Xác định hoạt tính sinh học và bản chất hóa học của một số hoạt chất từ nấm nội sinh trên cây khổ sâm croton tonkinensis gagnep và cây bùm bụp mllotus apelta lour

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ NHƯ HẰNG XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BẢN CHẤT HĨA HỌC CỦA MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY KHỔ SÂM (Croton tonkinensis Gagnep.) VÀ CÂY BÙM BỤP (Mallotus apelta Lour.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI- 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ NHƯ HẰNG XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BẢN CHẤT HĨA HỌC CỦA MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY KHỔ SÂM (Croton tonkinensis Gagnep.) VÀ CÂY BÙM BỤP (Mallotus apelta Lour.) Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số : 62.42.40.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ MAI HƯƠNG PGS.TS NGÔ TỰ THÀNH HÀ NỘI – 2010 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xiii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng thể nội sinh thực vật (CTNS) nấm nội sinh thực vật (NNS) 1.2 Sinh học sinh thái học NNS 1.2.1 Quan hệ NNS với chủ chúng 1.2.2 NNS bảo vệ chống tác nhân có hại 14 1.2.2.1 Bảo vệ chủ chống côn trùng hại 14 1.2.2.2 Bảo vệ chủ trƣớc điều kiện môi trƣờng bất lợi 20 1.2.3 Đa dạng sinh học NNS 21 1.2.4 NNS nhiệt đới 23 1.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh 25 1.3.1 Đại cƣơng 25 1.3.2 Các chất kháng vi sinh vật 26 1.3.3 Các chất gây độc tế bào ung thƣ 27 1.3.3.1 Taxol 27 1.3.3.2 Các xanton 29 1.3.3.3 Các chất từ Penicillium sp nội sinh Hopea hainanensis 29 iii 1.3.3.4 Các chất từ nấm Stemphylium globuliferum nội sinh thuốc Mentha pulegium 29 1.3.3.5 Các chất từ nấm Ampelomyces sp nội sinh thuốc Urospermum picroides 30 1.3.4 Các chất chống oxy hóa 30 1.3.5 Các chất kháng kí sinh trùng 31 1.3.6 Các chất ức chế miễn dịch 33 1.3.7 Các chất chữa bệnh tiểu đƣờng 33 1.3.8 Các độc tố 34 1.3.9 Các enzym thủy phân ngoại bào 36 1.3.9.1 Đại cƣơng 36 1.3.9.2 Mối liên quan enzym với vai trò nấm nội sinh chủ 37 1.4 Nấm nội sinh thuốc 38 1.5 Các nghiên cứu nấm nội sinh Việt Nam 40 1.6 Giới thiệu chi Trichoderma 41 1.6.1 Đại cƣơng 41 1.6.2 Sinh học ứng dụng Trichoderma 41 1.6.3 Phân bố địa lý Trichoderma 43 1.7 Giới thiệu hai thuốc 44 1.7.1 Khổ sâm - Croton tonkinensis Gagnep - họ Euphorbiaceae 44 1.7.2 Bùm bụp - Mallotus apelta Lour - họ Euphorbiaceae 46 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48 2.1 Vật liệu 48 iv 2.1.1 Mẫu 48 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 49 2.1.3 Các dòng tế bào 49 2.1.4 Dụng cụ, hoá chất thiết bị nghiên cứu 49 2.2 Môi trƣờng 50 2.2.1 Môi trƣờng phân lập nấm nội sinh 50 2.2.2 Môi trƣờng nuôi giữ chủng nấm nội sinh 50 2.2.3 Các môi trƣờng thử hoạt tính enzym 51 2.2.4 Môi trƣờng nuôi VSVKĐ tế bào 52 2.3 Phƣơng pháp 52 2.3.1 Phân lập NNS từ mẫu 52 2.3.2 Phân loại nấm phƣơng pháp hình thái học 53 2.3.3 Phân loại nấm phƣơng pháp sinh học phân tử 53 2.3.4 Thu nhận cặn chiết từ dịch lên men chủng NNS 54 2.3.5 Tách chất từ cặn chiết dịch lên men chủng Trichoderma konilangbra KS14 55 2.3.6 Xác định cấu trúc hợp chất tách đƣợc 56 2.3.7 Xác định hoạt tính sinh học chủng NNS 57 2.3.7.1 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 57 2.3.7.2 Xác định hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thƣ 59 2.3.7.3 Xác định hoạt tính chống oxy hố 61 2.3.7.4 Xác định hoạt tính enzym ngoại bào 63 2.3.8 Khảo sát tác dụng chế phẩm Trichoderma konilangbra KS14 63 khổ sâm 63 v CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Phân lập nấm nội sinh từ thuốc 65 3.1.1 Các chủng nấm nội sinh từ khổ sâm 65 3.1.2 Các chủng nấm nội sinh từ bùm bụp 66 3.2 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật chủng NNS phân lập đƣợc 68 3.3 Phân loại chủng nấm nội sinh phƣơng pháp hình thái phƣơng pháp sinh học phân tử 73 3.3.1 Phân loại chủng NNS phƣơng pháp hình thái 73 3.3.1.1 Chủng KS6 73 3.3.1.2 Chủng MB8 74 3.3.1.3 Chủng KS14 75 3.3.1.4 Chủng KS15 76 3.3.1.5 Chủng KS17 77 3.3.1.6 Chủng KS18 77 3.3.1.7 Chủng KS19 78 3.3.1.8 Chủng MR2 79 3.3.1.9 Chủng KS24 80 3.3.1.10 Chủng KS33 81 3.3.2 Phân loại chủng nấm nội sinh KS14 phƣơng pháp sinh học phân tử…… 85 3.4 Hoạt tính sinh học cặn chiết dịch lên men chủng nấm nội sinh đƣợc lựa chọn 87 3.4.1 Hoạt tính kháng VSV cặn chiết etylaxetat 87 3.4.2 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ cặn chiết etylaxetat 90 vi 3.4.3 Hoạt tính chống oxy hoá cặn chiết etylaxetat 92 3.4.4 Hoạt tính enzym ngoại bào dịch nuôi chủng nấm lựa chọn 93 3.5 Tìm hiểu điều kiện ni thích hợp cho hoạt tính kháng VSV chủng nấm T konilangbra KS14 96 3.5.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng lên men 96 3.5.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi 97 3.5.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi 99 3.5.4 Ảnh hƣởng nguồn cácbon nguồn nitơ 100 3.6 Bản chất hóa học hợp chất tách đƣợc từ dịch lên men chủng NNS T konilangbra KS14 103 3.6.1 Hợp chất KS14-1 103 3.6.2 Hợp chất KS14-2 105 3.6.3 Hợp chất KS14-3 107 3.6.4 Hợp chất KS14-4 109 3.6.5 Hợp chất KS14-5 111 3.7 Hoạt tính sinh học hợp chất tách đƣợc từ chủng T konilangbra KS14 113 3.7.1 Hoạt tính kháng VSV 113 3.7.2 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ 115 3.7.3 Hoạt tính chống oxy hoá 116 3.7.4 So sánh hoạt tính sorbixilin ergosterol peroxit với ent-7βhydroxy-18-axetoxy-kaur-16-en-15-on 117 3.8 Tác dụng chế phẩm T konilangbra KS14 khổ sâm 120 KẾT LUẬN 124 KIẾN NGHỊ 126 vii CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 PHỤ LỤC viii ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ NHƯ HẰNG XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BẢN CHẤT HĨA HỌC CỦA MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY KHỔ SÂM (Croton tonkinensis. .. QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Phân lập nấm nội sinh từ thuốc 65 3.1.1 Các chủng nấm nội sinh từ khổ sâm 65 3.1.2 Các chủng nấm nội sinh từ bùm bụp 66 3.2 Sàng lọc hoạt tính. .. 55 2.3.6 Xác định cấu trúc hợp chất tách đƣợc 56 2.3.7 Xác định hoạt tính sinh học chủng NNS 57 2.3.7.1 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 57 2.3.7.2 Xác định hoạt tính gây độc