nghiên cứu thành phần hóa học cây cỏ mực (eclipta prostrata l., asteraceae

Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu phân lập sắc ký và xác định cấu trúc các thành phần hóa học đặc biệt là các hợp chất phân cực từ phần trên mặt đất của cây Cỏ mực của Việt Nam.. 16

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC

(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC

(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)

Chuyên ngành: Hóa Học Hữu Cơ

Mã số: 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS Phan Minh Giang

Hà Nội – 2011

7

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU …….1

Chương 1: TỔNG QUAN …….2

1.1 Khái quát về Eclipta prostrata L (syn Eclipta alba L.) (Asteraceae) …….2

1.1.1 Đặc điểm thực vật …….2

1.1.2 Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam …….3

1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata …….3

1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần …….8

Chương 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU … 11

2.1 Nhiệm vụ của Luận văn … 11

2.2 Phương pháp nghiên cứu … 11

2.2.1 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất.11 2.2.2 Các phương pháp xác định cấu trúc … 14

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN … 14

3.1 Đối tượng nghiên cứu … 14

3.2 Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực … 14

3.3 Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực … 15

3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực … 15

3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1) … 16

3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2) … 16

3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3) … 16

3.3.5 Phân tách phần chiết nước (EA4) … 17

3.4 Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP)……….19

3.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP) … 19

3.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (EP2)……….19

3.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EP3) … 19

8

3.4.4 Phân tách phần chiết nước (EP4) … 20

3.5 Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập … 22

Chương 4: THỰC NGHIỆM … 31

4.1 Thiết bị và hóa chất … 31

4.2 Đối tượng nghiên cứu … 32

4.3 Điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực … 32

4.4 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EA………32

4.4.1 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1) … 32

4.4.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2) … 34

4.4.3 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3) … 34

4.4.4 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nước (EA4) … 34

4.5 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EP … 35

4.5.1 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2) … 35

4.5.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3) … 36

4.5.3 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nước (EP4) … 36

4.6 Phân tách sắc ký các phần chiết EA … 37

4.6.1 Phần chiết n-hexan (EA1) … 37

4.6.2 Phần chiết điclometan (EA2) … 38

4.6.3 Phần chiết etyl axetat (EA3) … 38

4.6.4 Phần chiết nước (EA4) … 39

4.7 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập từ EA … 39

4.8 Phân tách sắc ký các phần chiết EP … 40

4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2) … 40

4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3) … 41

4.8.3 Phần chiết nước (EP4) … 41

4.9 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập từ EP…… 42

KẾT LUẬN … 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO … 46

4

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng

CC (Column Chromatography): Sắc kí cột thường

FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh

Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế

DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT

ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi điện tử

5

MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ

Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)

Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực

Bảng 2: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1)

Bảng 3: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2)

Bảng 4: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3)

Bảng 5: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EA4) Bảng 6: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2)

Bảng 7: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)

Bảng 8: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EP4)

Sơ đồ 1: Chiết và phân tách sắc ký phần thân cây Cỏ mực (EA)

Sơ đồ 2: Chiết và phân tách sắc ký phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP)

6

MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của Metyl gallat (II)

Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR và DEPT của Metyl gallat (II)

Phụ lục 3: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin I (III)

Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin I (III)

Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin I (III)

Phụ lục 6: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin II (IV)

Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin II (IV)

Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin II (IV)

Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của Norwedelolacton (V)

Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR và DEPT của Norwedelolacton (V)

Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của Hesperidin (VI)

Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR và DEPT của Hesperidin (VI)

9

LỜI MỞ ĐẦU

Trong các nghiên cứu y dược hiện đại các hợp chất thiên nhiên từ các cây thuốc bao gồm các flavonoit, tecpenoit và ancoloit tiếp tục là nguồn cung cấp các

hợp chất có tiềm năng cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học Eclipta prostrata L.,

syn Eclipta alba L (Asteraceae) là cây thuốc dùng phổ biến trong Y học cổ truyền

Việt Nam và một số nước trên thế giới Các nghiên cứu hóa học các loài Eclipta

prostrata của Trung Quốc, Nhật Bản và Ấn Độ đã xác định được các nhóm hợp

chất tritecpen (oleanan và taraxastan) glycozit, các flavonoit, các coumarin, các

ancaloit-steroit và các thiophen polyacetylen trong các bộ phận của cây Eclipta

prostrata Dựa trên các kiến thức dược lý học dân tộc và các hoạt tính sinh học của

các phần chiết nhiều hoạt chất có tác dụng chống ung thư, kháng viêm và chống

HIV của các chất được phân lập từ Eclipta prostrata đã được phát hiện

Sự đa dạng về các nhóm cấu trúc lý thú của Eclipta prostrata, sự tương quan

của các cấu trúc này với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng và ý nghĩa khoa học và

thực tiễn của việc đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc Cỏ mực (Eclipta

prostrata L., Asteraceae) của Việt Nam đã thúc đẩy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu

một cách hệ thống về hóa thực vật của cây Cỏ mực Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu phân lập sắc ký và xác định cấu trúc các thành phần hóa học đặc biệt là các hợp chất phân cực từ phần trên mặt đất của cây Cỏ mực của Việt Nam Các kết quả nghiên cứu theo hướng này sẽ là các bước đầu tiên trong các chương trình hiện đại hóa Y học cổ truyền Việt Nam Các hợp chất phân cực chưa được xác định trong một số nghiên cứu trước đã được phân lập trong nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sắc ký hiện đại

trong họ này được chia thành 13 tông Chỉ có một trong số 13 tông này là Lactuceae, có

thể là có đủ khác biệt để có thể coi là một phân họ (phân họ Cichorioideae), các tông còn lại, phần lớn là chồng ghép lẫn nhau, được đưa vào phân họ Asteroideae

Các loài thuộc về họ Cúc có các đặc trưng sau: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính, tức là với các nhị hoa kết hợp lại với nhau tại các gờ của chúng bởi các bao phấn, tạo thành ống, bầu nhụy với sự phân bổ cơ bản của các noãn hoa, các noãn hoa trên một bầu nhụy, mào lông (chùm lông trên quả), quả là loại quả

bế (tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín)

Eclipta prostrata L (syn Eclipta alba L.), họ Cúc (Asteraceae), có tên thông dụng

ở Việt Nam là Cỏ mực, Cỏ nhọ nồi, Nhọ nồi, hạn liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo

Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)

11

Cỏ mực thuộc loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa Thân màu lục hay màu nâu nhạt hay hơi đỏ tía Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5  1,2 cm Mép lá nguyên hay

có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa Qủa bế dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát

1.1.2 Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam [1]

Cỏ mực được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu cam, đái ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết loét, bị thương, chảy máu, viêm da Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau

dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc

Cách dùng: dùng tươi hay giã lấy nước uống, hoặc sao cháy đen với liều

15-30 g sắc uống Dùng riêng hoặc phối hợp với ngó sen, lá trắc bá Trong trường hợp sát trùng cũng dùng sắc uống hoặc giã tươi lấy nước uống, bã đắp Có thể dùng tươi xoa tay chữa rát do vôi, chữa nấm ngoài da và nhuộm tóc có màu tím đen

Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt, mỗi ngày 1-3 ống (2 ml) Có nơi đã sản xuất thành công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu

1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata

Năm 1966: F Bolhman và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức)

đã phân lập từ lá khô Eclipta alba 2 dẫn xuất thiophen 1 và 2 và polyacetylen 3 [5]

1

S

(C C) 2 CH=CH 2

H 3 C-C C

12

Sau đó năm 1966, N R Krishnaswamy và cộng sự (Đại học Delhi, Ấn Độ)

đã xác định được cấu trúc của một polythienyl, α-terthienyl methanol (4) từ Eclipta

alba [5]

4

Năm 1985: P Sing và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức) đã

phân lập được một thành phần dithienyl acetylen (5) từ rễ và phần trên mặt đất cây

Eclipta erecta (một tên gọi khác của Eclipta prostrata) [10]

5

Phân tách sắc kí cột phần trên mặt đất và rễ cây Eclipta erecta cho một hợp

chất dithienyl acetylen, 5-isovalennyloxymetylen-2-(4-isovalennyloxy-but-3-inyl)

dithiophen (6) và 5-angeloyloxy-methylen-2-(but-3-en-1-ynyl)-dithiophen (7); stigmasterol (8) và sitosterol (9) là các thành phần từ phần trên mặt đất [8]

Năm 1985: T R Govindachari và M S Premila đã phân lập từ Eclipta alba

wedelolacton (10), norwedelolacton (11) và axit norwedelic (axit

HO OH HO

HO

ValH2C C CCH2CH2OVal

13

Năm 1992: P Sihgh và S Bhagrava (Đại học Rajasthan, Ấn Độ) đã phân lập

được một hợp chất từ phần rễ Eclipta erecta [9]

13

Năm 1997: S Yahara và cộng sự (Đại học Kumamoto, Nhật Bản) đã phân

lập từ cây khô Eclipta alba ở Trung Quốc bốn taraxastan triterpen glycozit, các

eclalbasaponin VII-IX (14-17) cùng với các eclalbasaponin I-VI Cấu trúc của các

eclalbasaponin đã xác định được là 3β,20β,16β- và 3β,20β,28-trihydroxytaraxastan

glycozit và các saponin sulfat của chúng [15]

Năm 1998: M S Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã

phân lập từ phần chiết metanol Eclipta alba tám hoạt chất ancaloit có khung steroit

18-25 Ancaloid chính được phân lập là

(20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22(N)-dien-3β-ol (verazin, 20); và các hợp chất khác là dehydroverazin (18), 20-epi-verazin (19), ecliptabin (21), 20-epi-4β-hydroxyverazin (22), 4β-hydroxylverazin (23), 20-epi-25β-hydroxyverazin (24) và 25β-

Năm 2008: M K Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã

phân lập được một flavonoit, diosmetin (26) và hai isoflavonoit, hydroxybiochanin (27) và 3-O-methylorobol (28) từ phần chiết metanol Eclipta

15

Năm 2008: M K Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã

phân lập từ dịch chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata năm oleanan

tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) [6]

29 30 R1=H, R2=GlC

31 R1=H, R2=H

32 R1=GlC, R2=GlC

33 R1=SO3, R2=H

Năm 2011: Sáu hợp chất đã được S Tewtrakul và cộng sự (Đại học Prince of

Songkla, Thái Lan) phân lập từ Eclipta prostrata là

hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl tiglat (34), hydroxymethy-(2,2:5,2)-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl angelat (35),

5-hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và

16

1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần

1.3.1 Hoạt tính ức chế HIV-1 của các terthienyl, orobol và wedelolacton

Sáu hợp chất đã được phân lập từ phần chiết toàn cây Eclipta prostrata trong

một nghiên cứu phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học trong thử nghiệm ức chế enzym HIV-1 integrase (IN) [12] Các hợp chất này đã được xác định là 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-

terthyenyl angelat (35), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và wedelolacton (39) Wedelolacton (39) đã được xác định là có

hoạt tính mạnh nhất đối với HIV-1 IN với IC50 là 4,0 ± 0,2 µm, tiếp đó là hợp chất

38 (IC50 = 8,1 ± 0,5 µm), các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính với IC50 >

100 µm Đối với hoạt tính ức chế HIV-1 protease (PR) hợp chất 34 thể hiện hoạt

tính chống lại HIV-1 PR với IC50 = 58,3 ± 0.8 µm, hợp chất 37 (IC50 = 83,3 ± 1.6

µm) và hợp chất 36 (IC50 = 93,7 ± 0,8 µm) trong khi các hợp chất 33, 38 và 39

không thể hiện hoạt tính (IC50 > 100 µm) Các tác dụng ức chế HIV-1 IN của wedelolacton, một dẫn xuất coumarin và orobol, một dẫn xuất isoflavon là các hoạt tính đáng chú ý của nghiên cứu này

HO

O

HO OCH3

17

1.3.2 Hoạt tính kháng viêm của các terthienyl, orobol và wedelolacton

Phần chiết toàn cây Eclipta prostrata và các hợp chất terthienyl,

terthienyl tiglat (34), terthienyl angelat (35), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl acetat (36), ecliptal (37) cùng với falvonoit orobol (38) và coumestan wedelolacton (39) được phân lập

5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-từ cây này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trong nghiên cứu ức chế sự sản sinh nitơ oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và TNF-α trong các tế bào

RAW264.7 gây bởi lipopolisaccarit (LPS) [13] Orobol (38) đã được phát hiện là có

hoạt tính mạnh nhất với NO ở IC50 = 4,6 µm, các hợp chất 34, 35 và 37 cho các giá

trị IC50 lần lượt là 12,7, 14,9 và 19,1 µm Hợp chất 38 ức chế PGE2 với IC50 = 49,6

µm trong khi không có hoạt tính với TNF-α với IC50 > 100 µm Cơ chế tác dụng của orbol đã được xác định là ức chế enzym iNOs và sự biểu hiện của COX-2 mRNA

1.3.3 Hoạt tính kháng nấm của các ancaloit khung steroit

Các hợp chất ancaloit khung steroit (18-25) được phân lập từ lá cây Eclipta

alba ở Suriname đã được thử nghiệm với bốn chủng vi nấm Saccharomyces

cerevisiae và một chủng vi nấm Candida albicans [2] Các hợp chất 19-21 và 25 có

hoạt tính kháng nấm mạnh nhất Hợp chất 25 có khả năng kháng nấm Candida

albicans và giá trị MIC của hợp chất này (< 3,1 g/ml) chỉ hơi yếu hơn các thuốc kháng nấm đang được sử dụng lâm sàng là amphotericin B và ketoconazole Các chất còn lại có khả năng yếu chống tế bào độc hại M-109 Các hợp chất này được xác định là có hoạt tính chủ yếu là kháng nấm do thử nghiệm hoạt tính gây độc dòng tế bào M-109 của tất cả các hợp chất này đều cho giá trị IC50 > 10 g/ml

1.3.4 Hoạt tính chống tăng sinh của các tritecpenoit

Phần chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata đã được phân lập theo định hướng hoạt tính chống tăng sinh của các tế bào HS (Hepatic Stellate) in

vitro [5] Các tế bào HS được biết đến là có vai trò chìa khóa trong sự phát sinh

bệnh xơ hóa Năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) đã được phân lập Axit echinocystic và

18

eclalbasaponin II đã được phát hiện là có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh của các tế bào HS Nghiên cứu đã cho thấy nhóm axit cacboxylic tự do ở vị trí C-28 của các dẫn xuất glycozit của axit echinocystic đối với hoạt tính chống u xơ Trên cơ sở

nghiên cứu này hoạt tính chống u xơ của Eclipta prostrata và các tritecpenoit thành

phần có thể cho giả thiết về triển vọng điều trị sự u xơ gan

19

Chương 2:

NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nhiệm vụ của luận văn

Đối tượng nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất cây Cỏ

mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae), một cây thuốc phổ biến trong y học cổ

truyền Việt Nam và trên thế giới Mặc dù đã có một số nghiên cứu được công bố

trên thế giới về các hợp chất hữu cơ từ cây Eclipta prostrata cho đến này chưa có

các nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học cây thuốc này của Việt Nam, đặc biệt là về các hợp chất phân cực Tiếp tục các hướng nghiên cứu hóa thực vật của

thế giới về E prostrata, Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu các qui trình phân

tách sắc ký đặc biệt là đối với các hợp chất phân cực, phân lập các hợp chất thành phần và xác định cấu trúc của chúng bằng các phương pháp phổ

Các nhiệm vụ được đưa ra trong Luận văn này là:

- Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Cỏ

mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae);

- Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác định các hệ dung môi sắc ký điều chế thích hợp với chất hấp phụ silica gel;

- Phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất thành phần chính đặc biệt là các hợp chất phân cực bằng các phương pháp sắc ký điều chế;

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập bằng phương pháp phổ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Sắc kí lớp mỏng (TLC)

Sắc kí lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp chất, định hướng phân tách sắc ký, kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập sắc

ký, đặc trưng các hợp chất (TLC so sánh và co-TLC) và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất được phân lập

Sắc kí cột thường (CC)

20

Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi và được

sử dụng để phân tách các phần chiết phân lập các hợp chất thiên nhiên Sắc ký cột

CC được thực hiện trên silica gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ

Sắc kí cột (CC) gradient trên nhựa polyme pha đảo có kích thước lỗ cao Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản) theo cơ chế sắc ký phân bố được

sử dụng để phân tách sơ bộ các hợp chất phân cực trong phần chiết nước

Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE)

Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE) được sử dụng để tinh chế các hợp chất phân cực Chiết pha rắn trên pha đảo là quá trình chuyển chất tan (chất cần phân tích) từ pha lỏng sang pha rắn Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích Pha rắn là loại chất hấp phụ kỵ nước kiểu silica biến cải (C-18)

có kích thước 40 µm với đường kính lỗ xấp xỉ 60 Ao liên kết với nhóm octadecylsilan, pha động là dung môi phân cực thường là MeOH-H2O

Sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC)

Sắc ký cột loại trừ theo kích thước được thực hiện theo chế độ CC dưới trọng lực của dung môi với chất hấp phụ cho sắc ký là Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100 µm) Sắc kí cột loại trừ theo kích thước phân tử được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic

Các kỹ thuật phổ được sử dụng trong Luận văn:

Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS);

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR);

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT

22

Chương 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu cho nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất

của cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) dùng làm thuốc được thu mua ở

Gia Lâm, Hà Nội

Mẫu được lấy làm hai lần:

Lần 1 vào tháng 4 năm 2009: nguyên liệu là phần thân được tách khỏi lá Lần 2 vào tháng 6 năm 2010: nguyên liệu là cả phần trên mặt đất

Các kết quả nghiên cứu sơ bộ phần trên mặt đất mẫu cây Cỏ mực được thu thập lần 1 cho thấy:

1) Các thành phần hóa học của phần lá và phần thân cây Cỏ mực có nhiều chất giống nhau qua phân tích TLC;

2) Các phần ít phân cực chứa chủ yếu là các sterol;

3) Có khả năng phân tách tiếp các hợp chất phân cực hơn từ phần trên mặt đất Phần trên mặt đất có thể là bộ phận chứa nhiều hoạt chất của cây thuốc này

do đó phần trên mặt đất cây Cỏ mực đã được thu thập lần 2 cho một nghiên cứu hệ thống về các hợp chất phân cực trong cây Cỏ mực

3.2 Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực

Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp chất hữu cơ thuộc các lớp chất hữu cơ mong muốn Trong Luận văn này nhằm đạt được sự làm giàu sơ bộ các hợp chất theo độ phân cực trong các phân chiết riêng biệt, nguyên liệu cây Cỏ mực được xử lý theo một qui trình chiết và phân tách hai pha lỏng chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần

Chiết hai pha rắn-lỏng: Bột nguyên liệu cây Cỏ mực (lần 1: phần thân

(phần trên mặt đất được tách lá); lần 2: phần trên mặt đất) được ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần trong 4 ngày) Các dịch chiết metanol được lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 50 oC thu được phần chiết metanol

23

Phân tách hai pha lỏng: Để phân tách các hợp chất có trong phần chiết

metanol phần chiết này được hòa với nước cất cho một dịch nước của phần chiết

metanol Chiết dịch nước này với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, điclometan và etyl axetat cho các dịch chiết trong n-hexan, điclometan và etyl

axetat Cất loại kiệt dung môi các dịch chiết, thu được các phần chiết hữu cơ tương ứng Dịch chiết nước còn lại được cô kiệt dưới áp suất giảm cho phần chiết nước

Qui trình này phân tách các hợp chất trong phần trên mặt đất cây Cỏ mực

thành nhóm các hợp chất ít phân cực trong các phần chiết n-hexan và điclometan,

nhóm các hợp chất phân cực trung bình trong phần chiết etyl axetat và nhóm các hợp chất phân cực trong phần chiết nước

Qui trình điều chế các phần chiết từ thân (EA) và phần trên mặt đất (EP) cây

Cỏ mực đượctrình bày tóm tắt trong các Sơ đồ 1 và Sơ đồ 2

Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực được trình bày trong Bảng 1

Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân cây Cỏ mực

3.3 Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực

3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực

Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60F254

(TLC, Merck) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton cho các phần chiết ít phân cực (n-hexan và điclometan) và hệ ba dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic

cho phần chiết phân cực hơn etyl axetat

Sự phân giải trên sắc kí lớp mỏng cho thấy phân tách sắc kí cột các phần chiết này cần được thực hiện với sự rửa giải gradient

24

3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1)

Phần chiết n-hexan (EA1) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên

silica gel với các hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1

Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA1 theo độ phân cực từ

EA1.1 đến EA1.4 hexan-axeton 19:1), EA1.5 hexan-axeton 9:1), EA1.6

axeton 6:1), EA1.7 và EA1.8 (n-axeton 3:1) và EA1.9

3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2)

Phần chiết điclometan (EA2) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient

trên silica gel với các hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton 6:1, 3:1, 2:1 và 1:1

Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA2 theo độ phân

cực, từ EA2.1 đến EA2.4 (n-hexan-axeton 6:1), EA2.5 và EA2.6 (n-hexan-axeton 3:1), EA2.7 và EA2.8 (n-hexan-axeton 2:1) và EA2.9 (n-hexan-axeton 1:1)

Nhóm phân đoạn EA2.1 và EA2.2 (hexaaxeton 6:1) được rửa bằng hexan cho β-sitosterol (I) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng

n-3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3)

Phần chiết etyl axetat (EA3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient

trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1 và 10:19:1

Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA3 theo độ phân cực thành

2 nhóm phân đoạn từ EA3.1 đến EA3.6 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1) và từ

EA3.7 đến EA3.10 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 10:19:1)

Nhóm phân đoạn EA3.3 được phân tách sắc kí cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH cho 5 nhóm phân đoạn từ EA3.3.1 đến EA3.3.5.Các nhóm phân đoạn EA3.3.1, EA3.3.2 và EA3.3.3 được rửa bằng điclometan cho metyl gallat (chất II) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng

25

3.3.5 Phân tách phần chiết nước (EAT4)

Phần chiết nước (EA4) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên

polime pha đảo Diaion HP-20 với gradient MeOH-H2O thành 5 phân đoạn EA4.1

(H2O), EA4.2 (20% MeOH), EA4.3 (40% MeOH), EA4.4 (60% MeOH) và EA4.5

(MeOH)

Phân đoạn 60% MeOH-H2O (EA4.4) được phân tách sắc kí cột Sephadex

LH-20 với dung MeOH, sau đó bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1 cho saponin tritecpenoit eclalbasaponin I (chất

III) Chất này còn được phân lập từ phân đoạn MeOH (EA4.5) qua phân tách sắc kí

cột (CC) trên silica gel với các hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1

Quy trình chiết và phân tách phần thân cây Eclipta prostrata (EA) được trình

bày trên Sơ đồ 1

1 Ngâm với MeOH ở nhiệt độ phòng

2 Chiết với n-hexan, điclometan, etyl axetat

fomic cho phần chiết phân cực hơn etyl axetat

Sự phân giải trên sắc kí lớp mỏng cho thấy phân tách sắc kí cột các phần chiết này cần được thực hiện với sự rửa giải gradient

3.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (EP2)

Phần chiết điclometan (EP2) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient

trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 thành 12

nhóm phân đoạn: EP2.1 (phân đoạn 1-3), EP2.2 (phân đoạn 4-13), EP2.3 (phân đoạn 14-15), EP2.4 (phân đoạn 16-24), EP2.5 (phân đoạn 25-30), EP2.6 (phân đoạn 31-36), EP2.7 (phân đoạn 37-42), EP2.8 (phân đoạn 43-48), EP2.9 (phân đoạn 49-51), EP2.10 (phân đoạn 52-60), EP2.11 (phân đoạn 61-62) và EP2.12

(phân đoạn 63-66)

Nhóm phân đoạn EP2.2 được rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (chất I)

Nhóm phân đoạn EP2.11 được phân tách bằng cột chiết pha rắn SPE RP-18

với hệ dung môi MeOH-H2O 70%, chất nhận được được rửa bằng hệ dung môi

n-hexan-axeton 1:1 cho saponin tritecpenoit eclalbasaponin II (chất IV) Chất này cũng nhận được từ phân đoạn EP2.12 sau khi phân đoạn này được tinh chế bằng

cách chiết pha rắn SPE RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O 70%

3.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EP3)

Phần chiết etyl axetat (EP3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient

trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1 và 10:20:1 thành

10 nhóm phân đoạn: EP3.1 (phân đoạn 1-2), EP3.2 (phân đoạn 3-4), EP3.3 (phân đoạn 5-6), EP3.4 (phân đoạn 7-11), EP3.5 (phân đoạn 12-15), EP3.6 (phân đoạn

28

16-17), EP3.7 (phân đoạn 18-22), EP3.8 (phân đoạn 23-27), EP3.9 (phân đoạn 35) và EP3.10 (phân đoạn 35-37)

28-Các nhóm phân đoạn EP3.7, EP3.8 và EP3.9 được phân tách sắc kí cột

Sephadex LH-20 với dung môi MeOH sau đó được rửa bằng hệ dung môi

n-hexan-axeton 1:1 cho eclalbasaponin II (IV) đã phân lập được từ phần chiết điclometan (EP2)

Nhóm phân đoạn EP3.10 được rửa bằng dung môi MeOH cho chất flavonoit glycozit hesperidin (chất VI)

3.4.4 Phân tách phần chiết nước (EP4)

Phần chiết nước (EP4) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên

nhưa polyme pha đảo Diaion HP-20 với gradient MeOH-H2O thành 4 phân đoạn:

EP4.1 (20%MeOH), EP4.2 (40%), EP4.3 (60%) và EP4.4 (MeOH)

Phân đoạn EP4.2 được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các

hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1, 6:1 và 3:1 Phân đoạn EP4.2.4 được tinh chế

bằng Mini-C trên silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O 8:2:0,2 và 7:3:0,5

thu được norwedelolacton (chất V)

Phân đoạn EP4.3 được tách bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các hệ

dung môi CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1, 6:1, 3:1 và rửa bằng MeOH cho hesperidin (VI)

đã được xác định từ phần chiết etyl axetat (EP3)

Quy trình chiết và phân tách phần trên mặt đất cây Eclipta prostrata (EP)

được trình bày trên Sơ đồ 2

1 CC, silica gel, CH 2 Cl 2 -MeOH 15:1, 9:1, 6:1, 3:1

2 CC, silica gel, CH2Cl2-MeOH-H2O 8:2:0,2 và 7:3:0,5

1 Ngâm với MeOH ở nhiệt độ phòng

2 Chiết với n-hexan, điclometan, etyl axetat

nước

30

3.5 Xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập

Các phần chiết ít phân cực n-hexan (EA1) và điclometan (EA2) từ nguyên liệu thân (EA) cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) được phân tách gradient với hệ dung môi n-hexan-axeton cho thành phần chính β-sitosterol (I)

Phần chiết etyl axetat (EA3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient

trên silica gel với hệ ba dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH trong một qui trình

phân tách các hợp chất phenolic từ thực vật cho metyl gallat (II)

Một qui trình phân tách các hợp chất phân cực sử dụng kết hợp Diaion

HP-20 và silica gel đã được áp dụng cho phần chiết nước (EA4) để phân lập được saponin tritecpenoit eclalbasaponin I (III)

Các phân tích TLC cho thấy sự tương đối trùng lặp giữa các thành phần của các phần chiết thân và lá cây Cỏ mực (được tách từ phần trên mặt đất) của mẫu lấy vào tháng 4 năm 2009 (lần 1) Do đó để có thể nghiên cứu hệ thống hơn các hợp

chất phân cực từ cây Cỏ mực nguyên liệu phần trên mặt đất (EP) của cây Cỏ mực

đã được thu mua vào tháng 6 năm 2010 (lần 2) Nguyên liệu này đã được nghiên cứu theo các qui trình chiết, phân tách và phân lập tương tự Kết quả là ngoài các

hợp chất β-sitosterol (I) được phát hiện trong các phần chiết ít phân cực n-hexan

(EP1) và điclometan (EP2) các hợp chất eclalbasaponin II (IV) và norwedelolacton (V) đã được phân lập được từ phần chiết etyl axetat (EP3) và hesperidin (VI) từ phần chiết nước (EP4) Một lượng saponin tritecpenoit eclalbasaponin II (IV) cũng

đã được phân lập từ phần chiết điclometan (EP2) sau khi các nhóm phân đoạn phân

cực nhất được phân tách trên pha đảo RP-18

β-Sitosterol (chất I)

Hợp chất I được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim không màu, Rf = 0,38

(TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử

vanilin/H2SO4 đặc 1%

31

Chất I được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở so sánh TLC và co-TLC với

chất chuẩn β-sitosterol

Metyl gallat (chất II)

Hợp chất II được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,70

(TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat-axit fomic 10:10:1, v/v/v), vệt chất hiện màu

vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%, hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl35%

Phổ 1H-NMR (CD3OD) của II cho thấy sự có mặt của hai nhóm tín hiệu

cộng hưởng từ proton, trong đó tín hiệu ở δH 3,83 (3H, s) của 3 proton của một

nhóm metoxy và tín hiệu ở δH 7,06 (2H, s) của 2 proton vòng thơm tương đương

Phổ 13C-NMR và DEPT (CD3OD) của II chỉ ra sự có mặt của các nhóm sau:

một nhóm cacbonyl este ở δC 169,1 (s), 4 cacbon sp2 (4C) của một vòng benzen thế

4 lần trong đó có có 3 cacbon liên kết với oxi [δC 146,5 (s), 139,8 (2  s) và 121,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13

14 1516 17 18

19

20 21

22 23

24 25 26

27

28 29

II

32

(s)] và 2 nhóm metin sp2 (2CH) của vòng benzen thế [δC 110,1 (2  d)] và một

nhóm metoxy ở δC 52,3 (q)

Các dữ kiện phổ NMR cho thấy II có cấu trúc của metyl gallat phù hợp với

các dữ kiện phổ của chất chuẩn metyl gallat

Eclalbasaponin I (chất III)

Hợp chất III được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,66 (TLC, silica gel, CH2Cl2-MeOH 2:1, v/v), vệt chất hiện màu đen với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%

Phổ ESI-MS (+) của III cho pic giả ion phân tử ở m/z 819,2 ([M + Na]+) cho giả thiết về một công thức phân tử C42H68O14 của chất III

Phổ 1H-NMR (CD3OD) của III cho thấy sự có mặt của 7 nhóm metyl bậc ba

dưới dạng singlet (7s) ở δH 0,80, 0,86, 0,89, 0,97, 0,98, 1,07 và 1,38; một nhóm

oxymetin ở δH 3,0 (1H, dd, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz), một proton olefinic của một nối đôi thế ba lần ở δH 5,33 (1H, t, J = 3,0 Hz) và hai proton anomeric của 2 nhóm glucopyranosyl ở δH 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,36 (1H, d, J = 8,0 Hz)

Phổ 13C-NMR và DEPT (CD3OD) của III bao gồm 42 cacbon trong số đó có

30 cacbon của một khung tritecpenoit và 12 cacbon của 2 nhóm glucopyranosyl

Tritecpenoit sapogenin chứa 7 nhóm metyl (7q) ở δC 33,3, 28,6, 27,3, 25,1, 17,8,

17,0 và 16,1; 9 nhóm metylen (9t) ở δC 47,8, 40,2, 36,4, 36,3, 34,2, 31,6, 27,1, 24,5

1 2 3 4

5 6 7 8 9 10

11

12 13 14 15 16 17 18

19 20 21

22

23 24

33

và 19,3; 5 nhóm metin (5d) ở δC 90,9, 74,0, 57,2, 48,2 và 42,2 trong số đó có 2

nhóm oxymetin (δC 90,9 và 74,0); 6 C bậc bốn (6s) 50,1, 42,7, 40,9, 39,9, 37,9 và

31,3; một nối đôi thế 3 lần ở δC 123,7 (d) và 144,6 (s) và một nhóm cacbonyl este ở

δC 177,3 (s) Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của hai nhóm glucopyranosyl

xuất hiện ở δC 106,7 (d), 78,7 (d), 78,2 (d), 75,7 (d), 71,7 (d) và 62,8 (t) và 95,8 (d), 78,3 (d), 77,7 (d), 74,9 (d), 71,2 (d) và 62,5 (t) Các cấu hình  của 2 nhóm

glucopyranosyl được xác định dựa trên hằng số tương tác (J = 7,5 Hz và 8,0 Hz)

của các proton anomeric Các dữ kiện phổ NMR của chất III xác định một cấu trúc

glycozit của một axit olean-12-en-28-oic Các nhóm -D-glucopyranosyl được giả

thiết là liên kết với C-3 và C-28 dựa vào các giá trị δC-3 và δC-28 và hóa lập thể H-3

đã được xác định nhờ hằng số tương tác J = 14,5 Hz của H-3

Các dữ kiện phổ NMR của chất III hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của

saponin tritecpenoit eclalbasaponin I [12] Hợp chất này đã được phân lập lần đầu

tiên từ cây Eclipta alba của Nhật Bản

Eclalbasaponin II (chất IV)

Hợp chất IV được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,65 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10, v/v/v), vệt chất hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%

1 2 3

4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16

17 18

19 20 21

22

23 24

25 26

27

28 29

34

Phổ ESI-MS (+) của IV cho các pic giả ion phân tử ở m/z 635,3 ([M + H]+)

và 657,0 ([M + Na]+) cho giả thiết về một công thức phân tử C36H58O9 của IV

Phổ 1H-NMR (CD3OD) của IV cho thấy sự có mặt của 7 nhóm metyl bậc ba

dưới dạng singlet (7s) ở δH 0,80, 0,87, 0,90, 0,98, 0,99, 1,08 và 1,39; 2 nhóm

oxymetin ở δH 3,03 (1H, d, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz) và 4,56 (1H, s br); một proton olefinic của một nối đôi thế ba lần ở δH 5,32 (1H, t, J = 3,5 Hz) và một proton anomeric của một nhóm glucopyranosyl ở δH 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz)

Phổ 13C-NMR và DEPT (CD3OD) của IV bao gồm 36 cacbon trong số đó có

30 cacbon của một khung tritecpenoit và 6 cacbon của một nhóm glucopyranosyl

Tritecpenoit sapogenin chứa 7 nhóm metyl (7q) ở δC 33,4, 28,6, 27,3, 24,9, 17,8,

17,0 và 16,1; 9 nhóm metylen (9t) ở δC 47,7, 39,9, 36,6, 36,3, 34,3, 32,6, 27,1, 24,5

và 19,3; 5 nhóm metin (5d) ở δC 90,8, 75,3, 57,2, 48,2 và 42,1 trong số đó có 2

nhóm oxymetin (δC 90,8 và 75,3); 6 C bậc bốn (6s) ở δC 49,8, 42,7, 40,7, 40,2, 37,9

và 31,4; một nối đôi thế 3 lần ở δC 123,5 (d) và 145,1 (s) và một nhóm cacbonyl axit

cacboxylic ở δC 181,5 (s) Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của nhóm

glucopyranosyl xuất hiện ở δC 106,7 (d), 78,3 (d), 77,7 (d), 75,7 (d), 71,7 (d) và 62,9 (t) Cấu hình  của nhóm D-glucopyranosyl được xác định dựa trên hằng số

tương tác (J = 7,5 Hz) của proton anomeric

Sự phù hợp của các dữ kiện phổ NMR thuộc khung tritecpenoit của chất IV

với của eclalbasaponin I (III) và sự xuất hiện của một nhóm axit cacboxylic (δC

181,5) cho thấy nhóm glucopyranosyl duy nhất của IV phải ở vị trí C-3 Trên cơ sở

các phân tích độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác (J = 14,5 Hz và 4,0 Hz)

hóa lập thể ở C-3 và C-16 của hợp chất này phù hợp với của chất eclalbasaponin I

Các dữ kiện phổ này hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của saponin tritecpenoit

eclalbasaponin II [12] Hợp chất này đã được phân lập lần đầu tiên từ cây Eclipta

alba của Nhật Bản Chất này cũng được thông báo là có trong cây Cỏ mực trồng ở

miền Nam [2]