2.2.1 Phương pháp chiết tách
Mẫu cành, vỏ thân, rễ và lá cây Mít lá đen được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 400C, xay nhỏ và chiết riêng biệt từng loại nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol. Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc và loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết MeOH.
Cao chiết MeOH được chiết lại lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclometan, etyl axetat. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết tương ứng.
Phân lập các cao chiết nhận được bằng phương pháp sắc ký cột thường, sắc ký cột nhanh với các dung môi thích hợp.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H- COSY).
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người do ATCC cung cấp:
- Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử,
thường không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết
thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩn mủ xanh,
gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi
ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
- Lactobacillus fermentum (Lp B14: )gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
- Enterococcus faecium (B650): gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.
Phương pháp tiến hành: thực hiện dựa trên phương pháp vi định lượng trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế
- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ là 128 µg/ml, 32 µg/ml, 8µg/ml, 2µg/ml, 0,5µg/ml
- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml khi tiến hành thử.
- Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng (+) kháng sinh được pha trong nước cất theo nồng độ 10mg/ml và khử trùng bằng màng lọc Millipore 0,22µm; tiến hành các bước thì nghiệm tiếp theo tương tự như các chất thử khác . Mẫu đối chứng (-) chất thử được thay thế bằng nước cất vô trùng.
- Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN bước sóng λ = 492nm và phần mềm raw data
Thí nghiệm được lặp lại với n = 3
2.2.3.2 Phương pháp thửđộc tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:
- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được
sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.
- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan.
- LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.
- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.
Phương pháp thử độ độc tế bào: được Viện Ung thư Quốc ga Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
Thử độc tế bào:
- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml. Bổ xung 200µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200
µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.
- Sau 72h thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
GI % = OD điều khiển − OD mẫu OD điều khiển x 100
GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
Thí nghiệm được lặp lại với n = 3
2.2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu.
Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 517 nm.
Cách tiến hành:
- Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH).
- Mẫu thử được pha loãng trong DMSO 100% theo dãy nồng độ là 128
µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml.
- Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. Phần trăm quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
% = OD mẫu trắng – OD mẫu thử
EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu:
Các số liệu được xử lý bằng phương pháp xác suất thống kê. Giá trị trung bình: X=∑ xi / n
Phương sai: S2
= ∑( xi – x)2 / (n-1)
Độ sai chuẩn: Sx= S/√
Sai số tuyệt đối: ∆x = t(α,ƒ).Sx
Kết quả: x= x ± ∆x
Khoảng giới hạn tin cậy: x = t (α,ƒ).Sx
TRong một số trường hợp còn tính sai số tương đối: A= ∆x. 100/x
Trong đó:
xi: giá trị số liệu thực nghiệm
x: trung bình cộng
n: số lần thí nghiệm
t(α,ƒ) tra theo bảng với α = 0,95; ƒ = n-1
2.3 Thực nghiệm chiết tách, tinh chế và số liệu phổ, thử hoạt tính sinh học của các hợp chất từ loài nghiên cứu hợp chất từ loài nghiên cứu
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH
y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ậ t đ ộ q u a n g h ọ c ( O D )
2.3.1 Chiết mẫu thực vật
Các mẫu lá, vỏ thân, cành, rễ được nghiền nhỏ và tiến hành chiết riêng biệt. Từng bộ phận của loài được ngâm chiết nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol. Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết MeOH. Các mẫu chiết được gọi theo tên bộ phận cây sử dụng.
2.3.2 Sàng lọc hoạt tính các cao chiết bộ phận:
Cao chiết lá, vỏ thân, cành, rễ sau khi loại hết dung môi, làm khô tiến hành cân và pha loãng theo các nồng độ được sử dụng thử các hoạt tính : kháng sinh, gây độc tế bào và chống oxy hóa DPPH theo các phương pháp đã trình bày trong phần trên (2.2.3)
2.3.3 Chiết tách và phân lập các chất từ cao chiết vỏ thân:
Tiến hành tách chiết mẫu vỏ thân theo quy trình như sau:
Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ thân cây Mít lá đen
Phân lập các chất từ cao chiết
Tiến hành phân lập các chất từ cặn chiết diclometan thân sử dụng sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel, dung dịch rửa giải là n-Hexan/EtOAc tăng dần tỷ lệ từ
Dịch chiết tổng MeOH 153,7g
Chiết siêu âm (3 lần) trong MeOH Mẫu vỏ thân nghiền nhỏ 1kg
Cao chiết MeOH 2 95,8g
Cất loại dung môi
Dịch chiết diclometan
Cao chiết diclometan 20,9g
Cất loại dung môi
Cao tổng 1
Cao chiết EtOAc 37g
Chiết diclometan
Cất loại dung môi Chiết
0-100% thu phân đoạn. Sau khi xử lý các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột
lặp lại với các dung môi thích hợp, kết tinh lại thu đươc các hợp chất AFD2, AFL2,
AFD3, AFD6.
Quá trình phân lập các chất từ cao chiết DCM được khái quát theo sơ đồ sau:
Hình 2.2: Phân lập các chất từ cao chiết DCM Chất AFD2:
Sắc ký cột cao chiết Diclometan bằng hệ dung môi n-hexan: EtOAc với tỷ lệ tăng dần, ở hệ dung môi n-hexan: EtOAc (95:5) thu được phân đoạn B giàu chất AFD2 và AFL2. Tiếp tục tiến hành sắc ký cột PĐ B với hệ n-hexan: EtOAc từ 0- 5%, chúng tôi thu được các phân đoạn giàu chất ADF2, chất này sau đó được kết tinh lại trong n-hexan thu được chất màu trắng, kết tinh dạng chùm hình kim. AFD2 được xác định là β –sitosterol dựa trên các kết quả sắc ký bản mỏng so sánh với chất chuẩn Rf = 0,54 (TLC, silica gel, n-hexan: EtOAc = 80:20), điểm nóng chảy 140-1420C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,52 (1H, m, H-3); 5,35 (1H, dd; 3,0 Hz, 3,0 Hz, H-6); 0,68 (3H, s, H-18); 1,01 (3H, s, H-19); 0,93
Cao chiết Diclometan (20g)
SKC silicagel n-hexan: EtOAc (0-100%)
5% EtOAc 15% EtOAc 40% EtOAc
PHĐ B 1,3g PHĐ C 15mg PHĐ E 64mg AFD6 20mg AFD3 8mg AFD2 26mg AFL2 11mg Kết tinh phân đoạn SKC silica-gel Kết tinh phân đoạn Kết tinh phân đoạn hệ n-hexan: EtOAc (0-10%)
(3H, d, J = 7,0 Hz, H- 21); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27); δH 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz, H- 29).
Chất AFL2:
Tương tự AFD2, sau khi sắc ký cột PĐ B và tiến hành SKBM kiểm tra các phân đoạn, để kết tinh thu được tinh thể trắng AFL2, điểm nóng chảy 262 – 2640C; TLC: Rf 0.78 (n-hexan-EtOAc =6:4); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 0,73 (3H, s, H-24), 0,88 (3H, s, H-25), 0,89 (3H, d, J = 2.7 Hz, H-23), 0,96 (3H, s, H- 30), 1,01 (3H, s, H-26), 1,02 (3H, s, H-27), 1,06 (3H, s, H-28), 1,19 (3H, s, H-29), 1,26 (3H, s, H-30), 1,97 (1H, m, H-1a), 2,28 (2H, m, H-2b, H-4), 2,40 (1H, m, H- 2a), 1,29-1,78 (m); Chất AFD3:
Khi giải hấp với hệ n-hexan: EtOAc (85:15) thu được phân đoạn C chứa một cấu tử chính. Tiến hành kết tinh lại nhiều lần bằng EtOAc thu được chất AFD3 dưới dạng chất rắn hình vảy màu trắng; Rf = 0, 43 (TLC, silica gel, n-hexan: EtOAc = 80:20); điểm nóng chảy 276-2800C.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 4;68 (2H, d, J = 32 Hz, H-29); 3,18
(m), 3,02 (m); 2,29(q); 1,96 (d); 1,69 (s, 3H, H-30); 0,76-1,66(m);
Chất AFD6:
Phân đoạn E tiếp tục được phân tách trên cột silicagel bằng hệ dung môi n- hexan: EtOAc = 60:40 và kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được chất bột vô định hình màu vàng. 1H NMR (MeOD, 500MHz) δ 12,89 (1H, s, OH-5); 7,18 (1H, s, H-6’), 6,28 (1H, s, H-3’), 6.31 (1H, s, H-6), 6,08 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-11), 5,45 (1H, br d, J=9.45Hz, H-12), 5,28 (1H, br t, J = 6,5 Hz, H-17), 3,52 (1H, br dd, J = 7,5; 15 Hz, H-16a), 3,44 (1H, br dd, J = 7,5; 15 Hz, H-16b), 1.93 (3H, br s, H3-15), 1.84 (3H, br s, H3-20), 1.69 (6H, br s, H3-14, 19); 2.3.4 Thử hoạt tính các chất đã phân lập
Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các phương pháp đã nêu trong phần 2.2.
Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150µl) có giếng chất nồng độ đầu là 20mg/ml. Tiến hành pha loãng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất thử tiếp theo. Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha loãng về các nồng độ thấp hơn bằng nước cất cho các nồng độ lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml. Sử dụng 10 µl chất thử đã pha loãng cho mỗi giếng thử nghiệm để được các nồng độ 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml.
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính các dịch chiết tổng từ Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Tiến hành ngâm chiết riêng các mẫu (theo phương pháp đã nêu ở phần 2.3), lượng cao chiết mỗi bộ phận thu được như sau:
Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết các bộ phận cây mẫu
STT Tên mẫu Khối lượng mẫu khô (gam)
Khối lượng cao chiết thu được (gam)
Hiệu suất chiết (%) 1 Vỏ thân 40 2,46 6,15 2 Thân 40 1,30 3,25 3 Rễ 40 1,28 3,20 4 Lá 40 2,65 6,62
Vậy, bộ phận lá và vỏ thân cho hiệu suất chiết cao nhất đạt hơn 6%.
Để lựa chọn bộ phận mẫu có khả năng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tốt, chúng tôi tiến hành các phép thử.
3.1.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng sinh các cao chiết tổng Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Theo tài liệu đã công bố chi Artocarpus phân bố ở các nước trên thế giới có hoạt tính kháng sinh nên chúng tôi tiến hành thử hoạt tính này đối với các bộ phận khác nhau của cây thu hái ở Việt Nam. Theo phương pháp đã được mô tả ở phần 2.2.3.1 chúng tôi đã thu được các kết quả trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao chiết
Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Tên mẫu
Chủng vi sinh vật
IC50 (µg/ml)
Lá Vỏ thân Cành Rễ
Gram
(+)
Lactobacillus fermentum 4,25 91,4 >128 95,09
Bacillus subtilis 3,65 71,62 >128 64,32
Staphylococcus aureus 5,49 20,97 88,80 74,13
Gram (-) Salmonella enterica >128 >128 >128 >128 Escherichia coli >128 >128 >128 >128 Pseudomonas aeruginosa >128 >128 >128 >128 Nấm Candida albican >128 >128 >128 >128
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các mẫu trên các chủng vi sinh vật gram (+), gram (-) và nấm được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy mẫu lá, vỏ thân, cành và rễ đều có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật gram (+) nhưng hầu như không kháng các chủng vi khuẩn gram (–) và nấm kiểm định trên. Trong đó mẫu lá có hoạt tính mạnh nhất thể hiện giá trị IC50 nhỏ nhất với chủng Lactobacillus fermentum,
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus lần lượt là 4,25; 3,65; 5,49 µg/ml. Ngoài ra mẫu vỏ thân cũng cho hoạt tính khá tốt, đặc biệt kháng với chủng Staphylococcus
aureus với giá trị IC50 là 20,97µg/ml.
Các nghiên cứu hoạt tính kháng sinh cao chiết lá, thân, vỏ, rễ của các loài khác trong chi Artocarpus cũng cho phổ kháng sinh tương đối rộng với nhiều chủng vi khuẩn. Như kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng sinh cao chiết nước loài
Artocarpus heterophyllus của Khan và cộng sự ( 2003) cho thấy hoạt tính ức chế của cao chiết với các chủng như S.aureus, E. faecalis, S. typhimurium và E. coli.
Kết quả này chứng minh tác dụng kháng viêm của cây này đã đươc dùng trong y học cổ truyền; góp phần định hướng cho việc sử dụng và khai thác loài như một kháng sinh thực vật chữa các bệnh do vi khuẩn gram (+) gây ra.
3.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống ôxy hoá DPPH
Hoạt tính chống oxy hóa gần đây được quan tâm nhiều hơn bởi nó như một chìa khóa vạn năng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học khác. Các chất chống oxy hóa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, và một số chất trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được bổ sung vào dược phẩm và thực phẩm chức năng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, phòng và điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung thư….Các chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng do đặc
điểm lý hóa của chúng như thân thiện với cơ thể, bền nhiệt … các chất này thường có bản chất là các polyphenon. Theo như tài liệu đã công bố, chi Mít rất giàu polyphenon và cũng có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao. Do vậy chúng tôi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mới có nguồn gốc thực vật. DPPH là gốc tự do có màu tím hấp thụ
