Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài mít lá đen Artocarpus nigrifolius C Y Wu

Trong đó, ngoài giá trị làm thực phẩm nhiều loài còn được sử dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh như thấp khớp, hạ huyết áp, tiểu đường như mít Artocarpus heterophyllus, xa kê Art

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Tú Anh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN

ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Tú Anh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN

ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Văn Tuyến

Hà Nội - 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật của loài Artocapus nigrifolius C Y Wu 03

1.2 Ứng dụng trong y học cổ truyền của chi Artocapus 04

1.3 Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học một số loài thuộc chi Artocapus

1.3.1 Hoạt tính kháng sinh 07

1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 09

1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa 14

1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác 18

1.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 19

1.4.1 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng sinh in vitro 19

1.4.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro 22

1.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro 23

Chương 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất 25

2.1.1 Mẫu thực vật 25

2.1.3 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp tách chiết 26

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc 26

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 27

2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu 30

2.3 Thực nghiệm 30

2.3.1 Chiết mẫu thực vật 31

2.3.2 Sàng lọc sơ bộ hoạt tính dịch chiết các bộ phận 31

2.3.3 Phân lập chất 31

2.3.4 Thử hoạt tính các chất 33

`Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sàng lọc sơ bộ hoạt tính dịch chiết các bộ phận 35

3.2 Thành phần hóa học cây Mít lá đen (Artocapus nigrifolius C Y Wu) 39

3.3 Hoạt tính sinh học của các chất 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance Spectroscopy proton

13

C-NMR Carbon – 13 Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Magnetic Resonance cacbon 13 Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Mulitiple Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Bond Coherence nhiều liên kết HMQC Heteronuclear Single Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Quantum Coherence một liên kết

KB human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô

HepG2 hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người

human MCF7 Ardeno carcinoma Ung thư vú

LU Human lung carcinoma Ung thư phổi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm thực vật loài Mít lá đen Artocapus nigrifolius C.Y.Wu 4 Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro 21 Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự 22

Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ và thân cây Mít lá đen 32

Hình 2.2: Phân lập các chất từ cao chiết diclometan 33 Hình 3.1 Sắc ký cột cao chiết DCM và SKBM một số phân đoạn cao chiết mẫu vỏ

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng so sánh của ADF2 và β-sitosterol 41 Hình 3.3: Tỉ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật theo các nồng độ của AFD6 47 Hình 3.4 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB 48 Hình 3.5 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 49 Hình 3.6 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư vú MCF7 50 Hình 3.7 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư phổi Lu 51 Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống oxy hóa theo phương pháp sử dụng DPPH

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết các bộ phận cây mẫu 35

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao chiết Artocarpus nigrifolius

Bảng 3.5: 13C – NMR của các chất AFL2 và AFD3 (CDCl3) và (CDCl3 + CD3OD) 44

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh của các chất chiết tách từ loài Artocarpus nigrifolius

Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào KB và Hep-G2 của các chất 48

Bảng 3.8 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào MCF7 và Lu của các chất 50 Bảng 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa của AFD6 51

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước tính Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30% Kết quả điều tra nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc Trong thời gian qua, nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số

đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng

năm Như vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn Không những vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang

được các nước trên thế giới hết sức quan tâm

Chi Artocarpus (họ Dâu tằm, Moraceae) là một chi thực vật khá phổ biến ở

Việt Nam với 15 loài Trong đó, ngoài giá trị làm thực phẩm nhiều loài còn được sử dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh như thấp khớp, hạ huyết áp, tiểu đường

như mít (Artocarpus heterophyllus), xa kê (Artocarpus altilis)…Thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Artocarpus đã được các nhà

khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu từ lâu, nhiều hợp chất mới với những hoạt tính tốt đã được công bố [31] Tuy nhiên, ở Việt Nam mới có một số ít loài

được nghiên cứu như: Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis), Chay lá to

(Artocarpus lakoocha Roxb.) và cây Mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk.) Các

nghiên cứu này cũng đã tìm ra được một số chất thuộc nhóm auronol glucosid có hoạt tính sinh học tốt có thể ứng dụng vào cuộc sống và là tiền đề cho các nghiên

cứu tiếp theo [6] Ở Việt Nam loài mít lá đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu mới

được tìm thấy và bổ sung vào danh mục loài của chi mít (Artocarpus) năm 2011 do

nhóm tác giả PGS.TS Trần Minh Hợi, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Nhóm tác giả cũng đã công bố hoạt tính sinh học của cây và cho các kết quả rất đáng quan tâm Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn loài cây này làm đối tượng nghiên cứu và thực

hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt chất sinh học loài mít lá đen

Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu”

Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu thành phần hóa học và phát hiện các

hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu Để

đạt được mục tiêu trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau:

- Thu hái và định tên cây

- Xử lý mẫu

- Tách chiết, phân lập, xác định cấu trúc các thành phần hóa học của cây

- Thử hoạt tính sinh học các mẫu cao chiết và các hợp chất tinh sạch được

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật của loài Artocarpus nigrifolius C Y Wu

Chi Artocarpus thuộc họ dâu tằm (Moraceae), là một họ thực vật lớn gồm

khoảng 60 chi và hơn 1400 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới châu Á Trên thế giới chi này gồm khoảng 60 loài, phần lớn là cây thân gỗ, có

nhựa mủ màu trắng Hoa đơn tính cùng gốc Hoa đực gồm hai hay bốn phiến, một nhị với chỉ nhị ở giữa với 2 bao phấn ở hai bên, mở bởi hai kẽ nứt Hoa cái có màu hơi xanh, nhỏ phát triển thành gié nạc, ngắn Sau khi thụ phấn chúng phát triển

thành quả tụ, có thể phát triển rất to Lá kèm từ nhỏ như ở Artocarpus integer (Thunb.) Merr (mít tố nữ) và nguyên cho tới lớn và xẻ thùy Artocarpus communis

Forst & Forst.f ( Xa kê) Một số loài trong chi có quả ăn được nên được trồng ở

nhiều nước trên thế giới như Artocarpus heterophyllus, Artocarpus integer,

Artocarpus rigidus, Artocarpus tokinensis Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Artocarpus

ở Việt Nam có 15 loài và dưới loài [4]

Loài Artocarpus nigrifolius C Y Wu

Cây thân gỗ cao 15m, mọc thẳng, cành nâu sậm, vỏ sần sùi có nếp nhăn dày 1- 2,5 mm Chồi non ngắn lá có lông màu nâu đen rỉ sắt Cuống lá đen, mỏng, dài 1,8 -2,8 cm có lông màu nâu đen khi còn non, phiến lá hình elip hoặc elip hẹp, kích thước 5-11 x 2-4 cm, mỏng như giấy, phía xa gân giữa lá có màu xanh nâu và lông rất nhỏ màu trắng, phía gần gân giữa lá có màu gần như đen và không lông, gần cuống lá có hình nêm rộng, gân lá không đối xứng; phần đuôi lá có chóp nhọn dài 0,5-1,5cm Phần gân lá chính và gân loại 2 nổi rõ ở cả hai mặt lá, gân loại 3 không

lộ Cụm hoa đơn tính mọc ở nách lá Cụm hoa đực có kích thước 4-7mm hoa đôi, cụm hoa cái có màu trắng khi còn non, màu xanh sậm khi khô, hình nón ngược, 5-9mm, có nốt sần, chỏm cánh hoa có dạng tù, cuống dài 1-1,5 cm, mỏng

Tiến hành thu mẫu tại các tỉnh: Sơn La, Phú Thọ thu tiêu bản và vật mẫu cành, lá, quả

Hình 1.1: Đặc đ ể

Artocarpus nigrifolius

vào hệ sinh vật của nư

cần được nghiên cứu

1.2 Ứng dụng trong y h

Nhiều loài trong chi

Đông Nam Á để điều trị

chảy Thịt quả và hạt đư

cây uống để trị bệnh tiêu ch

vú; tro đốt của lá là loại thu

Ở nước ta, dân gian dù

gan vàng da bằng cách n

Đức, lá xa kê còn có th

như gút, sỏi thận, tiểu đ

ặc điểm thực vật loài Mít lá đen Artocarpus

1 Cành Mít lá đen 2 Chồi Mít lá Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu là một loài mới được nghi

ước ta, do đó, các tài liệu ghi nhận về chúng ch

ng trong y học cổ truyền của chi Artocarpus

oài trong chi Artocarpus được dùng trong y học cổ

ể đ ều trị các bệnh như kháng viêm, sốt rét, trị ung nhđược sử dụng như thuốc bổ có tác dụng làm mát, h

êu chảy và hạ sốt, lá giúp tăng tiết sữa cho ph

ại thuốc trị giun trong y học cổ truyền nhiều

a, dân gian dùng lá xa kê (Artocarpus altilis) ch

ằng cách nấu là tươi để uống Ngoài ra, theo lươ

ê còn có thể phối hợp với một số loại thuốc khác trị đ

ậ ểu đường týp 2, chứng huyết áp cao dao động [

thường dùng để ăn, quả còn xanh có bột dùng để làm thực phẩm Hạt xa kê luộc hoặc rang ăn ngon như hạt rẻ có tác dụng lợi trung tiện, kích dục

Artocarpus altilis không chỉ làm thức ăn chăn nuôi, lá của nó được sử dụng

để điều trị xơ gan, tăng huyết áp và bệnh tiểu đường ở Indonesia [30]

Ở Tân đảo, rễ cây được dùng để trị hen và các rối loạn dạ dày, ruột, một số

rối loạn khi mang thai, đau răng miệng và trị bệnh về da

Ở Papua Niu- Guinea, vỏ cây được dùng để trị bệnh ghẻ; nhựa cây được pha

loãng uống trị ỉa chảy và lỵ; lá dùng phối hợp với lá đu đủ giã với vôi cho đến khi

có màu vàng, lấy hỗn hợp này đắp trị sưng háng, lá cũng được dùng trị đinh nhọt, sưng háng [3]

Thân và rễ loài Artocarpus altilis đã được sử dụng ở Đài Loan từ lâu để điều

trị bệnh xơ gan và chứng tăng huyết áp Ngoài ra chúng còn được dùng để kháng viêm, giải độc

Ở Ấn Độ, trong một nghiên cứu sàng lọc tác dụng dược lý của cao khô chiết

từ vỏ và lá xa kê bằng cồn 500, các tác giả nhận thấy cao thô có tác dụng lợi tiểu rõ rệt trong thí nghiệm với chuột cống trắng so với lô đối chứng

Ở Trinidad và Banhamas, người ta dùng nước sắc lá xa kê để hạ huyết áp và

trị hen suyễn, lá giã nát đắp trị tưa lưỡi, nước ép từ lá dùng như thuốc nhỏ tai, tro

đốt từ lá dùng bôi lên da chữa nhiễm trùng và bột lá khô dùng để điều trị lá lách mở

rộng Quả giã nát làm thuốc đắp lên vết sưng tấy giúp mau mưng mủ, hoa chữa đau răng bằng cách hơ nóng chà lên niếu xung quanh chỗ đau Nhựa cây dùng để chữa trị bệnh về da và giảm đau thần kinh tọa, pha loãng uống trị tiêu chảy

Ở nước ta, hạt mít dai ( A heterophyllus) được dùng trị ghẻ lở, sản hậu ít

sữa Múi mít dùng chữa sốt rét rừng và giải say rượu [1] Hạt mít nướng hay luộc ăn thì hạ khí, thông trung tiện Lá mít được dùng làm thuốc lợi sữa, chữa ăn uống không tiêu, ỉa chảy, và trị huyết áp cao Lá mít giã đắp cũng làm mụn nhọt bớt sưng

đau Gỗ và lá mít còn được dùng làm thuốc an thần, chữa huyết áp cao hay những

trường hợp co quắp: mài gỗ mít lên miếng đá nháp hay chỗ nháp của trôn bát, cho thêm ít nước đến khi nước trở nên đục nhiều thì uống với liều hàng ngày là 6-10g

Gỗ và nhựa mít làm tiêu sưng, giải độc, chữa sưng tấy, mụn nhọt, dưới dạng sắc nước uống (gỗ) và bôi (nhựa) Rễ cây sắc nước uống trị ỉa chảy và cùng với vỏ trị các loại viêm gây sốt Dịch nhựa cây thường được dùng đắp rút mủ mụn nhọt, còn dùng trị bệnh giang mai và trừ giun Dái mít dùng chữa sa dạ con và lõi mít có tính gây sảy thai[2] Ở Ấn Độ người ta dùng lá chữa các bệnh ngoài da và trị rắn cắn [31] Rễ sắc uống trị tiêu chảy và vàng da Dịch ép của cây đắp vào chỗ sưng hạch

và áp xe để làm mưng mủ Quả xanh có tác dụng làm săn, quả chin nhuận tràng Nhựa mủ bôi trị vết thương [2]

Ở Indonesia, dịch ép quả mít non có trong thành phần một thuốc uống trị sốt

Quả non trộn với cao khô từ lá cây Uncaria gambir ăn trị đau bụng Lá hoặc quả có trong thành phần bài thuốc chữa uồng trị tiêu chảy, nước sắc lá giã nát dùng làm thuốc chữa đau răng

Hạt Chay lá to (Artocarpus lakocha) ở Ấn Độ được dùng làm thuốc xổ, vỏ

cây dùng tán bột đắp vết thương để rút mủ hoặc pha thuốc đắp mụn nhọt và các vết nứt nẻ ở da Ở Thái Lan, nạc của trái được xem như thuốc bổ gan, gỗ, quả chay sắc nước uống dùng trị giun kim, giun đũa, sán xơ mít và dùng ngoài da trị ghẻ Ở nước

ta, vỏ, mủ trị đau lá lách; hột làm thuốc xổ

Các loại trái cây Artocarpus lakocha thường được ăn tươi Bột trái cây ăn

được và dùng như là một loại thuốc bổ cho gan Ở Thái Lan, bột Artocarpus

lakoocha Roxb còn gọi là Puag-Haad được sử dụng làm thuốc trị sán dây truyền

thống [8].Vỏ cây có chứa 8,5% tannin được nhai như trầu và cũng được sử dụng để

điều trị bệnh về da

Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis) có quả dùng để chữa phổi nóng, ho ra

máu, thổ huyết, chảy máu mũi, đau họng, dạ dày thiếu toan, kém ăn Nếu không có quả chay tươi có thể dùng quả chay khô hay rễ chay sắc uống Rễ chay dùng chữa tê thấp, đau lưng, mỏi gối và chữa rong kinh, bạch đới; còn dùng làm chắc chân răng Liều dùng 20-40g dạng thuốc sắc

Ngoài ra, những loài khác trong chi Artocarpus cũng được sử dụng trong y học dân gian ở các nước Đông Nam Á từ lâu: nhựa từ Artocarpus lowii truyền

thống được sử dụng như một loại dầu ăn và thuốc mỡ trong y học dân gian

Artocarpus chempeden là một trong các loại thuốc dân tộc Indonesia; hạt cây đã

được sử dụng để chống lại tiêu chảy và rễ của nó chống lại bệnh sốt rét Phía Tây

Java, Artocarpus elasticus Reinw ex Blume đã được sử dụng để điều trị viêm,

tránh thai cho nữ (vỏ cây), bệnh lỵ và lá non cho điều trị bệnh lao Bên cạnh việc sử

dụng làm thuốc, các loài trong chi Artocarpus được sử dụng như một loại thực

phẩm và vật liệu xây dựng nhà ở [31]

1.3 Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của một số loài thuộc chi

Artocarpus

Với việc được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong y học cổ truyền, chi

Artocarpus đã sớm được các nhà khoa học trên thế giới để ý Từ chi này, rất nhiều

các hợp chất sinh học thứ cấp đã được tách chiết, tinh sạch, sàng lọc hoạt tính và nhiều trong số chúng có hoạt tính tốt, hứa hẹn khả năng được áp dụng vào thực tiễn Các hoạt tính thường được thăm dò là: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, gây độc với các tế bào ung thư và khả năng chống các gốc oxy hóa Ngoài ra, tùy theo những tác dụng của loài trong y học dân gian, tùy theo tính chất của các nhóm chất, người ta có thể thăm dò các hoạt tính khác như: tính kháng virus, ức chế các enzyme, chống tiểu đường… Dưới đây, chúng tôi xin giới thiệu về những hoạt tính

sinh học của các hợp chất đã được tách từ các loài thuộc chi Artocarpus

1.3.1 Hoạt tính kháng sinh:

Cao chiết methanol vỏ cây loài Artocarpus communis và một số hợp chất tự

nhiên tinh sạch được từ loài này như artonin E (1), methylbut-1-enyl) phenyl]benzofuran-6-ol (2) có khả năng kháng nhiều chủng vi

2-[(3,5-dihydroxyl)-(Z)-4-(3-sinh vật như : P.seudomonas stuartii (ATCC29916), P.aeruginosa (PAO1),

Klebsiella pneumonia (ATCC11296); S.aureus (ATCC25922), S.typhi

(ATCC6539), E.coli (ATCC8739), C.albican (W3100) Trong đó (1) và (2) cho giá

trị MIC là 32 µg/ml với P.aeruginosa, giá trị này cao hơn cả chất kháng sinh đối

chiếu là chloramphenicol [32]

(1) (2)

Từ vỏ cây loài Artocarpus rigida Blume người ta cũng tìm thấy hợp chất

artonin E (1) với hoạt tính kháng sinh rất tốt tương đương với các chất kháng sinh

đối chứng Điều này cho thấy khả năng ứng dụng của artonin E trong thực tế như

một chất kháng sinh [28]

Hợp chất pyranocycloartobiloxanthone A (3) được tìm thấy ở loài

Artocarpus obtusus thể hiện hoạt tính kháng sinh tốt với một số chủng vi sinh vật

như: Staphylococcus aureus kháng methicillin (ATCC33591) với đường kính

vòng vô khuẩn là 20mm tương đương với hoạt tính của chất đối chứng là

streptomycin sulfat, hay kháng Bacillus subtilis với đường kính vòng vô khuẩn là 12mm, ngoài ra nó cũng thể hiện hoạt tính với các chủng B.subtillis (ATCC 6633),

E.coli (ATCC 25922), S.aureus (ATCC 6538) và Salmonella typhimurium (S865B)

với đường kính nhỏ hơn 10 mm Mặc dù không cao như tính kháng khuẩn, Pyranocycloartobiloxanthone A cũng thể hiện hoạt tính kháng nấm trên các chủng

Candida albicans (ATCC 1023) và Saccharomyces cerevisiae (S617) với đường

kính vùng ức chế lần lượt là 7 và 8 mm [19]

O O

OH HO

OH

(3)

Cao chiết thô methanol của thân, vỏ thân, vỏ rễ, lá, hạt, quả, gỗ của

Artocarpus heterophyllus và các phân đoạn dịch chiết sau đó với dichloromethane,

ethyl acetate và butanol

Bacillus cereus, B.coagulans, B.megaterium, B.subtilis, Lactobacillus casei, Micrococcus luteus, M.roseus, Staphylococcus albus, S.aureus, S.epiderepidermidis, Streptococcus fa

tumaefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P.vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,

marcescens, Trichomonas vaginalis

thân Artocarpus kemando

người) với giá trị IC50

(4)

ethyl acetate và butanol đã cho phổ kháng vi sinh vật rộng vớ

Bacillus cereus, B.coagulans, B.megaterium, B.subtilis, Lactobacillus casei, Micrococcus luteus, M.roseus, Staphylococcus albus, S.aureus, S.epiderepidermidis, Streptococcus faecalis, St.pneumoniae, Agrobacterium tumaefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P.vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,

marcescens, Trichomonas vaginalis Trong đó, phân đoạn butanol (n

ả của Artocarpus heterophyllus có hoạt tính t

ài cũng thể hiện hoạt tính ức chế với các chủ

(14 mm), S typhimurium (13 mm) và E coli

độc tế bào

ộng sự đã tách được một số hợp chất

là artoindonesianin L (4), artonin M (5) cycloartobiloxanthone (7) Những hợp chất này đ

ối với dòng tế bào P388 bạch cầu chuột vớ

ậ ộng với nhiều chủng như:

Bacillus cereus, B.coagulans, B.megaterium, B.subtilis, Lactobacillus casei, Micrococcus luteus, M.roseus, Staphylococcus albus, S.aureus,

ecalis, St.pneumoniae, Agrobacterium tumaefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P.vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia

ế bào ung thư biểu mô (KB); hợp chất (7),

ạt tính kháng dòng ung thư vú (BC); xanthone artonol

, (11), artorigidusin xanthone artonol B (10),

ả năng gây độc với các

artonol có hoạt tính tốt

đạt giá trị IC50 lần lượt

với các dòng tế bào trên là at 1,33; 1,46; 0,

được tìm thấy ở rễ loài

chloroform Artocarpus chempeden

dòng tế bào bạch cầu chu

OH O

m 2004, Syah và cộng sự đã tách được hai hợp chất isoprenyl flavones l

(13) và artoindonesianin V (14) từ lõi thân

ể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng t

à 2,0 và 0,5µg/ml (Syah và cộng sự, 2004) N

ợc các hợp chất artoindonesianin A-2, artoindonesianin

, cudraflavone C (17), artoindonesianin T

Artocarpus chempeden; các hợp chất này đều thể hiệ

ạ ầu chuột P388 với giá trị IC50 lần lượt là 3,66; 5,45; 4,50;

artoindonesianin A-3 (15), , artoindonesianin T (18) từ dịch chiết

ề ể hiện hoạt tính ức chế

à 3,66; 5,45; 4,50; 4,50;

(14)

ại prenyl flavones tách chiết từ Artocarpus altilis

, artocarpin (20), chaplashin (21), morusin (22) , cycloartobiloxanthone (7), artonin E (1), cudraflavone C

; các hợp chất này thể hiện khả năng gây độdòng KB, BC và Vero với giá trị IC50 tương tự nhau từ 2,9–14,7 µ

(19)

(16)

(18)

Artocarpus altilis viz là

(22), cudraflavone B , cudraflavone C (17),

ăng gây độc tế bào với các

7 µg/ml [33]

(20)

(23)

trái xa kê (Artocarpus communis) các chất 5’

(24) và 3,4,2’,4’-tetrahydroxy-3’-geranyldihydrochalcone

ức chế nhiều dòng tế bào ung thư trong nghiên c

vitro [trên các dòng ung thư nguyên bào gan (HepG2, Hep3B), ung th

), ung thư gan (PLC5, Huh7)] [32]

Yong-Hong Wang và cộng sự (2004) tiến hành tách chiết và thử hoạt tính

gây độc tế bào các chất artochamin C (26), artocarpin (20), artonin E (1) từ loài

Artocarpus chama trên một số dòng tế bào ung thư Kết quả nghiên cứu cho thấy,

artochamin C (26) có hoạt tính ức chế mạnh trên các dòng MCF-7, 1A9, HCT-8 và

SKMEL-2 với giá trị ED50 trong khoảng 2,0-2,3 µg/mL; yếu hơn với A549, KB,

KB-VIN với ED50 là 3,0-3,4 µg/mL, tuy nhiên (26) không thể hiện hoạt tính đáng

kể nào với các dòng tế bào CAKI-1, U-87-MG, PC-3, MDA-MB- 231 khi ED50

của chúng đều lớn hơn 4,0 µg/mL Artocarpin (20) cũng có hoạt tính ở mức trung

bình với các dòng tế bào thử nghiệm như A549, MCF-7, 1A9, HCT-8, U-87-MG, MDA-MB-231, KB, và KB-VIN với giá trị ED50 trong khoảng 3,2-3,8 µg/mL, và

cũng không thể hiện hoạt tính trên các dòng CAKI-1, SK-MEL-2, PC-3 ở nồng độ

dưới 4,0 µg/mL Artonin E (1) gây độc mạnh với dòng tế bào 1A9 (ED50 < 1,25

µg/ml), MCF-7 (ED50 = 2,2 µg/ml), gây độc yếu hơn trên các dòng HCT-8,

MDAMB-231 (lần lượt ED50 = 3,3 và 3,0 µg/ml)

1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật ngày càng thu hút

sự quan tâm của các nhà khoa học do khả năng tăng cường sức khỏe, giảm các bệnh tật kinh niên của chúng Thành phần hóa học của loài thuộc chi Artocarpus chứa nhiều hợp chất phenol là nhóm hợp chất có tính chống oxy hóa cao, có khả năng

ứng dụng vào thực tiễn như là thực phẩm bổ sung Do đó, việc phân lập các chất có

hoạt tính này từ các loài trong chi đã được tiến hành từ lâu và cho nhiều kết quả khả quan

Các chất cycloheterophyllin

thấy trong một số loài thu

dịch treo mô não chuộ

cycloheterophyllin (27), artonin A (28), artonin B

ài thuộc chi Artocarpus ức chế sự peroxy hóa lipi

ột, loại bỏ 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH)

ốc hydroxyl OH- được tạo ra bởi 2,2’-azobis (2

ệ Fe3+–ascorbate–EDTA–H2O2 đã được Ko v

(28)

(29)

ống oxy hóa của các hợp chất geranyl flavonoid phân l

ã được Jayasinghe và cộng sự nghiên cứu Tính ch

ợ ất được đánh giá bằng khả năng loại bỏ gốc DPPH theo ph

TLC ( TLC bio-autography method) của Takao Tấ

ế ắng nhạt trên nền màu tía ở nồng độ 1,0 µg/m

4’ - tetrehydroxychalcon (30), 8 – geranyl ) và isonymphaeol-B (32) cho thấy vết trắ

ấ ết trắng nhạt mạnh trên

ất chống oxy hóa của ương pháp đo ảnh phổ Giá trị

prenylflavonoid được phân lập từ vỏ rễ loài Artocarpus communis bao gồm:

cyclogeracommunin (33), artoflavone A (34), artomunoisoxanthone (35),

artocommunol CC (36), artochamin D (37), artochamin B (38),

dihydroartomunoxanthone (39), và các prenylflavonoid từ Artocarpus elasticus

như cycloartelastoxanthone (40), artelastoheterol (41), artonol A (42),

cycloartobiloxanthone (7) tất cả đều thể hiện hoạt tính ức chế các tác nhân gây oxy hóa Đặc biệt là các chất (34), (40), (41), (7) có hoạt tính khá cao trong thử nghiệm

chống oxy hóa DPPH với EC50 lần lượt là 24,2±0.8; 18,7±2.2; 42,2±2,8, 26,8±1,2

µM

(33) (34)

(35) (36)

Trong nghiên cứu chất kháng vi khuẩn lao, những hợp chất prenyl flavon

được tách ra từ rễ Artocarpus altilis gồm: cycloartocarpin (19), artocarpin (20),

chaplashin (21) , cudraflavone B (23), cycloartobiloxanthone (7), artonin E (1), cudraflavone C (17), artobiloxanthone (8) đều thể hiện khả năng kháng lại vi khuẩn

lao Mycobacterium tuberculosis H37Ra với MIC trong khoảng từ 3.12 đến

100µg/ml, đây là một giá trị tương đối tốt khi so sánh với chất hiện đang dùng làm thuốc lao là kanamycin với giá trị MIC đạt 2,5µg/ml [31]

Tác dụng bảo vệ tế bào, chống xơ vữa động mạch đã được chứng minh với

dịch chiết ethyl acetate của loài Artocarpus altilis, nhóm nghiên cứu cũng đã phát

hiện ra nhóm chất chính mang lại hiệu quả này trong dịch chiết là flavonoid trong

đó có β-sitosterol [33]

Bằng những thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã bước đầu chứng minh được khả năng làm tăng đường huyết, giảm tác hại tiểu đường type II của dịch

chiết nước A.communis

Năm 2005, Goncalves và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng rotavirut in vitro của các loại thuốc truyền thống từ thực vật, trong đó có loài Artocarpus integrifolia Lamk Nhóm nghiên cứu nhận thấy, loài cây này có tác dụng đặc biệt

với các chủng rotavirut của người (HCR 3) và khỉ (SA-11) Ở nồng độ 480µg/ml dịch chiết, 99,2% virut HCR 3 và 96,4% SA-11 bị ức chế Do đó, dịch chiết của loài này rất có tiềm năng ứng dụng để ngăn chặn dịch ỉa chảy nếu nguyên nhân được xác định là do rotavirut

1.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro:

Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro cho kết quả chính xác cao và thời gian thực hiện tương đối ngắn Ở phần tiếp theo, chúng tôi sẽ đề cập đến những phép thử phổ biến nhất

1.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro:

Có nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro Có thể phân loại các phương pháp này bằng kỹ thuật đưa chất thử vào hệ thử [5]

Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc:

Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được tẩm vào khoanh giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng chất Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh

Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc:

Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh

(a) (b)

(c) (d) Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro

(a) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (b) Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc; (c) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng;

(d)Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng:

Nguyên tắc của phương pháp là dùng hang loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu Thêm những nồng độ khác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các

ống Xác định nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của

vi khuẩn Nồng độ này được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal inhibitory concentration) Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng

2 lần liên tiếp hoặc phương pháp hệ nồng độ

Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth microtitre technique)

Phương pháp này, về nguyên tắc, chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng

2 lần liên tiếp, nhưng phải có dàn máy ELISA ( Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn,

tự động, tiết kiệm và có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ thông thường ở chỗ:

•Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi

ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm

•Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khác nhau của chất thử còn ở

đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng

•Kỹ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ thị TTC), nhưng ở đây, được xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng

492 nm của dàn máy ELISA

Phương pháp sinh tự ký ( Bioautography)

Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng

kháng sinh in vitro sinh ký tự

Phương pháp này sử dụng khi đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần nào trong dược liệu này có tác dụng

Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sử dụng môi trường đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản mỏng, tiến hành láng môi trường thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h để xác định vùng vết chất làm vi khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụng kháng khuẩn Để phát hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC (Triphenyl tetrazolium Chloride)

1.4.2 Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào

Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng

tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai

phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB

Phương pháp MTT:

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp

chí Immunological Methods năm 1983 [1] Theo tác giả, muối tetrazolium được

dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ

và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

Tetrazolium (màu vàng) Formaran (màu tím)

Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để

đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng

dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào

pH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào

đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base

để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng

1.4.3 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của chất:

Oxy không thể thiếu với sự sống, khi đi vào cơ thể, oxy tham gia nhiều quá trình sinh hóa học Trong quá trình đó, chúng tạo ra những tiểu phân trung gian gọi

là gốc tự do Các gốc này có thể gây hại cho sức khỏe, do đó trong cơ thể cần thiết duy trì sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa Đó là trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi Tuy nhiên, do nhiều tác động, cân bằng này

di chuyển theo hướng gia tăng dạng oxy hoạt động Vì vậy việc bổ sung vào cơ thể các dạng chất chống oxy hóa là cần thiết

Để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một

số phương pháp sau:

Phương pháp sử dụng DPPH

Nguyên tắc: 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do

được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa

của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước song λ = 517nm

Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II

Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc

tự do Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện

qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II và 2,2’-bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II)

Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O 2*-

Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2*- Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được

định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức

chất có màu tím được đo ở bước song λ = 550nm Hoạt tính của mẫu thử được thể hiện qua việc giảm sự hình thành phức màu tím

Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H 2 O 2

Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2*- và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể nhưng nếu hiện điện ở nồng độ cao chúng sẽ tạo ra 1O2 ,*OH là phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản

ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase )

Chương 2 - THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất

2.1.1 Mẫu thực vật

Mẫu thực vật loài Artocarpus nigrifolius C Y Wu thu tại khu Bảo tồn thiên

nhiên Copia, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La vào tháng 6 năm 2010 Số hiệu mẫu PVT 419 Tiêu bản do TS Nguyễn Tiến Hiệp định tên và được lưu giữ tại Phòng tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Mẫu lá, cành, rễ và vỏ thân sau khi thu được phơi trong bóng râm và xử lý sơ

bộ trước khi tách chiết

2.1.2 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật

Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60

F254 Merk, độ dày 0,2mmm

Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 0,063- 0,1 mm

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 0,040- 0,063 mm

Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau

Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4) (thành phần); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanilin 1,2g; MeOH 200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)

Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện

Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance 500MHz viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol

đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng

2.1.3 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học

Các môi trường nuôi cấy Merk: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud Dextro Broth), SDA (Sabouraud Dextro Agar) cho nấm

Chất tham khảo (Sigma) sử dụng trong phép thử hoạt tính kháng sinh: kháng

sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng Escherichia coli; kháng sinh streptomycin cho chủng Pseudomonas aeruginosa; kháng sinh amphotericin B

Tủ cấy sinh học an toàn cấp II;

Máy li tâm (Universal 320R);

Kính hiển vi ngược (Zeizz);

Tủ lạnh sâu -250C,-800C;

Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ);

Máy quang phổ (Genios Tecan);

Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết tách

Mẫu cành, vỏ thân, rễ và lá cây Mít lá đen được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ

400C, xay nhỏ và chiết riêng biệt từng loại nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc và loại dung môi dưới

áp suất giảm thu được cao chiết MeOH

Cao chiết MeOH được chiết lại lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclometan, etyl axetat Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu

được các cao chiết tương ứng

Phân lập các cao chiết nhận được bằng phương pháp sắc ký cột thường, sắc

ký cột nhanh với các dung môi thích hợp

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY)

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:

Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người do ATCC

cung cấp:

- Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử,

thường không gây bệnh

- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết

thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệnh về đường

tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩn mủ xanh,

gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi

ở trẻ em và các bệnh phụ khoa

- Lactobacillus fermentum (Lp B14: )gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột

lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

- Enterococcus faecium (B650): gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường

tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não

Phương pháp tiến hành: thực hiện dựa trên phương pháp vi định lượng trên môi trường lỏng Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các

giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC 50 (nồng độ ức chế

50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu)

- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ là 128 µg/ml, 32 µg/ml, 8µg/ml, 2µg/ml, 0,5µg/ml

- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml khi tiến hành thử

- Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng (+) kháng sinh được pha trong nước cất theo nồng độ 10mg/ml và khử trùng bằng màng lọc Millipore 0,22µm; tiến hành các bước thì nghiệm tiếp theo tương tự như các chất thử khác Mẫu đối chứng (-) chất thử được thay thế bằng nước cất vô trùng

- Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường Giá trị MIC được xác định tại giếng

có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật

- Giá trị IC 50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN bước sóng λ = 492nm và phần mềm raw data

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.2.3.2 Phương pháp thử độc tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:

- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được

sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào

- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan

- LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi

- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú

Phương pháp thử độ độc tế bào: được Viện Ung thư Quốc ga Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự

phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

Thử độc tế bào:

- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml;

2µg/ml; 0,5µg/ml Bổ xung 200µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1 Giếng điều khiển có 200

µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h

- Sau 72h thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều

đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN

GI % = OD điều khiển − OD mẫu

GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu

Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 517 nm

Cách tiến hành:

- Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH)

- Mẫu thử được pha loãng trong DMSO 100% theo dãy nồng độ là 128