Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành β amyloid gây bệnh alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe sophora japonica l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đỗ Thị Hải Anh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ HOA HÒE (Sophora japonica L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đỗ Thị Hải Anh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ HOA HÒE (Sophora japonica L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới người thày tận tâm bảo, tạo điều kiện cho em học tập, trau dồi kiến thức suốt thời gian qua – PGS.TS Nguyễn Quang Huy Nếu hướng dẫn, giúp đỡ động viên liên tục thày, em khó hồn thành luận văn thạc sĩ Tiếp đến, em xin chân thành cảm ơn GS Shunsuke Izumi PGS.TS Kazumi Saikusa, phịng thí nghiệm Khoa Tốn học Khoa học sống, ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Hiroshima tạo điều kiện, quan tâm hướng dẫn em làm thí nghiệm thời gian em học tập trao đổi ĐH Hiroshima Dưới hướng dẫn thầy cô, em học nhiều điều hay bổ ích, phục vụ nhiều cho trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy mơn Hóa sinh Sinh học phân tử, thày cô giáo Khoa Sinh học chuyên viên phòng Đào tạo Sau Đại học trường ĐH Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện cho em hồn thành chương trình học tập khóa học Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln bên động viên, cổ vũ tinh thần cho em em gặp khó khăn suốt thời gian em học tập thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên cao học Đỗ Thị Hải Anh Đỗ Thị Hải Anh i Sinh học thực nghiệm K25 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.1.1 Bệnh Alzheimer giới Việt Nam 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh Alzheimer 1.1.3 Chẩn đốn phịng ngừa bệnh Alzheimer 1.1.4 Mối liên hệ stress oxi hóa bệnh Alzheimer 1.1.5 Vai trò β-amyloid bệnh Alzheimer 10 1.2 Tổng quan flavonoids nghiên cứu flavonoids từ thực vật 12 1.2.1 Tổng quan flavonoids 12 1.2.2 Giá trị sinh học flavonoids 15 1.3 Tổng quan Hoa hòe (Sophora japonica L.) 19 1.3.1 Giới thiệu chung 19 1.3.2 Thành phần hóa học hoa hịe 20 1.3.3 Công dụng hoa hòe 21 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu 23 2.1.1 Mẫu thực vật 23 2.1.2 Mẫu peptide 23 2.2 Hóa chất 23 2.3 Thiết bị thí nghiệm 23 2.3.1 Thiết bị tách chiết xác định hợp chất 23 2.3.2 Thiết bị đánh giá khả bắt gốc tự giảm tích tụ peptide βamyloid 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 Đỗ Thị Hải Anh ii Sinh học thực nghiệm K25 2.4.1 Phương pháp tách chiết 24 2.4.2 Phương pháp sắc ký mỏng 25 2.4.3 Phương pháp sắc ký cột 26 2.4.4 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 28 2.4.5 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân 29 2.4.6 Phương pháp khối phổ 31 2.4.7 Phương pháp chuẩn bị mẫu β-amyloid dung dịch chất chuẩn, chất tinh 32 2.4.8 Phương pháp bắt gốc tự DPPH 33 2.4.9 Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavin T 35 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Phân lập tinh hợp chất có dịch chiết 37 3.1.1 Phân lập chất phương pháp sắc ký mỏng 37 3.1.2 Tinh chất phương pháp sắc ký cột 38 3.1.3 Tinh chất phương pháp sắc ký lỏng-lỏng 40 3.2 Xác định hợp chất có phân đoạn 42 3.2.1 Xác định cấu trúc chất C2 42 3.2.2 Xác định cấu trúc chất C6 45 3.3 Đánh giá khả làm giảm tích lũy β-amyloid 52 3.3.1 Hoạt tính chống oxi hóa 52 3.3.2 Hoạt tính làm giảm tích tụ peptide β-amyloid 54 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Đỗ Thị Hải Anh iii Sinh học thực nghiệm K25 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết phân tách dịch chiết nụ hoa hòe phương pháp sắc ký cột 38 Bảng 3.2 Kết sắc ký mỏng phân đoạn thu sau chạy sắc ký cột 39 Bảng 3.3 Tổng kết chất tinh cao khô thu từ dịch chiết nụ hoa hòe 41 Bảng 3.4 Bảng so sánh giá trị peak quercetin chuẩn với chất C2 43 Bảng 3.5 Thành phần nguyên tố hợp chất C6 47 Bảng 3.6 Bảng so sánh giá trị peak Neohesperidin chuẩn chất C6 50 Bảng 3.7 Giá trị quét gốc tự DPPH chất 53 Đỗ Thị Hải Anh iv Sinh học thực nghiệm K25 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ minh họa q trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4] Hình 1.2 Mảng viêm thần kinh tích tụ β-amyloid não bệnh nhân Alzheimer [2] 11 Hình 1.3 Cấu trúc vịng flavonoid 13 Hình 1.4 Cây hoa hịe 20 Hình 2.1 Sơ đồ minh họa cột sắc ký 27 Hình 2.2 Sơ đồ minh họa hoạt động hệ ESI-MS/MS 32 Hình 3.1 Kết sắc ký mỏng dịch chiết nụ hoa hòe 37 Hình 3.2 Các phân đoạn khác sau chạy sắc ký cột 39 Hình 3.3 Kết sắc ký mỏng chất C2 C6 so sánh với quercetin rutin chuẩn 40 Hình 3.4 Chất C6 41 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR quercetin chuẩn 42 Hình 3.6 Phổ 1H-NMR C2 43 Hình 3.7 Cơng thức cấu tạo chất C2 – quercetin 45 Hình 3.8 Phổ khối lượng ESI chất C6 46 Hình 3.9 Phổ 1H-NMR Neohesperidin chuẩn 48 Hình 3.10 Phổ 1H-NMR chất C6 48 Hình 3.11 Phổ 13C-NMR Neohesperidin chuẩn 49 Hình 12 Phổ 13C-NMR chất C6 49 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học C6 – neohesperidin 51 Hình 3.14 Đồ thị đường chuẩn khả chống oxi hóa vitamin C 52 Hình 3.15 Biểu đồ thể tích lũy β-amyloid điều kiện khác 54 Đỗ Thị Hải Anh v Sinh học thực nghiệm K25 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Aβ Β-amyloid DPPH 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl MS Mass Spectrometry – Phổ khối lượng NMR Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân SSTT Sa sút trí tuệ Đỗ Thị Hải Anh vi Sinh học thực nghiệm K25 MỞ ĐẦU Nhờ tiến khoa học công nghệ phát triển kinh tế xã hội, sống người ngày cải thiện Tuổi thọ trung bình lồi người tăng lên thành tựu y tế công cộng kết phát triển kinh tế, xã hội Tuy nhiên gây thách thức vấn đề chăm sóc bảo vệ sức khỏe cho số lượng lớn người cao tuổi xã hội Tuổi già làm tăng nguy phát triển bệnh mạn tính thối hóa Một bệnh mạn tính khơng lây nhiễm thối hóa thường gặp người cao tuổi hội chứng sa sút trí tuệ (SSTT), bệnh Alzheimer chiếm tới 50-70% Hiện tỉ lệ mắc SSTT tăng theo tuổi theo hàm số mũ rên toàn giới, theo báo cáo Hiệp hội Alzheimer giới, có khoảng 50 triệu người mắc bệnh Alzheimer năm 2016, ước tính lên đến khoảng 150 triệu người vào năm 2050 Sa sút trí tuệ thật thảm hoạ người cao tuổi Bệnh gây suy giảm trí nhớ nhiều lĩnh vực nhận thức khác, kèm theo với rối loạn hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả hoạt động chất lượng sống bệnh nhân Người mắc bệnh Alzheimer bị dần khả tự chăm sóc ngày phụ thuộc vào người khác việc thực hoạt động thể chất tinh thần Chi phí cho điều trị bệnh Alzheimer tốn kém, đứng sau bệnh tim mạch ung thư Vì việc tìm phương pháp phịng ngừa chữa trị bệnh Alzheimer vô cần thiết xã hội Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú với trữ lượng lớn, có nhiều tiềm thuốc Cây hoa hòe (Sophora japonica L.) loại trồng phổ biến Việt Nam Cây vừa cho bóng mát, vừa cung cấp giá trị khác đặc biệt kinh tế y học Hoa hòe vị thuốc sử dụng rộng rãi thuốc y học cổ truyền từ xưa đến Mọi phận cây, đặc biệt khơ, hoa chồi có giá trị lớn y học nụ hoa hòe dùng làm thuốc cầm máu cho bệnh đổ máu cam, ho máu, ruột chảy máu, tiểu tiện Đỗ Thị Hải Anh Sinh học thực nghiệm K25 máu dạng thuốc sắc Các nghiên cứu gần thành phần flavonoids thực vật có khả giúp chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, đặc biệt khả giảm tích lũy peptide β-amyloid – loại peptide gây bệnh Alzheimer Vì lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu khả ức chế hình thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora japonica L.)” với mục đích:  Tách chiết tinh chất có hoạt tính sinh học từ nụ hoa hòe  Đánh giá khả ngăn chặn tích tụ peptide β-amyloid in vitro từ số chất tách từ nụ hoa hoè Đỗ Thị Hải Anh Sinh học thực nghiệm K25 ... ? ?Nghiên cứu khả ức chế hình thành β- amyloid gây bệnh Alzheimer số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora japonica L. )” với mục đích:  Tách chiết tinh chất có hoạt tính sinh học từ nụ hoa hòe  Đánh giá khả. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đỗ Thị Hải Anh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β- AMYLOID GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ HOA HÒE (Sophora japonica L. ) Chuyên ngành:... phịng ngừa bệnh Alzheimer 1.1.4 Mối liên hệ stress oxi hóa bệnh Alzheimer 1.1.5 Vai trò β- amyloid bệnh Alzheimer 10 1.2 Tổng quan flavonoids nghiên cứu flavonoids từ thực vật