly đƣợc vẫn không đáng kể Theo Hsu và cộng sự (2001), nhiệt độ tăng làm tăng khả năng truyền khối và khả năng khuếch tán của dung môi siêu tới hạn Michielin và cộng sự (2005) cũng kết luận rằng khi tăng nhiệt độ xử lý từ 303K lên 313K cùng tại áp suất xử lý 20Mpa thì hiệu suất tăng thêm 0.05% (tính trên khối lượng nguyên liệu) Vasapoloo và cộng sự (2004) cũng mô tả ảnh hưởng tương tự khi trích lycopene từ cà chua với nhiệt độ tăng từ 45 o C lên 60 o C thì hiệu suất cũng tăng theo tỷ lệ thuận

Vì vậy, trong nghiên cứu này, nhiệt độ xử lý 60 o C là thích hợp để trích ly các chất từ nấm Linh Chi bằng phương pháp SC-CO 2 Lúc này hiệu suất trích ly đạt được là 56.3% và 32.5% tương ứng với hàm lượng triterpen và chất khô hòa tan

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý SC-CO 2 đến hàm lượng triterpen

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý SC-CO 2 đến hàm lượng chất khô 3.3.4 Ảnh hưởng của áp suất xử lý đến hiệu quả trích ly

Kết quả ảnh hưởng của áp suất xử lý đến hiệu quả trích ly bằng SC-CO 2 được thể hiện trên hình 3.19, 3.20 Hàm lƣợng triterpen và chất khô hòa tan cùng đạt giá trị cực đại tương ứng 0.982g và 3.127g tại áp suất xử lý 150 bar, hàm lượng triterpen cao hơn 81.7% so với mẫu đối chứng nhƣng hàm lƣợng chất khô hòa tan

51 thì thấp hơn 28.2% Hàm lƣợng hai hàm mục tiêu này không thay đổi cho dù áp suất có tăng cao hơn Và cũng giống như các thí nghiệm trước, hàm lượng polysacharide thu đƣợc vẫn rất thấp không đáng kể Theo Hsu và cộng sự (2001), áp suất ảnh hưởng đến tỷ trọng của lưu chất siêu tới hạn, lưu chất có tỷ trọng càng cao thì độ hòa tan các chất càng lớn Tỷ trọng lưu chất gia tăng khi áp lực được tăng lên Mặc dù sự gia tăng hàm lƣợng các chất khô hòa tan là không đáng kể khi thay đổi áp lực xử lý nhƣng sự thay đổi áp suất là quan trọng để gia tăng hàm lƣợng các triterpen Ngoài ra áp suất cao còn có tác dụng phá vỡ các bào tử góp phần giải phóng các chất (Fu và cộng sự, 2009) Michielin và cộng sự (2005) cũng nhận thấy áp suất xử lý cao hơn cũng đem lại hàm lƣợng cao hơn các chất trích đƣợc trong thảo dƣợc Equisetum

Như vậy, hiệu suất trích ly sẽ đạt được lần lượt 62.3% và 34.5% tương ứng với hàm lƣợng triterpen và chất khô hòa tan khi áp suất xử lý SC-CO2 là 150 bar

Chúng tôi cũng chọn áp suất này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Hình 3.19 Ảnh hưởng của áp suất xử lý SC-CO 2 đến hàm lượng triterpen

SC-CO2 Ethanol 60% Áp suất xử lý (bar)

Hình 3.20 Ảnh hưởng của áp suất xử lý SC-CO 2 đến hàm lượng chất khô 3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả trích ly