Kết quả nghiên cứu bằng thực nghiệm trong bản luận văn với tên gọi : “ Tương tác của chùm tia laser bán dẫn công suất thấp lên nấm linh chi ” cho thấy: Khi sử dụng hiệu ứng hai bước sóng
BỐI CẢNH HÌNH THÀNH ĐỀ TÀI, MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ CỦA LUẬN VĂN
Bối cảnh hình thành đề tài luận văn
Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc Các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời Sách ―Thần nông bản thảo‖ đã nói: ―Linh chi là thuốc kết tinh được cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương‖ Đến đời Minh (năm 1595) trong sách ―Bản thảo cương mục‖, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành ―Lục bảo Linh chi‖ theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị liệu của Linh chi theo từng màu Nói chung các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với nhũng bệnh về tim mạch, phổi, gan… Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [2, 9]
Các thành phần hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alkaloid, protein, polysaccharide… Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, được nghiên cứu nhiều nhất thuộc nhóm polysaccharide
Với những tác dụng hữu ích trên, hiện nay nấm linh chi được trồng với quy mô lớn trên cả nước để đáp ứng như cầu nâng cao sức khỏe cũng như phòng và chữa bệnh ngày càng tăng Ngoài việc tăng diện tích, năng suất trồng nấm thì nâng cao chất lượng tai nấm để tăng hàm lượng hoạt chất sinh học có trong tai nấm cũng là một vấn đề đáng quan tâm Xuất phát từ tình hình thực tế ấy, Phòng thí nghiệm công nghệ Laser – Khoa khoa học ứng dụng thuộc trường Đại học Bách Khoa – Đại học quốc gia có chương trình với tên gọi: ―Nghiên cứu ứng dụng Laser bán dẫn làm việc ở các bước sóng khác nhau với công suất thấp nhằm nâng cao chất lượng của nấm linh chi và nấm lim xanh‖ phục vụ chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng Đề tài luận văn thạc sĩ với tên gọi : ―Sự tương tác của chùm tia laser bán dẫn công suất thấp lên nấm linh chi‖ là bước đột phá đầu tiên của chương trình nghiên cứu nêu trên.
Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chính của đề tài gồm:
Xây dựng hoàn chỉnh phương pháp nghiên cứu bằng thực nghiệm sự tương tác của chùm tia laser bán dẫn làm việc ở các bước sóng khác nhau với công suất thâp lên nấm linh chi, nhằm nâng cao hàm lượng polysaccharide có trong quả thể nấm linh chi để phục vụ cho việc điều trị bệnh.
Nhiệm vụ chính của đề tài luận văn
Để hoàn thành tốt mục tiêu của đề tài cần phải thực hiện hoàn chỉnh các nhiệm vụ chính sau đây:
1.3.1 Thực hiện tổng quan các vấn đề chính liên quan trực tiếp đến đề tài, bao gồm:
Những vấn đề cơ bản về nấm linh chi;
Hàm lượng polysaccharide có trong quả thể nấm linh chi;
Các công trình nghiên cứu ứng dụng laser công suất thấp trên các loại nấm ăn và nấm dược liệu
1.3.2 Xây dựng phương pháp nghiên cứu bằng thực nghiệm sự tương tác của chùm tia laser bán dẫn làm việc ở các bước sóng khác nhau với công suất thấp lên quá trình phát triển của nấm linh chi
1.3.3 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm linh chi
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ CHÍNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
Khái quát về nấm
2.1.1 Giới thiệu sơ lƣợc về nấm
Theo khái niệm cũ, nấm là thực vật, như các loại cây cỏ khác, nhưng là thực vật không có sắc tố xanh (diệp lục tố) Tuy nhiên những nghiên cứu ngày càng nhiều trên sinh lý và biến dưỡng cho thấy nấm có nhiều điểm khác với thực vật [8]: không có lục lạp, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào, không có một chu trình phát triển chung như thực vật
Nấm chỉ có thể hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể từ cơ thể khác hay từ đất qua bề mặt của tế bào hệ sợi nấm Chính vì thế, tất cả hệ thống phân loại sinh giới hiện nay đều coi nấm là một giới riêng, tương đương với giới thực vật và động vật
R.H.Whitaker (1969) đã đưa ra hệ thống phân loại 5 giới (Kingdom) [3]
– Giới khởi sinh (Monera): gồm vi khuẩn và tảo lam
– Giới nguyên sinh (Protista): gồm một số tảo đơn bào, nấm đơn bào có khả năng di động nhờ lông roi (tiên mao) và các động vật nguyên sinh
– Giới nấm (Fungi hay Mycetalia, Mycota)
– Giới thực vật (Plantae hay Vegetabilia)
A.L.Takhtadjan (1983) đưa ra hệ thống phân loại như sau:
– Giới Mycota: gồm vi khuẩn và vi khuẩn lam
Woese (1980) căn cứ vào trật tự nucleotid trong acid ribonucleid (ARN) của ribosome 16S và 5S để tách vi khuẩn ra làm hai giới
– Giới vi khuẩn thật (Eubacteria)
– Giới vi khuẩn cổ (Archaebacteria) Ông đã gộp nấm, thực vật, động vật thành một giới chung gọi là sinh vật có nhân thật (Eukaryota)
Hiện nay, các nghiên cứu về nấm thường dựa vào hệ thống phân loại của R.H.Whitaker (1969) và hệ thống phân loại của A.L.Takhtadjan (1983) [8]
Khóa phân loại nấm hiện đại bao gồm các ngành như sau:
– Ngành nấm nhầy (Exomycotina): loài nấm này có cả hai tính chất động vật và thực vật, chúng sinh sản bằng bào tử, nhưng tế bào lại là khối sinh chất không có vách ngăn bao bọc, di chuyển và nuốt thức ăn như động vật (amib)
– Ngành nấm thật (Eumycotina): chiếm số lượng lớn, bao gồm các tế bào với nhân tương đối hoàn chỉnh Tế bào nấm có vách bao bọc như tế bào thực vật, đa số cấu tạo bởi chitin Nhiều tế bào nấm còn tích trữ đường ở dạng glycogen, giống như động vật Một số loài sinh sản theo lối tạo những giao tử có lông roi để di động (động bào tử), nhưng hợp tử lại phát triển theo một kiểu chung của nấm [2]
Dựa theo tổ chức hình thái, nấm có thể được xắp xếp thành 4 lớp chính:
– Lớp Phycomycetes (Lớp nấm tảo): sợi không có vách ngăn ngang, có động bào tử, gồm 2 lớp phụ:
- Lớp phụ Oomycetes (Nấm noãn)
- Lớp phụ Zygomycetes (Nấm tiếp hợp)
– Lớp Ascomycetes (Lớp nấm túi): sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng bào tử túi, sinh sản hữu tính theo kiểu tạo túi (nang) và bào tử túi (ascospore)
– Lớp Basidiomycetes (Lớp nấm đảm): sinh sản hữu tính theo kiểu tạo đảm bào tử
(basidiospore) Thường gặp ở những nấm lớn có tai nấm (nấm rơm, nấm hương…) – Lớp Deuteromyceter (Lớp nấm bất toàn – Fungi imperfect): không có khả năng sinh sản hữu tính
2.1.2 Hình thái học của nấm
2.1.2.1 Hình thái học của sợi nấm
Tuyệt đại đa số nấm được cấu tạo bởi những sợi nấm (hyphae) Sợi nấm có dạng ống, chứa đầy tế bào chất và dịch bào Sợi nấm có hai loại, một loại không có vách ngăn, nhiều nhân, một loại có vách ngăn, trên màng vách ngăn có lỗ thông để truyền thông tin và trao đổi chất Vách tế bào chủ yếu được cấu tạo bởi kitin – glucan Sợi nấm có thể có thể phát triển từ bào tử hay từ một đoạn sợi nấm và có đặc điểm sinh trưởng về phía ngọn, phân nhánh Sợi nấm trong nhiều năm có thể tiếp xúc với nhau hình thành một khối gọi là thể sợi nấm Đối với nấm đảm thì sự hình thành sợi nấm trải qua 3 giai đoạn:
Sợi nấm sơ sinh: sau khi bào tử nảy mầm, hình thành ống mầm rồi phân nhánh thành sợi nấm Những sợi nấm này thường không có vách ngăn hoặc có vách ngăn nhưng đều là một nhân
Sợi nấm song nhân: do thể sợi nấm cùng nhân hay khác nhân kết hợp với nhau tạo nên sợi nấm có vách ngăn nhiều tế bào, mỗi tế bào chứa hai nhân còn gọi là sợi nấm song nhân (dicaryolic hyphae)
Sợi nấm thứ sinh: những sợi nấm này phân hóa và kết thành quả thể gồm tán nấm, cuống nấm, mô nấm [12, 13] Đối với nấm túi: sợi nấm song nhân chỉ sinh ra trước khi hình thành túi Sự hình thành quả thể ở nấm túi là sự phối hợp giữa sợi nấm cấp một và sợi nấm song nhân
Một số loại nấm có hình thái liên hợp dạng móc (clamp connection), tế bào đỉnh sợi nấm (2 nhân) mọc ra một mấu nhỏ, một trong hai nhân chui vào mấu này Mỗi nhân phân cắt thành hai, hai thành bốn nhân, hai nhân giữ lại đỉnh tế bào, một nhân chui vào mấu, một nhân nằm ở gốc tế bào Tế bào đỉnh ban đầu xuất hiện hai vách ngăn, chia thành ba tế bào Sau đó vách ngăn giữa mấu và tế bào gốc bị khai thông, tế bào gốc tiếp nhận nhân từ mấu chuyển xuống và trở thành tế bào song nhân Như vậy từ một tế bào song nhân trở thành hai tế bào song nhân và giữa hai tế bào còn lưu lại một cái móc [2]
Tản hay cơ thể của nấm là những tế bào đơn hay dạng sợi kéo dài Phần lớn các sợi phân nhánh Khi các sợi nấm bện lại với nhau tạo thành thể sinh bào tử, gọi là quả thể hay tai nấm Đặc trưng của nấm lớn là có cơ quan sinh sản bào tử kích thước lớn, có thể nhìn thấy bằng mắt thường, do sự kết bện của sợi nấm khi gặp điều kiện thuận lợi Thường có hai kiểu quả thể trong nhóm nấm lớn:
– Kiểu 1: bào tử thường được sinh ra trong những thể hình cầu, như những nấm thuộc Gasteromycetes
– Kiểu 2: bào tử sinh ra ở một phần của quả thể nấm Những nấm này thuộc
Basidiomycetes Có thể bào tử ở phần phiến hay không thuộc phiến (Aphyllophorales) Ở nhóm này ta thường gặp hai kiểu quả thể như sau:
Quả thể lật ngược, phiến ở phía trên hay không có phiến, thường không có hình dạng nhất định Chúng rất mỏng, đôi khi dày nhất đạt 2 mm
Quả thể thẳng đứng, gặp ở nhóm Basibiomyceteses hay Discomycetes Các sợi nấm phủ lên nhau ở mặt ngoài hay chỉ một phần bên trên Những kiểu này quả thể rất khác nhau ở các phần chân nấm, mũ nấm, phiến nấm [1, 3].
Đặc điểm hình thái – cấu trúc – sinh thái của nấm linh chi
Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay:
Theo phân loại nấm linh chi của Trung Quốc, nhà nghiên cứu Zhao Jiding, người đã dành gần 50 năm nghiên cứu về lĩnh vực này, đã chia nấm linh chi ra làm 6 loại:
Nấm linh chi đỏ: còn được gọi là linh chi HgS, thường được tìm thấy ở trên núi Huo Ganoderma lucidum là đại diện chính cho loài nấm này Những đặc điểm của nấm linh chi đỏ chính là nắp nấm có hình dạng giống như quả thận hoặc hình bán nguyệt, màu nâu đỏ Thân nấm có dạng giống như một thân cây, cùng màu hoặc đậm hơn so với nắp nấm
Nấm linh chi tím: còn được biết đến với tên gọi là linh chi gỗ Đặc điểm của loại nấm này là nắp nấm có màu nâu hoặc nâu tím Quả thể có màu nâu, bào tử của chúng lớn hơn nấm linh chi đỏ.Ganoderma sinense là đại diện của loài nấm này
Linh chi màu vàng: còn được gọi là hoàng chi Loại nấm này có màu vàng tím Một cây nấm lớn có thể nặng khoảng 5 kg hoặc hơn, còn cây nấm non thì nặng khoảng 1,5 đến 2 kg Laetiporus sulphureus là đại diện của loài nấm này Khi tươi thì nấm này sẽ chứa rất nhiều nước
Linh chi trắng: còn được gọi là nấm linh chi ngọc bích Theo như Bao Puzi mô tả thì đây là loại nấm không có chất béo, Fomitopsis officinalis là đại diện cho loài nấm này Loại nấm này có quả thể màu trắng, hình dáng giống như một cái móng ngựa
Một cây nấm lớn có thể nặng đến nhiều kilogram Loại nấm này thường mọc trên cây thông và một số loại cây lá kim khác
Linh chi đen: còn được gọi là nấm linh chi xuân Loại nấm này thường mọc ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có màu đen bên trong có màu đỏ, thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng Amauroderma rugosum và Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này đều có màu đen
Linh chi xanh: còn được gọi là nấm linh chi rồng Theo Bao Puzi miêu tả thì nấm linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá Coriolus versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này Đặc điểm của loài này là mũ nấm cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn
Trong mỗi loài nấm linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau Ví dụ như nấm linh chi đỏ thì cóGanoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều nhất Đối với linh chi tím thì cóGanoderma neojaponicum và Ganoderma sinense
Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiên cứu 2 loại đó là linh chi đỏ và linh chi tím
Nấm Linh chi là dạng thể quả Thể quả có cuống dài hoặc ngắn, thường đính bên, đôi khi đính tâm Cuống nấm thường hình trụ hoặc thanh mảnh (cỡ 0.3 – 0.8 cm đường kính), hoặc mập khỏe (2 – 3.5 cm đường kính), ít khi phân nhánh, dài từ
2.7 – 22 cm, đôi khi có uốn khúc cong quẹo Lớp vỏ cuống láng đỏ – nâu đỏ – nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên bề mặt tán nấm
Hình 2.2 Cấu tạo cắt ngang của tai nấm linh chi Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận, gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc có hình dạng khác thường Trên mặt nấm có vân gợn đồng tâm và có chia rãnh phóng xạ, màu sắc đỏ nâu, nâu tím, nâu đen, nhẵn bóng, láng như veni, thường sẫm màu dần khi già Kích thước tán biến động lớn từ 2 – 36 cm, dày 0.8 – 3.3 cm
Phần đính cuống gồ lên hay lõm Phần thịt nấm màu vàng kem – nâu nhợt, phân chia theo kiểu lớp trên và lớp dưới
Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm Bào tử nấm thường có dạng hình trứng cụt đầu màu rỉ sắt Cấu tạo vỏ ngoài bào tử gồm hai lớp, có thể quan sát được dưới kính hiển vi Lớp ngoài nhẵn, lớp trong có nhiều gai nhỏ, nối liền hai lớp vỏ Bào tử nấm Linh chi có kích thước trung bình 4.5 – 6,5 x 8,5 – 11,5 m
Khi nuôi cấy tơ nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, sợi nấm ngăn thành nhiều phần và hình thành các bào tử vô tính Chu kỳ sống của nấm Linh chi giống như hầu hết các loại nấm khác, nghĩa là cũng bắt đầu từ các bào tử, bào tử nảy mầm phát triển thành hệ mạng sợi tơ nấm Gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm sẽ kết thành nụ nấm, nụ phát triển thàn chồi, rồi tán và thành tai trưởng thành Trên tai sinh ra các bào tử, bào tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục [1, 2, 6]
Chu trình sống của nấm Linh chi [5]
Hình 2.3 Chu trình phát triển của nấm Linh chi [5]
Nấm Linh chi mọc trên cây thân gỗ (thuộc bộ đậu fabales) sống hay đã chết
Nấm mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán nhẹ Ở Việt Nam, nấm Linh chi phân bố khắp từ Bắc chí Nam, tùy theo từng vùng mà có các chủng loại khác nhau Ở những vùng thấp có độ cao dưới 500 m, có các chủng chịu được nhiệt độ cao (28 – 35oC) như vùng châu thổ sông Hồng, vùng trung du Bắc Bộ, vùng đồng bằng sông Cửu Long Ở vùng cao như Đà Lạt, Sapa, Tam Đảo… lại có các chủng loại ôn hòa, thích hợp nhiệt độ thấp (20 – 26oC)
2.2.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi
Nguồn cacbon: nguồn cacbon chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột, pectin, lignin, cenlulose, hemicenlulose, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và tạo thành các chất cần thiết
Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu ure, muối amon, sulphate amon Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều khó hình thành thể quả
Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1 Giai đoạn hình thành thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1
Thành phần hóa học và đặc tính dƣợc lý của nấm linh chi
Theo phân tích của Viện nghiên cứu dược liệu Quảng Đông, Trung Quốc thì thành phần hóa học trong nấm linh chi hoang dại có: [5]
Phân tích nguyên tố trong các cơ quan của nấm linh chi cho thấy phốt pho, silic, lưu huỳnh, kali, canxi và magiê là các thành phần khoáng sản chính Sắt, natri, kẽm, đồng, mangan, và stronti cũng được phát hiện với số lượng thấp hơn, cũng như các kim loại nặng như chì, cadmium, thủy ngân
Trong một nghiên cứu các thành phần không bay hơi của nấm linh chi, tìm thấy trong nấm có chứa 1,8% tro, 26-28% carbohydrate, 3-5% chất béo thô, 59% chất xơ thô, và 7-8% protein thô [14] Ngoài ra, nấm có chứa một loạt các phân tử hoạt tính sinh học như terpenoid, steroid, phenol, nucleotide và các dẫn xuất của chúng, glycoprotein, và polysaccharide
Polysaccharide và triterpene là hai thành phần hoạt động sinh lý quan trọng trong nấm linh chi [15, 16] Tuy nhiên, hàm lượng và tỷ lệ phần trăm của từng thành phần có thể rất đa dạng trong các sản phẩm tự nhiên và thương mại, được minh chứng bằng số liệu trong bảng 2.3 Khi 11 mẫu sản phẩm nấm linh chi thương mại mua tại cửa hàng Hồng Kông được lựa chọn ngẫu nhiên để đánh giá cho hai thành phần, triterpenes và polysaccharide, người ta thấy hàm lượng triterpene dao động từ 0% đến 7,8% và hàm lượng polysaccharide đa dạng 1,1-15,8% [17] Sự khác biệt về hàm lượng hoạt chất xảy ra vì nhiều lý do, trong đó có sự khác biệt về loài hay chủng nấm được sử dụng và sự khác biệt trong phương pháp sản xuất
Bảng 2.3 So sánh hàm lượng triterpene và polysaccharide trong 11 mẫu linh chi thương mại [17]
Loại sản phẩm Triterpenes (%) Polysaccharide (%)
A (chiết xuất từ quả thể) 1.36 4.48 B (chiết xuất từ quả thể) 2.36 5.32 C (chiết xuất từ quả thể) 1.88 15.70 D (chiết xuất từ quả thể) 1.06 10.97 E (chiết xuất từ quả thể) 0.44 7.51 F (chiết xuất từ quả thể) 1.78 6.18 G (chiết xuất từ quả thể) 1.44 13.30 H (chiết xuất từ quả thể) 0.50 15.80 I (chiết xuất từ quả thể) 7.82 7.66
K (bột sợi nấm) Không xác định 12.78 Đáng chú ý là hàm lượng germanium trong quả thể nấm linh chi thu được từ tự nhiên cao thứ năm về nồng độ (489 mg / g) trong số các khoáng chất được phát hiện [18]
Hàm lượng germanium có trong nấm linh chi cao gấp 5 - 8 lần trong nhân sâm [5]
Germanium ở liều thấp đã được ghi nhận với khả năng kháng u, chống oxy hóa, và các hoạt động antimutagenic [19]
Một số protein và lectin có trong nấm linh chi đã được nghiên cứu tác dụng chữa bệnh Hàm lượng protein trong nấm linh chi khô được tìm thấy vào khoảng 7-8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác [20] Protein nấm có chứa tất cả các axit amin thiết yếu và rất giàu lysine và leucin Protein hoạt tính sinh học được báo cáo là góp phần vào tính chất dược liệu của nấm linh chi, bao gồm LZ-8, một protein ức chế miễn dịch được tinh chế từ các sợi nấm [21] Lectin cũng được phân lập từ thân cây và sợi nấm linh chi [22] , nghiên cứu cho thấy 114-kDa hexameric lectin, một glycoprotein có 9,3% đường trung lập biểu hiện khả năng ngưng kết hồng cầu trên pronase hồng cầu của con người [23] Ở động vật, lectin tham gia vào nhiều quá trình tế bào và hoạt động của hệ thống miễn dịch [24]
Các hợp chất khác đã được phân lập từ nấm linh chi bao gồm các enzyme như metalloprotease, có khả năng trì hoãn thời gian đông máu; ergosterol (tiền vitamin
D 2 ); nucleoside và nucleotide [25] Hơn nữa, bào tử nấm linh chi đã được báo cáo có chứa một hỗn hợp của một số axit béo chuỗi dài có thể đóng góp vào hoạt động kháng u của nấm [26]
2.3.2 Tác dụng trị liệu của Nấm Linh chi Ở các nước Đông Nam Á, (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…) việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với qui mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý và phương cách điều trị lâm sàng
Giá trị dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị Nấm học thế giới thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New York
Bảng 2.4 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu
Tên gọi Màu sắc Đặc tính dược lý
Thanh chi (Long Chi) Xanh Vị chua, tính bình, không độc chữa trị sáng mắt,bổ gan khí, an thần, tăng trí nhớ
Hồng chi (xích chi) Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,dưỡng tim, bổ trung, trị tức ngực
Hoàng chi (kim chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần, ích tì khí
Bạch chi (ngọc chi) Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, an thần, chữa ho ngịch hơi
Hắc chi (huyền chi) Đen Vị ngọt, tính bình, không độc, trị bí tiểu, ích thận khí
Tứ chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức xương khớp, gân cốt
Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng cụ thể của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau:
Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)
Bảo can (bảo vệ gan)
Cường tâm (thêm sức cho tim)
Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá)
Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)
Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc)
Giải cảm (giải toả trạng thái bị cảm)
Trường sinh (sống lâu, tăng tuổi thọ)
Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh:
– Hiệu quả chống ung thư: linh chi có hiệu quả cao trong việc giết chết các tế bào ung thư Hoạt chất chiết xuất từ linh chi gây ra vụ bắt giữ ô-chu kỳ và apoptosis trong các tế bào khối u của con người, bao gồm: ung thư phổi Lewis [27], bệnh bạch cầu HL-60 [28], ung thư vú MDA-MB-123 [29], ung thư tuyến tiền liệt PC-3 [30], khối u Hela ở tử cung [31], ung thư buồng trứng SKOV4 [32], ung thư đại tràng HT-29 [33] và SW480 [34], ung thư biểu mô phổi PG [35], ung thư bàng quang MTC-11 [36], … Thông qua các quy định về biểu hiện của tín hiệu khác nhau, các tế bào khối u đã bị bắt giữ bởi nấm linh chi tại các thời điểm khác nhau của chu kỳ tế bào, ví dụ, ung thư vú tại giai đoạn G0 / G1; ung thư phổi ở giai đoạn G1; ung thư gan tại giai đoạn G1 / G2; và bàng quang, tuyến tiền liệt, và bệnh bạch cầu ở giai đoạn G2 Gao và Zhou (2003) đã thử nghiệm trên 134 bệnh nhân ung thư khác nhau và bổ sung cho họ viên nang linh chi với liều 1800 mg / ngày trong 12 tuần Miễn dịch tế bào ở 80% số bệnh nhân này đã được tăng cường đáng kể về interleukin huyết tương (IL) -2, IL-6, γ interferon (IFN-γ) và hoạt động tế bào diệt tự nhiên (NK) [37] Trong một nghiên cứu khác, cách thức tương tự đã được áp dụng với 68 bệnh nhân ung thư phổi trong đó các thông số miễn dịch bao gồm tổng số tế bào T, tế bào NK, và tỷ lệ CD4 / CD8 đã được tăng cường đáng kể trong nhóm dùng kết hợp với nấm linh chi Ngoài ra, chất lượng cuộc sống về điểm Karnofsky được cải thiện với khoảng 65% số bệnh nhân này [38]
– Đối với bệnh về hệ tim mạch: nấm linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều thì huyết áp ổn định Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số sinh bệnh Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư [2]
– Đối với các bệnh về hô hấp: nấm linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị tức ngực, ích phổi, thông mũi, chữa ho…có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn [5,6]
Giới thiệu sơ lƣợc về hoạt chất Polysaccharide có trong nấm linh chi
Polysacharide là một trong những thành phần hữu hiệu nhất chứa trong Linh chi, rất được các nhà y dược học coi trọng Thành phần Polysacharide ở Linh chi (Ganoderma lucidum Polysacharide) nay đã được phân ly thành hơn 200 loại, trong đó phần lớn là chất thuộc loại kết cấu, tồn tại ở thành tế bào, và một số ít là chất tồn trữ, tồn tại ở trong tế bào
Theo kết quả phân tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide của nấm linh chi (Ganoderma lucidum- polysaccharide: GL- PSs) là đường glucose [39, 54] Ngoài ra, GL- PSs cũng có cấu trúc polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí liên kết β hoặc α khác nhau như 1- 3, 1- 4 và 1- 6 với các dạng đồng phân - D [55] Phân nhánh đặc điểm cấu tạo và tính tan được cho là ảnh hưởng đến tính antitumorigenic các polysaccharide [39]
Hình 2.4 Cấu trúc lặp lại có thể có của Glucans chiết xuất từ linh chi [56]
Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM) Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng
Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị
Vai trò dƣợc học của polysaccharide
Kích thích hệ miễn dịch cơ thể
Nghiên cứu ảnh hưởng của polysaccharide trên biểu hiện cytokine trong tế bào đơn nhân lách của chuột cho thấy polysaccharide chiết xuất từ nấm linh chi giúp kích hoạt các cytokine, tăng cường hệ miễn dịch [59]
Các thí nghiệm đã cho thấy các hợp chất polysaccharide, heteroglycans (PL-1 and
PL-4) và glucan (PL-3) trong nấm Linh Chi có tác dụng tăng cường sự phát triển của các tế bào lympho T và lympho B [55]
GLIS là một phần hoạt tính sinh học được phân lập từ nấm Linh Chi có tỉ lệ carbohydrate: protein là 11,5: 1, phần carbohydrate gồm có bảy monosacarit khác nhau, chủ yếu là D-glucose, D-galactose và D-mannose theo tỷ lệ mol 3,0: 1: 1 GLIS có tác dụng kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho B [61]
Ức chế khối u phát triển
Hoạt động chống khối u của polysaccharide trong nấm linh chi là sự kết hợp giữa hoạt động tăng cường hệ miễn dịch và cơ chế gây độc trực tiếp tế bào khối u [59]
Tham gia tổng hợp DNA,bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ
Khả năng sửa chữa DNA của một tế bào là rất quan trọng cho sự toàn vẹn của hệ gen và bình thường hóa cho sự phát triển của sinh vật
Nghiên cứu cho thấy các polysaccharide từ nấm linh chi giúp tăng cường quá trình sửa chữa DNA của tế bào sau khi tiếp xúc với phóng xạ gamma [58]
Quá trình oxy hóa là một phần trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh nhân như ung thư, lão hóa và xơ vữa động mạch Nghiên cứu chỉ ra rằng các polysaccharide, polysaccharide-petide và các thành phần phenolic của nấm linh chi tham gia mạnh mẽ vào các hoạt động chống oxy hóa [60]
Như vậy nấm Linh Chi giúp điều hòa, tăng cường hệ miễn dịch và nội tiết, hạn chế sự phát triển khối u, cải thiện lưu thông và loại bỏ các gốc tự do có hại Nó cũng có thể làm giảm tác dụng phụ độc hại và giảm thiểu những cơn đau trong quá trình hóa trị liệu và xạ trị Theo báo cáo Ung thư thế giới do cơ quan Ung thư của WHO công bố trong ngày Ung thư thế giới đã dự báo số trường hợp mắc mới ung thư ước tính từ 14 triệu người vào năm 2012 lên 22 triệu người sau 2 thập kỷ nữa Cũng trong giai đoạn này, số trường hợp tử vong do ung thư ước tính sẽ tăng từ 8,2 triệu mỗi năm lên 13 triệu người Thống kê của Dự án phòng chống ung thư Quốc gia, mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 70.000 người chết và hơn 200.000 nghìn người mắc mới Đó là con số đáng báo động về tình hình mắc bệnh ung thư ở nước ta Theo dự đoán của các chuyên gia, con số này sẽ không dừng lại ở đó mà còn gia tăng trong những năm tiếp theo Do đó việc sử dụng tương tác chùm tia laser bán dẫn công suất thấp lên nấm Linh Chi nhằm tăng cường quá trình tổng hợp polysaccharide trong quả thể nấm Linh Chi sẽ hỗ trợ cho quá trình điều trị cũng như việc bào chế thuốc một cách dễ dàng, chất lượng nhất.
Các công trình nghiên cứu sử dụng laser bán dẫn công suất thấp trên các loại nấm ăn và nấm dƣợc liệu
2.5.1 Cơ sở khoa học của đề tài
Tuy nấm không có diệp lục như thực vật, nhưng tác động của ánh sáng tự nhiên và ánh sáng laser lên quá trình phát triển của nấm đã được chứng minh qua quá trình quang thụ của nấm Quá trình quang thụ của nấm diễn ra bằng cách hấp thụ có chọn lọc những bước sóng khác nhau Hoạt động chính bao gồm sự thay đổi về mặt cấu trúc protein, phản ứng oxy hóa khử trong quang hóa, hoặc vài dạng khác nhau trong quá trình biến đổi quang hóa Quá trình quang thụ trong nấm được kiểm soát bởi các loại phân tử: phytochrome, protein white- collar, cryptochrome / photolyase và AppA / BLUF [62]
Phytochrome là một tế bào cảm quang có trong cả thực vật và nấm Phytochrome tồn tại ở hai hình thức có thể chuyển đổi qua lại với nhau được là P r và P fr
Hình 2.5 Cấu trúc của phytochrome ở hai dạng P r và P fr P r khi hấp thụ ánh sáng đỏ (~ 667 nm) sẽ lập tức chuyển đổi sang P fr , ngược lại khi P fr hấp thụ ánh sáng xa đỏ (~ 730 nm) sẽ nhanh chóng chuyển sang dạng P r Trong đó P là hình thức sinh lý hoạt động của protein, kéo theo các hoạt động sinh lý của nấm, còn P r là hình thức ức chế hoạt động của phytochrome Đối với hạt giống, hệ thống phytochrome được sử dụng để xác định sự có mặt của ánh sáng Một hạt giống sẽ nảy mầm khi tiếp xúc với ánh sáng trên mặt đất, khi đó phytochrome nhận ánh sáng và tồn tại ở dạng P fr , kích thích hoạt động trong hạt, báo hiệu bắt đầu dự nảy mầm Còn trong bóng tối, phytochrome tồn tại ở dạng P r , ức chế quá trình hoạt động, hạt không nảy mầm
Thực vật và nấm sử dụng hệ thống phytochrome để điều chỉnh sự tăng trưởng theo mùa cũng như theo ngày và đêm Lúc bình minh hay những lúc ánh sáng mặt trời chứa nhiều ánh sáng đỏ (~ 667 nm), ít ánh sáng xa đỏ (~ 730 nm), phytochrome tồn tại ở dạng hoạt động P fr , kích thích sự tăng trưởng, ra hoa, … Đến lúc mặt trời lặn, P fr chuyển về dạng P r , sự phát triển trở nên chậm lại
Thụ quang nhờ vào protein white - collar (WC) Protein WC được phức hợp từ các protein WC-1 và WC-2, trong đó WC-1 có hai vai trò quan trọng : nó là nơi tiếp nhận ánh sáng cho nấm và là thành phần cần thiết để điều chỉnh nhịp sinh học
Hình 2.6 Cấu trúc của protein WC [63]
Miền LOV là nơi hấp thụ ánh sáng của protein WC-1, nó được gắn với flavin mang màu FAD, chịu trách nhiệm cho việc chuyển đổi ánh sáng thành năng lượng cơ
FAD hiển thị hấp thụ tối đa ánh sáng ở bước sóng 450 nm, do đó WC-1 có độ nhạy tối đa với ánh sáng xanh Cả WC-1 và WC-2 đều có miền PAS cho phép chúng liên kết với các protein khác Dưới đây là một mô hình đơn giản cho quá trình tương tác giữa WC với ánh sáng màu xanh
Hình 2.7 Mô hình tương tác giữa WC với ánh sáng xanh [63]
Thụ quang nhờ cryptochrome / photolyase và AppA / BLUF: Đầu tiên, các cryptochrome / photolyase là những đại diện trong bộ gen nấm
Cryptochromes là một lớp các flavoproteins nhạy cảm với ánh sáng màu xanh (các flavoproteins có vai trò là photosensory trong nấm có chứa miền LOV) Cryptochromes tham gia vào các nhịp sinh học của thực vật [62] Ánh sáng cung cấp năng lượng cho quá trình sửa chữa DNA trong nấm và photolyases là xúc tác cho quá trình này hoặc để kiểm soát sự phát triển của nấm [62] Các nhà nghiên cứu đã phân lập được một gen DNA photolyase (phr1) từ Trichoderma harzianum , một loại nấm đất phổ biến được quan tâm như là một tác nhân kiểm soát sinh học chống lại tác nhân gây bệnh trong đất và là một mô hình cho việc nghiên cứu sự phát triển phụ thuộc vào ánh sáng của nấm
Thứ hai, chúng ta nên đề cập đến AppA là một loại protein duy nhất tích hợp oxi hóa khử và ánh sáng tín hiệu [62] Miền BLUF (Blue Light Sensing Using Flavin) có tác dụng như một thụ thể ánh sáng màu xanh Trong protein tiếp nhận ánh sáng, miền BLUF được liên kết với một miền adenylyl cyclase Adenylate cyclase là một protein đóng vai trò quan trọng trong chuỗi truyền tín hiệu từ bên ngoài tế bào vào trong tế bào chất bằng protein G Khi nhận được tín hiệu truyền từ protein G (protein G nhận tín hiệu từ thụ thể), adenylate cyclase sẽ thực hiện chức năng của mình là xúc tác quá trình chuyển hóa adenosine triphosphate (ATP) thành adenosine monophosphate (AMP)
Enzyme adenylate cyclase được hoạt hóa khi ta chiếu ánh sáng xanh vào tế bào chứa nó và ngay lập tức, tốc độ chuyển đổi từ ATP sang AMP vòng tăng vọt Sản phẩm của adenylate cyclase - AMP là một mắt xích quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội các enzyme PKA có tác dụng thay đổi hoạt tính một số loại protein trong tế bào [62]
Từ những nghiên cứu trên cho thấy sự tương tác của ánh sáng laser trên nấm là một công cụ kích thích sinh học giúp ích trong quá trình sinh trưởng, quá trình tổng hợp các hoạt chất có ích của nấm Từ đó cho thấy việc tương tác của chùm tia laser bán dẫn công suất thấp lên nấm linh chi sẽ mang lại kết quả đầy hứa hẹn
2.5.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
Trên thế giới, quá trình tương tác giữa chùm tia laser với một số nấm ăn và nấm dược liệu đã được nghiên cứu
Nấm Chaga được nuôi cấy trong môi trường agar lỏng và được chiếu xạ bởi laser He-Ne (bước sóng 632,8 nm); laser argon (bước sóng 488,0 nm) ; LED màu xanh
(bước sóng 463 nm); LED màu đỏ (bước sóng 625 nm) Kết quả thu được cho thấy ảnh hưởng tích cực của chiếu xạ lên sinh khối và sự tích tụ melanin, kết quả được trình bày theo tỷ lệ % thay đổi so với nhóm đối chứng (xem nhóm đối chứng là 100%) [64]
Hình 2.8 Tương tác của chùm tia laser lên nấm Chaga [64]
Một nghiên cứu khác cho thấy quá trình tương tác của laser He-Ne (bước sóng 633 nm) và laser argon (bước sóng 514,5 nm) lên 3 loại : nấm sò, nấm hương và nấm hầu thủ được nuôi cấy trong môi trường thạch agar cho thấy sợi nấm phát triển vượt trội và sinh khối nấm tăng từ 36 đến 51% [65]
Bảng 2.5 Tương tác của laser He-Ne và laser Argon lên nấm sò, nấm hương và nấm hầu thủ [65]
Tuy nhiên, các nghiên cứu này tập trung ở vùng ánh sáng nhìn thấy và laser hoạt động ở chế độ liên tục Tại Việt Nam, việc sử dụng chùm tia laser bán dẫn công suất thấp tác động lên quá trình nuôi trồng nấm ăn cũng như nấm dược liệu còn mới mẻ, chưa có bất kỳ đề tài nghiên cứu hoặc một báo cáo nào
Trong luận văn này tôi tập trung nghiên cứu về tương tác của chùm tia laser bán dẫn công suất thấp lên nấm linh chi để khảo sát sự sinh trưởng của nấm và định lượng hàm lượng polysaccharide thu được trong quả thể nấm để nâng cao chất lượng nấm linh chi, phục vụ cho việc điều chế các dược phẩm nâng cao hệ miễn dịch của cơ thể cũng như hỗ trợ trong việc điều trị khối u và ung thư …
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BẰNG THỰC NGHIỆM VỀ SỰ TƯƠNG TÁC CỦA CHÙM TIA LASER BÁN DẪN LÀM VIỆC Ở CÁC BƯỚC SÓNG KHÁC NHAU VỚI CÔNG SUẤT THẤP LÊN NẤM LINH CHI
SÓNG KHÁC NHAU VỚI CÔNG SUẤT THẤP LÊN NẤM LINH CHI 3.1 Phương pháp nghiên cứu và đối tượng khảo sát
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, có so sánh với nhóm đối chứng
3.1.2 Thiết bị phục vụ cho thí nghiệm
Trong thí nghiệm tôi sử dụng hai loại thiết bị sau đây:
3.1.2.1 Thiết bị quang trị liệu bằng laser bán dẫn công suất thấp loại 2 kênh
Trong thiết bị này, bộ phần điều trị có 02 kênh Chúng hoàn toàn giống nhau, nhưng độc lập với nhau Ở mỗi kênh có 01 đầu quang trị liệu phục vụ cho thí nghiệm Đầu quang trị liệu là nơi tạo ra hiệu ứng hai bước sóng đồng thời, do:
Laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 780 nm;
Laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 940 nm; tạo nên, với các thông số chính như sau:
- Công suất phát xạ chùm tia thay đổi từ (0 – 20) mW;
- Tần số chùm tia thay đổi từ (5 – 100) Hz
Trên mặt máy của thiết bị ở mỗi kênh có 2 núm vặn để thực hiện sự thay đổi nêu trên
Bộ phận định thời gian phục vụ cho thí nghiệm gồm: 5, 10, 15, 20, 25 và 30 phút
Trên hình 3.1 giới thiệu thiết bị quang trị liệu bằng laser bán dẫn loại 2 kênh
Hình 3.1 Thiết bị quang trị liệu bằng laser bán dẫn loại 2 kênh
3.1.2.2 Thiết bị quang châm bằng laser bán dẫn công suất thấp loại 5 kênh
Năm kênh quang châm hoàn toàn giống nhau nhưng độc lập với nhau Mỗi kênh có một đầu quang châm Đó là laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 940 nm, với các thông số chính như sau:
Công suất phát xạ chùm tia thay đổi từ (0 – 12) mW;
Tần số điều biến chùm tia thay đổi từ (0 – 50) Hz
Trên mặt máy của thiết bị ở mỗi kênh có 02 núm vặn để thực hiện sự thay đổi nêu trên
Bộ phận định thời phục vụ cho thí nghiệm gồm: 5, 10, 15, 20, 25 và 30 phút
Trên hình 3.2 giới thiệu thiết bị quang châm bằng laser bán dẫn loại 5 kênh
Hình 3.2 Thiết bị quang châm bằng laser bán dẫn loại 5 kênh Trong thí nghiệm thực nghiệm chúng tôi sử dụng: a Hiệu ứng hai bước sóng đồng thời, do:
Laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 780 nm;
Laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 940 nm; tạo nên, với:
- Công suất phát xạ chùm tia 18 mW;
- Tần số điều biến chùm tia laser 50 Hz
Thời gian tương tác là 10 phút, 20 phút và 30 phút b Sử dụng laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 940 nm, với:
Công suất phát xạ 11 mW;
Tần số điều biến chùm tia 50 Hz;
Thời gian tương tác là 10 phút, 20 phút và 30 phút
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm a) Giống
Các túi meo giống nấm linh chi cấy trên cọng mì có ngày tuổi tương đồng từ
10—15 ngày được cung cấp bởi Công ty nấm Trang Sinh, địa chỉ cửa hàng: 1002 Nguyễn Trãi, phường 12, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh b) Lựa chọn giống nấm
Giống nấm linh chi phải đạt các yêu cầu sau:
+ Có màu trắng đồng nhất từ trên xuống dưới túi giống;
+ Giống không quá già, kết màng dày ở quanh túi giống;
+ Giống không quá non (giống chưa ăn kín đáy túi)
+ Giống không bị nhiễm mốc (mốc đen, mốc xanh + Giống có mùi thơm đặc trưng, không có mùi chua, không có hiện tượng tiết dịch màu nâu hay màu vàng ở thành hoặc đáy túi …) c) Môi trường nuôi trồng
Môi trường nuôi trồng là các bịch cơ chất có thành phần gồm mùn cưa cây cao su được bổ sung bột ngô 7%, cám gạo 7%, bột nhẹ 1 – 1,5%, đường 0,5% Các bịch cơ chất được hấp cách thủy ở nhiệt độ 100 0 C, thời gian hấp thanh trùng là 12 tiếng
Hình 3.3 Bịch cơ chất đã được hấp khử trùng d) Dụng cụ, phương tiện dùng trong thí nghiệm
Thí nghiệm có sự chuẩn bị của các vật dụng : đồng hồ đo nhiệt độ - độ ẩm, bình phun sương, nhà trồng nấm
Hình 3.4 Nhà trồng nấm giai đoạn nuôi sợi
Hình 3.5 Nhà trồng nấm giai đoạn chăm sóc quả thể
3.3 Quy trình tương tác chùm tia laser bán dẫn công suất thấp lên nấm linh chi 3.3.1 Quá trình chuẩn bị tương tác laser và tiền xử lý
Giai đoạn 1: Chuẩn bị giống trước khi cấy giống Chia 7 túi meo giống thành 7 nhóm mỗi nhóm 1 túi gồm:
+ Nhóm đối chứng + 3 nhóm chiếu 2 bước sóng kết hợp 940nm và 780nm với thời gian lần lượt là 20, 25, 30 phút
+ 3 nhóm chiếu 1 bước sóng 940mm với thời gian lần lượt là 20, 25, 30 phút
Hình 3.6 Meo giống nấm Linh Chi trước khi cấy
- Tiến hành chiếu laser đợt 1 trên meo giống a) b)
Hình 3.7 Meo giống được tương tác với chùm tia laser: a) bước sóng kết hợp 780nm & 940nm, thời gian 10 phút b) bước sóng 940nm , thời gian 10 phút Giai đoạn 2: cấy giống và nuôi sợi nấm
Mỗi túi meo giống sau khi được tác động bằng laser sẽ được dùng để cấy vào 10 túi cơ chất (các túi cơ chất có thành phần dinh dưỡng như nhau), ta có được 7 nhóm bịch phôi nấm Linh Chi, mỗi nhóm 10 bịch phôi Các nhóm bịch phôi này tiếp tục được tác động laser trong quá trình phát triển đến khi quả thể nấm Linh Chi đủ điều kiện thu hoạch
Quá trình cấy giống được thực hiện bên cạnh đèn cồn để sát khuẩn, hạn chế nấm mốc xâm nhập
- Xếp các bịch cơ chất lên kệ
Hình 3.9 Kệ trồng nấm gồm 7 nhóm, mỗi nhóm 10 bịch phôi
- Chuẩn bị bình tưới phun sương và đồng hồ đo nhiệt độ, độ ẩm để thuận tiện trong việc chăm sóc nấm Trong thời gian nuôi sợi, nhiệt độ nhà trồng nấm được giữ từ 20-30 0 C, độ ẩm không khí từ 80-90% Trong giai đoạn nuôi sợi nấm linh chi không cần ánh sáng, nếu cuờng độ ánh sáng cao có thể gây thoái hóa sợi nấm sớm, như: tiết dịch vàng trong túi giá thể
Hình 3.10 Đồng hồ đo nhiệt độ - độ ẩm và bình phun sương
3.3.2 Tương tác laser trong quá trình phát triển của sợi nấm và quả thể
- Sau 7-10 ngày từ khi cấy giống, hệ sợi nấm phát triển, lúc này tiếp tục tương tác laser với hệ sợi nấm, giữa hai lần tương tác cách nhau 5 ngày a) b) Hình 3.11 Bịch phôi nấm Linh Chi sau 15 ngày từ khi cấy giống được chiếu laser a) Nhóm hai bước sóng kết hợp, thời gian 20 phút b) Nhóm một bước sóng, thời gian 20 phút
Hình 3.12 Tơ nấm phát triển sau khi cấy giống 15 ngày a) nhóm tác động bởi hai bước sóng kết hợp, thời gian 20 phút b) nhóm đối chứng
Giai đoạn 3: quả thể nấm Linh Chi được hình thành và phát triển
- Quả thể nấm Linh Chi bắt đầu hình thành sau 30-35 ngày từ khi cấy giống Tiếp tục tương tác laser lên quả thể và hệ sợi nấm, giữa hai lần tương tác cách nhau 5 ngày
Hình 3.13 Tơ nấm kết lại chuẩn bị hình thành quả thể và được tác động bởi 2 bước sóng kết hợp 780nm & 940nm, thời gian 20 phút
- Khi quả thể nấm hình thành, nhà trồng nấm được thiết kế lại để đạt lượng ánh sáng và độ thông thoáng cần thiết cho sự phát triển của quả thể Giai đoạn chăm sóc quả thể, nhiệt độ nhà trồng nấm được giữ từ 22-31 0 C, độ ẩm không khí từ 85-95% Trong giai đoạn hình thành quả thể nấm cần ánh sáng tán xạ và ánh sáng cân đối từ mọi phía để quả thể nấm linh chi phát triển đều Nguồn ánh sáng sử dụng là ánh sáng khuếch tán của mặt trời
- Quả thể nấm Linh Chi lớn dần và bước vào giai đoạn thu hoạch sau khoảng 2 tháng rưỡi đến 3 tháng kể từ khi cấy giống a) b) Hình 3.14 Quả thể nấm linh chi a) sau khi phát triển được 15 ngày và b) sau khi phát triển được 1 tháng rưỡi
- Lựa chọn nấm linh chi đúng độ tuổi, nấm linh chi đến tuổi thu hái khi thấy có các đặc điểm sau:
+ Viền trắng nấm không còn nữa + Màu cánh nấm chuyển sang màu cánh gián đồng nhất + Phát tán bào tử màu nâu.
QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE
TRONG MẪU NGHIÊN CỨU VÀ MẪU ĐỐI CHỨNG 4.1 Các mẫu nấm linh chi
Nấm linh chi sau khi thu hái được phân thành 7 mẫu như sau:
Mẫu 1, mẫu 2 và mẫu 3 lần lượt là mẫu nấm linh chi được tác động bởi 2 bước sóng đồng thời (780 nm và 940 nm) với thời gian tác động tương ứng là 10 phút, 20 phút và 30 phút
Mẫu 4 là mẫu nấm linh chi ở nhóm đối chứng
Mẫu 5, mẫu 6 và mẫu 7 lần lượt là mẫu nấm linh chi được tác động bởi bước sóng 940 nm với thời gian tác động tương ứng là 10 phút, 20 phút và 30 phút
Hình 4.1 Các mẫu nấm sau khi thu hoạch Các mẫu nấm linh chi được phân tích hàm lượng polysaccharide tại Trung tâm sâm và dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, địa chỉ : 41 Đinh Tiên Hoàng, phường Bến Nghé, quận 1, thành phố Hồ Chí Mình
4.2 Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide Ðịnh lượng polysaccharide theo phương pháp phenol - acid sulfuric đặc, đo độ hấp thu dung dịch tại bước sóng 488 nm so với đường chuẩn glucose
Khái niệm về đường tổng và đường khử: a Đường tổng (hay còn gọi là Glucid) bao gồm
Monosaccharid: đường đơn (Simple carbohydrates), đơn vị cấu tạo của carbohydrat
Các đường đơn liên kết với nhau bằng liên kết glycosid
Polysaccharid thuần: gồm nhiều phân tử monosaccharid thuộc cùng 1 loại liên kết với nhau bằng liên kết glycoside
Polysaccharid tạp: gồm một số monosaccharid thuộc những loại khác nhau, những dẫn xuất của monosaccharid và một số chất khác b Đường khử là hợp chất glucid mà trong phân tử có nhóm aldehyde hoặc ceton
4.3 Hóa chất và thiết bị
Dung môi: ethanol, nước cất Hóa chất: natri hydroxyd, acid sulfuric, phenol, acid 3,5- dinitrosalicylic (DNS) Chất chuẩn: glucose
Máy siêu âm, tủ sấy, bếp cách thủy, máy đo quang
4.4 Quy trình xác định hàm lƣợng polysaccharide trong mẫu
Nguyên liệu được xay thành bột có kích thước 2 mm
4.4.1 Mất khối lƣợng do sấy khô
- Tiến hành: cân chính xác khoảng 1 g dược liệu vào một chén cân (đã sấy ở 105 oC đến khối lượng không đổi và đã cân bì), đem sấy ở 105 o C trong tủ sấy dưới áp suất thường đến khối lượng không đổi (nghĩa là chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5mg)
Trong đó: a: khối lượng bột dược liệu trước khi sấy (g) b: khối lượng bột dược liệu sau khi sấy (g) H%: độ ẩm (kl/kl)
Cho 3 ml mẫu thử vào ống nghiệm khô, thêm 0,5ml dung dịch thuốc thử α-naptol
1% trong cồn 80% vào ống nghiệm (không lắc dung dịch), tiếp tục cho từ từ acid sulfuric đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện ở mặt phân cách hai dung dịch một vòng màu tím
Cho 3 ml mẫu thử vào ống nghiệm, thêm 1ml thuốc thử Fehling A và 1ml thuốc thử
Fehling B vào, lắc đều và đem đun trên bếp cách thủy Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch
Định lượng đường tổng a Xây dựng đường chuẩn
Cân chính xác 50 mg glucose chuẩn hòa trong nước và định mức thành 50 ml, ta được dung dịch glucose 0,1 % Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo lần lượt là 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch glucose mẫu 0,1% trên, cho nước cất vào vạch mức Từ mỗi bình hút ra 1ml cho vào ống nghiệm, trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 àg glucose
Nước cất (ml) Định mức đến 100 ml
Hút mỗi ống trên ra 1 ml cho vào các ống nghiệm Khối lượng glucose (àg) 0 10 20 30 40 50 60 70
Thực hiện phản ứng màu
Hút 1 ml dịch mẫu đã chuẩn bị vào ống nghiệm có nút vặn Thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5 % Thêm tiếp vào ống nghiệm 5 ml H2SO4 đậm đặc, tuyệt đối không để dây acid vào thành ống Để 10 phút rồi lắc và giữ ở nhiệt độ phòng 10 - 20 phút xuất hiện màu Màu bền vững trong vài giờ Xác định cường độ màu trong phổ quang kể ở bước sóng 490 nm Dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa cường độ màu và nồng độ glucose b Xác định hàm lượng đường tổng Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 5 g mẫu chiết hồi lưu chiết với nước cất (200 ml x 3 lần), trong 1 giờ Lọc, tập trung dịch chiết đun cách thủy đến khi dung dịch mẫu còn khoảng 50 ml, chuyển dịch chiết vào bình định mức 50, thêm nước cất đến vạch Hút chính xác 20 ml dung dịch mẫu, thêm vào mẫu 80 ml cồn tuyệt đối, để lạnh ở 4 o C trong vòng 24 giờ, lọc, thu tủa Hòa tan tủa bằng nước cất, định mức 50 ml, lọc, thu được dung dịch A
Thực hiện phản ứng màu: Đối với mẫu 1, 2, 3, 4, 5 và 6
Hút 2,5 ml dung dịch mẫu cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất cho đủ 10 ml Hút 1 ml cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch phenol 5 % và 5 ml H2SO 4 đậm đặc, tuyệt đối không để dây acid vào thành ống Để 10 phút rồi lắc và giữ ở nhiệt độ phòng 10 – 20 phút xuất hiện màu Màu bền vững trong vài giờ Xác định cường độ màu trong phổ quang kể ở bước sóng 490 nm Thí nghiệm lặp lại 3 lần Đối với mẫu 7
Hút 4 ml dung dịch mẫu cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất cho đủ 10 ml Hút 1 ml cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch phenol 5 % và 5 ml H 2 SO 4 đậm đặc, tuyệt đối không để dây acid vào thành ống Để 10 phút rồi lắc và giữ ở nhiệt độ phòng 10 – 20 phút xuất hiện màu Màu bền vững trong vài giờ Xác định cường độ màu trong phổ quang kể ở bước sóng 490nm Thí nghiệm lặp lại 3 lần
Mẫu chuẩn: hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn tương đương với 50 g glucose chuẩn, thêm 1 ml dung dịch phenol 5 % và 5 ml H 2 SO 4 đậm đặc, tuyệt đối không để dây acid vào thành ống Để 10 phút rồi lắc và giữ ở nhiệt độ phòng 10 – 20 phút xuất hiện màu Màu bền vững trong vài giờ Xác định cường độ màu trong phổ quang kể ở bước sóng 490nm
Mẫu trắng: hút chính xác 1 ml nước cất, thêm 1 ml dung dịch phenol 5 % và 5 ml
H 2 SO 4 đậm đặc, tuyệt đối không để dây acid vào thành ống Để 10 phút rồi lắc và giữ ở nhiệt độ phòng 10 – 20 phút xuất hiện màu Màu bền vững trong vài giờ Xác định cường độ màu trong phổ quang kể ở bước sóng 490 nm
Hàm lượng đường tổng được tính theo công thức:
Với A%: hàm lượng đường tổng trên mẫu khô kiệt (%) OD t : mật độ quang của mẫu thử
OD 0 : mật độ quang của mẫu trắng
OD C : mật độ quang của mẫu chuẩn d: độ pha loãng m : khối lượng glucose chuẩn (50 g) m OD OD d m OD A OD
40 m: khối lượng mẫu đã trừ ẩm (g)
Định lượng đường khử a Xây dựng đường chuẩn
Từ dung dịch glucose chuẩn (1 mg/ml), pha các dung dịch glucose chuẩn nồng độ từ 100 - 500 (àg)
Hút đều ở mỗi ống trên ra 0,5 ml cho vào các ống nghiệm Khối lượng glucose
Thực hiện phản ứng màu
Lắc đều và hút ra mỗi ống nghiệm dung dịch chuẩn chính xác 0,5 ml cho vào các ống nghiệm sạch và khô khác Thêm vào mỗi ống 0,5 ml DNS Đem đun cách thủy ở 100 o C trong 3 phút, làm nguội và thêm 5 ml nước cất Xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở bước sóng 530 nm Dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa cường độ màu và nồng độ glucose b Xác định hàm lượng đường khử Chuẩn bị mẫu
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
5.1 Kết quả bước đầu thu được khi quan sát quá trình sinh trưởng và hình thái của quả thể nấm linh chi
5.1.1 So sánh quá trình sinh trưởng của sợi nấm trong giai đoạn nuôi sợi
Quan sát quá trình sinh trưởng của sợi nấm ở các nhóm được tác động bởi laser và nhóm đối chứng cho thấy : sợi nấm ở nhóm tác động bởi 2 bước sóng kết hợp đều phát triển nhanh hơn nhóm đối chứng (kết quả khác biệt rõ rệt nhất ở nhóm tác động bởi 2 bước sóng kết hợp, thời gian chiếu xạ 20 phút) Với nhóm được tác động bởi 1 bước sóng 780 nm, sợi nấm phát triển tốt nhất ở thời gian chiếu xạ 10 phút a) b) c) Hình 5.1 Tơ nấm phát triển sau 20 ngày từ khi cấy giống: a) Nhóm tác dộng bởi 2 bước sóng kết hợp, thời gian 20 phút b) Nhóm tác động 1 bước sóng, thời gian 10 phút c) Nhóm đối chứng
5.1.2 So sánh hình thái quả thể nấm linh chi thu đƣợc :
Quan sát hình thái quả thể nấm linh chi ở các nhóm trong quá trình phát triển nhận thấy:
Quả thể nấm linh chi ở nhóm tác động bởi 2 bước sóng kết hợp, thời gian chiếu xạ 20 phút có tai nấm dày, mặt trên tai nấm nhìn gồ ghề hơn các nhóm còn lại
Hình 5.2 Tai nấm ở nhóm tác động bởi 2 bước sóng kết hợp thời gian chiếu xạ 20 phút Quả thể nấm linh chi thu được ở nhóm tác động bởi 2 bước sóng kết hợp có kích thước to hơn so với nhóm đối chứng và nhóm tác động 1 bước sóng a) b) c)
Hình 5.3 Quả thể nấm linh chi sau 1 tháng rưỡi phát triển a) nhóm tác động bởi 2 bước sóng kết hợp, thời gian 20 phút b) nhóm tác động bởi 1 bước sóng, thời gian 10 phút c) nhóm đối chứng
5.2 Hàm lƣợng polysaccharide ở nhóm tác động so với nhóm đối chứng 5.2.1 Hàm lượng đường tổng
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 h a m lu o n g d u o n g t o n g (% ) thoi gian chieu xa (phut)
Hình 5.4 So sánh hàm lượng đường tổng giữa các nhóm Biểu đồ cho thấy:
Các nhóm được tác động bởi 2 bước sóng kết hợp (780 và 940 nm) đều có hàm lượng đường tổng tăng So với nhóm đối chứng, nhóm được chiếu xạ trong 10 phút có hàm lượng đường tổng tăng 15,50 %, nhóm được chiếu xạ trong 20 phút tăng 34,50 % và nhóm được chiếu xạ trong 30 phút tăng 4,34 % Như vậy khi được tác động bởi 2 bước sóng kết hợp trong khoảng thời gian 20 phút cho hàm lượng đường tổng tăng cao nhất
Trong các nhóm được tác động bởi bước sóng 940 nm, với thời gian tác động ngắn (10 phút) ta thu được mẫu nấm có hàm lượng đường tổng cao hơn nhóm đối chứng 7,64 % Càng tăng thời gian chiếu xạ (20 phút và 30 phút) hàm lượng đường tổng trong quả thể nấm càng giảm
Như vậy việc tác động bởi 2 bước sóng kết hợp đã tạo ra những kích thích sinh học giúp quá trình tổng hợp polysaccharide trong nấm linh chi tốt hơn Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc vào công suất phát xạ và thời gian chiếu xạ Ở đây, quá trình tổng hợp polysaccharide là tốt nhất ở thời gian chiếu xạ vừa phải (20 phút), việc chiếu xạ quá lâu sẽ ảnh hưởng xấu, làm giảm khả năng tổng hợp polysaccharide trong nấm linh chi
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 h a m lu o n g d u o n g kh u (% ) thoi gian chieu xa (phut)
Hình 5.5 So sánh hàm lượng đường khử giữa các nhóm Từ biểu đồ cho thấy:
Các nhóm được tác động bởi 2 bước sóng kết hợp (780 & 940 nm) trong thời gian 10 và 20 phút cho hàm lượng đường khử tăng theo thời gian Với thời gian tác động 10 phút hàm lượng đường khử tăng 6,82% so với nhóm đối chứng và tăng 36,71% ở thời gian tác động 20 phút Nếu tiếp tục tăng thời gian tác động lên 30 phút, hàm lượng đường khử sẽ bị giảm đi so với nhóm đối chứng
Các nhóm được tác động bởi bước sóng 940 nm đều cho kết quả hàm lượng đường khử ít hơn nhóm đối chứng, lượng đường khử giảm mạnh nhất ở mức thời gian tác động 10 phút (giảm 17,88% so với nhóm đối chứng)
Qua đây có thể thấy với hàm lượng đường khử, việc kết hợp 2 bước sóng tác động đồng thời (780 & 940 nm) cũng mang lại kết quả khả quan hơn so với chỉ dùng bước sóng 940 nm Kết quả thu được cũng ảnh hưởng bởi công suất chiếu xạ và thời gian chiếu xạ, ở cả hàm lượng đường tổng và đường khử, việc chiếu xạ với thời gian dài (30 phút) đều ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp polysaccharide Kết quả thu được là tốt nhất ở cả hàm lượng đường tổng và đường khử đều ứng với thời gian tác động là 20 phút
6.1 Những kết quả thu đƣợc 6.1.1 Đã tổ chức hoàn chỉnh việc nghiên cứu bằng thực nghiệm sự tương tác chùm tia laser bán dẫn làm việc ở các bước sóng khác nhau với công suất thấp lên nấm linh chi
6.1.2 Khi sử dụng hiệu ứng hai bước sóng đồng thời do:
Laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 780 nm;
Laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 940 nm tạo nên, với công suất phát xạ 18 mW, tần số điều biến 50 Hz và thời gian tương tác 10 phút, 20 phút và 30 phút, thu được kết quả tốt:
Sợi nấm phát triển nhanh hơn so với nhóm đối chứng
Quả thể linh chi phát triển tốt hơn so với nhóm đối chứng
Hàm lượng polysaccharide tăng so với nhóm đối chứng Đặc biệt khi sử dụng hiệu ứng hai bước sóng đồng thời, do laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 780 nm và 940 nm tạo nên, với công suất phát xạ 18 mW, tần số điều biến 50 Hz và thời gian tương tác 20 phút, mang lại hiệu quả cao nhất so với nhóm đối chứng Cụ thể như sau:
Quả thể nấm linh chi to và đạt đường kính 10,5 cm so với nhóm đối chứng chỉ đạt 8,7 cm
Hàm lượng polysaccharide tăng 34,50 % so với nhóm đối chứng
6.1.3 Khi sử dụng bước sóng 940 nm với công suất phát xạ 11 mW, tần số điều biến 50
Hz với thời gian tương tác 10 phút, mang lại hiệu quả tốt hơn so với nhóm đối chứng Cụ thể như sau:
Quả thể nấm linh chi lớn hơn và dày hơn so với nhóm đối chứng
Hàm lượng polysaccharide cao hơn 7,64% so với nhóm đối chứng
6.1.4 Sự tương tác của chùm tia laser bán dẫn với hiệu ứng hai bước sóng đồng thời, do laser bán dẫn làm việc ở bước sóng 780 nm và 940 nm tạo nên, với công suất phát xạ 18 nhóm đối chứng về mọi phương diện cần được khảo sát, đây là tiền đề để chúng tôi nghiên cứu tiếp tục
6.2 Đóng góp về mặt khoa học và kỹ thuật của đề tài
Sử dụng laser bán dẫn làm việc ở các bước sóng khác nhau với công suất thấp tác động lên nấm dược liệu quý của Việt Nam để nâng cao chất lượng quý giá của chúng là một hướng mới đầy triển vọng Vì:
Nâng cao dược liệu quý của nấm
Kỹ thuật đơn giản dễ dàng phổ cập rộng rãi
Không gây phản ứng phụ có hại cho sức khỏe người tiêu dùng trước mắt và lâu dài