Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài mít lá đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 30

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Tú Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LỒI MÍT LÁ ĐEN ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Tú Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LỒI MÍT LÁ ĐEN ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Tuyến Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật loài Artocapus nigrifolius C Y Wu 03 1.2 Ứng dụng y học cổ truyền chi Artocapus 04 1.3 Hoạt tính sinh học thành phần hóa học số lồi thuộc chi Artocapus 1.3.1 Hoạt tính kháng sinh 07 1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 09 1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa 14 1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác 18 1.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 19 1.4.1 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng sinh in vitro 19 1.4.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro 22 1.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro 23 Chương 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật thiết bị, hóa chất 25 2.1.1 Mẫu thực vật 25 2.1.3 Thiết bị hóa chất thử hoạt tính sinh học 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp tách chiết 26 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc 26 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 27 2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu 30 2.3 Thực nghiệm 30 2.3.1 Chiết mẫu thực vật 31 2.3.2 Sàng lọc sơ hoạt tính dịch chiết phận 31 2.3.3 Phân lập chất 31 2.3.4 Thử hoạt tính chất 33 `Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc sơ hoạt tính dịch chiết phận 35 3.2 Thành phần hóa học Mít đen (Artocapus nigrifolius C Y Wu) 39 3.3 Hoạt tính sinh học chất 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1H-NMR 13 C-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton Carbon – 13 Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Magnetic Resonance cacbon 13 Spectroscopy HMBC HMQC Heteronuclear Mulitiple Phổ tương tác dị hạt nhân qua Bond Coherence nhiều liên kết Heteronuclear Single Phổ tương tác dị hạt nhân qua Quantum Coherence liên kết s singlet d doublet t triplet q quartet J (Hz) số tương tác tính Hz δ(ppm) ppm= part per million độ dịch chuyển hóa học tính ppm KB human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô HepG2 hepatocellular carcinoma Ung thư gan người human MCF7 Ardeno carcinoma Ung thư vú LU Human lung carcinoma Ung thư phổi IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể ED50 Effective dose 50% Liều hiệu đáp ứng 50% SKC Sắc ký cột DMSO dimethyl sulfoxide DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đặc điểm thực vật lồi Mít đen Artocapus nigrifolius C.Y.Wu Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro 21 Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự 22 Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ thân Mít đen 32 Hình 2.2: Phân lập chất từ cao chiết diclometan 33 Hình 3.1 Sắc ký cột cao chiết DCM SKBM số phân đoạn cao chiết mẫu vỏ thân 40 Hình 3.2 Sắc ký mỏng so sánh ADF2 β-sitosterol 41 Hình 3.3: Tỉ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật theo nồng độ AFD6 47 Hình 3.4 Minh họa ảnh hưởng AFD6 dịng tế bào ung thư biểu mơ KB 48 Hình 3.5 Minh họa ảnh hưởng AFD6 dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 49 Hình 3.6 Minh họa ảnh hưởng AFD6 dòng tế bào ung thư vú MCF7 50 Hình 3.7 Minh họa ảnh hưởng AFD6 dòng tế bào ung thư phổi Lu 51 Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống oxy hóa theo phương pháp sử dụng DPPH AFD6 52 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết phận mẫu 35 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính kháng sinh cao chiết Artocarpus nigrifolius C Y Wu 36 Bảng 3.3 Hoạt tính chống ơxy hố mẫu lá, vỏ thân, rễ cành Artocarpus nigrifolius C Y Wu 38 Bảng 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào cao dịch chiết phận loài Artocarpus nigrifolius C Y Wu 39 Bảng 3.5: 13C – NMR chất AFL2 AFD3 (CDCl3) (CDCl3 + CD3OD) 44 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh chất chiết tách từ loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu 46 Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc dịng tế bào KB Hep-G2 chất 48 Bảng 3.8 Hoạt tính gây độc dịng tế bào MCF7 Lu chất 50 Bảng 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa AFD6 51 MỞ ĐẦU Việt Nam nước có hệ thực vật phong phú đa dạng Tổng số loài thực vật ghi nhận Việt Nam khoảng 10.500 loài tổng số 12.000 loài theo ước tính Trong số đó, nguồn tài ngun làm thuốc chiếm khoảng 30% Kết điều tra nguồn tài nguyên thuốc Viện Dược liệu (2006) cho biết Việt Nam có 3.948 lồi thực vật bậc cao, bậc thấp nấm lớn dùng làm thuốc Trong thời gian qua, nước ta có 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 tổng số thuốc cấp số đăng ký lưu hành hàng năm Như nhu cầu sử dụng dược liệu chế xuất thuốc nước lớn Không vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên nước giới quan tâm Chi Artocarpus (họ Dâu tằm, Moraceae) chi thực vật phổ biến Việt Nam với 15 lồi Trong đó, ngồi giá trị làm thực phẩm nhiều lồi cịn sử dụng y học dân gian để chữa bệnh thấp khớp, hạ huyết áp, tiểu đường mít (Artocarpus heterophyllus), xa kê (Artocarpus altilis)…Thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thuộc chi Artocarpus nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu từ lâu, nhiều hợp chất với hoạt tính tốt công bố [31] Tuy nhiên, Việt Nam có số lồi nghiên cứu như: Chay Bắc (Artocarpus tonkinensis), Chay to (Artocarpus lakoocha Roxb.) Mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk.) Các nghiên cứu tìm số chất thuộc nhóm auronol glucosid có hoạt tính sinh học tốt ứng dụng vào sống tiền đề cho nghiên cứu [6] Ở Việt Nam lồi mít đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu tìm thấy bổ sung vào danh mục lồi chi mít (Artocarpus) năm 2011 nhóm tác giả PGS.TS Trần Minh Hợi, viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Nhóm tác giả cơng bố hoạt tính sinh học cho kết đáng quan tâm Do vậy, lựa chọn loài làm đối tượng nghiên cứu thực đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt chất sinh học lồi mít đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu” Mục tiêu luận văn nghiên cứu thành phần hóa học phát hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học lồi Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu Để đạt mục tiêu thực nội dung sau: - Thu hái định tên - Xử lý mẫu - Tách chiết, phân lập, xác định cấu trúc thành phần hóa học - Thử hoạt tính sinh học mẫu cao chiết hợp chất tinh Chương - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật loài Artocarpus nigrifolius C Y Wu Chi Artocarpus thuộc họ dâu tằm (Moraceae), họ thực vật lớn gồm khoảng 60 chi 1400 loài, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới châu Á Trên giới chi gồm khoảng 60 loài, phần lớn thân gỗ, có nhựa mủ màu trắng Hoa đơn tính gốc Hoa đực gồm hai hay bốn phiến, nhị với nhị với bao phấn hai bên, mở hai kẽ nứt Hoa có màu xanh, nhỏ phát triển thành gié nạc, ngắn Sau thụ phấn chúng phát triển thành tụ, phát triển to Lá kèm từ nhỏ Artocarpus integer (Thunb.) Merr (mít tố nữ) nguyên lớn xẻ thùy Artocarpus communis Forst & Forst.f ( Xa kê) Một số lồi chi có ăn nên trồng nhiều nước giới Artocarpus heterophyllus, Artocarpus integer, Artocarpus rigidus, Artocarpus tokinensis Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Artocarpus Việt Nam có 15 lồi lồi [4] Lồi Artocarpus nigrifolius C Y Wu Cây thân gỗ cao 15m, mọc thẳng, cành nâu sậm, vỏ sần sùi có nếp nhăn dày 1- 2,5 mm Chồi non ngắn có lơng màu nâu đen rỉ sắt Cuống đen, mỏng, dài 1,8 -2,8 cm có lơng màu nâu đen cịn non, phiến hình elip elip hẹp, kích thước 5-11 x 2-4 cm, mỏng giấy, phía xa gân có màu xanh nâu lơng nhỏ màu trắng, phía gần gân có màu gần đen khơng lơng, gần cuống có hình nêm rộng, gân không đối xứng; phần đuôi có chóp nhọn dài 0,5-1,5cm Phần gân gân loại rõ hai mặt lá, gân loại khơng lộ Cụm hoa đơn tính mọc nách Cụm hoa đực có kích thước 4-7mm hoa đơi, cụm hoa có màu trắng cịn non, màu xanh sậm khơ, hình nón ngược, 59mm, có nốt sần, chỏm cánh hoa có dạng tù, cuống dài 1-1,5 cm, mỏng Tiến hành thu mẫu tỉnh: Sơn La, Phú Thọ thu tiêu vật mẫu cành, lá, Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống ng oxy hóa theo phương pháp sử dụng DPPH AFD6 Từ kết trên, ên, nhận nh thấy, y, artochamin B llà chất có khả chống oxy hóa tốt ốt Giá trị ức chế có hiệu gốc tự ự DPPH c chất đạt EC50 = 20,51 µg/ml; điều ày b artochamin B hợp chất ấ thuộc ộc nhóm flavonoid, m nhóm chất ứng minh có khả chống oxy hóa ất hiệu hiệ Như vậy, ậy, qua kết kế thử nghiệm hoạt tính sinh học ọc hợp h chất phân lập từ loài ài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu thể thấy: ấy: artochamin B có hoạt ho tính tốt tất ất thử nghiệm Trong đó, artochamin B có tác động đặc biệt tốt với dòng òng ung thư th thử nghiệm, có khả ă ức chế dịng tế bào đạt IC50 tốt ên dòng KB 1,18 µg/ml KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Về hoạt tính dịch chiết phận cây: Bốn dịch chiết phận mít đen gồm: vỏ thân, lá, cành, rễ thể hoạt tính thử nghiệm Trong đó: - Hoạt tính kháng sinh: dịch chiết lá, vỏ thân, cành, rễ có hoạt tính kháng chủng vi sinh vật gram (+) với IC50 khoảng 3,65- 95,09 µg/ml - Hoạt tính chống xy hố DPPH: ngồi mẫu cành, mẫu có hoạt tính, đặc biệt mẫu vỏ thân có hoạt tính mạnh với giá trị EC50 42,08 µg/ml - Hoạt tính gây độc tế bào: bốn cặn chiết thể hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư thực nghiệm KB, HepG2, Lu MCF7 với giá trị IC50 khoảng 10µg/ml – 86µg/ml Về thành phần hóa học cây: Từ vỏ thân lồi mít đen (Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu) thu hái Sơn La phân lập chất: - Hai hợp chất triterpenoid: axit bentulinic, friedelin - Một hợp chất steroid β-sitosterol - Một hợp chất flavon artochamin B Về hoạt tính sinh học chất phân lập được: Các chất phân lập thể hoạt tính khác thử nghiệm, đó, artochamin B hợp chất có hoạt tính tốt nhất; với khả ức chế Bacillus subtilis (IC50 21,79 µg/ml), Staphylococcus aureus (IC50 25,14 µg/ml), gây độc bốn dịng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu MCF7 với giá trị IC50 1,18; 3,6; 20,0; 4,59 µg/ml, hoạt tính chống oxy hóa mạnh với giá trị EC50 20,51 µg/ml KIẾN NGHỊ: Tiếp tục nghiên cứu sâu hoạt tính chất, đặc biệt artochamin B để áp dụng vào thực tiễn Những dịch chiết phận khác có nhiều hoạt tính tốt cần tiếp tục nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích cộng (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật- Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học- Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ - TP Hồ Chí Minh Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật- Hà Nội Nguyễn Chí Bảo (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào Chay to (Artocarpus lakoocha Roxb.) Mít dai (Artocarpus heterophyllus LamK.) Việt Nam, Luận văn Tiến sĩ Hóa học , Viện Hóa học Tiếng Anh Anima Pandey and S.P.Bhatnagar (2009), “Preliminary photochemical screening and antimicrobial studies on Artocarpus lakoocha Roxb”, Ancient science of life, Vol 28, No 4, pp 21-24 Charoenlarp, P.Radomyos, P.Harinasuta (1981), “Treatment of taeniasis with Puag-Haad: a crude extract of Artocarpus lakoocha wood”, The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 12, 568–570 Euis Holisotan Hakima, Asnizara, Yurnawilisa, Norio Aimib, Mariko Kitajimab, Hiromitsu Takayamab (2002), “Artoindonesianin P, a new prenylated flavones with cytotoxic activity from Artocarpus lanceifolius”, Fitoterapia, vol.73, pp 668–673 10 R.I John Fresney (1993): “Culture of animal Cells: A manual of basis techniques, 3rd Edition”, Wiley & Sons Inc., New York 11 Hadacek, F., Greger, H (2000), “Test of antifungal natural products methodolagies, comparability of result and assay choise”, Phytochem Anal., 90, 137-147 12 Iqbal Musthapa, Lia D Juliawaty, Yana M Syah, Euis H Hakim, Jalifah Latip, and Emilio L Ghisalberti (2009), “An Oxepinoflavone from Artocarpus elasticus with Cytotoxic Activity Against P-388 Cells”, Arch Pharm Res, Vol 32, No 2, pp 191-194 13 Junichi Kitajima, Toru Ishikawa, Eiko Fujimatu, Kyoko Kondho, Tomomi Takayanagi (2003), “Glycoside of 2-C-methyl-D-erthritol from the fruits of anise, coriander and cumin”, Phytochemistry, Vol.62, pp.115-120 14 L.J Shai, L.J.McGaw, M.A.Aderogha, L.K.Mdee, J.N.Eloff (2008), “Four pentacyclic triterpenoids with antifungal and antibacterial activity from Curtisia dentate (Burm.f) C.A.Sm.leaves”, Journal of Ethnopharmacology, vol.119, pp.238-244 15 Lin, K.W., Liu, C.H., Tu, H.Y., Ko, H.H., Wei, B.L., 2009, “Antioxidant prenylflavonoids from Artocarpus communis and Artocarpus elasticus”, Food Chemistry 115, 558–562 16 M.R Khan, A.D Omoloso, M Kihara (2003), “Antibacterial activity of Artocarpus heterophyllus”, Fitoterapia , Vol.74, pp 501–505 17 Manjeshwar Shrinath Baliga, Arnadi Ramachandrayya Shivashankara, Raghavendra Haniadka, Jerome Dsouza, Harshith P Bhat (2011), “Phytochemistry, nutritional and pharmacological properties of Artocarpus heterophyllus Lam (jackfruit): A review”, Food Research International, vol 44, pp.1800–1811 18 Mossmann, T., (1983) “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J Immunol Meth.65, 55-63 19 NajihahMohd Hashim, M Rahmani, G.Cheng Lian Ee, Mohd A Sukari, M Yahayu, W.Oktima, A Ali and Rusea Go (2012), “Antiproliferative Activity of Xanthones Isolated from Artocarpus obtusus”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2012, Article ID 130627 20 Namdaung, U., Aroonrerk, N., Suksamrarn, S., Danwisetkanjana, K., Saenboonrueng, J., Arjchomphu, W., Suksamrarn, A., (2006), “ Bioactive constituents of the root bark of Artocarpus rigidus subsp rigidus”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, vol.54, pp.1433–1436 21 Pual Cos, Louis Maes, Jean-Bosco Sindambiwe, Arnold J Vlietinck, Dirk Vanden Berghe; “ Bioassay for antibacterial and antifungal activities”; Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of Antwerp, Belgium,1-13 (2005) 22 Ratna Asmah Susidarti, M.Rahmani, A.Manaf Ali, M.Aspollah Sukari, Hazar B.M.Ismail, “ Friedelin from Kelat merah” , Eugenia chlorantha Duthie 23 Scudiero D A., Shoemaker R H., Kenneth D P., Monks A., et al, (1988), “Evaluation of a soluable tetrazolium/ formazan assay for cell growth and drug sensibility in culture using human and other tumor cell lines.”, Cancer Reaseach 48: 4827-4833 24 Shashi B Mahato and Asish P Kundu (1994), “13C-NMR spectra of pentacyclic triterpenoids, a compilation and some salient features”, Phytochemistry, Vol 37, No 6, pp 1517-1575 25 Sisay Feleke and Abeba Brehane (2005), “ Triterpene compounds from latex of Ficus sur I”, Chemical Society of Ethiopia, Vol.19(2), pp 307-310 26 Stefan Berger, Dieter Sicker (2009), “Classic in spectroscopy – Isolation and structure elucidation of natural products”, Wiley – VCH, pp 481-499 27 Suhartati, T., Achmad, S.A., Aimi, N., Hakim, E.H., Kitajima, M., Takayama, H., Takeya, K., (2001), “Artoindonesianin L, a new prenylated flavone with cytotoxicity activity from Artocarpus rotunda”, pp.912–918 Fitoterapia, vol 72, 28 Suhartati, T., Yandri, Hadi, S (2008), “ The bioactivity test of artonin E from the bark of Artocarpus rigida Blume”, European Journal of Scientific Research, vol.23, pp.330–337 29 Supawatchara Singhatong, Donrawee Leelarungrayub and Chaiyavat Chaiyasut (2010), “Antioxidant and toxicity activities of Artocarpus lakoocha Roxb heartwood extract”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol 4(10), pp 947-953 30 Syah, Y.M., Achmad, S.A., Ghisalberti, E.L., Hakim, E.H., Mujahidin, D (2004), “ Two new cytotoxic isoprenylated flavones, artoindonesianin U and V from heartwood of A chempeden”, Fitoterapia , vol.75, pp 134–140 31 U.B Jagtap, V.A Bapat (2010), “Artocarpus: A review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology”, Journal of Ethnopharmacology 129 (2010) 142–166 32 Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui and Berhanu M Abegaz (2011), “Antimicrobial activities of the methanol extract and compounds from Artocarpus communis (Moraceae)”, BMC Complementary and Alternative Medicine 33 Wang, Y., Deng, T., Lin, L., Pan, Y., Zheng, X., (2006), “Bioassay guided isolation of antiatherosclerotic phytochemicals from Artocarpus altilis”, Phytotherapy Research 20, 1052–1055 34 Yong-Hong Wang, Ai-Jun Hou, Lei Chen, Dao-Feng Chen, Han-Dong Sun, Qin-Shi Zhao, Kenneth F Bastow, Yuka Nakanish, Xi-Hong Wangn, KuoHsiung Lee (2004), “New Isoprenylated Flavones, Artochamins A-E, and Cytotoxic Principles from Artocarpus chama”, J Nat Prod 67, 757-761 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR chất AFD2 58 Phụ lục 2: Các phổ chất AFL2 59 Phụ lục 3: Các phổ hợp chất AFD3 60 Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR chất AFD6 61 Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR chất AFD6 62 Phụ lục 7: Phổ 13C CPD & DEPT chất AFD6 63 Phụ lục 8: Phổ HSQC HMBC chất AFD6 64 Phổ HMBC chất AFD6