Bước đầu nghiên cứu loài nấm linh chi mới phát hiện ở vườn quốc gia Cát Tiên tomophagus sp.nov. dựa trên các phân tích về hình thái và sinh học phân tử

HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU LOÀI NẤM LINH CHI MỚI PHÁT HIỆN Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN Tomophagus Sp.Nov DỰA TRÊN CÁC PHÂN TÍCH VỀ HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ PHẠM NGỌC DƢƠNG, NGUYỄN THỊ ANH Vườn Quốc gia Cát Tiên VŨ ĐÌNH DUY Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam LÊ XUÂN THÁM Sở Khoa học Công nghệ, Lâm Đồng Murill (1905a,b) ngƣời thành lập chi Tomophagus Murr từ việc tách loài Ganoderma colossum (Fr.) C.F Barker., từ chi Ganoderma dựa đặc điểm hình thái điển hình nhƣ lớp thịt nấm khác biệt loài so với lồi khác chi, lớp thịt nấm có màu vàng nhạt, dầy thƣờng trở nên xốp sáng khô Chi Tomophagus Murr không đƣợc chấp nhận Furtado (1965), Steyaert (1972, 1980), Corner (1983), Ryvarden (1991) nhiều tác giả khác Steyaert (1980) cho G colossum dạng nhiệt đới loài G.oregonense Murrill Tuy nhiên nghiên cứu gần Moncalvo et al (1995, 2000) gần Hong Jung (2004) chủng loại phát sinh dựa sinh học phân tử G.colossum G oregonense cách xa ông ủng hộ cho quan điểm xác lập chi Tomophagus Tomophagus colossus đƣợc mô tả Fries (1851) từ mẫu vật thu đƣợc rừng Costa Rica với tên gọi Polyporus colossus, sau đƣợc Baker (1918) chuyển vào chi Ganoderma Đây loài gặp đƣợc ghi nhận có vùng nhiệt đới trừ Đông Phi theo nghiên cứu Ryvarden, Johamsen (1980) Ofodile cộng (2005) Ở Việt Nam Tomophagus colossus đƣợc ghi nhận lần Patouillard (1897) với tên gọi G abokense Pat., loài đƣợc ghi nhận lại gần Việt Nam Ngơ Anh (2001) Lồi thứ hai chi Tomophagus cattenensis đƣợc mô tả Lê Xuân Thám, Phạm Ngọc Dƣơng (2011) từ mẫu vật thu đƣợc đợt điều tra khu hệ nấm lớn Vƣờn Quốc gia Cát Tiên, dựa việc so sánh đặc điểm hình thái lồi với mẫu vật loài Tomophagus colossus phát trƣớc đặc biệt có sử dụng nghiên cứu sinh học phân tử thơng qua việc phân tích vùng gene ITS loài nghiên cứu đối chiếu với liệu ngân hàng gene (genebank) để xác lập loài thứ hai cho chi Các nghiên cứu đƣợc đăng tạp chí Mycol Progress năm 2011 Báo cáo tiến hành trình bày kết nghiên cứu bƣớc đầu loài Tomophagus sp., từ mẫu vật thu thập đƣợc từ Vƣờn Quốc gia Cát Tiên năm 2014, lồi thứ ba đƣợc ghi nhận cho chi Nếu lồi thứ hai chi Tomophagus Murr đƣợc phát Vƣờn Quốc gia Cát Tiên I PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu vật cho nghiên cứu Mẫu vật loài chi nấm Tomophagus Murr đƣợc phát Vƣờn Quốc gia Cát Tiên gồm có lồi Tomophagus colossus, Tomophagus cattiennenis, mẫu vật loài Tomophagus sp Mới phát 55 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Trình tự gene loài gần giũi genebank: Bảng Danh sách loài genbank sử dụng nghiên cứu Stt Tên loài/thứ Tomophagus cattienensis Tomophagus cattienensis Tomophagus colossus Tomophagus colossus Tomophagus colossus Tomophagus colossus Tomophagus colossus Tomophagus colossus ITS JN184398 JN184397 JN184396 JN184395 JX310825 Z37071 Z37091 FJ154769 Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp phân tích hình thái: Phƣơng pháp nghiên cứu so sánh hình thái cổ điển Các mẫu nấm thu đƣợc Vƣờn Quốc gia Cát Tiên đƣợc tiến hành mơ tả so sánh hình thái với mô tả Murill (1905a,b), Lê Xuân Thám, Phạm Ngọc Dƣơng (2011) Sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát đặc điểm bào tử đảm đặc điểm hiển vi khác Giải trình tự hiệu chỉnh trình tự: Sản phẩm PCR đƣợc điện di gel agarose 1,5% tinh Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Đức) Sản phẩm đƣợc sử dụng làm khn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mồi xuôi mồi ngƣợc) với mồi ITS1/ITS4, sử dụng BigDye terminator cycler v3.1 đọc kết hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự nucleotide chủng nấm đƣợc so sánh với trình tự có Genbank, sử dụng phần mền BLAST NCBI (website http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) Trình tự DNA sau đọc đƣợc hiệu chỉnh mắt với trợ giúp phần mền ChromasPro1.7.6 (Technelysium, 2013) để loại bỏ vùng tín hiệu nhiễu Các trình tự phân tích đƣợc xếp thẳng hàng phần mền Bioedit v7.0.5.2 (Hall, 1999), Clustal W (Thompson et al., 1997), geneDoc 2.7 (Nicholas et al., 1997) Các vùng khơng có khả xếp bị loại bỏ trƣớc phân tích Xác lập mơ hình tiến hóa: Dữ liệu trình tự nucleotide đƣợc khảo sát phân bố nucleotide, kiểm tra giả thuyết xác định mô hình tiến hóa tối ƣu cách sử dụng chuẩn thông tin Akaie đƣợc hiệu chỉnh (corrected AICc-Akaike Information Criterion) phần mền Modeltest v3.7 (Posada, 2005) Kết khảo sát đƣợc sử dụng làm tham số đầu vào để tính tốn ma trận khoảng cách di truyền xây dựng phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp: tiết kiệm tối đa MP (Maximum Parsimony), xác suất tối đa ML (Maximum Likelihood) kết nối liền kề NJ (Neighbor Joining) Đây đại diện điển hình cho phƣơng pháp phân tích tiến hóa đƣợc sử dụng rộng rãi Xây dựng tiến hóa: Để xây dựng tiến hóa phƣơng pháp ML, MP NJ, liệu DNA đƣợc chuyển vào phần mềm Bioedit v7.0.5.2 (Hall, 1999), Clustal W (Thompson et al., 1997), geneDoc 2.7 (Nicholas et al., 1997) với thông số tiến hóa (giá thị thơng số gamma, giá trị tỷ lệ điểm khơng biến thiên, giá trị mơ hình tiến hóa, ) đƣợc lấy từ kết phân tích mơ hình tiến hóa Modeltest v3.7 Tất tiến hóa theo phƣơng pháp đƣợc phân tích từ phần mềm PAUP*4.0b10 (Swofford, 2003), Mega 6.0.6 (Tamura etal., 2013) chúng đƣợc thực với 1.000 lần lặp lại để xác định giá trị ủng hộ (bootstrap) Phần mềm Treview đƣợc dùng để hiệu chỉnh hình ảnh tiến hóa (Page, 1996) 56 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TỒN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Mơ tả hình thái tự nhiên lồi Tomophagus sp Thể mọc đơn lẻ gốc gỗ lớn chết thời kỳ phân hủy mạnh, thƣờng gặp vài thể to nhỏ phát triển chủ, có cuống nhƣng khơng rõ Khi non dạng cục mọng dạng cầu, vàng, vàng bóng phần gốc, sau tỏa rộng dần thành dạng quạt, dạng gần trịn Thể trƣởng thành thƣờng có dạng u móng hình quạt , dầy tới 11-15 cm, chiều dài tới >15-20 cm, chiều rộng chỗ lớn tới >15 cm Đặc điểm thể thƣờng ổn định hình thái dạng quạt trịn khác biệt với T colossus (loài dễ bị dị dạng thể mềm nhũn Mép nấm non mọng tròn Lớp vỏ tán láng nhẵn, bóng tƣơi non, vàng ƣơm tƣơi - vàng chanh - vàng cam, mỏng, dễ đập vỡ Khi nấm già khô lớp vỏ nhiều nứt dập, nhiên lớp vỏ màu vàng, vàng chanh, gần nhƣ không đổi màu, đặc điểm khác so với loài Tomophagus cattiennensis thể cịn non có màu vàng, vàng chanh cịn thể hồn chỉnh trƣởng thành chuyển sang màu vàng nâu sậm Hình 1: Hình ảnh ngồi tự nhiên bào tử đảm loài Tomophagus sp.nov (ảnh: Phạm Ngọc Dương) Lớp thịt nấm (context) dầy xốp tƣơng đồng với lớp thịt nấm loài Tomophagus cattienensis, tƣơi nhũn mềm nhƣ chất bọt biển (spongy) 3-7 cm, khô nhẹ ngả màu vàng nhạt (hình 1c) Đặc điểm thịt nấm dầy xốp vốn đƣợc coi đặc trƣng cho 57 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ việc xác lập chi Tomophagus, đồng thời khác với chủng vùng khác Lớp bào tầng gần cuống nấm mỏng màu vàng nâu đất Bào tử dạng Ganodermanoid điển hình, với lớp vỏ dầy, bào tử dạng hình trứng, tƣơng đồng với bào tử hai loài chi Tomophagus phát trƣớc đó, bề mặt bào tử các cột chống dạng lƣới Kích thƣớc bào tử nhỏ chút trịn so với lồi Tomophagus cattiennensis phát trƣớc đó, kích thƣớc bào tử 14-17 x 10-12 µm Đây chứng để khẳng định loài phát loài khác so với T.cattiennensis Kết giải mã trình tự gen nhân (ITS) với chủng nấm Tomophagus sp Kết xác định trình tự vùng gen nhân (ITS) cho ảnh điện di đồ với đỉnh huỳnh quang rõ nét, cƣờng độ mạnh rõ ràng (kết không đây) Sau loại bỏ trình tự mồi vùng tín hiệu nhiễu, chúng tơi thu đƣợc trình tự nucleotide chủng nấm Tomophagus sp có độ dài 647 nucleotide Bảng Khoảng cách di truyền cặp lồi nghiên cứu Trình tự thu đƣợc chủng nấm Tomophagus sp đƣợc kiểm tra tính tƣơng đồng (similarity) với trình tự sẵn có ngân hàng Genbank công cụ BLAST Kết tìm kiếm cho thấy trình tự chủng nấm Tomophagus sp tƣơng đồng cao với loài chi Tomophagus Việc so sánh với sở liệu Genbank nhằm mục đích cho kết tham chiếu với nhóm lồi tƣơng đồng với trình tự truy vấn Kết BLAST khơng thể kết luận xác lồi Với trƣờng hợp BLAST có độ bao phủ tƣơng đồng cao (99%) suy ngƣợc lại tên lồi kết BLAST hiển thị trình tự tƣơng đồng mà Genbank có Do kết BLAST cho điểm nghi vấn chƣa chuẩn xác, chúng tơi sử dụng phƣơng pháp dựng phát sinh chủng loại để xác định tên khoa học cho chủng nấm Tomophagus sp Mơ hình tiến hóa tối ƣu theo tiêu chuẩn AICc đƣợc xác định cho khối liệu phân tích TrN+G thông số -lnL = 2820.6282, AIC = 5653.2563, K = 6, freqA = 0.2305, freqC = 0.2438, freqG = 0.2318, freqT = 0.2938, R(a) [A-C] = 1.0000, R(b)[A-G] = 1.5207, R(c) [A-T] = 1.0000, R(d) [C-G] = 1.0000, R(e) [C-T] = 2.5482, R(f) [G-T] = 1.0000, gamma Shape = 0.2442 đƣợc sử dụng để xây dựng tiến hóa Cây tiến hóa đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp MP, ML, NJ Kết đƣợc biểu thị hình 2, 3, 4: 58 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 64 Tomophagus colossus JN184395 93 Ganoderma sp.AJ749970 Tomophagus colossus JN184396 98 Tomophagus cattienensis JN184398 100 Tomophagus cattienensis JN184397 Tomophagus sp Macrocybe gigantea KJ463732 0.05 Hình 2: Mối quan hệ họ hàng chủng nấm Tomophagus sp với loài/thứ chi lấy Genbank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS phƣơng pháp Maximum Likelihood (ML) Macrocybe gigantea (KJ463732) đƣợc xem nhƣ lồi ngồi nhóm (outgroup) Tomophagus colossus JN184395 33 93 Ganoderma sp.AJ749970 Tomophagus colossus JN184396 99 Tomophagus cattienensis JN184398 Tomophagus cattienensis JN184397 100 Tomophagus sp Macrocybe gigantea KJ463732 Hình 3: Mối quan hệ họ hàng chủng nấm Tomophagus sp với loài/thứ chi lấy Genbank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS phƣơng Maximum Parsimony (MP) Macrocybe gigantea (KJ463732) đƣợc xem nhƣ lồi ngồi nhóm (outgroup) 56 Tomophagus colossus JN184395 98 100 Ganoderma sp.AJ749970 Tomophagus colossus JN184396 Tomophagus cattienensis JN184398 100 Tomophagus cattienensis JN184397 Tomophagus sp Macrocybe gigantea KJ463732 0.05 Hình 4: Mối quan hệ họ hàng chủng nấm Tomophagus sp với loài/thứ chi lấy Genbank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS phƣơng pháp Neighbor Joining (NJ) Macrocybe gigantea (KJ463732) đƣợc xem nhƣ lồi ngồi nhóm (outgroup) 59 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Từ số khoảng cách di truyền sở so sánh trình tự gen ITS - rDNA, sơ đồ mối quan hệ họ hàng chủng nấm Tomophagus sp với loài/thứ chi lấy Genbank đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp ME (Minimum Evolution), MP (Maximum Parasimony) NJ (Neighbor Joning) kết nhận đƣợc nhƣ So sánh khác biệt phân hóa lồi Tomophagus sp so với hai lồi cịn lại chi Tomophagus Murr - Những khác biệt hình thái: Các phân tích hình thái cho thấy lồi Tomophagus sp mang đặc điểm đặc trƣng chung loài chi Tomophagus Murr., nhƣ lớp thịt nấm dầy màu vàng nhạt, thƣờng trở nên xốp nhẹ sáng khô (Murill.,1905a,b ) Tuy loài ghi nhận đƣợc có điểm khác biệt: Về màu sắc lồi Tomophagus sp non có màu vàng chanh già chuyển sang màu vàng đậm, sáng màu giống với màu loài Tomophagus colossus nhiên màu thƣờng đậm bề mặt thể thƣờng bị nứt khô, lồi Tomophagus cattiennensis non có màu vàng chanh nhƣng sau nhanh chóng chuyển thành màu vàng nâu, nâu, vàng sậm (Lê Xuân Thám & Phạm Ngọc Dƣơng, 2011) - Cấu trúc bào tử đảm: Bào tử loài Tomophagus sp tƣơng đồng với hai loài phát trƣớc Tomophagus colossus Tomophagus cattiennensis nhƣ có dạng Ganodermanoid điển hình với lớp vỏ dầy bề mặt gồ ghề Tuy kích thƣớc bào tử có khác biệt tiến hành so sánh Kích thƣớc lồi Tomophagus sp nhỏ so với hai lồi cịn lại, lớp chóp phủ thƣờng mỏng hơn, hình dạng bào tử trịn Kích thƣớc bào tử Tomophagus sp khoảng 14-17 x 10-12 µm kích thƣớc bào tử Tomophagus cattiennensis 17,5-21,5 x 11,5-14,5 loài Tomophagus colossus 14-20 x 9-14 (Lê Xuân Thám & Phạm Ngọc Dƣơng, 2011) Hình 5: Bào tử đảm lồi Tomophagus cattiennensis , Tomophagus colossus Tomophagus sp phát Vƣờn Quốc gia Cát Tiên năm 2014 (ảnh: Phạm Ngọc Dương) - Khoảng cách di truyền: Kết giải trình tự vùng gene ITS, kết hợp với việc so sánh với trình tự gen lồi chi Tomophagus Murr phát trƣớc (Lê Xuân Thám, Phạm Ngọc Dƣơng 2011) khoảng cách di truyền loài phát tách biệt so với lồi nghiên cứu trƣớc Khoảng cách di truyền Tomophagus sp., so với Tomophagus cattiennensis 0,125, so với lồi Tomophagus colossus 0,105-0,108 (Bảng 2) Các phân tích dựa phần mềm PAUP*4.0b10 theo ba phƣơng pháp ML, MP, NJ loài Tomophagus sp phát hoàn toàn tách biệt với hai lồi cịn lại chi Tomophagus Murr., với hệ số ủng hộ (bootstrap) cao (hình 2, 3, 4) 60 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ a b c d Hình 6: So sánh hình thái thể 03 loài chi Tomophagus: a: Tomophagus cattiennensis; b: Tomophagus colossus; c, d Tomophagus sp nov (ảnh: Phạm Ngọc Dương) III KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu hình thái lồi Tomophagus sp., kết luận loài phát Vƣờn Quốc gia Cát Tiên thuộc chi Tomophagus Murr., theo quan điểm Muuril (1905) với đặc điểm hình thái điển hình nhƣ lớp thịt nấm dầy, xốp, có màu vàng nhạt thƣờng trở nên xốp, sáng màu khô Các phân tích vùng gene ITS cho thấy Tomophagus sp hồn tồn tách biệt so với hai lồi cịn lại phát chi Tomophagus Murr., kết nghiên cứu cho thấy lồi Tomophagus sp loài đƣợc phát cho chi Tomophagus Murr., loài cho khoa học thứ hai thuộc chi nấm hoàng chi quý giá đƣợc phát Vƣờn Quốc gia Cát Tiên TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH Ngo Anh, Trinh Tam Kiet, Nguyen Thi Duc Hue, 2001 Some scarce taxa of the family Ganodermataceae Donk in Vietnam Journal of Genetics and Applications, Special Issue: Biotechnology, Genetics Society of Vietnam, Hanoi, Vietnam, p 52–56 Furtado, J S., 1965 Ganoderma colossum and the status of Tomophagus Mycologia, 57: 979–984 Moncalvo, J M., H H Wang, R S Hseu, 1995 The use of ribosomal DNA sequence data for species identification and phylogeny in the Ganodermataceae In: Buchanan PK, Hseu RS, Moncalvo JM (eds) Ganoderma: Systematics Phytopathology and Pharmacology, Taipei, p 31–44 61 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Murrill, W A., 1905a The Polyporaceae of North America: XII A synopsis of the white and bright-colored pileate species Bull Torrey Bot Club, 32: 469–493 Murrill, W A 1905b Tomophagus for Dendrophagus Torreya, 5:197 Patouillard, N 1897 Contribution a la flore mycologique du Tonkin (3e serie) Journal de Botanique 11: 335–374 Xuan Tham Le, Ngoc Duong Pham, Quoc Hung Nguyen Le, Bryn T M Dentinger, Jean-Marc Moncalvo, 2011 Tomophagus cattiennensis sp nov., a new Ganodermataceae species from Vietnam: Evidence from morphology and ITS DNA barcodes A NEW Tomophagus SPECIES FROM CAT TIEN NATIONAL PARK OF VIETNAM BASED ON THE EVIDENCE FROM MORPHOLOGY AND ITS DNA BARCODES PHAM NGOC DUONG, NGUYEN THI ANH, VU DINH DUY, LE XUAN THAM SUMMARY Ganoderma Karsten and allies (Ganodermataceae Donk, Polyporales, Agaricomycetidae) are a group of polypore fungi of significant economic importance In 1905 Murrill created the genus Tomophagus to segregate G colossus (Fr.) C.F Baker from Ganoderma based on its unusually thick and pale context that becomes soft and light when dry In this paper we report a third species of Tomophagus from Cat Tien National Park in southern Vietnam (Cat Tien is a designated UNESCO Biosphere Reserve; The MAB Programme 2007) The new species reported here is distinct from its two closest allies, i.e T colossus and T cattienensis on the basis of combined evidence from morphology, and ITS rDNA barcodes 62