Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro cho kết quả chính xác cao và thời gian thực hiện tương đối ngắn. Ở phần tiếp theo, chúng tôi sẽ đề cập đến những phép thử phổ biến nhất.
1.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro:
Có nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro. Có thể phân loại các phương pháp này bằng kỹ thuật đưa chất thử vào hệ thử [5].
Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc:
Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được tẩm vào khoanh giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng chất. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.
Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc:
Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro
(a) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (b) Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc; (c) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng;
(d)Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng
Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng:
Nguyên tắc của phương pháp là dùng hang loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ khác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của
vi khuẩn. Nồng độ này được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal inhibitory concentration). Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp hoặc phương pháp hệ nồng độ.
Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth microtitre technique)
Phương pháp này, về nguyên tắc, chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp, nhưng phải có dàn máy ELISA ( Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ thông thường ở chỗ:
•Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm.
•Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khác nhau của chất thử còn ở đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng.
•Kỹ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ thị TTC), nhưng ở đây, được xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng 492 nm của dàn máy ELISA.
Phương pháp sinh tự ký ( Bioautography)
Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự
Phương pháp này sử dụng khi đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần nào trong dược liệu này có tác dụng.
Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sử dụng môi trường đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản mỏng, tiến hành láng môi trường thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h để xác định vùng vết chất làm vi khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụng kháng khuẩn. Để phát hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC (Triphenyl tetrazolium Chloride)
1.4.2 Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào
Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
Phương pháp MTT:
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp
chí Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào.
Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.
1.4.3. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của chất:
Oxy không thể thiếu với sự sống, khi đi vào cơ thể, oxy tham gia nhiều quá trình sinh hóa học. Trong quá trình đó, chúng tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là gốc tự do. Các gốc này có thể gây hại cho sức khỏe, do đó trong cơ thể cần thiết duy trì sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa. Đó là trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi. Tuy nhiên, do nhiều tác động, cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng dạng oxy hoạt động. Vì vậy việc bổ sung vào cơ thể các dạng chất chống oxy hóa là cần thiết.
Để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một số phương pháp sau:
Phương pháp sử dụng DPPH
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước song λ = 517nm.
Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II
Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện
qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II và 2,2’-bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II).
Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2*-
Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2*
-
. Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức chất có màu tím được đo ở bước song λ = 550nm. Hoạt tính của mẫu thử được thể hiện qua việc giảm sự hình thành phức màu tím.
Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H2O2
Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2*-
và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể nhưng nếu hiện điện ở nồng độ cao chúng sẽ tạo ra 1
O2 ,*OH là phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase ).
Chương 2 - THỰC NGHIỆM 2.1. Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất
2.1.1 Mẫu thực vật
Mẫu thực vật loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu thu tại khu Bảo tồn thiên nhiên Copia, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La vào tháng 6 năm 2010. Số hiệu mẫu PVT 419. Tiêu bản do TS. Nguyễn Tiến Hiệp định tên và được lưu giữ tại Phòng tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
Mẫu lá, cành, rễ và vỏ thân sau khi thu được phơi trong bóng râm và xử lý sơ bộ trước khi tách chiết.
2.1.2 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 Merk, độ dày 0,2mmm.
Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 0,063- 0,1 mm Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 0,040- 0,063 mm. Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.
Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4) (thành phần); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanilin 1,2g; MeOH 200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)
Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance 500MHz viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.
2.1.3 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học
Các môi trường nuôi cấy Merk: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud Dextro Broth), SDA (Sabouraud Dextro Agar) cho nấm.
Chất tham khảo (Sigma) sử dụng trong phép thử hoạt tính kháng sinh: kháng sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng Escherichia coli; kháng sinh streptomycin cho chủng Pseudomonas aeruginosa; kháng sinh amphotericin B cho nấm.
Môi trường nuôi cấy tế bào: môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1; huyết thanh bò FBS
Chất tham khảo Ellipticine (Sigma) trong phép thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư.
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH): chất tạo ra gốc tự do Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170);
Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C;
Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan);
Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiết tách
Mẫu cành, vỏ thân, rễ và lá cây Mít lá đen được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 400C, xay nhỏ và chiết riêng biệt từng loại nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol. Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc và loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết MeOH.
Cao chiết MeOH được chiết lại lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclometan, etyl axetat. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết tương ứng.
Phân lập các cao chiết nhận được bằng phương pháp sắc ký cột thường, sắc ký cột nhanh với các dung môi thích hợp.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H- COSY).
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người do ATCC cung cấp:
- Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử,
thường không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết
thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩn mủ xanh,
gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi
ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
- Lactobacillus fermentum (Lp B14: )gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
- Enterococcus faecium (B650): gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.
Phương pháp tiến hành: thực hiện dựa trên phương pháp vi định lượng trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế
- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ là 128 µg/ml, 32 µg/ml, 8µg/ml, 2µg/ml, 0,5µg/ml
- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml khi tiến hành thử.
- Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng (+) kháng sinh được pha trong nước cất theo nồng độ 10mg/ml và khử trùng bằng màng lọc Millipore 0,22µm; tiến hành các bước thì nghiệm tiếp theo tương tự như các chất thử khác . Mẫu đối chứng (-) chất thử được thay thế bằng nước cất vô trùng.
- Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN bước sóng λ = 492nm và phần mềm raw data
Thí nghiệm được lặp lại với n = 3
2.2.3.2 Phương pháp thửđộc tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:
- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được
sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.
- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan. - LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.
- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.
Phương pháp thử độ độc tế bào: được Viện Ung thư Quốc ga Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
Thử độc tế bào:
- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml. Bổ xung 200µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200
µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.