4.5. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EP
4.5.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nước (EP4)
Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254
(Merck), hệ 3 dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10 và CHCl3-MeOH-H2O 7:3:0,5 (EP4.1, EP4.2 và EP4.3). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Kết quả phân tích TLC được trình bày ở Bảng 8.
Bảng 8: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EP4)
Phần chiết Hệ dung môi STT Rf Dạng vệt Hiện màu
EP4.1
EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10
1 0,85 Dẹt Xanh
2 0,68 Dẹt Tím
3 0,34 Dẹt Vàng
CHCl3-MeOH-H2O 7:3:0,5
1 0,65 Dẹt Tím
2 0,34 Dẹt Vàng
EP4.2
EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10
1 0,82 Tròn Xanh
2 0,68 Tròn Vàng
3 0,62 Dẹt Tím
4 0,54 Dẹt Tím
5 0,41 Dẹt Vàng
CHCl3-MeOH-H2O 7:3:0,5
1 0,79 Dẹt Vàng
2 0,63 Dẹt Tím
3 0,26 Dẹt Vàng
EP4.3
EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10
1 0,68 Tròn Vàng
2 0,46 Tròn Vàng
3 0,37 Tròn Tím
CHCl3-MeOH-H2O 7:3:0,5
1 0,85 Dẹt Vàng
2 0,65 Dẹt Tím
4.6. Phân tách sắc ký các phần chiết từ nguyên liệu thân cây 4.6. 1 Phần chiết EA1
Phần chiết n-hexan EA1 (2,7 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 àm), kớch thước cột tỏch 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải với
46
hệ dung môi gradient n-hexan-axeton tỉ lệ 19:1, 9:1, 6:1 và 3:1. Mẫu được đưa lên cột theo phương phỏp tẩm mẫu trờn silica gel (Merck, 63-200 àm).
Các phân đoạn phân tách được thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 9 nhóm phân đoạn: EA1.1 (4 mg), EA1.2 (0,9 g), EA1.3 (0,27 g), EA1.4 (0,12 g), EA1.5 (33 mg), EA1.6 (90 mg), EA1.7 (0,26 g), EA1.8 (0,11 g) và EA1.9 (29 mg).
Các nhóm phân đoạn EA1.2, EA1.4 và EA1.5 được rửa bằng n-hexan cho chất β-sitosterol (EA1.2, EA1.4 và EA1.5) (chất I) (khối lượng tương ứng là 10 mg, 0,11 g và 30 mg) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
4.6.2 Phần chiết EA2
Phần chiết điclometan EA2 (1,3 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 àm), kớch thước cột tỏch 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton tỉ lệ 6:1, 3:1, 2:1 và 1:1. Mẫu được đưa lên cột theo phương phỏp tẩm mẫu trờn silica gel (Merck, 63-200 àm).
Các phân đoạn được tách thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 9 nhóm phân đoạn: EA2.1 (0,1 g), EA2.2 (0,18 g), EA2.3 (63 mg), EA2.4 (56 mg), EA 2.5 (60 mg), EA2.6 (54 mg), EA2.7 (0,11 g), EA2.8 (0,13 g) và EA2.9 (0,53 g).
Các nhóm phân đoạn EA2.1 và EA2.2 được rửa bằng n-hexan cho chất β- sitosterol (EA2.1 và EA2.2) (chất I) (khối lượng 0,27g) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
4.6.3 Phần chiết EA3
Phần chiết etyl axetat EA3 (3,4 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel (Merck cỡ hạt 63-200àm) (kớch thước 3 cm i.d. 20 cm) được nhồi theo phương pháp nhồi cột ướt. Mẫu được đưa lên cột sắc ký CC theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200àm). Cột sắc ký được rửa giải gradient bằng hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1 và 10:19:1, thu được 10 phân đoạn chính từ EA3.1 đến EA3.10 từ các phân đoạn phân tích (20 ml/phân đoạn) qua phân tích TLC.
47
Nhóm phân đoạn EA3.3 được tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex LH-20, rửa giải gradient bằng metanol. Kiểm tra quá trình rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu được 3 nhóm phân đoạn từ EA3.3.1 đến EA3.3.5. Các nhóm phân đoạn EA3.3.1, EA3.3.2 và EA3.3.3 được rửa bằng điclometan, thu được metyl gallat (EA3.3.1, EA3.3.2 và EA3.3.3) (chất II) (khối lượng tương ứng là 10 mg, 0,15 g và 0,13 g) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
4.6.4 Phần chiết nước (EA4)
Phần chiết nước EA4 được phân tách bằng cột Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals) (3 cm i.d. 20 cm), rửa giải bằng gradient H2O, MeOH-H2O 20%, MeOH 40%, MeOH 60% và MeOH. Các phân đoạn được thu theo hệ dung môi rửa giải cho 5 phân đoạn từ EA4.1 đến EA4.5. Các phân đoạn này được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm.
Phân đoạn EA4.4 (60%MeOH-H2O) được chạy sắc ký cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng metanol. Kiểm tra quá trình rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu được 3 nhóm phân đoạn từ EA4.4.1 đến EA4.4.3. Phân đoạn EA4.4.1 được phân tỏch bằng CC (1 cm i.d. x 25 cm) trờn silica gel (40-63àm), hệ dung mụi gradient CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1, 4:1 và 2:1. Kết quả thu được 4 nhóm phân đoạn chính được ký hiệu từ EA4.4.1 đến EA4.4.1.4. Phân đoạn EA4.4.1.2 được rửa nhiều lần bằng điclometan thu được chất eclalbasaponin I (EA4.4.1.2) (chất III) (khối lượng 10 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Phân đoạn EA4.5 (MeOH) được chạy CC (1 cm i.d x 25 cm, silica gel (40- 63àm)), hệ dung mụi CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1, 4:1 và 2:1, thu được 7 nhúm phõn đoạn, được ký hiệu từ EA4.5.1 đến EA4.5.7. Nhóm phân đoạn EA4.5.6 được rửa nhiều lần bằng điclometan, thu được chất EA4.5.6 (chất III) (khối lượng là 0,1 gam) dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt.
4.7. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EA β-Sitosterol (I)
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 141-142 oC.
48
Rf = 0,38 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 6:1, v/v). Vệt chất hiện màu hồng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Metyl gallat (II)
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 201-203 oC.
Rf = 0,27 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-HCOOH 20:19:1, v/v/v), vệt chất hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%, hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3 5%.
1H-NMR (CD3OD): δ 3,83 (3H, s, 7-OCH3), 7,06 (2H, s, H-2, H-6).
13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 169,1 (s, C-7), 146,5 (s, C-4), 139,8 (s, C-3, C- 5) 121,5 (s, C-1), 110,1 (d, C-2, C-6), 52,3 (q, C-8).
Eclalbasaponin I (III) Bột vô định hình màu trắng.
Rf = 0,66 (TLC, silica gel, hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 2:1, v/v), vệt chất hiện màu đen với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
ESI-MS: m/z 819,2 [M + Na]+ (C42H68O14Na).
1H-NMR (CD3OD): δ 0,80 (3H, s), 0,86 (3H, s), 0,89 (3H, s), 0,97 (3H, s), 0,98 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,38 (3H, s) (23-CH3, 24-CH3, 25-CH3, 26-CH3, 27-CH3, 29-CH3, 30-CH3), 3,0 (1H, dd, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz, H-3), 3,17-3,43 (8H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-2, H-3, H-4, H-5), 3,68 (2H, dd, J = 12,0 Hz, 5,5 Hz, H-6, H-6), 3,83 (1H, t, J = 12,0 Hz, H-6), 3,84 (1H, t, J = 12,0 Hz, H-6), 4,34 (1H, d, J
= 7,5 Hz, H-1), 4,9 (1H, tín hiệu bị che khuất, H-16), 5,33 (1H, t, J = 3,0 Hz, H- 12), 5,36 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1).
13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 16,1 (q, C-25), 17,0 (q, C-24), 17,8 (q, C-26), 19,3 (t, C-6), 24,5 (t, C-11), 25,1 (q, C-30), 27,1 (t, C-2), 27,3 (q, C-27), 28,6 (q, C- 23), 31,3 (s, C-20), 31,6 (t, C-22), 33,3 (q, C-29), 34,2 (t, C-7), 36,3 (t, C-21), 36,4 (t, C-15), 37,9 (s, C-10), 39,9 (s, C-8), 40,2 (t, C-1), 40,9 (s, C-4), 42,2 (d, C-18), 42,7 (s, C-14), 47,8 (t, C-19), 48,2 (d, C-9), 50,1 (s, C-17), 57,2 (d, C-5), 62,5 (t, C- 6), 62,8 (t, C-6), 71,2 (d, C-4), 71,7 (d, C-4), 74,0 (d, C-16), 74,9 (d, C-2), 75,7
49
(d, C-2), 77,7 (d, C-5), 78,2 (d, C-5), 78,3 (d, C-3), 78,7 (d, C-3), 90,9 (d, C-3), 95,8 (d, C-1), 106,7 (d, C-1), 123,7 (d, C-12), 144,6 (s, C-13), 177,3 (s, C-28).
4.8. Phân tách sắc ký các phần chiết từ nguyên liệu phân trên mặt đất 4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2)
Phần chiết điclometan (EP2) (4,9 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trờn silica gel (Merck, 63-200 àm), kớch thước cột tỏch 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton tỉ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1. Mẫu được đưa lờn cột sắc ký theo phương phỏp tẩm trờn silica gel (Merck, 63-200 àm). Cỏc phân đoạn phân tách được thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 12 nhóm phân đoạn từ EP2.1 đến EP2.12.
Nhóm phân đoạn EP2.2 ( 0,45 g) được rửa nhiều lần bằng silica gel thu được β-sitosterol (EP2.2) (0,39 g) tinh thể hình kim màu trắng.
Các nhóm phân đoạn EP2.11-EP2.12 (0,5 g) được phân tách bằng cột chiết pha rắn RP-18 với MeOH, thu được eclalbasaponin II (EP2.11 và EP2.12) (chất IV) (40 mg) dưới dạng các tinh thể màu trắng.
4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3)
Phần chiết etyl axetat (EP3) (4,9 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel (Merck, 63-200 àm), kớch thước cột tỏch 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải với hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1 và 10:20:1. Mẫu được đưa lên cột sắc ký theo phương phỏp tẩm trờn silica gel (Merck, 63-200 àm). Cỏc phõn đoạn được tách thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 10 nhóm phân đoạn từ EP3.1 đến EP3.10.
Các nhóm phân đoạn EP3.7-EP3.9 (0,96 g) được gộp lại và tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex LH-20, rửa giải với metanol. Các phân đoạn chứa chất thu được rửa bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 1:1 cho chất eclalbasaponin II (EP3.7.2) (chất IV) (0,5 g) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
50
Phân đoạn EP3.10 được rửa bằng metanol cho hesperidin (EP3.10) (chất VI) (28 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
4.8.3 Phần chiết nước (EP4)
Phần chiết nước EP4 được hòa tan trong metanol rồi đưa lên phân tách bằng cột Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals) (3 cm i.d. 20 cm). Rửa giải bằng H2O, MeOH-H2O 20%, 40% và 60% và MeOH. Các phân đoạn được thu theo hệ dung môi rửa giải cho 4 phân đoạn từ EP4.1 đến EP4.4. Các phân đoạn này được cất loại dung môi dưới áp suất giảm.
Phân đoạn EP4.2 (40% MeOH-H2O) được phân tách cột CC (1 cm i.d. 25 cm) trờn silica gel (Merck, 40-63 àm), hệ dung mụi gradient CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1, 6:1 và 3:1, thu được 5 nhóm phân đoạn chính EP4.2.1 đến EP4.2.5 từ các phân đoạn phân tách (20 ml/phân đoạn) qua phân tích TLC. Nhóm phân đoạn EP4.2.4 (1,87 g) được phõn tỏch sắc ký cột trờn silica gel (Merck, 40-63 àm) với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O 8:2:0,2 và 7:3:0,5 cho norwedelolacton (EP4.2.4) (10 mg) (chất V) dưới dạng bột vô định hình màu vàng.
Phân đoạn EP4.3 (60% MeOH-H2O) được phân tách CC (1 cm i.d. 25 cm) trờn silica gel (Merck, 40-63àm)), hệ dung mụi gradient CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1, 6:1 và 3:1, thu được 5 nhóm phân đoạn EP4.3.1 đến EP4.3.5 từ các phân đoạn phân tách (20 ml/phân đoạn). Nhóm phân đoạn EP4.3.4 (0,4 g) được rửa nhiều lần với MeOH cho hesperidin (EP4.3.4) (26 mg) (chất VI) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
4.9. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EP β-Sitosterol (I)
Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 141-142 oC.
Rf = 0,38 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 6:1 (v/v). Vệt chất hiện màu hồng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Eclalbasaponin II (IV) Bột vô định hình màu trắng.
51
Rf = 0,65 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10, v/v/v), vệt chất hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
ESI-MS: m/z 635,3 ([M + H]+) (C36H59O9), 657,0 ([M + Na]+) (C36H58O9Na).
1H-NMR (CD3OD): δ 0,80 (3H, s, 26-CH3), 0,87 (3H, s, 24-CH3), 0,90 (3H, s, 25-CH3), 0,98 (3H, s, 29-CH3), 0,99 (3H, s, 30-CH3), 1,08 (3H, s, 24-CH3), 1,39 (3H, s, 27-CH3), 3,03 (1H, d, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz, H-3), 3,19-3,38 (4H, H-2, H-3, H-4, H-5), 3,68 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 5,0Hz, H-6a), 3,86 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 2,0 Hz, H-6b), 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 4,56 (1H, s br, H-16), 5,32 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12).
13C-NMR (CD3OD): δ 16,1 (q, C-25), 17,0 (q, C-24), 17,8 (q, C-26), 19,3 (t, C-6), 24,5 (t, C-11), 24,9 (q, C-30), 27,1 (t, C-2), 27,3 (q, C-27), 28,6 (q, C-23), 31,4 (s, C-20), 32,6 (t, C-22), 33,4 (q, C-29), 34,3 (t, C-7), 36,3 (t, C-15), 36,6 (t, C- 21), 37,9 (s, C-10), 39,9 (t, C-1), 40,2 (s, C-4), 40,7 (s, C-8), 42,1 (d, C-18), 42,7 (s, C-14), 47,7 (t, C-19), 48,2 (d, C-9), 49,8 (s, C-17), 57,2 (d, C-5), 62,9 (t, C-6), 71,7 (d, C-4), 75,3 (d, C-16), 75,7 (d, C-2), 77,7 (d, C-5), 78,3 (d, C-3), 90,8 (d, C-3), 106,7 (d, C-1), 123,5 (d, C-12), 145,1 (s, C-13), 181,5 (s, C-28).
Norwedelolactone (V) Bột vô định hình màu trắng.
Rf = 0,21 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10, v/v/v), vệt chất hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
1H-NMR (CD3OD): δ 6,88 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,97 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4), 7,18 (1H, s, H-10), 7,36 (1H, s, H-7).
13C-NMR (CD3OD): δ 99,6 (d, C-10), 100,9 (s, C-6a), 101,8 (d, C-7), 104,6 (s, C-11b), 105,2 (d, C-2), 106,1 (d, C-4), 115,6 (s, C-6b), 145,5 (s, C-8), 147,0 (s, C-10a), 151,4 (s, C-9), 155,8 (s, C-11a), 155,9 (s, C-4a), 156,9 (s, C-3), 160,6 (s, C- 1), 160,7 (s, C-6).
Hesperidin (VI)
Bột vô định hình màu trắng.
52
Rf = 0,33 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10, v/v/v), vệt chất hiện màu đen với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz, 6-CH3), 2,78 (1H, dd, J = 17,0 Hz, 3,0 Hz, H-3a), 3,12-3,83 (11H, m, H-3b, H-2, H-3, H-4, H-5, 2H-6, H-2, H-3, H-4, H-5), 3,78 (3H, s, 4-OCH3), 4,53 (1H, s, H-1), 4,97 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 5,50 (1H, d, J = 12,0 Hz, 3,0 Hz, H-2), 6,13 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,14 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,90-6,96 (3H, m, H-2, H-5, H-6).
13C-NMR (DMSO-d6) (2S): δ 17,8 (q, C-6), 42,1 (t, C-3), 55,8 (q, 4- OCH3), 66,1 (t, C-6), 68,3 (d, C-5), 70,3 (d, C-2), 70,7 (d, C-3), 70,8 (d, C-4), 72,1 (d, C-4), 75,6 (d, C-3), 76,3 (d, C-5), 78,4 (d, C-2), 95,6 (d, C-8), 96,5 (d, C-6), 99,6 (d, C-1), 100,6 (d, C-1), 103,4 (d, C-10), 112,2 (d, C-5), 114,2 (d, C- 2), 117,9 (d, C-6), 131,0 (s, C-1), 146,5 (s, C-3), 148,0 (s, C-4), 162,6 (s, C-9), 163,1 (s, C-5), 165,2 (s, C-7), 196,9 (s, C-4).
13C-NMR (DMSO-d6) (2R): δ 17,8 (q, C-6), 42,1 (t, C-3), 55,8 (q, 4- OCH3), 66,07 (t, C-6), 68,3 (d, C-5), 69,7 (d, C-2), 70,7 (d, C-3), 73,0 (d, C- 4), 72,1 (d, C-4), 75,6 (d, C-3), 76,3 (d, C-5), 78,38 (d, C-2), 95,6 (d, C-8), 96,5 (d, C-6), 99,5 (d, C-1), 100,6 (d, C-1), 103,4 (d, C-10), 112,1 (d, C-5), 114,1 (d, C-2), 117,8 (d, C-6), 130,96 (s, C-1), 146,48 (C-3), 147,98 (s, C-4), 162,5 (s, C-9), 163,0 (s, C-5), 165,1 (s, C-7), 196,9 (s, C-4).