Luận văn thạc sĩ khoa học: Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hoạt nhục đầu khấu ( Myristica Fragrans )

Việc nghiên cứu tìm ra các chất có khả năng điều trị căn bệnh ung thư, cũng như ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung thư làm tăng thời gian sống cho bệnh nhân luôn được các nhà khoa

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Chinh

NGHIÊN CỨU TÁC DUNG CHONG UNG THU CUA MỘT SO

HOAT CHAT PHAN LAP TU HAT NHUC DAU KHAU

(Myristica fragrans )

LUAN VAN THAC SI KHOA HOC

Hà Nội - 2011

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Chinh

NGHIÊN CỨU TÁC DUNG CHONG UNG THU CUA MỘT SO

HOAT CHAT PHAN LAP TU HAT NHUC DAU KHAU

(Myristica fragrans )

Chuyén nganh: Sinh hoc thuc nghiém

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THAC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Phương Thiện Thương

Hà Nội - 2011

Trang 3

Luận văn thạc sĩ khoa học Mục lục

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 52-5: 2S 2t 2t 21221 21271211211211.11211211 1111211211111 erree 1

Chương 1 - TONG QUAN woe eecescssssssssssssssscsecsessesssssssussecscsessessssusssssessessessesseesssesaeees 3

1.1 UNG THU VÀ CO CHE SINH BỆNH scssscsssesssesssesssessesssesssessesesesssessees 31.1.1 Đặc điểm tế bao ung thư và quá trình tiến triển bệnh - 41.1.1.1 Đặc điểm tế bào ung thư - ¿5c seSE+EE+EE2EE2EEEEEEeEkerkerkrrrrei 41.1.1.2 Quá trình tiến triển bệnh ung thư - 2-2 2 2 xe£x+£++£+E+zEzez 5

1.1.2 Hậu quả của ung thư đối với cơ thỂ - 2-2-5 522 £+££+£E+£E£+Ez+rssrsez 71.2 MOT SO LOẠI THUOC THƯỜNG DUNG TRONG DIEU TRI

UNG THU oeececcsscsscsssessessssssessessessussssssessessessusssessssussusssessessessussssssessessnesseesess 8

1.2.1 Thuốc alkyl ha ccceccccceccccccsccsessesssssesesscscssessesssssessssucscsessessessessessesneaveaee 81.2.2 Thuốc chong chuyền hóa ¿- 2 ¿+ E2 E+EE+EE+E££EE+E£EE£EEeEESEEeEErrerree 81.2.3 Thuốc làm thay đổi đáp ứng sinh học - 2 2s x+zsz+zz+zs+rxez 9

1.2.4 Dược liệu Việt Nam chữa ung thư - - 5 5 + + sekeeeeereserreree 9

1.3 MOT SO MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC DUNG CHONG UNG

THU CUA CHE PHẨM -+- 2£ 5¿+E£+EE£EE£EEt2EEEEEEEEEEEEEErrkerkerkrrei 101.3.1 Mô hình nuôi cấy tẾ bào i VỈfFO 525cc EEEEEEkerkerkerkerres 101.3.1.1 Nuôi cấy 2D - c5 ST 211211211211 21 0111121121121 1111111 101.3.1.2 Nuôi cấy spheroid -¿- 2565 tk xEEEEEE1211211 212111111 xe 12

b Ung dụng của spheroid trong nghiên cứu ung thư - 2-2 2s s+£s£s+£+2 +2 13

c Một số đặc tính của tế bào ung thư phù hợp với mô hình nuôi cấy 3D 14

1.3.2 Mô hình i7! ViWO cc 5 2211111111231 111111993111 vn ng xen 16

1.4 CAC DONG CHUOT SWISS VÀ BALB/C -2¿©255ccccxcscxe2 17

1.4.1 Dòng chuột Swiss ccecccescessecsseeceseeesseceseecsaeeceaeceseeceaeeceaeeesaeeeseeeaes 18 1.4.2 Dòng chuột BALB/C ccccssscsssesssesssssesssecsssssssssecssecssecsecesecssecsusesecasecsneess 18

1.5 CAC CHE PHAM PHAN LẬP TỪ HẠT NHUC DAU KHAU

MYTISTICE FFAQTANS oo .eecccesecceseceseeesceeeseesnecesceseseeseaeeeneseaeecsseeeaeeesueseaeessaeenes 19

1.6 THUOC DOI CHUNG TAXOL VA 6MP ccscsscsssessessesssessessessecssesseeseeses 20

Nguyễn Thị Chỉnh KI8 Sinh học Thực nghiệm

Trang 4

2.1.2.2 Dụng cụ và vat tư tiêu haO - - TS HH HH ng re, 242.1.2.3 Thiết bị nghiên cứu - 2: £+2+EE+EE+EE£EEE2EESEEEEEEEErrkrrkerkerree 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 2-22 +¿©+£x£+£x++zxetxeerxesrxez 252.2.1 Phương pháp SRB - xác định độc tính đối với TBUT của các hoạt

chất trong mô hình iw Vitro -¿- + + s©++++E++EE+E£+EezEerEerxersereee 252.2.2 Phương pháp thử tác dụng của hoạt chất trên spheroid MCF7 26

2.2.2.1 Phương pháp tao spheroid MCF7 ccxcsseesseesessesske 26

2.2.2.2 Thiết kế thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất

meso-dihydroguairetic acid trên spheroid MŒTF7 - s5 <+<ss++ 27

2.2.2.3 Xác định thé tích khối spheroid MÉCF7 2- 22 s+csz>se2 282.2.3 Phương pháp gây u rắn và thử tác dụng chống ung thư của hoạt

chất trên chuộỘt - - -sStx‡StSEEEE+EEEEEEEEEEEEEEEEESEEEEEEEEEEEEEEEEkrkrrkrrrrke 29

2.2.3.1 GAY U c 2c 22 T222 221121122121121 01112101 29

p5 8ö 0O hh 29

2.2.3.3 Cách cho uống -:- 2-5252 2E2EEEEEEEEEEEE1111211211 2171111111 c0, 302.2.3.4 Liều uỐng - + St x2 1 1211211 217111111111111 111111111110 302.2.3.5 Xác định kích thước khối u -2-5+©5225£+£++£xezxzEezrxerxersee 302.2.3.6 Xử lý số liệu 5c St 1 1E 1211 11011211211 2111111111 11 1 1e 31

Chương 3 — KET QUA ciceecesceccescssessessessessesvssvcsessessesscsuesucsvssessessesuesucsusssssesaessessesnease 32

3.1 KET QUA THU DOC TINH TREN CAC DONG TE BAO UNG

THU VA DONG TE BAO THUONG 0 cccscssessesssessessesseessessessessesseeseeseess 32

VI

Trang 5

3.2 SỰ BIEN DOI THE TÍCH VÀ HÌNH THÁI KHOI SPHEROID

MCF7 DƯỚI TAC DUNG CUA CHE PHAM 3.8 -: 37

3.2.1 Su tao spheroid MCF7 trong thi nghiém thir tac dung cua hoat

CHAE Lees eecceeeecsssesessseeeessneecssnsecesssecessnsecssnseessuneessneeessnseessnneessnneeessnseessnees 373.2.2 Hình thái của khối spheroid MCF7 dưới tac dụng của hoạt chat 1 383.2.3 Thể tích khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của hoạt chat 1 43

3.3 SỰ BIEN DOI VE THE TÍCH VÀ HÌNH THAI KHOI U RAN

SAR180 TREN CHUOT SWISS DUGI TAC DUNG CUA CHE

PHAM 3.8 Ở CAC LIEU THU KHAC NHAU -2-©-2 5525552 47

3.3.1 Ảnh hưởng của hoạt chat 1 đến kích thước khối u - 413.3.2 Ảnh hưởng của hoạt chất 1 đến hình thái khối u chuột - 51

0097925275 -::: 56

TÀI LIEU THAM KHẢO 2-2 52 2+EE+EE£EEE2EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrrkerkrrer 57

Tiếng VIỆK c5 TT E1 1121121111 1111 11 11011 1111 T1 1 1 1111111111 1 grờy 57Ting AMD 0a 58

vil

Trang 6

Luận văn thạc sĩ khoa học Danh mục chữ viết tắt

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC | American Type Culture Collection DMEM | Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl Sulfoxide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ICs0 | half maximal inhibitory concentration

FBS Fetal Bovine Serum

MCF-7 Michigan Cancer Foundation — 7

MDCK | Madin-Darby Canine Kidney Cells

OD Optical density PBS Phosphate Buffered Saline RPMI Roswell Park Memorial Institute SRB Sulforhodamine B

TCA Trichloroacetic Acid

6MP Mercaptopurine

DCDM Đối chứng dung môiDCSH Đối Chứng Sinh Hoc

DCUT Đối Chứng Ung Thu

TBUT Té Bao Ung Thu

Nguyén Thi Chinh K18 Sinh học Thực nghiệm

Trang 7

Luận văn thạc sĩ khoa học Danh mục bảng

DANH MỤC BANG

Bang 1 Hóa chất sử dụng trong đề tài -¿- 2-55 SE 22212121212 erkrree 23

Bảng 2 Dụng cụ và vật tư tiêu haO c1 1 v11 1v ng ng ng rvt 24

Bang 3 Các thiết bị sử dụng ¿- 25+ 522522 2EEEEEEEEEEE121121121121 1111111111 25Bang 4 Bồ trí thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất 1 trên mô hình spheroid MCF7

¬ 28

Bảng 5 Phân bố thời gian và liều lượng cho chuột uống ở các lô thí nghiệm 30Bảng 6 Giá trị IC50 của các hoạt chất trên các dòng tế bào ung thư - 34Bang 7 Tỷ lệ tan rã khối cầu spheroid dưới tác dụng của hoạt chat 1 43Bảng 8 Tỷ lệ kích thước khối spheoroid dưới ảnh hưởng của hoạt chất 1 qua các

lần đo so với ngày đầu trước khi tra hoạt chất -¿¿+++cx+zxvzxzrezrxerxeres 44Bảng 9 Tỷ lệ kích thước khối spheroid dưới ảnh hưởng của taxol qua các lần đo so

với ngày đầu trước khi tra thuỐc ¿2 2 E+E£+EE+EE+EE£EEEEEESEEEEEEEEErEkrrkerkrex 46

Bang 10 Tỷ lệ chuột tiêu hết u ở các lô thí nghiệm 2 2 ¿5 s2 s+£s2 5+2 48Bang 11 Kích thước u (mm) qua các lần dO - 5c ©5¿25£5++x+zx++z+zxerxrsz 49

Bảng 12 Thẻ tích u (mm?) qua các lần đo -2-©2¿©¿2+£+£x++2zxeerxevrreezree 50

il

Trang 8

Luận văn thạc sĩ khoa học Danh mục hình

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Một số dòng TBUT bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy - 11

Hình 2 Chuột Swiss (A) va BALB/c (B) eeeceeceesceseeeeeeseeeeseeaeeeeeeeceeseeeeeeeaeeeeeaeeas 19

Hình 3 Cac lignan (1-4) phân lập từ hạt nhục đậu khấu - 5-52 s2 20Hình 4 Công thức cấu tạo và cấu hình không gian của Taxol - 21Hình 5 Thuốc chữa ung thư 6-MP ccccccssesssesssesssesssecssessecssecsuessssssecssecsueesesssecsneess 22

Hình 6 Tế bao sau trước và sau 48h ủ với meso-dihydroguairetic acid 32

Hình 7 Ảnh hưởng của 04 hoạt chất: meso-dihydroguairetic acid (chất 1);

macelignan (chất 2); fragransin A2 (chất 3) và nectandrin B (chất 4) lên sự tăng

trưởng của 08 dòng tế bào ung thư . -2¿5¿22++2E++EE+2Ext2EEtrkterxezrxerresree 36Hình 8 Anh hưởng của 04 hoạt chất meso-dihydroguairetic acid; macelignan;

fragransin A2 và nectandrin B lên sự tăng trưởng của dòng tế bào thường MDCK

Hình 9 Hình thái của khối spheroid MCF7 trong điều kiện nuôi cấy bình thường 38Hình 10 Sự tan rã của khối spheroid MCF7 dưới tac dụng của hoạt chất meso-

dihydroguairetic acid ở nồng độ 30IM -2-22- 552225 2+22E+2EE2EEeEErerkrsrkrrrrees 39Hình 11 Sự biến đổi hình thái khối spheroid MCF7 dưới tác dụng của hoạt chat

meso-dihydroguairetic acid ở nồng độ 30uM 2-©22-55222S22+2xczxrsrxerreeree 40Hình 12 Spheroid MCF7 dưới tác dụng của hoạt chất meso-dihydroguairetic acid ởnồng độ 20I1M - 2-5512 12EE15E157157111112112112111111111111111 21.11111111 40Hình 13 Hình ảnh của MCF7 dưới tác dụng của taxol ở nồng độ 30uM 42Hình 14 Hình ảnh của MCF?7 dưới tác dụng của taxol ở nồng độ 20uM 42Hình 15 Đồ thị về tỷ lệ kích thước khối spheroid đưới ảnh hưởng của | theo thời

50800 i99) 0017 45

Hình 16 Đồ thị tỷ lệ kích thước khối spheroid dưới ảnh hưởng của taxol theo thời

5800 4i0909 5007 46

Hình 17 Đồ thị thể tích u qua các lần đo ¿2-2 2+2 + £2+E£+E+Eerkerxerxersree 50

Hình 18 Chuột ở lô: ĐCSH (A), DCDM (B) sen eưko 52

ill

Trang 9

Luận văn thạc sĩ khoa học Danh mục hình

Hình 19 Chuột ở lô đối chứng 6-MP - 2: ¿©52+SE+EE£EE£2EE+EEvEEEEErEkerxerreree 53

Hình 20 Chuột ở lô uống hoạt chất meso-dihydroguairetic acid (1g/kg) - 54

IV

Trang 10

Luận văn thạc sĩ khoa học Mở dau

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay số người mắc bệnh ung thư ởViệt Nam cũng như trên thé giới ngày càng gia tăng Năm 2000, ở Việt Nam tỷ lệmắc chung của bệnh ung thư ở nam giới là 104/100.000 dân, ở nữ giới là101/100.000 dan, thì đến năm 2010 tỷ lệ nay ở nam giới tăng đến 181/100.000 dan

và ở nữ giới tăng đến 134/100.000 dân Trong đó các loại bệnh ung thư có tỷ lệ mắc

mới tăng rõ rệt là ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư thực quan, ung thư tiềnliệt tuyến ở nam giới và ung thư vú, ung thư đạ dày, ung thư phổi, ung thư đại tràng

và ung thư tuyến giáp ở nữ giới Mỗi năm Việt Nam có khoảng 75.000 người chết

vì bệnh ung thư Ước tính năm 2011 có thêm 126.000 người mắc mới [11] Bệnh

ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng, không loại trừ một ai

trong xã hội Việc nghiên cứu tìm ra các chất có khả năng điều trị căn bệnh ung thư,

cũng như ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung thư làm tăng thời gian sống cho

bệnh nhân luôn được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm nghiên cứu.Đến nay, đã có nhiều hoạt chất chống ung thư có nguồn gốc tự nhiên đã được khámphá ra và đem vào sử dụng trên lâm sàng Các hoạt chất điển hình là paclitaxel

(taxol), vinblastin và vincristin, camptothecin, adriamycin

Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm va mưa nhiều nên có hệ

thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Có rất nhiều loại cây được sử dụng là

những dược liệu quí Đã có nhiều hoạt chất được tách chiết từ thực vật có tác dụng

hỗ trợ điều trị căn bệnh ung thư cũng như ngăn chặn sự phát triển của khối u đượctim thấy như: đu đủ (Carica papaya L.) thuộc họ Du đủ (Papayaceae) [24], gắc

(Momordica cochinchinensis Streng) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [1], trinh nữ

hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [9], Do

đó, chắc chan trong thiên nhiên vẫn còn tiềm ân các hoạt chất có tác dụng chống

ung thư đang chờ con người khám phá.

Cây nhục đậu khấu có tên khoa học là Myristica fragrans Hout (tên tiếng

Anh: mace, nutmeg), thuộc họ nhục đậu khấu (Myristicaceae), là cây được trồng và

Nguyễn Thị Chỉnh K18 Cao học Sinh học

Trang 11

Luận văn thạc sĩ khoa học Mở dau

mọc ở miền Nam Việt Nam Các lignan (tức là các phenylpropanoids) là thành phần

chủ yếu có tác dụng sinh học của hạt nhục đậu khấu, gồm các chất chính fragransin

A2, nectandrin B, macelignan, meso-dihydroguaiaretic acid Đã có nhiều nghiêncứu về tác dụng sinh học các lignan phân lập từ hạt có tác dụng chống oxy hóa,chống viêm giảm đau, có tác dụng bảo vệ gan, giảm cholesterol trong máu, chống

xơ vữa động mạch, kháng khuẩn Nhưng cho đến nay những nghiên cứu về tác dụngchống ung thư của hạt và các lignan phân lập từ hạt ở Việt Nam và thế giới mới có

rất ít [27].

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụngchống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica

fragrans” với các mục đích chính như sau:

- Thử hoạt tính chống ung thư của các hoạt chất lignan phân lập được trên

mô hình nuôi cấy tế bào 2D

- Tạo mô hình và nghiên cứu tác dụng chống ung thư của lignan có tác dụng

chống ung thư mạnh nhất (trong các lignan đã thử nghiệm 2D) trên mô hình 3D và

in vivo.

Trang 12

Luận văn thạc sĩ khoa học T1 ong quan

Chương 1 - TONG QUAN

1.1 UNG THU VA CO CHE SINH BENH

Ung thu không phải chỉ là một loại bệnh ma là khoảng trên 200 loại bệnh

khác nhau [34] Mỗi loại có nguyên nhân riêng của nó, nhưng đều có nguồn gốcchung từ việc tế bào bị đột biến gen [34] Năm 1953, lần đầu tiên tế bào ung thư

được quan sát dưới kính hiển vi điện tử Những thành tựu nghiên cứu ở mô hình tếbào cho đến nay là cơ so chắc chắn cho nhận định của giáo sư Arnold Graffi “vấn

đề của ung thư thực chất là vẫn đề của tế bào học” Vì vậy muốn điều trị ung thưphải hiểu được cơ sở tế bào học của nó [8, 34] Các đặc điểm nỗi bật chung của tébao ung thu là tế bào bi đột biến gen, có khả năng sự tăng sinh vô hạn, không kiêmsoát được, có khả năng xâm lan và phát triển ở các cơ quan, tổ chức khác của cơ thé

(sự di căn), có khả năng tăng sinh mạch máu [13, 34].

Bệnh ung thư bắt đầu từ khi có một tế bào bắt đầu vượt qua sự kiểm soát của

cơ thể, bị đột biến gen, phát triển không ngừng và hình thành một đám tế bào cóchung đặc điểm là phát triển vô kiểm soát, xâm lấn và chèn ép các mô xung quanh

Có rất nhiều nguyên nhân làm chuyên dạng tế bào lành thành tế bào ung thư, bao

gồm: các tác nhân vật lý (chủ yếu là tia bức xạ ion hóa), các tác nhân hóa học, các

virus, một số bệnh viêm mạn tính, nhiễm trùng lâu ngày, rỗi loạn nội tiết, rối loạnhoạt động enzyme và nhiều vấn đề dinh dưỡng liên quan Các tác nhân này gây ảnhhưởng sâu sắc đến cơ cấu di truyền phân tử của tế bào, làm thay đổi khả năng traođổi chất, năng lượng và thông tin với môi trường Ngoài ra, ung thư còn có thé doyêu tố đi truyền bam sinh [3, 8, 34]

Quá trình hình thành khối u từ tế bào ung thư phải trải qua nhiều giai đoạn.Thời gian từ tế bào ung thư khởi đầu đến khi xuất hiện một u có thể nhận biết gọi là

thời kì tiềm ân (ở người có thể kéo dài từ 10 đến 20 năm) [8, 34] Sau khi phát triển

thành khối u, các tế bảo ung thư tiếp tục tăng sinh hỗn loạn, tự mất đi các thụ thé dénhận biết giới hạn với các tế bào bên cạnh, sản xuất 6 ạt cytokin va enzymeproteaza dé pha hủy mang đệm lót và môi trường ngoại bao xung quanh Do đó, các

Trang 13

tế bào ung thư liên kết lỏng lẻo, dé dang but ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và

mạch bạch huyết di cư đến các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục sinh sôi,

nảy nở, tăng sinh số lượng Quá trình này được gọi là sự di căn (metastasis) [10,34] Nói cách khác, di căn là một hay nhiều tế bào ung thư tăng trưởng ở mộtkhoảng cách nào đấy cách nơi phát sinh tiên phát của khối u Thông thường do hậuquả của đi căn mà ung thư gây ra là xấu, có khả năng gây tử vong

1.1.1 Đặc điểm tế bào ung thư và quá trình tiến triển bệnh

1.1.1.1 Đặc điểm tế bào ung thư

Tế bào ung thư là những tế bào đột biến, phân chia vô hạn không chịu sựkiểm soát của co thể, cho nên so với tế bào bình thường, tế bao ung thư có nhữngđặc điểm bất thường về hình dạng và kích thước của tế bào cũng như của nhân.Kích thước của tế bao ung thư khá lớn, khoảng 20 - 40um Hình dang tế bào rat đadạng, có thé là hình cầu, bầu dục, hình thoi, hình hạt , có thé có dang gai Nhữngđặc điểm bất thường của nhân cũng là đặc trưng quan trọng của tế bào ung thư.Chúng có thể chứa một hoặc nhiều nhân, thường có kích thước lớn và đa hình thái,

có thé tròn, hình thoi, méo mó hoặc tạo túi Kích thước nhân có thé rất khác nhau,song đa số nhân nằm lệch sang một bên và tỷ lệ giữa nhân và tế bào chất cao hơn sovới tỷ lệ nay ở tế bào thường Đây chính là những đặc điểm chính dé có thé phânbiệt và nhận biết tế bào ung thư về mặt hình thái Tính chất bắt màu của nhân và tếbào chất cũng thay đôi đậm nhạt khác nhau Các đặc điểm hình thái bat thường trêncủa tế bào ung thư là dấu hiệu quan trọng được coi là tiêu chuẩn vàng trong chân

đoán ung thư.

Về cấu trúc và chức năng, nhìn chung các tế bào ung thư đều giữ được đặcđiểm đặc trưng của những tế bào gốc tạo ra nó Tuy nhiên cũng có nhiều khía cạnh

khác biệt:

- Té bào bình thường trong cơ thé sau nhiều lần phân chia sẽ chết theo con

đường apoptosis Riêng tế bào ung thư có khả năng tăng sinh vô hạn độ, tạo

thành những tế bào bat diệt

Trang 14

- Tébao ung thư không tuân theo những tin hiệu từ những tế bào khác trong

đó có những tín hiệu ức chế tăng sinh _, bất kể những tác hại gây ra do số

lượng tế bào quá lớn gây chèn ép các mô xung quanh

- Té bao ung thư bị mat các phân tử trên bề mặt màng tế bào có khả năng giữ

chúng ở đúng vị trí, vì vậy chúng có thể tự tách ra và di chuyển đến những vịtrí khác trong cơ thé, quá trình này gọi là di căn

- _ Thời gian nhân đôi của tế bao ung thư rất ngắn (dòng tế bao Sarcoma 180 có

thời gian nhân đôi là 15,2 giờ) do tế bào ung thư có khả năng thoát khỏi sự

kiểm soát và điều hòa của cơ thể

1.1.1.2 Quá trình tiến triển bệnh ung thư

Weinberg R.A đề xuất 6 giai đoạn trong quá trình phát sinh ung thư ác tính[18] Có thể tóm tắt như sau:

1 Giai đoạn khởi phát

Các tế bào ung thư nhận được các tín hiệu thúc day sự tăng sinh và phân bao.Các tín hiệu này có thé xuất hiện do sự thay đổi của các yếu tố ngoại bào hoặc do sựthay đồi bên trong hệ thống truyền tín hiệu nội bao dẫn tới sự tăng sinh va phân bao.Trong những trường hợp “cực đoan” nhất, các tín hiệu kích thích phân bào lại dochính các tế bào ung thư tự sản sinh ra Lúc đó, tế bào được kích thích phân chia

không giới hạn.

2 Giai đoạn thúc day

Các tế bào trở nên “vô cảm” một cách bất thường với các tín hiệu ức chếphân bảo Trong các tế bào bình thường, sự phân bảo thường được kích hoạt bởi cáctín hiệu nhất định; và tồn tại song song với chúng là các tín hiệu ức chế phân bào

Bình thường, hai cơ chế này tôn tại song song và phối hợp với nhau ở mứccân bằng, vi vậy sự phân bào diễn ra 6n định và có tô chức Ở các tế bao ung thư thì

sự ngăn cản phân bao bị tê liệt, khi đó tế bao sẽ luôn được chuyên từ pha G1 sang S

đê tiên hành sao chép ADN và bước vào một chu trình tê bào mới bât kê các sai

Trang 15

hỏng ADN có được khắc phục hay không Các tế bào sau giai đoạn tăng trưởng này

sẽ tiếp tục phát triển thành các khối u ác tính

3 Giai đoạn chuyển biến

Như ta đã biết, protein p53 giữ vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ cơthé chống lại sự tích lũy sai hỏng ADN có thé gây nguy hiểm cho cơ thé Khi p53 bịmat chức năng này thi con đường apoptosis của tế bào không hoạt động Vì vậy tếbao hỏng có thé sống và tiếp tục nhân lên nhanh chóng Những tế bao này có xuhướng tạo ra các thế hệ tế bào con có mức độ sai hỏng còn cao hơn chính nó Hậuquả là mỗi tế bào con hình thành đều có nguy cơ chuyên thành các tế bào ung thư.Như vậy có thê nói, khả năng thoát khỏi cơ chế chết theo chương trình là “cột mốc”quan trọng đề một tế bào ung thư phát triển thành khối u ác tính

4 Giai đoạn lan tran

Các tế bào ung thư có khả năng sao chép vô tận Ở người, mỗi tế bào soma

thường chỉ có khả năng sao chép trung bình khoảng 60 — 70 lần Tuy nhiên các tếbào ung thư có thể vượt quá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần đầu mútnhiễm sắc thé được kéo dai nhờ hoạt động mạnh của enzyme ADN telomerase Khicác tế bao ung thư đạt đến giai đoạn nay, chúng được gọi là các tế bào bat tử

5 Giai đoạn củng cố

Các tế bào phát triển hệ thống tự nuôi dưỡng Các mô trong cơ thé đa bào

đều cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh dưỡng Các tế bào khối u tiền

ác tính thường tăng trưởng chậm do chúng được nuôi dưỡng bởi hệ tuần hoàn bìnhthường Nhưng ở các tế bào ung thư, khi khối u phát triển đến một mức nhất địnhthì xuất hiện sự hình thành mạch máu mới Lúc này các khối u được nuôi dưỡng và

phát triển rất mạnh Đây là một bước “củng cố” các tế bào ung thư ác tính hình

thành mạch máu mới nuôi dưỡng các khối u, giúp khối u phát triển mạnh mẽ và gâynguy hiểm cho cơ thể

6 Giai đoạn xâm lan và di căn

Ở giai đoạn này, các tế bao ung thư có khả năng xâm lấn vào các vùng môkhác và hình thành khối u mới Hơn 90% số bệnh nhân bị ung thư đều chết vào giai

Trang 16

đoạn khi các tế bao ung thư đã di căn tới các phần khác nhau của cơ thé Khi các

khối u di căn, các tế bao ung thư rời khỏi khối u nguyên phát và đi chuyển dọc theo

đường máu hoặc đường bạch huyết tới các vị trí khác nhau trong cơ thê trước khi

chúng trú ngụ ở vị trí mới và hình thành khối ung thư mới Như vậy kết qua di căn

là sự hình thành các khối u thứ cấp ở vị trí có thé cách rat xa vị trí khối u nguyênphát ban đầu Khi ung thư đã tiến triển đến giai đoạn này thì sự kiểm soát và điều tri

cực kỳ khó khăn Vi vậy có thé nói di căn là giai đoạn cuối cùng và nguy hiểm nhất

trong quá trình phát triển của ung thư.

Tuy nhiên đối với khối u lành tính thì giai đoạn này không xảy ra, các tế bàotrong khối u lành tính sinh sản chậm và bám vào các mô liên kết tại chỗ, khối u córanh giới rõ ràng và không gây cảm giác đau cho người bệnh nếu kích thước khối ukhông quá to hay chèn ép vào dây thần kinh Do đó khối u lành không gây nguyhiểm cho người bệnh và dễ chữa trị

1.1.2 Hậu quả của ung thư đối với cơ thể

Tại vị trí nguyên phát, nếu không điều trị ngăn chan kip thời, khối u pháttriển làm phá hủy mô lành xung quanh, làm hỏng các chức năng cơ quan có u và

gây đau đớn cho người bệnh.

Điều đáng nói là ung thư rat hay di căn vào các cơ quan quan trọng của cơthé làm tốn thương cơ quan này và là nguyên nhân chủ yếu làm người bệnh tử vong

Các tế bào ung thư sinh ra những độc tố hoặc các chất nội tiết không cần thiết gây

rỗi loạn chuyền hóa, cơ thể mệt mỏi, chán ăn

Ung thư cũng gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch, làm giảm khả năng chống

các bệnh nhiễm trùng, gây mat cân bằng dinh dưỡng do các tế bào ung thu pháttriển vượt trội, tranh chấp chất dinh dưỡng với các tế bào lành, làm cơ thể Suy mòn

và cuôi cùng là dan đên tử vong.

Trang 17

1.2 MOT SO LOẠI THUOC THUONG DUNG TRONG DIEU TRI UNG

THU

Có rat nhiêu loại thuôc được dùng trong điêu tri ung thư Căn cứ vào cơ chê tác dụng và câu trúc hoá học của các loại thuôc đó, có thê chia chúng thành các nhóm sau:

1.2.1 Thuốc alkyl hóa

Các thuốc alkyl hoá có chứa nhóm tạo liên kết alkyl với axit nucleic Do vậy,thuốc làm rối loạn sự nhân đôi và sự sao chép đề hình thành phân tử ADN mới Cácthuốc alkyl hóa cả các phân tử ARN và các phân tử protein, nên làm rối loạn chứcnăng của các màng khác nhau ở trong tế bào

Thuốc alkyl hóa gồm các nhóm chính sau: ddn xuất chlorethylamin

(Caryolysin 1fosfamid, cyclophosphamid, chloraminophen, sarcolysin, zitostop);

dẫn chất ethylenimin (Imiphos, thiophosphamid, photrin); dan chất nitrozoure(Belustin, carmustin, Fotemustin); Este cua methasulfon (Busulfan, treosulfan); danchat cua platin (Cisplatin, carboplatin); dén chất piperazin (Pipobroman, prospidin,

thiodipin); dẫn chất halogen hóa các đường đơn (Mitobronitol, mitolactol); dan

chất methylhydrazin (Procarbazin); thuốc alkyl hóa khác (Cytembena, dacarbasin,

ritrosulfan, hexastat) [12,1].

1.2.2 Thuốc chống chuyén hóa

Trong quá trình tổng hợp axit nucleic, cần có những chất tham dự vào dé tạothành axit nucleic gọi là chất chuyển hóa (metabolite) Thuốc chống chuyên hóa lànhững chất có cấu trúc tương tự như chất chuyển hóa, nên cạnh tranh với chấtchuyên hóa, ngăn cản việc tạo thành axit nucleic

Thuốc chống chuyển hóa gồm các nhóm chính sau: dẫn chất pyrimidin

(Fluoruracil, tegafur, cytabarin ); ddn chất purin (Azathioprin, mercaptopurin,

thioguann); dan chất của acid folic (Methotrexat); dan chất ure (Hydroxycarbamid,mitoguazon); dan chất acridin (Amsidin); dẫn chất anthracen (Bisantren,mitoxantron); dẫn chất khác (Pentostatin, celiptium)

Trang 18

1.2.3 Thuốc làm thay d6i đáp ứng sinh học

Các lymphokin, cytokin, sản phẩm của các tế bào do hoạt hóa hệ thống miễndịch có khả năng thay đổi đáp ứng sinh học làm tiêu giảm khối u Interferon,interleukin — 2, là những chất có nhiều tác dụng trong đó có tác dụng chống ungthư, thường dùng trong điều trị ung thư máu [1]

1.2.4 Dược liệu Việt Nam chữa ung thư

Thuốc chữa ung thư có nguồn gốc thực vật gồm một số alkaloid, glycozidhoặc các dan chất bán tổng hop của chúng Thuốc nhóm này có thé kế đến là:

vincristin, vinblastin, podophyllin, thaliblastin, etoposid, teniposid, elsidin Các nghiên cứu đã chỉ ra một sô cây thuôc Việt Nam có các thành phân kê trên:

a Dừa cạn: tên khoa hoc là Catharanthus roseus, thuộc ho trúc dao

Apocynaceae Từ dừa cạn đã chiết được các alkaloid chữa ung thư là

vinblastin, vincristin, cũng như các bán tổng hợp từ vinblastin là vinorelbin

và eldisin [4].

Một số cây trong họ hành tỏi Liliaceae như tỏi ta, hành ta và tỏi độc Nước

chiết từ tỏi có tác dụng chống lại ung thư miệng của chuột hamster khi gây

ung thư miệng chuột Dầu tỏi và dầu hành có tác dụng chống lại khối u ở da

chuột nhắt trắng [1]

Cây bat giác liên tên khoa học là Podophyllum tonkinense Gagnep, ho Hoang

liên gai Berberidaceae Cây này ở nước ta chưa thấy nghiên cứu tác dụngchữa ung thư nhưng ở Mỹ người ta đã chiết được từ cây Podophyllum

peltatum L cùng họ Berberidaceae chất podophyllotoxin có tác dụng chữaung thư.

Cây thông đỏ tên khoa học là Taxus wallichiana zucc, thuộc họ thanh tùng

Taxaceae Từ thong đỏ đã chiết xuất ra chất 10-deacetylbaccatin II, rồichuyên hóa ra thành taxol có tác dụng chữa ung thư

Du đủ tên khoa học là Carica papaya L, ho du đủ papayaceae, qua nghiêncứu đều cho thấy có tác dụng chữa ung thư [24]

Trang 19

1.3 MOT SO MO HINH NGHIEN CUU TAC DUNG CHONG UNG THU

CUA CHE PHAM1.3.1 Mô hình nuôi cấy tế bào in vitro

Việc các tế bào động vật có thé nuôi cấy, duy trì sự tăng sinh trong các chai,

lọ ngày càng dễ dàng hơn trong phòng thí nghiệm, đã mở ra hướng mới quan trọng

trong nghiên cứu công nghệ tế bào động vật đặc biệt là trong nghiên cứu nhằm tìm

ra các hợp chất chữa trị ung thư ở người Đề sàng lọc nhanh các hoạt chất có tácdụng chống ung thư người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Khinuôi cay trên mô hình in vitro, người ta thường nuôi cấy tế bào ung thư thành dạng2D và 3D Có thể thay rõ ưu điểm của mô hình này là khả năng tự động hoá cao, cóthể sử dụng nhiều máy móc thay thế cho người thực hiện, rút ngắn được quãng thờigian tiến hành thí nghiệm rất nhiều và quan sát được trực tiếp các diễn biến trongquá trình nghiên cứu Nó cũng cho phép thao tác cùng lúc với nhiều dòng tế bàokhác nhau, nhiều hợp chất khác nhau với một đải nồng độ rộng Tuy nhiên, mô hìnhnay có nhược điểm là tương tác giữa tế bao ung thư với hợp chất chỉ theo một

chiều, thiếu sự tương tác giữa tế bào ung thư với hệ miễn dịch cũng như của hệ

miễn dịch với hợp chất Điều kiện làm việc phải hoàn toàn vô trùng đòi hỏi kỹ thuật

và kinh nghiệm cao của người làm thí nghiệm, chi phí cho thí nghiệm cũng khá dattiền

1.3.1.1 Nuôi cấy 2D

Có nhiều điểm khác biệt về tập tính giữa tế bào nuôi cấy và tế bào cùng loại

trong cơ thé, do chúng chuyên từ sự kết hợp theo dạng không gian ba chiều sang

mặt phăng hai chiều Không còn đặc tính tương tác tế bào chuyên biệt của mô, vìkhi dòng tế bào hình thành, nó có thé hiện diện chỉ một, hay hai dạng tế bao nênnhiều tương tác đa chiều bị mat đi Môi trường nuôi cay cũng thường thiếu vàithành phan liên quan đến sự điều hòa in vivo, như các chất dẫn truyền thần kinh và

hệ nội tiệt Thiêu sự kiêm soát này, chuyên hóa của tê bào trong điêu kiện in vitro

10

Trang 20

Luận văn thạc sĩ khoa học Tổng quan

ồn định và dé kiểm soát hơn trong in vivo, nhưng có thể không thực sự đại diện cho

mô, nơi mà các tế bào này được tách ra [7]

Vi hầu hết các dòng tế bào được bảo quản lạnh nên thông thường, quy trình

nuôi cây bắt đầu bằng việc giải đông tế bào Các tế bào ung thư được nuôi cấy đơnlớp 2D trong dia Petri thủy tinh hoặc nhựa, bé sung môi trường nuôi cấy thích hợp

rồi được đưa vào trong tu nuôi cay 37°C, 5% CO2 Sử dụng các loại thuốc nhuộm

protein sẽ cho phép chúng ta xác định được mối quan hệ đáp ứng liều giữa các dòng

tế bào khác nhau với các nồng độ thuốc thử khác nhau [33]

Các tế bào khi được phân lập đem nuôi cấy in vitro thường phát triển thànhdạng trôi nôi hoặc bám dính hoặc hỗn hợp cả 2 loại Hầu hết các tế bảo động vậtđều bám vào một cấu trúc trong mô liên kết, màng cơ bản (basement membrane)hay chất nền khoáng (như xương) Các tế bào trong máu, bạch huyết hay những loại

tế bào khác chỉ phát triển bình thường trong “huyền phù” Các loại tế bào ung thư

sống trôi nổi như tế bào u lympho, tế bao ung thư máu hay tế bao ung thư mô liênkết Sarcoma-180 Nhiều tế bào sống ở dang bám dính như tế bào ung thư biểu môgan HepG2, tế bào ung thư cô tử cung HeLa, tế bào ung thư va MCF7, tế bào ungthư phổi H358 Một số tế bào sống ở dạng hỗn hợp cả bám dính, cả trôi nổi như tế

bao ung thư biểu mô phổi 3LL [16,20,33]

a TBUT phối H358, b TBUT vú MCF7

Sử dụng mô hình tế bào 2D có nhiều ưu điểm như thời gian sang lọc ngắn,cho phép thao tác với nhiều dong tế bào, nhiều hợp chất khác nhau va dai nồng độ

11

Trang 21

rộng cùng một lúc Tuy nhiên, mô hình nay có nhược điểm là tương tac giữa TBUT

với hợp chất chỉ theo một chiều, thiếu sự tương tác giữa TBUT với hệ miễn dịch

cũng như của hệ miễn dịch với hợp chất Như vậy mô hình này không mô phỏng

được điều kiện in vivo của cơ thé [33]

1.3.1.2 Nuôi cấy spheroid

Spheroid là những khối cầu đa bào được tạo ra do những tế bảo tụ tập với

nhau trong quá trình nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Đây là đặc tính của một sốdạng tế bào như: tế bào ung thư, tế bào phôi của động vật Những tế bao trongspheroid được đảm bảo phát trién trong không gian ba chiều và có đầy đủ các tươngtác tế bao — tế bào, tế bào — chất nền ngoại bao, tế bào —chat dinh dưỡng trong môitrường nuôi cấy và chúng vẫn giữ được những đặc trưng về tương tác giống nhưtrong điều kiện cơ thê

Spheroid có thé được coi là trong đương với những u rắn nhỏ trong cơ thé,

do những tế bào trong spheroid được phát triển trong không gian ba chiều có đầy đủ

các tương tác như khi tế bào phát triển trong cơ thê

a Cau trúc khối spheroid: gồm có 3 lớp

> Lớp vòng ngoài: Gồm những tế bào sống, phân chia mạnh, gồm khoảng từ 2-3

lớp tế bào xếp khít nhau Độ day mỏng của lớp này tùy thuộc từng dong tế baokhác nhau, tùy điều kiện môi trường và tùy nguồn tế bào ban đầu dùng để tạo

spheroid.

> Lớp trung gian: Gồm những tế bào vẫn sống nhưng đã ngừng phân chia Các tế

bào của vùng này có thể hòa nhập để thành những tế bào của vòng ngoài hoặcvòng trong phụ thuộc điều kiện nuôi cay (có mạch mau hoặc không, nông độ

glucose, pH ) Vai trò của vùng này khá quan trong trong các thí nghiệm điều

trị ung thư bằng hóa chất, tia xa tri.

> Lớp trong cùng: là lõi hoại tử Lõi nay có màu den do nó gồm những tế bao đã

chết Chúng có nhân kết đặc lại nên ánh sáng quang học không thể xuyên qua

được vì vậy lớp này có màu đen khi quan sát dưới kính hiên vi Độ day mỏng

12

Trang 22

của lớp này tùy thuộc vào từng giai đoạn khác nhau của sinh trưởng spheroid

[29].

b Ung dụng của spheroid trong nghiên cứu ung thư

Những spheroids có những ứng dụng đặc biệt mà những tế bào ung thư nuôi

cấy 2D không thê có được như:

Cấu trúc 3D của những spheroids cho phép những nghiên cứu chuyên sâu về

su hap thu của thuốc va sự kháng lại xạ trị và hóa trị những thứ mà phụ thuộc vàotương tác bên trong tế bào

Spheroids được sử dụng trong những mô hình nghiên cứu sự kích thích hoặc

ức chế sự tăng sinh mach máu in vitro, in vivo trong những thí nghiệm nuôi chung

với tê bảo nội mô in vitro hoặc cây ghép in vivo (cây ghép vào chuột, khi, )

Spheroids cũng được sử dụng dé nghiên cứu hiện tượng xâm lẫn, hoặc vi dicăn cũng như tương tác, phản ứng của tế bào lành trong những thí nghiệm đồng

nuôi cấy spheroid và những mô tế bào lành khác

Spheroids được dùng trong những mô hình thí nghiệm điều trị đích chănghạn như: liệu pháp gen trong điều trị ung thư,

Do đó có thể nói mô hình nuôi cấy spheroids mang lại rất nhiều hứa hẹn vàtiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu đặc tính sinh trưởng của các loại ung thư,tương tác, phản ứng của cơ thê đối với các dạng ung thư cũng như trong việc điều

trị, chuẩn đoán ung thư Và nó là mô hình không thé thiếu được trong các phòng thi

nghiệm thử thuốc điều trị ung thư trước khi tính toán liều lượng điều trị trên động

^

vật.

Ưu điểm của thử thuốc trên spheroid

> Spheroid là khối cầu da bào có những đặc điểm về hình thái, chức năng traođổi chất giống như đặc điểm của khối mô ung thư in vivo

> Trong nuôi cay spheroid, đặc tinh tự nhiên của tế bào không bị thay đôi Kha

năng tương tác giữa tế bào - tế bào, tế bào với môi trường tương tự như trong cơ thể

13

Trang 23

nên tinh chính xác cao, có ý nghĩa quan trọng trong việc sang lọc thuốc, tim ra cáchợp chất có tác dụng điều trị ung thư

> Co thé thay đổi điều kiện nuôi cấy phù hợp với mục đích thí nghiệm một

cách dễ dàng.

> Thời gian tiến hành thí nghiệm trên spheroid nhanh hon nhiều so với thử

nghiệm trên in vivo.

> Dé thực hiện, ít tốn kém hơn so với mô hình in vivo.

Nhược điểm của thử thuốc trên spheroid

Trong điều kiện in vivo còn có hệ miễn dịch, hệ thần kinh, nội tiết tham giađiều khiển hoạt động của tế bào nên tác động của thuốc đối với cơ thể sống làkhông thê giống hoàn toàn khi thử nghiệm trên spheroid

c Một số đặc tính của tế bào ung thư phù hợp với mô hình nuôi cấy 3D

Giữa những tế bào ung thư bị mat di sự ức chế tiếp xúc

Những tế bào bình thường ngừng phát triển khi màng tế bao tiếp xúc với mộtmàng khác Khi hai tế bào bình thường tiếp xúc với nhau 1 hoặc cả 2 sẽ ngừng

chuyền động hoặc chuyên động sang hướng khác Điều này ức chế sự tăng trưởng

sau khi tiếp xúc và được gọi là sự ức chế tiếp xúc (hay ức chế liên lạc)

Sự ức chế do tiếp xúc là một trong những nguyên nhân làm cho tế bào biết

khi nào phải ngừng phát triển Ví dụ như nó làm cho các tế bào của vết đứt ngón taykhông phát triển mãi mãi sau khi hàn gắn vét đứt tay Hơn nữa, những tương tácgiữa các tế bào làm cho chúng dừng sự phân chia và phát triển đúng chỗ, đúng thờiđiểm Những phân tử bề mặt tế bào giúp tế bào gắn với nhau ở đúng nơi đúng chỗ,xác định tế bào này ở vị trí này, ở bên cạnh tế bào này chứ không ở vị trí khác, bên

tế bảo khác

Nhưng tế bào ung thư bị biến đổi những đặc tính trên màng tế bào, bị mấtcác phân tử trên bề mặt tế bào Do đó mà các tế bào ung thư gắn một cách lỏng lẻovới các tế bào xung quanh Giữa các tế bảo ung thư mất sự ức chế tiếp xúc Chúngdường như thiếu sự nhận dạng đặc trưng và thông tin đặc trưng Những điều nàycho phép các tế bào có thể tách một cách dễ dàng từ các tế bảo hàng xóm và xâm

nhập vao các co quan khác nơi chúng hình thành các khôi u di căn,

14

Trang 24

Việc mat những sự ức chế tiếp xúc cũng như mất di những phân tử bề matgắn đặc hiệu của tế bào ung thư cũng giúp chúng dễ dàng tụ tập và phát triển thành

những khối spheroids trong điều kiện nuôi cay spheroids [29]

Các tế bào ung thư giảm khả năng dính

Trong cơ thé hầu hết các tế bào động vật đều bám vào một cấu trúc trong mô

liên kết màng cơ bản hay chất nền khoáng (như xương) Ngoại trừ những tế bào đặcbiệt khác trong máu, bạch huyết chỉ phát triển bình thường trong huyền phù Do đó

mà một số tế bao phát triển in vivo nhưng không thé phát triển in vitro Những tếbào bám dính vào bề mặt nuôi cấy chúng sẽ có hình dạng dài, trải rộng trên mặt đáyhộp nuôi, ngược lại, nếu không bám dính, tế bào sẽ có hình khối cầu đều Nhưngngược lại nếu nuôi những tế bào này trong điều kiện không bám với các tế bào khác

hoặc không bám đĩa nuôi cấy (đĩa nuôi cây không bám dính) thì chúng sẽ chết

Nhưng các tế bào ung thư thường mất nhu cầu bám dính Do đó mà chúng cókhả năng phát triển được trong huyền phù được phủ agar hoặc agarose ở đáy, hoặcphủ một lớp không bám ở đáy đĩa nuôi cấy Và đây là đặc tính chung của dòng tế

bào ung thư.

Nhưng đặc biệt có những thí nghiệm nói về sự bám dính tăng lên sau khi tếbao bình thường chuyên dạng thành tế bao ung thư

Những tế bào lành cùng loại sẽ có sự bám với nhau một cách đặc hiệu donhững thụ thể, chất liên kết đặc hiệu trên bề mặt tế bào Chăng hạn khi dùngenzyme trypsin dé tách các tế bào gan và các tế bào tuyến tụy Sau đó ủ chung 2loại tế bào này với nhau và nuôi chung trong môi trường dinh dưỡng Chúng sẽ pháttriển thành những miếng nhỏ mô gan và mô thận khác nhau mà không có những

mảnh mô có hai loại tê bảo này.

Nhưngở tế bao ung thư mat đi những phân tử liên kết đặc hiệu ấy nên chúng

có thé bám lẫn vào những tế bao khác loại với chúng cũng như có thé dé dang bamhoặc xâm lấn vào những khối mô lành Chang hạn khi nuôi chung những tế bào ungthư da ác tính ở động vật có vú với những tế bào thận bình thường thì chúng sẽ tạothành một dạng (khối tế bào) có cả tế bào thận lẫn tế bào da pha trộn lẫn nhau trongkhối tế bào đó Và đặc tính này cũng là một trong những nguyên nhân gây ra sự tụtập của những tế bào ung thư thành những khối spheroid trong nuôi cấy spheroid

15

Trang 25

Tóm tắt một trong những nguyên nhân gây giảm kha năng dính của tế baoung thư như sau: Ở thành phần màng tế bào ung thư thì hàm lượng những

gangliosides (những glycolipids ma bao gồm cả những axit sialic) giảm nhiều Dan

đến thành phan axit sialic giảm nhiều trong những tế bào ung thư Mà axit sialic làmột loại axit có thể làm nhiệm vụ kết dính tế bào một cách đặc hiệu theo cơ chế axit

sialic ở bề mặt tế bao này liên kết với kialytransferase của bề mặt tế bào kia Do đó

mà tính dính đặc hiệu của những tế bào ung thư bị giảm so với những tế bào bình

thường [29].

Sự mắt khả năng phụ thuộc neo

Hầu hết các tế bào bình thường phải gắn với một nền tảng cứng là khungngoại bao ECM, hoặc giá thé rắn (xương) dé phát trién

Tuy nhiên những tế bào ung thư có thé phát triển được ngay cả khi không cókhung ngoại bào để neo Như khi chúng có thể phát triển bình thường trong môitrường nuôi cấy có phủ vật liệu không bám dính ở đáy hoặc môi trường có methylcellulose Đặc tinh mat neo là 1 trong những đặc điểm nổi bật nhất của các tế bao

chuyền dạng biến đổi thành các khối u ác tính Đặc tinh này được sử dụng dé chọnlọc và phân lập được những tế bào chuyên dạng từ quần thê tế bào bình thường Và

đặc tính này cũng là một trong những nguyên nhân giúp hình thành những khốispheroid trong nuôi cấy spheroid [29]

1.3.2 Mô hình in vivo

Phương pháp in vivo được dùng dé chỉ những thí nghiệm dùng các mô sống

hay toàn bộ cơ thể còn sống làm đối tượng thử nghiệm Thực tế cho thấy có

những hop chat có tác dụng, biểu hiện hoạt tính khi thử nghiệm in vitro nhưngchưa chắc đã có kết quả mong muốn khi áp dụng lên cơ thé động vật thí nghiệm

Có nhiều loài động vật được sử dụng dé xây dựng mô hình in vivo như thỏ,mèo, chuột, cá, gà Trong số đó, chuột được sử dụng rộng rãi hơn cả do sự tương

đồng về mặt di truyền với con người cũng như sự tiện lợi khi nuôi và chăm sóctrong phòng thí nghiệm Chuột dễ sinh sản và đặc biệt là có sự ôn định khi dùng dégây tạo khối u thực nghiệm

16

Trang 26

Mô hình in vivo có ưu điểm nỗi bật là đánh giá được chính xác tác động củathuốc lên khối u cũng như lên cơ thé do sự tương tác của cả 3 yếu tố: khối u, thuốc

và hệ miễn dịch của động vật thí nghiệm Tuy nhiên, quá trình sàng lọc trên mô

hình này tốn nhiều thời gian hơn so với các mô hình khác và cần có sự theo déi chặtchẽ, thường xuyên của người làm thí nghiệm Ngoài ra, vấn đề đạo đức sinh họccũng là một điều cần quan tâm và gặp phải sự phản đối của những cá nhân và tô

chức bảo vệ quyền động vật (animal rights)

Như vậy, việc sử dụng bất kì mô hình nào cũng sẽ có những ưu nhược điểm

riêng Nếu như mô hình in vitro thé hiện rõ ưu điểm trong quá trình sàng lọc nhanh,

với thời gian ngắn, khả năng tự động hóa cao, sàng lọc được nhiều hoạt chất trênquy mô lớn thì mô hình in vivo lại cho phép đánh giá chính xác tác động của thuốclên khối u của cơ thé Việc sử dụng mô hình in vitro như mô hình sàng lọc sơ cấp sẽcho phép chúng ta tiết kiệm thời gian cũng như kinh phí khi sàng lọc một số lượnglớn, lựa chọn ra những hợp chất tiêu biểu có tác dụng dé tiền hành thử in vivo Đồng

thời từ đồ thị đáp ứng liều của các dòng TBUT với các hợp chất đã xác định được ở

sang lọc in vitro sẽ gợi ý cho người làm thí nghiệm nồng độ chất nên thử trên mô

hình in vivo.

1.4 CÁC DONG CHUOT SWISS VA BALB/C

Ngày nay, chuột thường được lựa chọn lam đối tượng của nhiều nghiên cứukhác nhau như ung thư, miễn dịch, độc tính, sự trao đổi chất, sinh học phát triển,tiêu đường, béo phì, lão hóa và các bệnh tim mạch do chúng có những đặc điểm phùhợp về mặt di truyền của tất cả các động vật có vú nên có giá trị sử dụng cao [32]

Chuột thuộc bộ Gam nhấm và giống Mus musculus bao gồm cả dòng 1M

musculus castaneus va M musculus molossinus thường được sử dụng trong nghiên

cứu nhiều nhất, ngoài ra còn có các giống khác như Mus spretus, Mus caroli, Mus

pahari, Mus domesticus va Peromyscus spp [32].

Chuột nhắt dùng trong phòng thi nghệm có thé chia thành 2 loại đó là:

> Chuột không thuần chung (outbred mice): Là sản phẩm cua quá trình

lai tạp giữa các cá thé không cùng dòng, dẫn đến sự pha trộn về hệ gen, thế hệ sau

17

Trang 27

có các đặc tính tốt hơn của bố mẹ Do vậy, chuột không thuần chủng có tính dị biệt

cao, tức là có sự khác biệt ngay cả trong bản thân mỗi cá thé cùng dòng Chúng có

ưu điểm là khả năng thích nghi với môi trường cao Loại chuột này được sử dụng

nhiều trong những thí nghiệm thông thường, cần những cá thể khỏe mạnh, sinh sảntốt mà không quá chú trọng vào kiểu hình đặc trưng

> Chuột thuần chủng (inbred mice): Chuột thuần chủng đồng nhất về

mặt di truyền, chúng có kiểu hình đặc trưng riêng cho từng dòng Chuột thuần

chủng được sử dụng trong nghiên cứu ung thư hơn 60 năm nay Mặc dù chúng có

giá thành đắt, khả năng thích nghi với môi trường kém hơn chuột không thuầnchủng, nhưng chúng có những đặc điểm di truyền phù hợp với nhiều loại nghiêncứu nên việc sử dụng chuột thuần chủng vẫn là lựa chọn tối ưu [32]

khối u trên chuột BALB/c cho tỷ lệ lên u phổi, và u thận cao trong khi tỷ lệ lên u vú

lại thấp hơn nhiều [32]

18

Trang 28

tne 1%

Hình 2 Chuột Swiss (A) và BALB/c (B)

1.5 CÁC CHE PHAM PHAN LẬP TỪ HẠT NHỤC DAU KHẨU (Myristica

fragrans)

Cây nhục đậu khấu có tên khoa học là Myristica fragrans (tên tiếng Anh:

mace, nutmeg), thuộc họ nhục đậu khấu (Myristicaceae) ), là cây được trồng va mọc

ở Việt Nam, đặc biệt là ở miền Nam Hạt của cây nhục đậu khấu (nutmeg) đượcdùng nhiều làm gia vị, mỹ phẩm và đặc biệt trong y học dân gian hạt nhục đậu khấuđược sử dụng nhiều để chữa rối loạn tiêu hóa như kém ăn, khó tiêu, nôn mửa, đingoài và dùng làm thức ăn dé kích thích tiêu hóa [5,34]

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trước đây đã chứng minh sự có mặt

của các chất béo, tinh dầu và lignan (tức là các phenylpropanoids) trong hạt nhục

đậu khấu [34,17] Các lignan là thành phần chủ yếu có tác dụng sinh học của hạtnhục đậu khấu, gồm các chất chính fragransin A2, myristicin, macelignan,otobaphenol và meso-dihydroguairetic acid [15] Đã có nhiều nghiên cứu về tácdụng sinh học của dịch chiết cồn (methanol, ethanol) của hạt và các lignan phân lập

từ hạt có tác dụng chống oxy hóa [19,31], chống viêm giảm đau [23,25], có tác

dụng bảo vệ gan [21,31], giảm cholesterol trong máu [28], chống xơ vữa động mạch

[19,30], kháng khuẩn [14] Nhưng cho đến nay những nghiên cứu về tác dụngchống ung thư của hạt và các lignan phân lập từ hạt mới có rất ít trên thế giới và ở

Việt Nam thì mới có ít [27].

19

Trang 29

Trong nghiên cứu sang lọc dé tìm các chat từ thiên nhiên có tác dung chốngung thư, nhóm tác giả [27] thay dich chiét EtOH cua hat cay nhuc dau khấu thu mua

tại Việt Nam có tac dụng tốt Nhóm tác giả [27] đã tiễn hành phân lập được một số

lignan chủ yếu có trong vị thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đã xácđịnh được cấu trúc của các lignan được phân lập từ hạt nhục đậu khấu Việt Nam

3 4

Fragransin A, Nectandrin B

Hình 3 Cac lignan (1-4) phan lập từ hat nhục đậu khấu

1.6 THUỐC DOI CHUNG TAXOL VÀ 6MP

1.6.1 Taxol

Paclitaxel (taxol) là một chat ức chế phân bào được sử dụng rộng rãi tronghóa trị ung thư như ung thư phối, buồng trứng, vú Taxol lần đầu tiên được

phân lập từ vỏ cây thủy tùng Thái Binh Duong (Taxus brevifolia, Taxaceae)

năm 1966 bởi Wall và Wani Đến năm 1967, hai người công bố chat này có tác

dụng chống ung thư và đặt tên cho nó là taxol Cơ chế của paclitaxel đã đượcbiết đến đó là chúng tác động vào chu trình tế bào, bảo vệ các vi ống không bị

phá hủy, ngăn cản sự kéo nhiễm sắc thê về hai cực tế bào trong quá trình phân

chia Điều này sẽ dẫn tế bào không thể tiếp tục phân chia mà sẽ đưa đến cái chết

theo chương trình apoptosis hoặc tế bao sẽ trở lại pha G1 của chu trình tế bao

20

Trang 30

Danh pháp Quốc tế (IUPAC) của Taxol: (20, 4a, 5B, 7B, 10B, 13a) -4,10-bis(acetyloxy) -13 - {[(R 2, 3) - 3 - (benzoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropanoy]]

oxy } - 1,7-dihydroxy-9-oxo-5, 20-epoxytax-11-en-2-YL benzoate.

Công thức phân tử: C47H51014

Khối lượng phân tử: 853,906 g/mol [34]

Hình 4 Công thức cấu tạo và cấu hình không gian của Taxol

21

Trang 31

S H

HN N

Le | mo

N

Hình 5 Thuốc chữa ung thư 6-MP

Cơ chế tác động của 6-MP là cạnh tranh với hypoxanthine và guanine trong

phan ứng với cnzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase

(HGPRTase) và tự nó biến đổi thành Acid thioinosinic (TIMP) Các nucleotide nộibao này ức chế một số phản ứng liên quan đến acid iniosinic (IMP) Hơn nữa, 6-

methylthioinosinate (MTIMP) được tạo nên từ sự methyl hóa TIMP Cả TIMP và

MTIMP đều có khả năng ức chế enzyme glutamine-5-phosphoribosylpyrophosphateamidotransferase — loại enzyme đặc trưng của con đường denovo tông hợp purine

ribonucleotide.

Các thử nghiệm cho thấy khi uống 6-MP thi có một số phan ứng phụ như buồn

nôn, biếng ăn, phát ban, ngứa, viêm, tiêu chảy và suy giảm chức năng gan Liều gâychết 50% động vat thí nghiệm của 6-MP là LDzo= 480mg/kg trọng lượng cơ thểchuột nhắt khi uống qua đường tiêu hóa

22

Trang 32

Luận văn thạc sĩ khoa học Phương pháp nghiên cứu

2.1.

2.1.1.

Chương 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN LIỆU

Đối tượng nghiên cứu

Các hoạt chất meso-dihydroguairetic acid; macelignan; fragransin A2 và

nectandrin B là 04 hoạt chất được phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica

fragrans được kí hiệu tương ứng là hoạt chất 1; 2; 3 :; 4 do Viện Dược liệu(Bộ y tế) cung cấp

09 dòng tế bào ung thư ở người: HeLa (dòng tế bào ung thư biểu mô cô tử

cung); H358 (dòng tế bào ung thư phổi); RD (dòng tế bào ung thư mô liên

kết); KPL4 (dòng tế bào ung thư vú); H460 (dòng tế bào ung thư biểu môphổi); MCF7 (dòng tế bào ung thư vú); H1299 (dòng tế bào ung thư biểu môphổi); HepG2 (dòng tế bào ung thư biểu mô gan), Sar180 (dòng tế bao ung

thư mô liên kết) và 01 dòng tế bào thường là: MDCK (dòng tế bào thận chó)

Các dòng tế bao trên đều có nguồn gốc từ ATCC (Mỹ) Môi trường nuôi cấy

và các hóa chât nuôi cây khác được cung câp bởi hãng Invitrogen.

Chuột nhat trắng dong Swiss (Mus musculus) trọng lượng trung bình 18-20g,

do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong phòng

nuôi động vật thí nghiệm của Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên.

2.1.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

2.1.2.1 Hóa chất thí nghiệm

Bảng 1 Hóa chất sử dụng trong đề tàiTên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất

Axit acetic Merck Duc

Agarose Sigma Hoa Ky

DMEM Invitrogen Hoa Ky

23

Trang 33

DMSO Prolabo Hoa Kỳ

Dung dịch sinh lý (NaCl 0,9%) Việt Nam

Ethanol cụnscons Factery Trung Quéc

FBS Invitrogen Hoa Ky

Methanol cụnsong — Trung Quốc

PBS Invitrogen Hoa Ky

Peniciline/Streptomicin Invitrogen Hoa Ky

RPMI 1640 Invitrogen Hoa Ky

SRB (Sulforhodamine B) Merck Duc

TCA Merck Duc

Tris Base MPBio — USA Hoa Ky

Trypsin Invitrogen Hoa Ky

2.1.2.2 Dụng cu va vật tư tiêu hao

Bảng 2 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Tên dụng cụ Hãng sản xuât Nước sản xuât Bơm kim tiêm Iml, 5ml Mediplast Việt Nam

Bông, giấy thắm Việt Nam

Buông đếm tế bào Malassez Pháp

Đầu tip 10, 200, 1000u1 Corning Hoa Kỳ

Đĩa nuôi cấy tế bào Corning Hoa Kỳ

Đĩa nuôi cấy 96 giếng Corning Hoa Ky

Ong ly tâm 1,5ml Corning Hoa Ky

Lam kính, lamen Sail Brand Trung Quéc

Ong ly tâm 15ml, 50ml Corning Hoa Ky

Nguyễn Thị Chỉnh

24

K18 Cao học Sinh học

Trang 34

2.1.2.3 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng cho đề tài được liệt kê ở Bảng 3:

Bảng 3 Các thiết bị sử dụng

Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Duc

ea VI SOI ngược Axiovert Carl Zeiss Đức

Máy ly tâm Universal 320 Hettich Đức

Pipett aid Gilson Phap

Tủ ấm 5% CO; Shel Lab Hoa Kỳ

Tủ hood Esco Đức

Microplate Reader Model 680 Bio — Rad Nhat Ban

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp SRB - xác định độc tính đối với TBUT của các hoạt chất

trong mô hình in vitro

a, Nap té bao

8000 tế bào trong 180 pl môi trường nuôi cấy DMEM (hoặc RPMI) tùythuộc từng dòng tế bào với hàm lượng 10% FBS, được nạp vào các giếng của đĩa

nuôi cấy 96 giếng, sau đó được ủ trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37°C, 5% CO2 cho tế

bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành ủ với hoạt chat

b, U với thuốc thử

Sau 24h nuôi cấy, đĩa thí nghiệm được cho thêm vào mỗi giếng 20ul dịchthuốc đã pha trong môi trường nuôi cấy có nồng độ đặc gấp 10 lần liều thử TẾ bào

được ủ với các chất theo 5 nồng độ 30uM -10uM -3uM -1uM — 0,3uM trong 48h

Mỗi nông độ được lặp lại 4 lần Sau đó đem có định với TCA.

c, Nhuộm với SRB

Protein tổng số của tế bao sau khi cé định bằng TCA 50% được nhuộm trong

25

Tiêu đề	Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Ung Thư Của Một Số Hoạt Chất Phân Lập Từ Hạt Nhục Đầu Khấu (Myristica Fragrans)
Tác giả	Nguyễn Thị Chinh
Người hướng dẫn	TS. Phương Thiện Thương
Trường học	Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
Chuyên ngành	Sinh Học Thực Nghiệm
Thể loại	luận văn thạc sĩ khoa học
Năm xuất bản	2011
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	69
Dung lượng	14,76 MB